Atividade antifúngica dos óleos essenciais e principais compostos químicos sobre Cryptococcus neoformans

A Deus

Supremo e causa primária de todas as coisas. Por me permitir viver, ter saúde, ter minha família, meus amigos e por me guiar nessa incrível jornada chamada pós-graduação. A Ele ofereço todas estas linhas, estas páginas, todos os momentos de minha vida. Nunca me desamparou, sempre está comigo, permitindo a realização de mais um sonho.

A minha família

Meus pais, Aurea e Euflordizio (in memoriam), meus irmão Edilson, Sandro e Ezequiel, e minha tia Zoraide. Por todas as orações que intencionam a mim, por todo apoio e torcida. Obrigada Família! Amo muito todos vocês!

A minha orientadora Maria de Fátima Costa Pires

A querida professora, amiga e orientadora Drª Maria de Fátima Costa Pires. Por toda dedicação em todos os momentos de orientação, sempre atenciosa, muito paciente, criteriosa e amiga. Por todas as trocas de experiências, histórias, momentos de descontração, levando a conclusão deste trabalho. Obrigada por ser essa grande Orientadora!

AGRADECIMENTOS

Muitas pessoas contribuíram direta e indiretamente para realização deste trabalho.

Ao Programa de Pós-Graduação da Coordenadoria de Controle de Doenças – Secretaria de Saúde do Estado de São Paulo, por todo suporte, formação e grandes aprendizados e a secretaria Tirces Francine, por toda dedicação, amizade e paciência com todos os alunos da pós!

Ao Fernando Amaral da World’s Naturals Fragrancies (WNF) pelos óleos essenciais.

A Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES pelo apoio financeiro. Bolsa de Mestrado, Doutorado e Pós-doutorado.

Ao Instituto Adolfo Lutz onde a pesquisa foi realizada.

Isolar um constituinte ativo de uma planta é uma afronta à natureza, é como retirar dela a inteligência e deixar para traz a sabedoria .

Deepak Chopra

(Médico endocrinologista, escritor, professor de ayuverda, espiritualidade e medicina corpo-mente).

SUMÁRIO

Capa

Folha de Rosto

Créditos

APRESENTAÇÃO

CAPÍTULO 1 - GÊNERO Cryptococcus

1.1CRYPTOCOCCUS NEOFORMANS

1.1.1 Fatores de virulência

CAPÍTULO 2 - ANTIFÚNGICOS

2.1 ANTIFÚNGICOS SINTÉTICOS

2.2 ANTIFÚNGICOS NATURAIS

CAPÍTULO 3 - ÓLEOS ESSENCIAIS

3.1 ATIVIDADE ANTIMICROBIANA DE ÓLEOS ESSENCIAIS

3.2 METABÓLITOS SECUNDÁRIOS EM PLANTAS

3.2.1 Terpenos

3.2.2 Fenóis

3.3 ESPÉCIES VEGETAIS DE ÓLEOS ESSENCIAIS E COMPOSTOS QUÍMICOS

CAPÍTULO 4 - DESENVOLVIMENTO DA PESQUISA

4.1 AMOSTRAS DE CRYPTOCOCCUS NEOFORMANS

4.2 PESQUISA DE FATORES DE VIRULÊNCIA

4.2.1 Produção de exoenzimas - Proteinase e Fosfolipase

4.2.2 Pesquisa de cápsula

4.3 TENSOATIVOS E SOLVENTE

4.3.1 Pesquisa da interferência dos tensoativos e solventes sobre a cepa padrão de C. neoformans ICB 163 D

4.4 ÓLEOS ESSENCIAIS

4.4.1 Análise cromatográfica

4.4.2 Pesquisa da atividade antifúngica in vitro dos óleos essenciais e compostos químicos sobre C. neoformans

4.5 ANTIFÚNGICO SINTÉTICO - ANFOTERICINA B - ETEST®

4.6 ANÁLISES DOS DADOS

4.7 CONTROLES DE QUALIDADE E BIOSSEGURANÇA

4.8 DESCARTES DOS RESÍDUOS

4.9 CONSIDERAÇÕES ÉTICAS

CAPÍTULO 5 - ATIVIDADE DOS ÓLEOS ESSENCIAIS E COMPOSTOS QUÍMICOS SOBRE C. neoformans

5.1 CRYPTOCOCCUS NEOFORMANS

5.2 FATORES DE VIRULÊNCIA

5.2.1 Produção de exoenzimas - Proteinase e Fosfolipase

5.2.2 Presença de cápsula

5.3 ATIVIDADE DOS TENSOATIVOS E SOLVENTE

5.4 ANÁLISE CROMATOGRÁFICA DOS ÓLEOS ESSENCIAIS

5.4.1 Eucalyptus citriodora Hooker.

5.4.2 Eucalyptus globulus Labill.

5.4.3 Eugenia caryophyllus Sprengel.

5.4.4 Melaleuca alternifolia Cheel.

5.4.5 Thymus vulgaris Lin.

5.5 ATIVIDADE DOS ÓLEOS ESSENCIAIS SOBRE OS ISOLADOS DE C. NEOFORMANS

5.6 ATIVIDADE DOS ÓLEOS ESSENCIAIS SOBRE A PRODUÇÃO DE CÁPSULA

5.7 ATIVIDADE DOS ÓLEOS ESSENCIAIS SOBRE A PRODUÇÃO DE EXOENZIMAS

5.8 ÓLEOS ESSENCIAIS DE EUGENIA CARYOPHYLLUS, THYMUS VULGARIS E PRINCIPAIS COMPOSTOS QUÍMICOS

5.8.1 Atividade dos principais compostos químicos do óleo essencial de E. caryophyllus

5.8.1.1 Atividade da mistura dos compostos químicos eugenol e β- cariofileno do óleo essencial de E. caryophyllus.

5.8.2 Atividade dos principais compostos químicos do óleo essencial de T. vulgaris

5.8.1.2 Atividade da mistura dos principais compostos químicos: carvacrol, linalol, p-cimeno e timol do óleo essencial de T. vulgaris

5.9 ANTIFÚNGICO SINTÉTICO - ANFOTERICINA B - ETEST®

CAPÍTULO 6 - PANORAMA DA ATIVIDADE DE ÓLEOS ESSENCIAIS E COMPOSTOS QUÍMICOS SOBRE C. neoformans

6.1 ATIVIDADE ENZIMÁTICA

6.2 CÁPSULA

6.3 ÓLEOS ESSENCIAIS

6.4 INFLUÊNCIA DOS FATORES ABIÓTICOS NA COMPOSIÇÃO QUÍMICA DOS ÓLEOS ESSENCIAIS

6.5 METODOLOGIAS EMPREGADAS NOS ENSAIOS COM ÓLEOS ESSENCIAIS E PRINCIPAIS COMPOSTOS QUÍMICOS

6.6 TENSOATIVOS E SOLVENTE

6.7 ATIVIDADES DOS ÓLEOS ESSENCIAIS E PRINCIPAIS COMPOSTOS QUÍMICOS

6.7.1 Principais compostos químicos de Eugenia caryophyllus Sprengel

6.7.2 Principais compostos químicos de Thymus vulgaris Linneus

6.8 ANTIFÚNGICO SINTÉTICO - ANFOTERICINA B - ETEST®

CAPÍTULO 7 - CONSIDERAÇÕES FINAIS

APÊNDICES

ANEXOS

Landmarks

Capa

Folha de Rosto

Página de Créditos

Sumário

APRESENTAÇÃO

Cryptococcus neoformans é o agente etiológico da criptococose doença infecciosa cosmopolita que acomete animais e humanos, especialmente imunodeprimidos.

Em meados da década de 1980 com o crescimento do número de pacientes com o HIV (Human Immunodeficiency Virus) observou-se que mais de 80% das infecções criptococócicas na época foram relatadas em pacientes com estas características, com prevalência variando de 2 a 10% nos Estados Unidos, Europa Ocidental e Austrália e 5 a 30% na África¹. Estima-se a mortalidade em 10% nos países desenvolvidos e 43% nos países emergentes². Em países considerados de baixa renda, a mortalidade foi estimada em 70%; 40% em países de renda média, 20 a 30% na Europa e 20% na América do Norte³.

No período entre 1990-2017 foram relatados 6.011 casos de criptococose somente na África⁴. Há uma estimativa de 223.100 casos de meningite criptococócica por ano em pacientes com HIV e contagens de CD4<100 células/µl, resultando em 181.100 mortes⁵. Nas regiões tropicais e subtropicais, com maior ônus da doença, a proporção de mortes relacionadas com o HIV devido ao Cryptococcus, representa cerca de 15%, sendo a segunda causa mais comum de mortalidade relacionada ao HIV em adultos, após a tuberculose ⁴.

A infecção ocorre por inalação das leveduras que se estabelecem no pulmão e pode se disseminar para outros órgãos por via hematogênica, tendo tropismo pelo sistema nervoso central⁶. Entretanto, a criptococose também pode acometer indivíduos não infectados pelo HIV, como transplantados, paciente com outras condições imunossupressoras e pacientes imunocompetentes⁷,⁸. Estima-se que no Brasil a meningite criptococócica ocorra como primeira manifestação oportunista em cerca de 4,4% dos casos de HIV e que a prevalência da criptococose associada ao HIV esteja entre 8% e 12% na região sudeste. Nas regiões norte e nordeste prevalecem os casos de criptococose em indivíduos sem evidência de imunossupressão, causados pela variedade gattii, comportando-se como endemia regional. Nos países desenvolvidos a mortalidade por criptococose seja 10%, chegando a 43% nos países em desenvolvimento⁹.

A anfotericina B, associada ou não a 5-flucitosina é o principal tratamento e entre os fatores de virulência mais estudados estão à produção de cápsula polissacarídica rica em glicoxilomanana e a produção de proteinases e fosfolipases extracelulares¹⁰,¹¹,¹².

Considerando que C. neoformans é um dos principais patógenos em indivíduos imunodeprimidos, que o uso da anfotericina B, associada ou não a 5-flucitosina é o principal tratamento para a criptococose, apesar dos efeitos colaterais, como a nefrotoxicidade serem extremamente graves e que existe a possibilidade da resistência de algumas cepas aos antifúngicos convencionais ¹¹ é relevante contribuir com novas opções terapêuticas, eficazes, seguras, de baixo custo para a população com maior acessibilidade ao produto, no controle de condições mórbidas prevalentes. Estudos apontam as valiosas propriedades terapêuticas de óleos essenciais de plantas sobre as leveduras patogênicas¹³.

Na busca de novas alternativas terapêuticas, eficazes, seguras e de baixo custo avaliou-se nesta pesquisa a atividade in vitro dos óleos essenciais de Eucalyptus citriodora Hooker, Eucalyptus globulus Labill, Eugenia caryophyllus Sprengel, Melaleuca alternifolia Chell e Thymus vulgaris Linneaus e os compostos químicos de Eugenia caryophyllus e Thymus vulgaris sobre C. neoformans.

A avaliação da atividade antifúngica destes óleos essenciais e compostos químicos foi realizada sobre isolados biológicos de origem humana e ambiental. Assim como a pesquisa da presença, redução ou ausência de cápsulas polissacarídicas e a produção das exoenzimas proteinase e fosfolipase, de isolados de C. neoformans, antes e após contato com os óleos essenciais e principais compostos químicos. Também avaliou-se a atividade dos isolados de C. neoformans frente ao antifúngico anfotericina B.

Nas condições desse estudo conclui-se que os óleos essenciais de E. caryophyllus e T. vulgaris, apresentaram atividade fungicida com as menores concentrações inibitórias em relação aos óleos essenciais de E. citriodora, E. globulus e M. alternifoia e cada composto químico sobre os isolados biológicos.

Quanto à produção de proteinase e fosfolipase todos os isolados eram fortemente produtores das exoenzimas e após exposição aos óleos essenciais e compostos químicos todos tornaram-se não produtores. Quanto a presença de cápsulas todos os isolados apresentavam cápsula e após contato com o óleo essencial e compostos químicos, ocorreu redução ou ausência da mesma, bem como as células de leveduras tenderam a se agrupar em número de 2, 4 ou mais células.

1 Colombo G, Aparo CV, Araújo Júnior EC, Makatu MY, Santos FS, Marinho M. Caracterização bioquímica e molecular de Cryptococcus spp. isolados de excretas ambientais de pombos (Columba livia domestica). Arquivo Brasileiro de Medicina Veterinária e Zootecnia. 2015; 67(6): 1639-1645. https://doi.org/10.1590/1678-4162-7753

2 Hurtado JC, Castillo P, Fernandes F, Navarro M, Liane L, Casa I, et al. Mortality due to Cryptococcus neoformans and Cryptococcus gattii in low-income settings: an autopsy study. Scientific reports. 2019; 9(1): 7493 https://doi.org/10.1038/s41598-019-43941-w

3 Mourad A, Perfect JR. Present and Future Therapy of Cryptococcus. Infections. Journal of fungi. 2019; 4(3): 79. https://doi.org/10.3390/jof4030079

4 Ashton PM, Thanh LT, Trieu PH, Van Anh D, Trinh NM, Beardsley J, et al. Three phylogenetic groups have driven the recente population expansion of Cryptococcus neoformans. Nature Communications. 2019; 10: 2035. https://doi.org/10.1038/s41467-019-10092-5

5 Rajasingham R, Smith RM, Park JB, Jarvis JN, Govender NP, Chiller TM, Denning DW, Loyse A, Boulware DR. Global burden of disease of HIV-associated cryptococcal meningitis: An updated analysis. Lancet Infect. Dis. 2017; 17(8):873-81. https://doi.org/10.1016/S1473-3099(17)30243-8

6 Kronstad JW, Attarian R, Cadieux B, Choi J, D’Souza CA, Griffiths EJ, et al. Expanding fungal pathogenesis: Cryptococcus breaks out of the opportunistic box. Nature