TCNICAS DE COAGULAO

INTRODUO
As provas de coagulao exigem cuidados de ordem tcnica para que os resultados obtidos sejam os mais exatos e reprodutveis possveis: a) a leso tecidual decorrente da puno venosa deve ser mnima; b) as seringas e os frascos de acondicionamento de sangue e plasma devem ser plsticos ou siliconizados; c) os coagulantes de escolha so o CITRATO DE SDIO usado na proporo de uma parte de anticoagulante para nove partes de sangue; d) o plasma deve ser separado em at 30 minutos aps a coleta e, dependendo da prova a ser executada, pode ser congelado por 4 horas, no mximo; e) realizar os testes em duplicata e em paralelo, com um controle normal de plasma.

1. PROVA DO LAO (Fragilidade Capilar)

PRINCPIO
A Prova do Lao ou Prova de Fragilidade Capilar, um teste que procura avaliar a capacidade dos vasos de resistirem a uma presso. Em ltima anlise, a prova avalia uma das funes pertinentes parte vascular da hemostasia.

TCNICA
a) delimitar uma rea de aproximadamente 5 cm2 no antebrao do paciente, marcando-se os sinais e manchas existentes (pintas, petquias existentes, etc.); b) determinar a presso arterial do paciente (mxima e mnima) e manter o manguito do aparelho no valor mdio entre as presses mxima e mnima, desde que esse valor no ultrapasse a 100 mm de Hg. Caso isso ocorra, a presso deve ser mantida em 100 mm de Hg; c) o manguito do aparelho deve ser mantido na presso obtida em b), por 5 minutos; d) retirar o aparelho e contar as petquias (apresentam-se em forma de pontos vermelhos-rutilante); e) a prova considerada POSITIVA quando forem contadas mais de 4 petquias na rea delimitada

2. TEMPO DE SANGRAMENTO (Mtodo de Duke)

PRINCPIO
O Tempo de Sangramento (T.S.) avalia a capacidade de se processar a hemostasia aps o vaso ter sido lesado. O T.S. depende da funo plaquetria e da integridade funcional do vaso. O mtodo mais comumente utilizado o de Duke, em que feita uma inciso, de tamanho padronizado, medindo-se a seguir o tempo decorrido at que cessar o sangramento, intervindo apenas os fatores plaquetrio e vascular.

TCNICA
a) realizar assepsia do lbulo da orelha (pode-se usar tambm a polpa digital) com algodo embebido em lcool e deixar evaporar; b) com auxlio de uma lanceta especfica e de um s golpe, fazer uma inciso local, com cerca de 2 mm de profundidade; disparar o cronmetro; c) a cada 30 segundos recolher a gota de sangue em papel de filtro (tendo o cuidado de que o mesmo no toque o lbulo ou a polpa), at que a ltima gota deixe apenas um sinal puntiforme no papel; d) anotar o tempo decorrido entre a primeira e a ltima gota recolhidas. Valor Normal: de 1 a 3 minutos.

INTERPRETAO
O Tempo de Sangramento um teste indicativo de distrbios plaquetrios ( em relao ao nmero funcionalidade das mesmas) e de alteraes da integridade vascular. As alteraes mais evidentes do Tempo de Sangramento so encontradas nas prpuras trombocitopnicas e trombopticas.

3. TEMPO DE COAGULAO DO SANGUE TOTAL (Mtodo de Lee-White)

PRINCPIO
O Tempo de Coagulao (T.C.) mede o tempo necessrio para que o sangue coagule in vitro.

TCNICA
a) proceder puno venosa, procurando lesar os tecidos, o mnimo possvel ; b) disparar o cronmetro, assim que o sangue entrar na seringa; c) separar 3 tubos de ensaio (10 x 120 mm), colocar 1 ml de sangue em cada um e lev-los imediatamente em banho 37C; d) 3 minutos aps a coleta, iniciar a observao do tubo 1, inclinando-o suavemente; repetir essa observao a cada 30 segundos at que o sangue coagule. Marcar o tempo transcorrido desde a coleta at a formao do cogulo; e) proceder do mesmo modo com os tubos 2 e 3; f) o Tempo de Coagulao ser o obtido pela mdia dos tempos encontrados nos 3 tubos, Valor Normal: de 4 a 9 minutos.

INTERPRETAO
O Tempo de Coagulao uma prova pouco sensvel para detectarem-se alteraes no sistema global da coagulao. Um prolongamento do Tempo de Coagulao pode ser causado por Hipofibrinogenemia, por deficincia de alguns dos fatores do sistema intrnseco e pela presena de anticoagulantes circulantes. O T.C. largamente empregado como mtodo de controle de terapia com anticoagulantes, especialmente no caso da heparina.

4. RETRAO DO COGULO (Mtodo de Mac-Farlane)

PRINCPIO
Aps a coagulao do sangue, o cogulo formado retrai-se ou mais precisamente, retrai-se a rede de fibrina, retendo os elementos figurados do sangue e liberando a parte lquida, o soro. A retrao do cogulo devida liberao de substncias, pelas plaquetas localizadas nos pontos de interseco das malhas da rede de fibrina, O volume de soro liberado, expresso percentualmente em relao ao volume inicial do sangue que se deixou coagular. A retrao de cogulo est relacionada diretamente ao nmero e funcionalidade das plaquetas e inversamente proporcional ao grau de anemia. TCNICA a) transferir cerca de 5 ml de sangue, sem anticoagulantes para um tubo cnico graduado, cujas paredes foram previamente umedecidas com soluo fisiolgica; b) fechar o tubo com uma rolha provida de um fio de arame com a ponta retorcida em anzol; c) aps a coagulao do sangue, colocar o tubo em banho 37C por 1 hora; d) ler, a seguir, o volume total ( cogulo e soro). Com o auxlio do fio de arame, retirar cuidadosamente o cogulo retrado; ler o volume final do soro.

CLCULO:
% de retrao = Vol. soro x Hematcrito do paciente Vol. total x Hematcrito normal (*)
(*)

Consultar tabela.

Valor Normal: de 45 a 55%

5.

TEMPO DE PROTROMBINA (Tempo de Quick de um estgio)

O teste do Tempo de Protrombina avalia a atividade coagulante do sistema extrnseco, incluindo a protrombina (ou seja, todo o complexo da protrombina) e o fibrinognio.

TCNICA
a) a um tubo de 12 x 75 mm, previamente mantido a 37C, pipetar 0,1 ml de tromboplastina e 0,1 ml de plasma (a tromboplastina ativada, mantendo-se 37C por 5 minutos); b) homogeneizar delicadamente, deixando por cerca de 20 segundos no banho a 37C; c) adicionar 0,1 ml de CaCl2 M/40, disparando simultaneamente o cronmetro; d) deixar em repouso cerca de 8 segundos e a seguir iniciar a observao do desenvolvimento da rede de fibrina (indica o ponto final da retrao). Valor Normal: de 10 a 14 segundos ( 70 a 100% de atividade).

OBSERVAO
Pode-se usar, alternativamente, tromboplastina a que foi adicionado previamente clcio e, nesse caso, colocam-se 0,2 ml de tromboplastina-clcica e 0,1 ml do plasma. Os reagentes (Tromboplastina, CaCl2) e tubos, devem estar 37C.

INTERPRETAO
O reagente tromboplstico tissular utilizado no teste no contm os fatores V, VII e X, que devem ser fornecidos pelo plasma do paciente, juntamente com a protrombina e o fibrinognio. Assim, a deficincia ou ausncia de qualquer um desses fatores, resulta em um prolongamento do Tempo de Protrombina. Admitindo-se que o fibrinognio esteja em concentrao normal, o prolongamento do Tempo de Protrombina deve-se deficincia de alguns dos fatores do complexo da Protrombina, O Tempo de Protrombina pode encontrar-se alongado nos seguintes casos: presena de anticoagulantes circulantes, na deficincia de vitamina K e nas hepatopatias de um modo geral.

5.1 ATIVIDADE PROTROMBNICA

A atividade protrombnica do material avaliada atravs do tempo (em segundos) e de uma curva de atividade (previamente preparada para cada lote da tromboplastina utilizada).

PREPARO DA CURVA DE ATIVIDADE

Faz-se uma mistura (pool) de pelo menos 3 plasmas normais obtidos do mesmo modo; distribui-se em 10 tubos da seguinte maneira: Tubos Pool plasma (ml) Sol. Fisiolgica (ml) Atividade (%) = 1 2 3 4 5 6 7 8 9 = 1,0 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 = 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 = 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0,1 1,0 10

Com a mesma tromboplastina determina-se o Tempo de Protrombina de cada um dos tubos; o tempo do tubo l corresponde 100% de atividade (*). Valor Normal: 70 a 100% de atividade. Obs.: O sangue no deve ter mais do que 4 horas de coleta (fatores, como o V, degradam-se, mesmo mantendo-se o sangue em congelador). (*) Uma preparao de tromboplastina considerada de boa qualidade, quando o seu 100% de atividade, frente a um pool de plasmas normais, corresponder a um Tempo de Protrombina entre 12 e 14 segundos.

6. TEMPO DE RECALCIFICAO DO PLASMA (T.R.P.)

PRINCPIO
A adio de ons clcio ao plasma (ou sangue) citratado, desencadeia o processo da coagulao, visto que, com exceo dos ons clcio (complexados pelo citrato), o plasma deve conter todos os fatores plasmticos da coagulao. O teste avalia todo o sistema de coagulao, principalmente o sistema intrnseco.

TCNICA
a) a um tubo mantido previamente a 37 C adicionar 0,2 ml de plasma e 0,2 ml de CaCl 2 M/40. Disparar o cronmetro, homogenizar; b) deixar em repouso em banho 37 C, por 30 segundos e a seguir iniciar a observao da formao de fibrina, inclinando-se levemente o tubo; c) marcar o tempo decorrido at a formao da fibrina. Valor Normal: 80 a 120 segundos.

INTERPRETAO
O TRP encontra-se alterado nos casos de deficincia de um ou mais dos fatores V, VIII, IX, X, XI e XII, avaliando ainda a Protrombina (II), o Fibrinognio (I) e a presena de anticoagulantes. O resultado altamente influencivel pelo nmero de plaquetas existentes no plasma

7. TEMPO DE CEFALINA OU TEMPO DE TROMBOPLASTINA PARCIAL (T.T.P.)

Trata-se de uma prova de recalcificao na qual, a fim de eliminar-se a influncias das plaquetas (visto que o nmero das mesmas interfere no TRP), adiciona-se uma quantidade tima de fosfolipdeos ( cefalina ou tromboplastina, por ex.).

Tcnica a. pipetar para um tubo de ensaio, 0,l ml de plasma (pobre em plaquetas) e 0,l ml de
cefalina. Homogenizar; b. incubar por l20 segundos em banho 37 C, agitando a mistura a cada l0 segundos; c. adicionar 0,l ml de CaCl 2 M / 40 ; disparar o cronmetro: d. marcar o tempo de coagulao ( tempo de formao da fibrina). Valor normal: 40 a 60 segundos. INTERPRETAO O TTPA uma prova sensvel para avaliar alteraes no processo da coagulao. O alongamento do TTPA, indicativo de alterao dos fatores V, VII, IX, X, II e I, ou ainda, de quando existirem anticoagulantes circulantes.

8. TEMPO DE TROMBOPLASTINAPARCIAL ATIVADA (TTPA) OU TEMPO DE KAOLIN-CEFALINA

O TTPA tambm consiste em uma prova de recalcificao em que as variveis constitudas pelo nmero de plaquetas e pelo grau de ativao dos fatores XI e XII so eliminadas atravs da adio de um fosfolpede e de um ativador (celite ou caolin, por exemplo). Com a adio dessas substncias, conseguem-se resultados mais reprodutveis e uma sensibilidade maior do que nas determinaes do T.R.P. e T.T.P.

TCNICA
a) em um tubo de ensaio, previamente aquecido a 37C, pipetar 1 ml de cefalina; incubar a 37C por 1 minuto; b) a seguir, adicionar 0,1 ml de caolin; aps 2 minutos recalcificar com 0,1 ml de CaCl2 e disparar o cronmetro; c) marcar o tempo de formao de fibrina; d) colocar 0,1 ml de plasma a um tubo mantido previamente a 37 C. Incubar por 1 minuto. e) adicionar 0,2 ml da mistura cefalina-caolin; incubar por 3 minutos; f) adicionar 0,1 ml de CaCl2 M / 40; disparar o cronmetro; g) marcar o tempo de formao da fibrina.

INTERPRETAO
O TTPA uma prova sensvel para avaliar alteraes no processo de coagulao. O alongamento do TTPA indicativo de alterao dos fatores V, VII, IX, X, II e I, ou ainda, de quando existirem anticoagulantes circulantes.

9. FIBRINOGNIO (Mtodo de Ratnoff-Menzie)

PRINCPIO
O fibrinognio do plasma pode ser separado das demais protenas plasmticas pela sua transformao em fibrina: submete-se a fibrina digesto em meio alcalino, havendo liberao de aminocidos, entre os quais, a tirosina. Esta pode ser dosada atravs da medida de intensidade da cor azul que se desenvolve com o reativo de Folin-Ciocalteau.

TCNICA
a) colocar em tubo de ensaio de 20 x 200mm; 1- 10 ml de soluo fisiolgica 2- 0,5 ml de plasma 3- 0,05 ml de trombina (25 U/ml) 4- basto de vidro; b) girar o basto mergulhado na soluo. Utilizando-se a trombina, a coagulao se processa em 2 ou 3 minutos. Com o decorrer da coagulao, os fios de fibrina aderem ao basto. Embora a reao possa se desenvolver temperatura ambiente, a mesma se processa mais eficientemente quando realizada 37C; assim, deve-se manter o tubo da reao em banho 37C, por 30 minutos, girando-se o basto a cada 510 minutos, de tal forma que a fibrina se enovele no basto. c) desprezar a soluo contida no tubo e lav-lo 3 vezes com soluo fisiolgica para eliminar qualquer interferente. O basto deve ser retirado e lavado 3 vezes com jatos de soluo fisiolgica; o cogulo aderido deve ser comprimido cuidadosamente em papel de filtro, aps cada lavagem. d) recolocar o basto no tubo, com a fibrina aderida ; adicionar ao tubo 1,0 ml de NaOH a 10%. Colocar o tubo em Banho-Maria por 10 minutos, tomando-se o cuidado de cobr-lo com papel alumnio, para evitar evaporao. e) aps o resfriamento do tubo em temperatura ambiente, adicionar sucessivamente e na ordem: 1- 7,0 ml de H2O destilada 2- 3,0 ml de Na2CO3 a 20%. Agitar 3- 1,0 ml de reativo de Folin (diludo 1/3 em H2O). Agitar; f) deixar em repouso temperatura ambiente por 30 minutos. Ler em espectrofotmetro 650 nm contra um branco, preparando da seguinte maneira: Branco: - 1,0 ml de NaOH 10% - 7,0 ml de gua destilada - 2,0 ml deNa2CO3 20% - agitar - 1,0 ml de Reativo de Folin Deixar em repouso temperatura ambiente por 30 minutos;

g) a D.O. da cor desenvolvida no sistema a dosar, diretamente proporcional concentrao de fibrinognio ou tirosina, at a quantidade de 0,35 mg de tirosina (caso a intensidade da cor obtida for superior quela obtida com 0,35 mg, diluir a soluo e fazer o clculo proporcional); h) a quantidade de tirosina correspondente leitura determinada em uma curva padro de tirosina. Para a converso da quantidade de tirosina em fibrina, multiplica-se o valor obtido, pela constante que a quantidade de tirosina contida na fibrina, em funo do teor de Nitrognio. Faz-se o clculo de mg% de fibrinognio em funo da quantidade de plasma usada para a dosagem (ex.: se usarmos 0,5 ml de plasma, multiplicamos por 200). Valor Normal: 165 a 485 mg% Padro 1- preparar, a partir da soluo estoque de tirosina (20 mg% em HCl 0,1N), uma soluo de uso (uma parte de soluo padro e 3 partes de gua destilada); 2- pipetar para um tubo: - 1,0 ml da soluo de tirosina - 6,0 ml de gua destilada - 1 ml de NaOH 10% - 3,0 ml de Na2CO3 20% - agitar - 1 ml de Folin - agitar.

RECOMENDAES DOS LIMITES TERAPUTICOS DA ANTICOAGULAO ORAL (8)

INDICAO

VALOR ALVO

INR VALORES LIMITES

Profilaxia do tromboelismo venoso (cirurgia de alto risco)

2,5

2-3

Tratamento de trombose venosa profunda preveno da embolia em pacientes com fibrilao atrial, doena cardaca valvular ou vlvulas biolgicas. Profilaxia de tromboelismo venoso (cirurgia de quadril)

2-4

Embolismo sistmico recorrente. Prtese valvular cardaca.

3,5

3 - 4, 5