Fixação Biológica de Nitrogênio: características moleculares e simbióticas de bactérias nativas do Semiárido Brasileiro

Dedico este livro à minha mãe,

Cleonice Moura Dias

(Em nossos corações).

A vida é o filme que você vê através dos seus próprios olhos.

Faz pouca diferença o que está acontecendo.

É como você percebe que conta.

DENIS WAITLEY

AGRADECIMENTOS

São muitas as pessoas que fizeram e fazem parte da minha trajetória pessoal e acadêmica. Sou muito grato a Deus pelo dom da vida e por ter me guardado até o presente momento. Por ter colocado tantas pessoas especiais ao meu redor. O seu nome seja hoje e eternamente louvado, amém.

Sou grato à minha família por tudo que tenho e que sou, em especial ao meu Pai Geraldo dos Santos Dias, que sempre fez tudo o que pôde para me ver estudando e crescendo na vida. Minha mãe Cleonice Moura Dias (em nossos corações), minhas irmãs Daiane Moura e Daniele Moura, meus sobrinhos Mateus, Alisson, Arthur e Iasmin. Meu primo e melhor amigo David Filho. Obrigado por sempre me apoiarem, vocês são a minha base.

A alguns dos meus antigos professores da graduação, mestrado e doutorado em Química que, pela dedicação e paixão pelo que fazem me incentivaram pela pesquisa e pela docência.

Agradeço ao Dr. Paulo Ivan Fernandes Junior pela oportunidade de orientação em meu mestrado, pela sua disponibilidade e interesse em nosso trabalho juntos. E a todos os colegas de pesquisa da Embrapa Semiárido.

Aos meus amigos de todas as horas Djanara, Sueny Benevides, Felipe Leonardo, Aparecida Nunes, Aila Suila, Daiane Nascimento, Tailane Ribeiro, Itany Fernandes, Conceição Oliveira, Thiago Felisberto, Daniela, Izabel Pesqueira, Pâmala Bagano, Marcelino Saturnino, Carolina Nascimento, Thalita Costa, Rafael Rodrigues, Weidjamire Galdino, Daniel Alencar e a todos os outros. Vocês são muito importantes para mim, obrigado por me apoiarem e estarem comigo nos momentos alegres e tristes. Cada um de vocês tem um lugar especial dentro do meu coração. Sou feliz por ter vocês!

Ao meu querido Lucas Lira que por sua presença e disposição tornou-se alguém tão especial para mim. Amo ter você!

À minha psicanalista e melhor psicoterapeuta do Vale do São Francisco, Grécia Rejane Nonato de Lima por me acolher em sua clínica e pelo excelente trabalho que tem desenvolvido comigo. Tenho sorte por ter você.

E a todos que direta ou indiretamente contribuíram para o desenvolvimento desse trabalho. Muito obrigado!

APRESENTAÇÃO

Os rizóbios representam um grupo de bactérias fixadoras de nitrogênio (FBN) conhecidas pela sua habilidade em disponibilizar N às leguminosas e favorecer o estabelecimento das plantas. A utilização de estirpes eficientes nesse processo favorece a redução do uso de fertilizantes nitrogenados. Dessa forma, estudos que visem conhecer, identificar, caracterizar e avaliar a diversidade dessas bactérias e os aspectos ligados à sua eficiência simbiótica são de grande importância. Esta obra disserta a respeito de uma pesquisa realizada com o objetivo de avaliar a diversidade e eficiência simbiótica de bactérias oriundas de sete espécies de leguminosas arbóreas nativas da caatinga. Durante a triagem dos isolados, buscou-se priorizar aqueles que apresentavam perfis moleculares de uma bactéria tipicamente diazotrófica. Para a realização deste trabalho, foi realizada primeiramente a certificação da pureza do estoque das bactérias, essa etapa é essencial e reflete em todas as etapas futuras desse tipo de estudo, uma que vez que a presença de impurezas junto às colônias do microrganismo, comprometem a clareza na avaliação dos resultados obtidos. Esse estudo verificou a amplificação de fragmentos de genes simbióticos nifH e nodA e o sequenciamento parcial do gene 16S rRNA das estirpes alvo. Gêneros diazotróficos como Paraburkholderia sp. e Rhizobium sp. foram encontrados e foi verificado uma elevada variabilidade genética, revelando um alto grau de polimorfismo. Também é apresentado um experimento de fixação biológica de nitrogênio feito com algumas bactérias com a espécie Vigna unguiculata (feijão caupi) para determinação do nível de eficiência simbiótica dos isolados bacterianos nesse tipo de planta. Este livro apresenta resultados importantes à respeito do perfil molecular dessas bactérias presentes na caatinga, bem como a respeito do comportamento dessas estirpes na associação com leguminosas, enfatizando a especificidade hospedeira como um fator altamente relevante para o isolamento e escolha de bactérias fixadoras de nitrogênio.

LISTA DE ABREVIATURAS

DNA- Ácido desoxirribonucleico

ADE – Água destilada estéril

AIA – Ácido Indolacético

EPS- Exopolissacarídeos

FBN – Fixação Biológica de Nitrogênio

YMA – Yeast Manintol Agar

PCR- Reação de polimerase em cadeia

mg/g- miligrama por grama

mL- mililitro

mM- milimolar

N - Nitrogênio

RPM- rotações por minuto

µg mL-1- micrograma por mililitro

UV – Ultravioleta

UNIVASF – Universidade Federal do Vale do São Francisco

EMBRAPA – Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária

SUMÁRIO

Capa

Folha de Rosto

Créditos

INTRODUÇÃO

2 - OBJETIVOS DA PESQUISA

2.1 - Objetivo geral

2.2 - Objetivos específicos

3 - BASES TEÓRICAS

3.1 - O Bioma Caatinga e a Região Semiárida

3.2 - Família Fabaceae (Leguminosas arbóreas da Caatinga)

3.3 - Fixação Biológica de Nitrogênio (FBN)

3.4 - Bactérias diazotróficas

3.4.1 - Caracterização Fenotípica de Rizóbios nodulantes de leguminosas

3.4.2 - Caracterização Genotípica de Rizóbios nodulantes de leguminosas

4 - PERCURSO METODOLÓGICO

4.1 - ORIGEM E VIABILIDADE DOS ISOLADOS

4.2 - CARACTERIZAÇÃO GENOTÍPICA DOS ISOLADOS

4.2.1 - Extração do DNA

4.2.2 - Seleção dos isolados por meio da amplificação dos genes simbióticos nifH e nodA

4.2.3 - Identificação dos isolados de Algaroba e Jurema Preta pelo sequenciamento parcial do gene 16S rRNA

4.2.4 - BOX – PCR dos isolados de Jurema Preta

4.3 - TESTE DE EFICIÊNCIA SIMBIÓTICA DE ISOLADOS DE JUREMA-PRETA COM FEIJÃO-CAUPI EM CONDIÇÕES DE CASA DE VEGETAÇÃO

5 - CONSIDERAÇÕES DOS RESULTADOS OBTIDOS

5.1 - Caracterização molecular

5.1.1 - Seleção dos isolados por meio