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Biocatálise e biotransformação - fundamentos e aplicações: Quarta Série de Textos do Workshop de Biocatálise e Biotransformação

Biocatálise e biotransformação - fundamentos e aplicações: Quarta Série de Textos do Workshop de Biocatálise e Biotransformação

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Biocatálise e biotransformação - fundamentos e aplicações: Quarta Série de Textos do Workshop de Biocatálise e Biotransformação

Duração:
464 páginas
4 horas
Editora:
Lançados:
14 de nov. de 2016
ISBN:
9788582453858
Formato:
Livro

Descrição

O conceito Biotecnologia é bastante geral e engloba uma ampla variedade de procedimentos para a modificação de organismos vivos com o objetivo de permitir e/ou melhorar a produção de um determinado bioproduto. Ao contrário de uma disciplina científica isolada, a biotecnologia trata-se de um campo multidisciplinar emergente, e envolve diversas áreas científicas, como a biologia, a genética, a química, a bioquímica, e a ciência de alimentos. Neste livro, os autores convidados retratam temas de suas pesquisas em laboratório e em sala de aula, onde muitos deles se relacionam com o cenário atual da biotecnologia e biocatálise, de forma a consolidar todos os segmentos explorados no VII Workshop de Biocatálise e Biotransformações e I Simpósio LatinoAmericano de Biocatalisis y Biotrasformaciones, realizados no ano de 2014, em Búzios, Rio de Janeiro, Brasil.
Editora:
Lançados:
14 de nov. de 2016
ISBN:
9788582453858
Formato:
Livro

Sobre o autor


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MULTICOMPONENTES

PREFÁCIO

A Lei de Inovação Tecnológica n⁰ 10.973, encaminhada ao Congresso Nacional em agosto de 2002 e aprovada em 2 de Dezembro de 2004, regula as relações entre o governo, a comunidade científica (universidades e institutos de pesquisa) e o setor empresarial, tendo como objetivo estimular cooperação entre esses segmentos em busca da inovação e do empreendedorismo científico e tecnológico. A inovação tecnológica sempre foi foco de países comprometidos com o planejamento estratégico voltado ao desenvolvimento, e, atualmente, este assunto é ainda mais destacado tendo tecnologias da informação e biotecnologia se voltado para as áreas de energia e saúde. O desafio a que se propôs na realização deste evento é, justamente, de apresentar e colocar em discussão estratégias biotecnológicas para aplicação no desenvolvimento de novos produtos com importância comercial.

Biotecnologia define-se pelo uso de conhecimentos sobre os processos biológicos e sobre as propriedades dos seres vivos, com o fim de resolver problemas e criar produtos de utilidade (Convenção sobre diversidade biológica da ONU). O conceito Biotecnologia é bastante geral e engloba uma grande variedade de procedimentos para a modificação de organismos vivos com o objetivo de permitir e/ou melhorar a produção de um determinado bioproduto. Ao contrário de uma disciplina científica isolada, a biotecnologia trata-se de um campo multidisciplinar emergente, e envolve diversas áreas científicas, como a biologia, a genética, a química, a bioquímica, e a ciência de alimentos. Um processo biotecnológico pode compreender tanto a utilização de micro-organismos inteiros, como leveduras ou bactérias, assim como seus componentes isolados, como enzimas, para a produção de compostos químicos os mais diversos (desde proteínas –biofármacos a antibióticos), na indústria alimentícia, até para a geração de biomassa e despoluição de efluentes.

Em setembro de 2014 realizamos a sétima edição do Workshop de Biocatálise e Biotransformações na cidade de Búzios, Rio de Janeiro. O primeiro evento ocorreu entre 18 a 22 de fevereiro de 2002 no Instituto de Química da Universidade de São Paulo (IQ-USP), sendo organizado pelo Prof. Dr. João Valdir Comasseto (IQ-USP) e Dra. Solange Sakata (IQ-USP). Inscreveram-se 60 participantes, foram apresentados 20 trabalhos na forma de seção de pôster e houveram 12 apresentações orais. Após este primeiro encontro, o evento tomou um caráter mais amplo, sendo organizados por outras Instituições de Ensino Superior ao redor do Brasil como por exemplo Unicamp (2004), USP – São Paulo (2006), USP – São Carlos (2008), Universidade Estadual de Maringá (2010 - UEM) e Universidade Federal do Ceará (2012 - UFC).

O número de participantes também cresceu durante estes anos, chegando a cerca de 200 participantes no evento organizado na UEM em 2010. Este crescimento do número de participantes está diretamente relacionado ao crescimento desta área no Brasil ao longo dos anos. Nossa comunidade ainda é pequena quando comparada a países europeus, mas na américa latina, com certeza somos líderes no desenvolvimento de metodologias aplicadas em biocatálise e biotransformações. Neste último evento realizado na cidade de Búzios, Rio de Janeiro, tivemos 175 inscritos e a apresentaçãoo de 125 trabalhos na forma de pôster.

Este ano também foi marcado pela associação com Simpósio LatinoAmericano de Biocatalisis y Biotrasformaciones, evento este organizado em conjunto por Argentina e Uruguai a cada 2 anos de maneira a unirmos as comunidades que trabalham no desenvolvimento de estratégias de biocatálise ou biotransformações. Esta união dos eventos é fundamental para que possamos integrar a comunidade da América do Sul em prol de um desenvolvimento sólido e de alto nível.

Nesta edição do Workshop de Biocatálise e Biotransformações tivemos a participações dos maiores expoentes mundiais na área de biotecnologia como os professores Roma Kazlauskas, Uwe Bornscheur, Benhard Hauer, Jon Stewart, Ulf Hanefeld e Sergio Riva, entre outros. Desta forma gostaríamos de destacar que a realização deste tipo de evento vem a ser uma oportunidade sem precedentes para a comunidade brasileira de estabelecer o intercâmbio de estudantes e parcerias científicas com estes grupos de excelência.

Neste livro, os autores convidados retratam temas de suas pesquisas em laboratório e em sala de aula, onde muitos deles se relacionam com o cenário atual da biotecnologia e biocatálise, de forma a consolidar todos os segmentos explorados no VII Workshop de Biocatálise e Biotransformações e I Simpósio LatinoAmericano de Biocatalisis y Biotrasformaciones. Sendo assim, os organizadores desta obra agradecem a todos os pesquisadores que aceitaram participar desta obra, assim como desejam a todos os pesquisadores, alunos e profissionais, uma boa leitura!

Rio de Janeiro, janeiro de 2017

CAPÍTULO 1: CATÁLISE COM CÉLULAS ÍNTEGRAS - APLICAÇÕES DE LIPASES POR MEIO DE SURFACE DISPLAY

Gabriela Coelho Breda¹, Leticia Dobler¹, Karina Daiha de Godoy¹, ², Denise Maria Guimaraes Freire³, Marcelo Victor Holanda Moura¹, Rodrigo Volcan Almeida¹, #

¹ Laboratório de Microbiologia Molecular e Proteínas, Programa de Pós-graduação em Bioquímica, Departamento de Bioquímica, Instituto de Química, Universidade Federal do Rio de Janeiro – Av. Athos da Silveira Ramos, 149 – Ilha da Cidade Universitária – Centro de Tecnologia, bloco A, sala 541, Rio de Janeiro - RJ, Brasil, CEP 21941-909

² Kasznar Leonardos Propriedade Intelectual - Rua Teófilo Otoni, 63 - Centro, Rio de Janeiro - RJ, CEP 20090-070

³ Laboratório Biotecnologia Microbiana, Programa de Pós-graduação em Bioquímica, Departamento de Bioquímica, Instituto de Química, Universidade Federal do Rio de Janeiro – Av. Athos da Silveira Ramos, 149 – Ilha da Cidade Universitária – Centro de Tecnologia, bloco A, sala 549, Rio de Janeiro - RJ, Brasil, CEP 21941-909

RESUMO

Lipases, triacilglicerol éster hidrolases (EC 3.1.1.3), são enzimas extremamente versáteis e de grande utilização industrial. O desenvolvimento de novas tecnologias de produção e utilização de enzimas, principalmente por meio da utilização da Catálise com Células Íntegras (CCI) tem ampliado o escopo de aplicações das lipases, sobretudo pela potencial redução de custos com purificação e imobilização. No presente trabalho é feita inicialmente uma caracterização conceitual da CCI. Posteriormente, é abordada a produção e utilização de lipases por CCI fazendo-se um levantamento bibliométrico de patentes e publicações científicas. Por último, é enfocada a utilização de lipases por meio da ancoragem em superfície de células (surface display) dando ênfase à produção de biodiesel e flavorizantes por meio da ancoragem em superfície de leveduras (ASL). O levantamento bibliométrico realizado indicou uma crescente produção a partir dos anos 2000, principalmente de publicações científicas pela academia. A ancoragem de lipases tem sido realizada em células de bactérias, leveduras e fungos, empregando diversas proteínas âncoras. Os resultados da utilização de lipases ancoradas na superfície de leveduras para a produção de biodiesel e flavorizantes são muito promissores, alcançando altas produtividades.

Palavras-chave: Whole cell, Lipase. Surface Display.

1. INTRODUÇÃO

A tecnologia enzimática se insere no contexto da biotecnologia e vem ganhando importância mundialmente. Em 2010, estimava-se que o mercado mundial de enzimas iria alcançar a marca de 4,4 bilhões de dólares até 2015. Este número foi alcançado logo em 2012 e ultrapassado em 2013, onde os valores foram superiores a 4,8 bilhões de dólares, extrapolando assim as projeções¹. Hoje, os especialistas preveem um montante de 7 bilhões de dólares de mercado até o ano de 2017, com um crescimento anual estimado em 8,3%. Os investimentos não somente vão continuar como tendem a aumentar, ampliando assim a importância financeira do setor¹,². A Figura 1 mostra a evolução da demanda mundial de enzimas, desde 2002 até a previsão para 2022.

Figura 1. Gráfico da demanda mundial de enzimas, em milhões de dólares, de 2002 até a projeção para 2022. Em azul está a demanda mundial, em vermelho o setor industrial (composto por Indústria de Alimentos/Bebidas, Biocombustíveis, Ração Animal, Limpeza e Outras Indústrias) e em verde o setor de especialidades (composto por Pesquisa e Biotecnologia, Diagnóstico e Outras Especialidades) ¹,².

Entre os diversos usos industriais, pode-se observar, de acordo com a Figura 2, que todos os setores tiveram um aumento no consumo de enzimas. Porém, enquanto todos os setores tiveram crescimento de cerca de 200%, o de biocombustíveis experimentou um crescimento, nos últimos 10 anos, de 470% até 2012, passando de 90 milhões de dólares em consumo de enzimas para mais de 515 milhões em 2012, o que corresponde a 10% do total do mercado.

Lipases, triacilglicerol éster hidrolases (E.C. 3.1.1.3), são catalisadores muito versáteis, devido à quantidade de substratos em que podem atuar, a capacidade de catalisarem reações em solventes aquosos e não aquosos e ao fato de comumente apresentarem enantioseletividade e regioseletividade³,⁴. Sendo por isso, aplicados em diversas áreas, como detergentes, alimentícia, couro, têxtil, oleoquímica, lubrificantes, cosméticos, farmacêutica e na indústria de papel⁵,⁶.

Figura 2. Gráfico de demanda por enzimas, em milhões de dólares, nos diversos setores industriais desde 2002, até a projeção para 2022. Em azul escuro 2002, em vermelho 2007, em verde 2012, em roxo 2017 e azul claro 2022¹,².

O uso de lipases como biocatalisadores na produção de intermediários para produtos farmacêuticos, agroquímicos e produtos de química fina tem crescido com o desenvolvimento de melhores técnicas de imobilização e de diminuição do custo dos catalisadores. A disponibilidade de novas tecnologias para síntese orgânica e o aumento da demanda por substâncias enantiopuras também vem incentivando o mercado a consumir cada vez mais lipases. Estas áreas tem a tendência a agregar muito valor aos processos e por isso tem a estimativa de se desenvolverem muito até 2022¹,⁴,⁷.

Embora enzimas sejam bastante promissoras e seu uso em diversas áreas da indústria já seja uma realidade, um dos maiores obstáculos para uma maior disseminação da utilização de biocatalisadores continua sendo o seu custo, principalmente quando comparados a catalisadores químicos convencionais.

Para tornar o uso de enzimas mais acessível, tecnologias visando aumentar a estabilidade, a atividade e incentivar o reciclo do catalisador vêm sendo empregadas. Uma destas estratégias se chama Catálise com Células Íntegras (CCI), onde o biocatalisador sofre o mínimo possível de processamento entre a sua produção e seu uso⁸-¹⁰. Em particular, uma das formas de CCI se chama Ancoragem em Superfície de Leveduras (ASL) ou Yeast Surface Display (YSD), onde a enzima em questão é ancorada no micro-organismo produtor através de uma proteína de membrana. A célula então age como um suporte, tornando a enzima mais estável e mais fácil de ser reutilizada, aumentando assim a quantidade de reciclo possível. Esta estratégia visa balancear um custo mais alto de produção de catalisadores através de uma maior eficiência na catálise e um maior tempo de duração da enzima⁸-¹⁰.

2. CATÁLISE COM CÉLULAS ÍNTEGRAS

Mesmo com vários avanços na área de biocatálise, muitos processos com inúmeras vantagens ainda permanecem inviáveis. Um dos maiores obstáculos continua sendo ultrapassar a barreira de custo do catalisador. Nesta direção, a CCI vem ganhando força, pois se apresenta como uma alternativa para diminuir gastos com purificação e imobilização do catalisador.

2.1. Célula Íntegras vs Enzimas Livres

A alta seletividade e especificidade de enzimas e as condições geralmente mais brandas de reação tornam esta abordagem preferível ao uso de catalisadores químicos convencionais. Em alguns casos, como a hidroxilação seletiva de carbonos não ativados, o uso de biotransformação pode ser a única solução disponível para produzir certos compostos¹¹. Em reações de mais de uma etapa, que apresentam aspectos como dependência de co-fatores ou baixa estabilidade em sua forma isolada, ou em casos de bioconversões com mais de uma etapa e dependência entre as mesmas, o uso de células íntegras é mais favorável¹².

Enzimas são capazes de catalisar reações em uma variedade de condições, muitas vezes não próprias para crescimento celular. O uso de solventes orgânicos, substratos, temperatura e pHs que seriam danosos para a célula se torna possível quando a enzima isolada é empregada¹³. Entretanto, isolar e purificar enzimas normalmente é um processo oneroso e demorado, o uso de co-fatores pode ser necessário para a atuação da enzima e problemas de estabilidade nas condições de catálise também podem ocorrer. A posterior recuperação de enzimas livres do meio reacional também é difícil de ser realizada, o que pode dificultar uma eventual purificação do produto final e o reuso do catalisador¹¹.

Já as maiores vantagens de se usar CCI são a proteção que as enzimas responsáveis pela conversão terão e o reciclo de co-fatores no interior da célula, no caso de internalização do substrato. No caso de uma catálise no exterior da célula, as vantagens seriam a economia de tempo e dinheiro com purificação da enzima livre e a facilidade no reciclo do biocatalisador¹⁰,¹⁴. Já as desvantagens do uso de células íntegras residem na formação de coprodutos, a dificuldade de homogeneizar o meio reacional e a possível produção de proteases que degradam a enzima de interesse. Outras desvantagens são as dificuldades de se internalizar o substrato para entrar em contato com a enzima e o meio reacional restrito, necessário para a manutenção da integridade celular no caso da catálise intracelular¹¹,¹⁵.

2.2. Tipos de Catálise com Células Íntegras

Embora esta técnica seja extremamente heterogênea, existem 3 formas mais comumente utilizadas de CCI¹⁴.

2.2.1. Catálise Extracelular

A primeira consiste em utilizar o micro-organismo inteiro, em sua forma livre ou imobilizada, como agente transformador nas reações alvo. Neste cenário, há a expressão extracelular de uma ou mais enzimas, que então irão realizar o processo sem a necessidade de purificação. As enzimas produzidas extracelularmente ficam como que aderidas às células ou aos suportes onde as células são cultivadas ou imobilizadas. Quando livre, o micro-organismo, por não formar soluções com os meios reacionais, é facilmente recuperado com operações unitárias simples como filtração ou centrifugação, podendo ser reutilizado na reação. Embora haja diversos casos de CCI com micro-organismos distintos, tais como Yarrowia lipolitica, Escherichia coli, Saccharomyces cerevisiae, entre outros, fungos filamentosos são os mais utilizados neste tipo de processo⁹.

Por sua habilidade de crescer hifas e grande expressão de enzimas extracelulares, fungos filamentosos são cultivados em suportes inertes, como poliuretano ou matrizes de particulado sólido, tais como tortas fermentadas de rejeitos agroindustriais. Este material sofre pouco ou nenhum processamento e é utilizado como catalisador heterogêneo, se mostrando altamente eficiente e de baixo custo de produção⁸,¹⁶.

O fungo filamentoso Rhizopus oryzae foi utilizado em CCI para produzir biodiesel. Este micro-organismo foi cultivado em um suporte inerte e utilizado na metanólise de óleo de soja⁸. A melhor forma de induzir a produção de lipases também foi estudada, com a suplementação do meio de cultivo com diversos óleos, como óleo de oliva ou ácido oleico. A adição destes óleos chegou a aumentar o índice de metil-ésteres acumulados ao final da reação em 10 vezes. O índice de conversão de metil-ésteres do CCI chegou a 90%, mesmo valor da enzima livre purificada, o que indica que este tipo de processo pode ser viável no futuro.

Em outro exemplo de uso de fungos para CCI, o micro-organismo Rhizomucor miehei foi utilizado para realizar a produção de biodiesel por meio de um processo de hidroesterificação¹⁶. Esporos de R. miehei foram inoculados sobre torta de babaçu, onde, através de um processo de fermentação em estado sólido, foram cultivados por 120h. Após o cultivo, o material foi liofilizado e utilizado para catálise, sem maiores tratamentos, o que foi chamado Preparado Enzimático Sólido (PES). Inicialmente o óleo ácido de macaúba foi 99,6% hidrolisado em 6 h de reação utilizando uma preparação enzimática contendo a lipase de mamona. Os ácidos graxos livres foram esterificados usando o PES de R. miehei atingindo 91% em etil-ésteres após 8h de reação, o que mostra que é um processo de baixo custo e promissor.

Apesar de apresentarem diversas vantagens e grande potencial, uma das desvantagens destes sistemas é o pouco controle sobre os coprodutos formados. Desta forma, mais de uma via metabólica do biocatalisador pode estar participando ativamente de alguma reação ou mais de uma classe de enzima pode ser secretada. Outra desvantagem se encontra na dificuldade de retirar impurezas do meio de cultivo dos catalisadores que seriam prejudiciais ao processo, como por exemplo, sais provenientes do meio utilizado para cultivar as células, outras proteínas produzidas pelos organismos ou mesmo, no caso da produção de biodiesel, glicerol que fica aderido no suporte ou na célula íntegra.

2.2.2. Catálise Intracelular

Outra estratégia empregando CCI consiste em utilizar enzimas ou vias metabólicas presentes no interior das células para realizar a catálise internamente¹⁷. Desta maneira, o substrato é internalizado e então as enzimas atuarão em sua transformação. O interior da célula atua como um ambiente de proteção, proporcionando condições favoráveis para a catálise e fazendo da célula um mini-reator. Esta técnica possui diversas vantagens, tais como a capacidade de tolerar concentrações mais altas de solventes orgânicos, uma vez que o micro-ambiente da enzima permanece favorável à catálise, ajudando a conservar a estrutura e aumentar a estabilidade de enzimas. Outra vantagem consiste na possibilidade de haver a regeneração de cofatores necessários para o processo, como NADH e NADPH¹⁵.

Uma desvantagem deste método é que uma vez que a internalização de um ou mais substratos é necessária, a permeabilidade da membrana celular pode se tornar um problema¹⁵. Na verdade, em reações onde há internalização, questões de transferência de massa e de permeabilização da membrana são quase sempre a etapa lenta do processo.

Como a maioria dos substratos é sintética e não possuem mecanismos de transporte, o principal fenômeno de transferência de massa se dá por difusão¹⁸. Baixar a barreira de permeabilidade da membrana externa faz com que as reações ocorram de forma mais rápida, com a permeabilização in vitro da célula.

Técnicas de permeabilização e estudos de resistência a solventes orgânicos são os principais pontos altos dos estudos de expressão intracelular, pois a dificuldade do encontro do substrato com a enzima permanece sendo o principal desafio¹⁵.

Uma das metodologias mais utilizadas de permeabilização celular é a de choque térmico, onde o congelamento e descongelamento da célula gera microporos na membrana. Agentes químicos como tolueno também são utilizados na permeabilização de células. Contudo, estes agentes oferecem pouco controle no processo e não raro promovem lise celular, extravasando o conteúdo e inviabilizando o reuso. Sendo assim, o equilíbrio entre célula integra e permeável é um dos desafios deste modelo¹¹.

Fontanille e Larroche¹⁹, utilizaram a bactéria Pseudomonas rhodesiae para realizar biotransformação intracelular de óxido de α-pineno e produzir isonovalal. Utilizando um sistema bifásico composto de fase aquosa, onde as células íntegras estavam, e uma fase orgânica, que continha o substrato dissolvido em hexadecano, eles alcançaram um rendimento de apenas 30%. Após a permeabilização das células, utilizando Triton X-100 e a metodologia de congelamento e descongelamento, este rendimento foi de 83%. Os autores concluíram que a barreira difusional foi a principal dificuldade na síntese de isonovalal. A presença de solventes no meio facilitou a difusão do substrato e melhorou o desempenho da biotransformação.

A produção de dióis, como 1,2 e 1,3 propanodiol se torna cada vez mais importante devido à utilização destas moléculas como precursores de diversas rotas de síntese de químicos e derivados. Rotas de produção utilizando CCI vêm ganhando mais destaque, principalmente as que utilizam fontes de carbono como o glicerol²⁰. Outras rotas menos utilizadas, através de sulfatases, também possuem seus benefícios, podendo ser interessantes também na eliminação de compostos tóxicos, contendo enxofre. O uso da estratégia de permeabilização foi empregado para aumentar a produção de 1,2 e 1,3 propanodiol a partir de 1,3, propanodiolsulfato cíclico e derivados utilizando a bactéria Bacillus sp. CCZU11-1²¹. Com o tratamento permeabilizante feito com 10% de tolueno durante 1,5 h a 30 °C, foi possível obter uma atividade catalítica de sulfatases 3,5 vezes superior às obtidas sem a etapa de permeabilização com rendimentos na faixa de 97,4%.

Outro exemplo de CCI em bactérias foi o uso de Eschericha coli imobilizada em suportes inertes para catalisar reações redox. Oxidações biocatalíticas comumente necessitam de co-fatores, como NADH, NADPH e FADH2 para serem realizadas. Como estas moléculas não são estáveis e são bastante caras, a CCI se torna uma opção viável²². Uma cepa de E. coli recombinante JM109(DE3)/pDTG141 expressando a enzima naftaleno dioxigenase, que catalisa a oxidação do naftaleno, uma molécula tóxica e insolúvel em água, foi utilizada para produzir (+)-cis-(1R,2S)-1,2-naftaleno dihidrodiol opticamente puro²³. Esta cepa foi testada tanto na forma de células livres quanto imobilizadas em alginato de cálcio, onde conseguiram ser reutilizadas por pelo menos 4 vezes. No entanto, a forma imobilizada apresentou menos atividade, por causa de problemas difusionais do substrato. A permeabilidade limitada da membrana externa de E. coli é um dos principais fatores que podem prejudicar a performance de técnicas CCIs que necessitam de internalização de substrato²⁴. Um dos principais mecanismos de internalização em E. coli é através de porinas, proteínas com domínios transmembranares hidrofóbicos. Suas estruturas α-helicoidais formam trímeros altamente associados, que por sua vez formam canais transportadores não-específicos. Para aumentar a permeabilidade de E. coli, criando novos canais não-específicos, uma viroporina de um coronavírus SARS (SCVE) foi expressa heterologamente em E. coli²⁴. Quando a proteína foi expressa, houve um aumento nas constantes de difusibilidade e de permeabilidade efetivas da célula. Os novos canais artificiais, com cerca de 0,6 nm de raio, aumentaram a taxa de internalização de moléculas pequenas, como N-fenilpentilamina, o que foi traduzido em um aumento na atividade catalítica de anidrase carbônica, onde o Vmáx de reação foi aumentado em 30%, demonstrando que esta estratégia pode ser utilizada em outros sistemas de CCI para aumentar a eficiência de bioconversões.

A técnica de permeabilização também pode ser aplicada a leveduras. Saccharomyces cerevisiae é uma levedura versátil, muito usada na indústria alimentícia e serve como potencial fonte da enzima catalase, importante em reações redox e no tratamento e remoção de H2O2 de rejeitos, provenientes, sobretudo da indústria têxtil²⁵. Uma cepa de S. cerevisiae foi utilizada para estudar a otimização da atividade de catalase utilizando técnicas de planejamento de experimentos²⁵. Para tanto, foram estudadas várias condições visando aumentar a permeabilidade da parede celular. Os principais parâmetros estudados foram a concentração do agente permeabilizante etanol, a temperatura do tratamento de incubação no processo de permeabilização e o tempo de duração deste processo. As condições ótimas de permeabilização obtidas foram de 14,8°C, 53%v/v de etanol e 40 minutos de tratamento. A atividade de catalase foi aumentada em 40 vezes nessas condições, o que indica que a questão difusional era um obstáculo importante na atividade da enzima.

2.2.3. Ancoragem em Superfície

A terceira forma de CCI consiste em se utilizar engenharia de proteínas para expressar a enzima de interesse ancorada à parede celular de micro-organismos. Desta forma, a célula age como um suporte, não participando da reação. Esta técnica é chamada de Ancoragem em Superfície. A Figura 3 mostra um esquema ilustrativo da técnica, onde uma enzima aparece ancorada na parede/membrana celular de um micro-organismo por meio de uma proteína âncora⁹.

Esta técnica torna a enzima mais acessível e o encontro com o substrato mais simples do que na abordagem anterior. Também evita problemas com transferência de massa, ao mesmo tempo em que expressa, purifica e imobiliza o biocatalisador em um único passo²⁶. Além disso, uma estratégia de produção mais tradicional, utilizando fermentação submersa também é favorecido, uma vez que hospedeiros de fácil manipulação genética e cultivo, como E. coli, S. cerevisae e P. pastoris são preferidos. Sendo assim, é possível controlar mais profundamente variáveis de sistema para a produção da enzima, como aeração, temperatura, pH e alimentação. Os meios de cultura também são mais definidos, minimizando a presença de impurezas e coprodutos indesejados em etapas posteriores de uso do catalisador²⁷.

Contudo, existem muitos fatores que afetam o desempenho do biocatalisador, como promotor, tipo da âncora, tamanho da âncora, tamanho da enzima responsável pela catálise, conformação e disponibilidade do sítio ativo e sistema de secreção do hospedeiro. Sendo assim, encontrar um equilíbrio entre estes aspectos é um desafio tecnológico na implementação deste modelo em escalas industriais¹⁴,²⁷.

Figura 3. Ilustração representando a técnica de Ancoragem em Superfície, onde a enzima se encontra ancorada na superfície da célula através de uma proteína de membrana. Estas enzimas então são responsáveis pela conversão do substrato em produto.

O tipo de promotor influirá nos níveis de expressão da quimera. Promotores fortes e induzíveis são mais utilizados, principalmente em E. coli, mas também há relatos de promotores constitutivos sendo usados no processo de expressão. Um promotor forte é capaz de proporcionar grande densidade de âncoras imobilizadas na superfície da célula. Isto pode vir a sobrecarregar o sistema de secreção, que não consegue endereçar corretamente as proteínas na mesma velocidade em que são produzidas e diminuindo a eficiência da expressão heteróloga²⁸.

A conformação final da enzima e a sua interação com a âncora e a superfície do hospedeiro também são importantes na atividade do biocatalisador. No caso de lipases, enzimas com estruturas maiores, estas tendem a interagir mais com a âncora. Interações com o sítio ativo da proteína tendem a modificar a capacidade de catálise de lipases, como foi descrito no trabalho de Sun et al.²⁹. Quando a proteína âncora se encontrava mais próxima do sítio ativo, houve maior efeito estérico e isto afetou a ligação do sítio ativo com o substrato.

O tipo de âncora pode influenciar muito na atividade catalítica. A imobilização pode ser feita utilizando a parte C- terminal da lipase ligada à parte N-terminal da âncora, como mostra a Figura 4a. Desta forma, a âncora se ligará à parede celular por meio de um domínio de glicofosfatidilinositol, ou GPI. Esta ligação âncora-parede celular é covalente e bem resistente. Lipases, por sua vez, comumente apresentam sítios catalíticos próximos a sua porção C- terminal. Esta orientação foi descrita como passível de causar impedimento no sítio ativo, diminuindo a atividade da quimera¹¹,³⁰.

Outra maneira de se imobilizar lipases em CCI é utilizar a porção N-terminal da lipase ligada à porção C-terminal da âncora, como mostra a Figura 4b. Desta forma, a interação âncora-célula não

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