Matria de Microbiologia

Fotografias colorizadas de bactrias observadas ao microscpio eletrnico. Da esquerda para a direita: Bacillus anthracis, Escherichia coli, Neisseria gonorrhoeae

2008

Introduo Microbiologia Introduo

Microbiologia: Mikros (= pequeno) + Bio (= vida) + logos (= cincia) A Microbiologia era definida, at recentemente, como a rea da cincia que dedica-se ao estudo dos microrganismos, um vasto e diverso grupo de organismos unicelulares de dimenses reduzidas, que podem ser

encontrados como clulas isoladas ou agrupados em diferentes arranjos (cadeias ou massas), sendo que as clulas, mesmo estando associadas, exibiriam um carter fisiolgico independente. Assim, com base neste conceito, a microbiologia envolve o estudo de organismos procariotos (bactrias, archaeas), eucariotos inferiores (algas, protozorios, fungos) e tambm os vrus.

Bactrias

Archaea

Fungos

Vrus

Algas Protozorios

Tipos estudados (Adaptado de Tortora et al., Microbiology, 8 ed)

de pelos

microrganismos microbiologistas.

Esta rea do conhecimento teve seu incio com os relatos de Robert Hooke e Antony van Leeuwenhoek, que desenvolveram microscpios que possibilitaram as primeiras observaes de bactrias e outros

microrganismos, alm de diversos espcimes biolgicos. Embora van Leeuwenhoek seja considerado o "pai" da microbiologia, os relatos de Hooke, descrevendo a estrutura de um bolor, foram publicados

anteriormente aos de Leeuwenhoek. Assim, embora Leeuwnhoek tenha fornecido importantes informaes sobre a morfologia bacteriana, estes dois pesquisadores devem ser considerados como pioneiros nesta cincia. Recentemente foi publicado um artigo discutindo a importncia de Robert Hooke para o desenvolvimento da Microbiologia.

Esquema do microscpio construdo por Robert Hooke e um esquema de um fungo observado por este pesquisador. (Adaptado de Tortora et al., Microbiology - 8 ed)

Rplica do microscpio construdo por Leeuwenhoek e de suas ilustraes, descrevendo os "animlculos" observados. (Adaptado do livro Brock Biology of Microorganisms, 10 Ed., 2003)

Classificao dos seres vivos

De acordo com a definio tradicional da microbiologia, esta uma cincia que at recentemente, era responsvel pelo estudo de organismos classificados em trs reinos distintos: Monera, Protista e Fungi. No entanto, a partir dos estudos de Carl Woese, a microbiologia passou a estar relacionada a trs domnios de seres vivos. Sistemas de classificao dos seres vivos: Linnaeus (sc. XVIII): reinos Animal e Vegetal Haeckel (1866): introduo do reino Protista Whittaker (1969): 5 reinos, dividos principalmente pelas

caractersticas morflogicas e fisiolgicas: Monera: Procariotos Protista: Eucariotos unicelulares - Protozorios (sem parede celular) e Algas (com parede celular) Fungi: Eucariotos aclorofilados Plantae: Vegetais Animalia: Animais

Classificao dos seres vivos, de acordo com Whittaker (1969) (Adaptado de Pommerville, J.C.(2004) Alcamo's Fundamentals of Microbiology)

No entanto, a partir dos estudos de C. Woese (1977), passamos a dispor de um sistema de classificao baseado principalmente em aspectos evolutivos (filogentica), a partir da comparao das sequncias de rRNA de diferentes organismos. Com esta nova proposta de classificao, os organismos so agora subdividos em 3 domnios (contendo os 5 reinos), empregando-se dados associados ao carter evolutivo. Archaea: Procariotos Bacteria: Procariotos Eukarya: Eucariotos

Classificao dos seres vivos, de acordo com Woese (1977) (Adaptado de Pommerville, J.C.(2004) Alcamo's Fundamentals of Microbiology)

A princpio, acredita-se que estes 3 domnios divergiram a partir de um ancestral comum. Provavelmente os microrganismos eucariticos atuaram como ancestrais dos organismos multicelulares, enquanto as bactrias e archaeas correspondem a ramos que no evoluram alm do estgio microbiano. Archaea: encontrados so organismos procariotos que, so freqentemente bastante so

em

ambientes

cujas

condies

extremas

(semelhantes s condies ambientais primordiais na Terra), sendo por isso, muitas vezes considerados como sendo ancestrais das bactrias. No entanto, hoje em dia considera-se as archaeas como um grupo

intermedirio entre procariotos e eucariotos. Muitos destes organismos so anaerbios, vivendo em locais

"inabitveis" para os padres humanos - fontes termais (com temperaturas acima de 100C), guas com elevadssimos teores de sal (at 5M de NaCl limite de dissoluo do NaCl), em solos e guas extremamente cidos ou alcalinos (espcies que vivem em pH 0, outras em pH 10) e muitas so metanognicas.

Genericamente, podemos dizer que as Archaeas definem os limites da tolerncia biolgica s condies ambientais. Bacteria: anteriormente Corresponde classificados a um enorme grupo de procariotos, pelos

como

eubactrias,

representadas

organismos patognicos ao homem, e bactrias encontradas nas guas, solos, ambientes em geral.

Dentre estas, temos as bactrias fotossintetizantes (cianobactrias) e outras quimiossintetizantes (E. coli), enquanto outras utilizam apenas substratos inorgnicos para seu desenvolvimento. Eukarya: No mbito microbiolgico, compreende as algas, protozorios e fungos (alm das plantas e animais).

As algas caracterizam-se por apresentarem clorofila (alm de outros pigmentos), sendo encontradas basicamente nos solos e guas. Os protozorios correspondem a clulas eucariticas, apigmentados, geralmente mveis e sem parede celular, nutrindo-se por ingesto e podendo ser saprfitas ou parasitas.

Os fungos so tambm clulas sem clorofila, apresentando parede celular, realizando metabolismo heterotrfico, nutrindo-se por absoro. Como mencionado anteriormente, os vrus so tambm assunto abordado em microbiologia, embora, formalmente, no exibam as

caractersticas celulares, no sentido de no apresentarem metabolismo prprio, de conterem apenas um tipo de cido nuclico, etc.

A Microbiologia na atualidade
A definio clssica de "microbiologia" mostra-se bastante imprecisa, e at mesmo inadequada, frente aos dados da literatura publicados nesta ltima dcada. Como exemplo pode-se citar duas premissas que j no podem mais ser consideradas como verdade absoluta na conceituao desta rea de conhecimento: as dimenses dos microrganismos e a natureza independente destes seres.

Em 1985 foi descoberto um organismo, denominado Epulopiscium fischelsoni que, a partir de 1991, foi definido como sendo o maior procarioto j descrito, exibindo cerca de 500 m de comprimento. Esta bactria foi

isolada do intestino de um peixe marinho (Surgeonfish, peixe barbeiro ou cirurgio), encontrado nas guas da Austrlia e do Mar Vermelho. Alm de apresentar dimenses nunca vistas, tal bactria mostra-se totalmente diferente das demais quanto ao processo de diviso celular, que ao invs de ser por fisso binria, envolve um provvel tipo de reproduo vivparo, levando formao de pequenos glbulos, que correspondem s clulas filhas.

Comparao entre o tamanho de uma clula de Epulopiscium e 4 paramcios (Adaptado do livro Brock Biology of Microorganisms, 10 Ed., 2003)

Mais recentemente, em 1999, outro relato descreve o isolamento de uma bactria ainda maior, isolada na costa da Nambia. Esta, denominada Thiomargarita namibiensis, pode ser visualizada a olho n, atingindo at cerca de 0,8 mm de comprimento e 0,1 a 0,3 mm de largura.

Microscopia de luz polarizada, os

revelando

grnulos de enxfre no interior da

bactria Thiomargarita

namibiensis.

Comparao entre a bactria

Thiomargarita namibiensis e uma Drosophila.

(Adaptado

de

Schulz, H. N. et al. (1999). Science, autor,

284:493-495 Clique no

caso deseje ler o artigo original)

Como

analisar

questo

do

tamanho

dos

microrganismos?
Durante muito tempo se acreditava que o tamanho das bactrias era imposto pelo seu prprio metabolismo, ou seja, se a bactria aumentasse muito em tamanho, ela seria incapaz de se manter vivel e morreria. Tal fato decorre da seguinte deduo: A rea superficial da membrana citoplasmtica seria o fator limitante para a eficincia das trocas com o meio externo. Sabendo-se que a rea de uma esfera calculada pela frmula que o volume de uma esfera obtido pela frmula e

, a medida que a

rea aumenta, seu volume aumenta muito mais rapidamente. Assim, se uma bactria comeasse a crescer, aumentando sua rea, a proporo

rea/volume diminuiria. Isto faria com que a clula passasse a apresentar um volume muito grande, sendo que sua rea superficial seria insuficiente, em termos de trocas atravs da membrana, para manter sua viabilidade. A partir dos isolados de bactrias gigantes, o conceito da limitao de tamanho bacteriano vem sendo abandonado, pois no h mais como questionar a existncia e viabilidade destas bactrias e, possivelmente, novos relatos sero incorporados, deixando de ser meras curiosidades.

Uma das explicaes mais provveis para tal fato reside na existncia de grandes mesossomos nestes tipos bacterianos, refutando assim a hiptese de que tais estruturas seriam meros artefatos de microscopia. Novos estudos vm sendo realizados, os quais esto trazendo informaes sobre outras estratgias desenvolvidas pelos microrganismos para que sobrevivam, quando apresentam dimenses extremamente maiores que os microrganismos "convencionais".

Microrganismos atuando como seres multicelulares

Outro aspecto que vem sendo demonstrado refere-se ao carter multicelular das bactrias. Embora estas exibam a capacidade de

sobreviver como uma clula nica, realizando os processos metablicos necessrios sua perpetuao, quando as bactrias encontram-se

associadas, formando colnias, ou biofilmes (estruturas rgidas, adesivas, de natureza geralmente polissacardica, que encontram-se fortemente

ancoradas s superfcies, criando um ambiente protegido que possibilita o crescimento microbiano), estas passam a se comportar de forma social, exibindo diviso de tarefas e alterando seu perfil fisiolgico de forma a apresentar uma cooperao que reflete-se em diferentes nveis metablicos. Sabe-se que muitos genes de virulncia so expressos somente quando a densidade populacional atinge um determinado ponto. Da mesma forma, a capacidade de captar DNA do meio externo, a bioluminescncia, etc, envolvem a percepo da densidade populacional por parte das bactrias. Este tipo de mecanismo de comunicao denominado sensor de quorum (quorum sensing) e vem sendo amplamente estudado nas mais diferentes reas da Microbiologia, uma vez que foi descrito tanto para bactrias como para fungos.

Estudos com bactrias primitivas

Ainda em relao s novas pesquisas desenvolvidas na rea de Microbiologia, temos o cultivo de bactrias pr-histricas, visando a busca de compostos com atividade antimicrobiana ou de interesse comercial. Neste sentido, empresas foram criadas (Ambergene), especializadas na

reativao de formas bacterianas latentes, isoladas de insetos preservados em mbar. Os resultados obtidos revelam a reativao de mais de 1200 espcies bacterianas, apresentando de 2 a at 135 milhes de anos. Em 2000, foi publicado um relato descrevendo o isolamento e cultivo de uma espcie bacteriana a partir do lquido contido em um cristal de sal de 250 milhes de anos. Os estudos de seqenciamento do DNA que codifica o RNA ribossomal 16S indicam que o organismo pertence ao gnero Bacillus, uma bactria em forma de bastonete, Gram positiva, com a capacidade de formar endsporos. At o momento, esta corresponde espcie bacteriana mais antiga.

Inseto retirada a

de

onde

foi

bactria

(provavelmente Bacillus), de 135 milhes de anos

Aspecto crescidas em

das meio

colnias slido

(Adaptado de Cano et al., (1995) Science, 268:1060-1064)

A questo da vida em marte

Em 1997, foram publicados relatos de expedies da NASA a Marte, sugerindo a presena de possveis microrganismos (nanobactrias) em espcimes minerais, sendo que achados semelhantes foram tambm detectados em partculas de meteoritos de Marte, que atingiram a Terra. A favor desta hiptese h o achado de microrganismos que decompem minerais, frequentemente isolados das profundezas marinhas (A cerca de 1,5 km abaixo do solo). Os meteoritos apresentam carbono, fsforo, nitrognio, alm da presena de gua. J em relao s condies ambientais de Marte (muito frio), temos como contra-argumento o isolamento de Archaea a partir de ambientes absolutamente inspitos, inicialmente comsiderados como

inadequados vida. De acordo com alguns pesquisadores, no absurdo considerar que a vida surgiu em Marte, pois estudos com o meteorito Nakhla, que caiu em 1911 no Egito, com aparentemente de 1,3 bilhes de anos, revelam a presena de elementos cocides, potenciais fsseis bacterianos, variando de 0,25 a 2,0 m de tamanho, o que seria correspondente ao tamanho mdio

atual das bactrias. Curiosamente, estas formas ovais apresentam um teor maior de carbono no seu interior que nas reas ao seu redor. Alm disso, exibem tambm um elevado teor de xido de ferro, um composto comum em clulas fossilizadas. Recentemente, a NASA enviou outra sonda para Marte e os dados recebidos reforam cada vez mais a idia da existncia anterior de vida em Marte, devido aos achados da possvel ocorrncia de gua naquele planeta.

Comparao entre possveis "microrganismos" presentes em rochas de Marte e microrganismos que compem a placa dental ho homem. (Adaptado de An Electronic Companion to Beginning Microbiology)

Assim, com base nestes novos achados e principalmente com estudos envolvendo as Archaea, a microbiologia vem levantando uma srie de questes quanto fisiologia e o metabolismo celular, alm de questionar permanentemente os limites das condies de vida.

Ubiqidade dos microrganismos

Os microrganismos so os menores seres vivos existentes,

encontrando-se em uma vasta diversidade de ambientes e desempenhando importantes papis na natureza. Este grupo caracteriza-se por ser

completamente heterogneo, tendo com nica caracterstica comum o pequeno tamanho dos organismos. Acredita-se que cerca de metade da biomassa do planeta seja constituda pelos microrganismos, sendo os 50% restantes distribudos entre plantas (35%) e animais (15%). Em termos de habitat, os microrganismos so encontrados em quase todos os ambientes, tanto na superfcie, como no mar e subsolo. Desta forma, podemos isolar microrganismos de fontes termais, com temperaturas atingindo at 130C (clique aqui para ler o relato do isolamento de um procarioto cujo mximo de temperatura de crescimento foi definido como 130C); de regies polares, com temperaturas inferiores a -10C; de

ambientes extremamente cidos (pH=1) ou bsicos (pH=13). Alguns sobrevivem em ambientes extremamente pobres em nutrientes,

assemelhando-se gua destilada. H ainda aqueles encontrados no interior de rochas na Antrtida. Em termos metablicos, temos tambm os mais variados tipos, desde aqueles com vias metablicas semelhantes a de eucariotos superiores, at outros que so capazes de produzir cido sulfrico, ou aqueles capazes de degradar compostos pouco usuais como cnfora, herbicidas, petrleo, etc. Uma vez que os microrganismos precederam o homem em bilhes de anos, pode-se dizer que ns evolumos em seu mundo e eles em nosso. Desta forma, no de se estranhar que a associao homem-microrganismo mostra-se com grande complexidade, com os microrganismos habitando nosso organismo, em locais tais como a pele, intestinos, cavidade oral, nariz, ouvidos e trato genitourinrio. Embora a grande maioria destes microrganismos no causem qualquer dano, compondo a denominada microbiota normal, algumas vezes estes podem originar uma srie de doenas, com maior ou menor gravidade. Nesta classe de organismos esto aqueles denominados patognicos e potencialmente patognicos. Sabe-se que em cerca de 1013 clulas de um ser humano podem ser encontradas, em mdia, cerca de 1014 clulas bacterianas. No homem, estas se encontram em vrias superfcies, especialmente na cavidade oral e trato intestinal.

Principais funes dos microrganismos na natureza

Alm de seu importante papel como componentes da microbiota residente de animais e plantas, em nosso dia a dia convivemos com os mais diversos produtos microbiolgicos naturais tais como: vinho, cerveja, queijo, picles, vinagre, antibiticos, pes, etc. Paralelamente, no pode ser deixada de lado a importncia dos processos biotecnolgicos, envolvendo

engenharia gentica, que permitem a criao de novos microrganismos, com as mais diversas capacidades metablicas. Os microrganismos desempenham tambm um importante papel nos processos geoqumicos, tais como o ciclo do carbono e do nitrognio, sendo genericamente importantes nos processos de decomposio de substratos e sua reciclagem. Dentre os compostos utilizados como substrato temos, alguns de grande importncia atualmente: DDT, outros pesticidas, cnfora, etc. O carbono encontra-se na atmosfera primariamente como CO2, sendo utilizado pelos organismos fotossintetizantes, para sua nutrio.

Virtualmente, a energia para o desenvolvimento da vida na Terra derivada, em ltima anlise, a partir da luz solar. Esta captada pelas plantas e microrganismos fotossintetizantes (algas e bactrias), que convertem o CO2 em compostos orgnicos, atravs da reao: CO2 + H2O => (CH2O)n + O2 Os herbvoros alimentam-se de plantas e os carnvoros alimentam-se dos herbvoros. O CO2 atmosfrico torna-se disponvel para a utilizao na fotossntese origina-se de duas fontes biolgicas principais: 1) 5 a 10% a partir de processos de respirao e 2) 90 a 95% oriundos da degradao

(decomposio ou mineralizao) microbiana de compostos orgnicos. Em termos de ciclo global, h um balano entre o consumo de CO2 na fotossntese e sua produo atravs da mineralizao e respirao. Este balano, no entanto, vem sendo fortemente alterado por atividades humanas, tais como a queima de combustveis fsseis, promovendo um aumento da qualntidade de CO2 atmosfrico, resultando no conhecido efeito estufa.

celulose

existente

nas

plantas,

embora

seja

um

substrato

extremamente abundante na Terra, no utilizvel pela vasta maioria dos animais. Por outro lado, vrios microrganismos, incluindo fungos, bactrias e protozorios a utilizam, muitos como fonte de no carbono trato e energia. de Destes vrios

microrganismos,

encontram-se

intestinal

herbvoros e nos cupins. Muitos compostos txicos podem ser degradados por microrganismos, dentre eles, policlorados, DDT, pesticidas.

Outra abordagem que tem se mostrado de grande valia para o homem refere-se introduo de genes bacterianos em outros organismos (ditos transgnicos), tais como plantas. Assim, est em franco desenvolvimento a obteno de plantas transgnicas resistentes a pesticidas ou ao ataque de insetos.

Microrganismos

como

agentes

de

doenas

Os microrganismos, eventualmente provocam doenas no homem, outros animais e plantas. Apesar dos enormes avanos em relao ao tratamento de doenas infecciosas, estas vm se tornando novamente um tema preocupante, em virtude do crescente surgimento de linhagens bacterianas cada vez mais resistentes s drogas. Atualmente, a Organizao Mundial da Sade vem demonstrando crescente interesse nas doenas emergentes e reemergentes, de origem infecciosa. Abaixo apresentamos um quadro cronolgico que deixa clara tais preocupaes, em relao ao nmero de mortes provocadas por doenas infecciosas.

(Adaptado do livro Brock Biology of Microorganisms, 10 Ed., 2003)

Importncia da Microbiologia
uma rea da Biologia que tem grande importncia seja como cincia bsica ou aplicada.

Bsica: estudos fisiolgicos, bioqumicos e moleculares (modelo comparativo para seres superiores). => Microbiologia Molecular

Aplicada: processos industriais, controle de doenas, de pragas, produo de alimentos, etc. reas de estudo: Odontologia: Estudo de microrganismos associados placa dental, crie dental e doenas periodontais. Estudos com abordagem preventiva. Medicina hospitalares. Nutrio: Doenas transmitidas por alimentos, Controle de e Enfermagem: Doenas infecciosas e infeces

qualidade de alimentos, Produo de alimentos (queijos, bebidas). Biologia: Aspectos bsicos e biotecnolgicos. Produo de

antibiticos, hormnios (insulina, GH), enzimas (lipases, celulases), insumos (cidos, lcool), Despoluio (Herbicidas - Pseudomonas, Petrleo), Bio-filme (Acinetobacter), etc. BIOTECNOLOGIA Uso de microrganismos com finalidades

industriais, como agentes de biodegradao, de limpeza ambiental, etc.

Um breve histrico da importncia da microbiologia

Efeitos Talvez um dos das aspectos mais doenas negligenciados nas quando se civilizaes estuda a

microbiologia refere-se s profundas mudanas que ocorreram no curso das

civilizaes,

decorrentes

das

doenas

infecciosas.

De forma geral, as doenas provocavam um abatimento fsico e moral da populao e das tropas, muitas vezes influenciando no desenrolar e no resultado de um conflito. A prpria mobilizao de tropas, resultando em uma aglomerao, muitas vezes longa, de soldados, em ambientes onde as condies de higiene e de alimentao eram geralmente inadequadas, tambm colaborava na disseminao de doenas infecciosas, para as quais nnao exisitam recursos teraputicos. Paralelamente, em reas urbanas em franca expanso, os problemas mencionados acima eram tambm de grande importncia, pois rapidamente as cidades cresciam, sendo que as instalaes sanitrias geralmente eram completamente precrias. Com a prtica do comrcio entre as diferentes naes emergentes, passou a haver a disseminao dos organismos para outras populaes, muitas vezes susceptveis a aqueles agentes infecciosos.

Abaixo listaremos, brevemente, um pequeno histrico com alguns exemplos dos efeitos das doenas microbianas no desenvolvimento de diferentes civilizaes. O declnio do Imprio Romano, com Justiniano (565 AC), foi acelerado por epidemias de peste bubnica e varola. Muitos habitantes de Roma foram mortos, deixando a cidade com menos poder para suportar os ataques dos brbaros, que terminaram por destruir o Imprio.

Durante a Idade Mdia varias novas epidemias se sucederam, sendo algumas amplamente disseminadas pelos diferentes continentes e outras mais localizadas. Dentre as principais molstias pode-se citar: Tifo, varola, sfilis, clera e peste. Em 1346, a populao da Europa, Norte da frica e Oriente Mdio era de cerca de 100 milhes de habitantes. Nesta poca houve uma grande epidemia da peste, que disseminou-se atravs da rota da seda (a principal

rota mercante para a China), provocando um grande nmero de mortes na sia e posteriormente espalhando-se pela Europa, onde resultou em um total de cerca de 25 milhes de pessoas, em poucos anos.

Novas epidemias da peste ocorreram nos sculos XVI e XVII, sendo que no sculo XVIII (entre 1720 e 1722), uma ltima grande epidemia ocorreu na Frana, matando cerca de 60% da populao de Marselha, de Toulon,. 44% em Arles, 30% em Aix e Avignon. A epidemia mais recente de peste originou-se na China, em 1892, disseminando-se pela ndia, atingindo Bombaim em 1896, sendo

responsvel pela morte de cerca de 6 milhes de indivduos, somente na ndia. Antes da II Guerra Mundial, o resultado das guerras era definido pelas armas, estratgias e pestilncia, sendo esta ltima decisiva. Em 1566, Maximiliano II da Alemanha reuniu um exrcito de 80.000 homens para enfrentar o Sulto Soliman da Hungria. Devido a uma epidemia de tifo, o exrcito alemo foi profundamente dizimado, sendo necessria a disperso dos sobrevivente, impedindo assim a expulso das hordes de tribos orientais da Europa nesta poca. Na guerra dos 30 anos (1618-1648), onde protestantes se revoltaram contra a opresso dos catlicos, alm do desgaste decorrente da longa durao do confronto, as doenas foram determinantes no resultado final. Na poca de Napoleo, em 1812, seu exrcito foi quase que completamente dizimado por tifo, disenteria e pneumonia, durante campanha de retirada de Moscou. No ano seguinte, Napoleo havia recrutado um exrcito de 500.000 jovens soldados, que foram reduzidos a 170.000, sendo cerca de 105.000 mortes decorrentes das batalhas e 220.000 decorrentes de doenas infecciosas. Em 1892, outra epidemia de peste bubnica, na China e ndia, foi responsvel pela morte de 6 milhes de pessoas.

At a dcada de 30, este era quadro, quando Alexander Fleming, incidentalmente, descobriu um composto produzido por um fungo do gnero

Penicillium,

que

eliminava

bactrias

do

gnero

Staphylococcus,

um

organismo que pode produzir uma vasta gama de doenas no homem. este composto - denominado penicilina - teve um papel fundamental na desfecho da II Guerra Mundial, uma vez que passou a ser administrado s tropas aliadas, enquanto o exrcito alemo continuava a sofrer pesadas baixas no campo de batalha. Alm destas epidemias, vale ressaltar a importncia das diferentes epidemias de gripe que assolaram o mundo e que continuam a manifestarse de forma bastante intensa at hoje. Temos ainda o problema mundial envolvendo a AIDS, o retorno da tuberculose (17 milhes de casos no Brasil) e do aumento progressivo que vrios dos nveis de de resistncia vm aos agentes

antimicrobianos atualmente.

grupos

bactrias

apresentando

Morfologia e ultraestrutura bacterianas (Parte 1) Morfologia: Tamanho, forma e arranjos bacterianos

As bactrias so extremamente variveis quanto ao tamanho e formas que apresentam. At recentemente acreditava-se que as menores bactrias apresentavam cerca de 0,3 relatos de clulas m (ex: Mycoplasma), entretanto, j existem denominadas nanobactrias ou

menores,

ultramicrobactrias, com tamanhos variando de 0,2 a 0,05

m de dimetro,

sendo algumas inclusive j cultivadas em laboratrio. H ainda controvrsias quanto a este grupo, pois vrios autores acreditam ser meros artefatos. Muitas bactrias medem de 2 a 6 m de comprimento, por 1 a 2 m de

largura, mas certamente estes valores no podem ser definidos como absolutos, pois eventualmente encontramos bactrias de at 500 ou 800 m, como no caso de Epulopiscium ou Thiomargarita.

Em relao s formas, a maioria das bactrias estudadas seguem um padro menos varivel, embora existam vrios tipos morfolgicos distintos. De maneira geral, as bactrias podem ser agrupadas em trs tipos morfolgicos

gerais:

cocos,

bacilos

espiralados.

Os cocos correspondem a clulas arredondadas, podem se dividir sem um plano de orientao definido, o que leva a um grande nmero de arranjos diferentes. Assim temos os cocos isolados, (cubos diplococos contendo 8 (Neisseria, clulas),

pneumococos),

tetracocos,

sarcinas

estreptococos (cocos em cadeia) e estafilococos (cocos formando massas irregulares).

Microscopia ptica, corada pelo mtodo de Gram, de cocos formando cadeias, um arranjo

denominado estreptococos.

Microscopia eletrnica de varredura das clulas

apresentadas acima.

Microscopia ptica, corada pelo mtodo de Gram, de cocos em um arranjo denominado

estafilococos.

Microscopia varredura

eletrnica

de

das

clulas

apresentadas acima.

Os

bacilos

tm

forma

de

bastonetes,

podendo

apresentar

extremidades retas (Bacillus anthracis), arredondadas (Salmonella, E. coli), ou ainda afiladas (Fusobacterium). Como seu plano de diviso fixo, ocorrendo sempre no menor eixo, os bacilos exibem uma menor variedade de arranjos, sendo via de regra encontrados isolados, como diplobacilos ou ainda como estreptobacilos. H ainda um arranjo, denominado em paliada, tambm denominado letras chinesas, que tpico do gnero Corynebacterium. Tal tipo de arranjo ocorre porque a parede celular desses organismos dupla e no momento da diviso celular ocorre a ruptura de apenas uma das camadas, deixando as clulas unidas pela camada de parede que no se rompeu. Os bacilos podem ainda apresentar-se como pequenas vrgulas (Vibrio cholerae) ou em forma de meia lua

(Selenomonas).

Microscopia

ptica,

corada

pelo mtodo de Gram, de bacilos arranjados dois a dois (diplobacilos).

Microscopia transmisso, de

eletrnica um bacilo

de em

processo de diviso celular.

Espiralados: Sua nomenclatura bastante controvertida ainda. Um tipo de classificao divide os espiralados em dois grupos, osespiroquetas, que apresentam uma forma de espiral flexvel, possuindo flagelos

periplasmticos. O outro grupo so os espirilos, que exibem geralmente morfologia de espiral incompleta e rgidos.

Geralmente os espiralados so microrganismos bastante afilados, de difcil observao por microscopia de campo claro, sendo muitas vezes analisados

por meio da microscopia de campo escuro, ou de tcnicas de colorao empregando a impregnao por sais de prata.

Microscopia

ptica

de

fluorescncia, de um organismo espiralado.

Microscopia

ptica,

utilizando um procedimento de impregano com sais de prata, revelando a bactria causadora da sfilis, Treponema pallidum (observe os grandes neutrfilos prximos s bactrias)

Micrografias eletrnicas colorizadas de diferentes bactrias. No sentido horrio: Enterococcus (cocos ovalados), Francisella (bacilos pequenos, com a regio central abaulada), Fusobacterium (longos bacilos, geralmente com extremidades mais afiladas) e Neisseria gonorrhoeae (diplococos em forma de rins). (Fotos obtidas de sites da internet)

ainda

formas

intermedirias

como

os

cocobacilos;

formas

pleomrficas (quando o microrganismo no tem uma morfologia padro), tal como Mycoplasma; ou ainda formas de involuo, originadas quando o meio encontra-se desfavorvel ao desenvolvimento. Nesses casos, como o organismo deixa de realizar os processos metablicos (nutrio e diviso celular) H adequadamente, bactrias este sofre alteraes tais morfolgicas. como extenses

tambm

apresentando

apndices,

celulares na forma de longos tubos ou hastes (prostecas) (Rhodomicrobium vannielii). Alm destas bactrias, estudos vm revelando a ocorrncia de bactrias com formas bastante peculiares, tais como clulas estreladas ou retangulares.

bactria bactria retangular (Adaptado de Tortora et al., Microbiologia, 1998) com

com

morfologia

morfologia semelhante a uma estrela

Bactria pedunculada (Adaptado de Madigan et al., Brock Biology of Microorganisms, 2003)

Ultraestrutra Bacteriana
A ultraestrutura bacteriana comeou a ser estudada em maiores detalhes nas dcadas de 50 e 60, a partir do melhoramento das tcnicas de microscopia eletrnica. Os procedimentos adotados incluam a lise celular, seguida de centrifugao para promover a separao dos vrios

componentes subcelulares, que podiam agora ser purificados e analisados bioquimicamente.

Parede Celular - Estrutura presente na maioria das bactrias conhecidas, exceto em micoplasmas e algumas Archaea, que no a possuem.

Corresponde a uma das estruturas mais importantes nas clulas bacterianas, estando localizada na poro mais externa, acima da membrana

citoplasmtica. Devido sua grande rigidez, a parede celular responsvel pela manuteno da forma do microrganismo. Como o ambiente intracelular bastante concentrado em relao ao meio externo, (variando de 2 a at 10 atm), a parede atua como uma barreira fsica rgida, que mantm a forma celular, impedindo que a clula estoure em decorrncia do grande turgor. Alm disso, a parede celular atua como uma barreira de proteo contra determinados agentes fsicos e qumicos externos, tais como o choque osmtico. A parede pode ainda desempenhar importante papel em

microrganismos patognicos, em decorrncia de presena de componentes que favorecem sua patogenicidade, tais como antgenos ou molculas envolvidas no reconhecimento celular. Em 1884, Christian Gram desenvolveu um mtodo de colorao de bactrias que permitia sua separao em dois grupos distintos, as Gram positivas (que coravam-se em roxo) e as Gram negativas (que coravam-se em vermelho). A partir do advento da microscopia eletrnica e do aperfeioamento das tcnicas de anlise bioqumica dos diferentes

componentes celulares, foi verificado que esta diferena entre as bactrias Gram positivas e Gram negativas era, provavelmente, devida s diferenas de composio e estrutura das paredes celulares.

Assim, quando observadas sob microscopia eletrnica de transmisso, as bactrias Gram positivas apresentam uma parede celular espessa (de 20 a 80 nm), de aspecto homogneo, enquanto as clulas Gram negativas exibem uma parede mais delgada (de 9 a 20 nm) e de aspecto bastante complexo, aparentemente apresentando mais de uma camada. A

microscopia eletrnica de varredura revelou outras diferenas entre estes dois grupos de organismos. As Gram positivas exibiam a superfcie mais lisa e homognea, enquanto as Gram negativas apresentavam-se com maior complexidade superficial.

Aspecto das paredes celulares de organismos Gram positivos e negativos (Adaptado de Madigan et al., Brock Biology of Microorganisms, 2003)

Composio da parede celular

Peptideoglicano (murena ou mucopeptdeo): Composto

exclusivamente encontrado no domnio Bacteria, sendo o responsvel pela rigidez da parede celular. O peptideoglicano corresponde a um enorme polmero complexo que, em bactrias Gram positivas pode formar at 20 camadas, enquanto em clulas Gram negativas est presente, formando apenas uma ou duas camadas. O peptideoglicano corresponde a um esqueleto, formado por dois derivados de acares, a N-acetilglicosamina (NAG) e o cido N-

acetilmurmico (NAM), unidos alternadamente, atravs de ligaes do tipo -1,4. O grupo carboxil de cada molcula de NAM liga-se a um

tetrapeptdeo, composto por aminocidos que alternam-se nas configuraes L e D. Destes aminocidos, o D-glutamato, D-alanina e o cido mesodiaminopimlico no so encontrados em qualquer outra protena conhecida. Acredita-se que sua presena confira maior resistncia da parede contra a maioria das peptidases.

Assim, em cada resduo de NAM h um tetrapeptdeo associado. A enorme rigidez da da parede celular resultante das ligaes entre os tetrapeptdeos de cadeias adjacentes. Neste aspecto, h uma grande diferena entre as bactrias Gram positivas e negativas. Nas bactrias Gram negativas (AlaGlu-DAP-Ala), a ligao entre os tetrapepdeos direta, ocorrendo entre o grupamento amino do DAP subterminal (posio 3) e o grupamento carboxi da D-Ala terminal (posio 4). J nas Gram positivas (Ala-Glu-Lys-Ala), a ligao indireta, sendo mediada por uma ponte interpeptdica de natureza varivel (cinco glicinas em S. aureus). A anlise das figuras abaixo deixa clara a grande estruturao do peptdeoglicano, em virtude das inmeras ligaes cruzadas existentes ao longo da molcula. Assim, devido a esta complexa estruturao fsica, o peptideoglicano confere rigidez parede, embora exiba certo grau de elasticidade e tambm porosidade.

peptideoglicano positivas

de

clulas

Gram

peptideoglicano negativas

de

clulas

Gram

Nas bactrias Gram positivas, cerca de 90% da parede celular composta pelo peptdeoglicano, que geralmente forma cerca de 20 camadas. O restante da parede composto essencialmente por cido teicico. Nas bactrias Gram negativas, apenas cerca de 10% da parede corresponde ao peptideoglicano, existindo geralmente como uma camada nica ou dupla. Os demais componentes da parede celular de bactrias Gram negativas sero analisados posteriormente.

Esquema ilustrando o espesso peptideoglicano de bactrias Gram positivas (Adaptado de Madigan et al., Brock Biology of Microorganisms, 2003)

cidos Teicicos: Juntamente com peptideoglicano, os cidos teicicos compem a parede celular das bactrias Gram positivas. Estes compostos, presentes em grandes quantidades, correspondem a polmeros de glicerol ou ribitol ligados a acares ou aminocidos e conectados entre si por meio de grupamentos Os cidos teicicos associam-se ao peptideoglicano pela fosfato. ligao do

grupamento 6 hidroxil do cido N-acetilmurmico, podendo alternativamente associar-se aos lipdeos da membrana citoplasmtica, quando passam a ser denominados de cidos lipoteicicos. Devido sua carga negativa, os cidos teicicos contribuem com o carter negativo da superfcie celular de Gram positivas. Seu papel fisiolgico ainda desconhecido, mas especula-se que estes possam participar nos processos de passagem de ons pela parede, ou ligar-se a prtons, mantendo um pH celular relativamente baixo.

Em casos de escassez de fosfato, os cidos teicicos podem ser substitudos por cidos teicurnicos, deixando assim os fosfatos livres para comporem ATP ou DNA, por exemplo.

Frmula de um cido teicico, contendo ribitol

(Adaptado de Madigan et al., Brock Biology of Microorganisms, 2003)

O componente adicional da Parede Celular de Gram negativos

Membrana Externa: Esta, embora denominada "membrana"externa um componente da parede celular, presente apenas nas bactrias Gram negativas. A membrana externa corresponde a uma segunda bicamada lipdica (semelhante membrana plasmtica), localizada acima do

peptideoglicano, contendo fosfolipdeos, lipoprotenas, protenas e tambm lipopolissacardeos. Quando comparada membrana citoplasmtica, a membrana externa exibe maior permeabilidade a pequenas molculas, tais como glicose ou outros monossacardeos.

Sua face interna geralmente rica em pequenas lipoprotenas (7,2 kDa), denominadas lipoprotenas de Braun, que ligam-se covalentemente ao peptideoglicano, ancorando firmemente a membrana externa camada de peptideoglicano. Estudos indicam que a membrana externa e a membrana citoplasmtica mantm contato em algumas discretas regies celulares, denominadas stios de adeso. Acredita-se que estas regies de juno podem conferir maior

rigidez parede celular das bactria Gram negativas, alm de fixar melhor a membrana externa, no deixando-a frouxa, associada somente ao

peptideoglicano. Os stio de adeso foram tambm denominados junes de Bayer e acredita-se que possam ser importantes locais de passagem de compostos citoplasmticos, seja componentes envolvidos na sntese da membrana externa ou diferentes nutrientes.

Esquema da parede celular de organismos Gram negativos

(Adaptado de Madigan et al., Brock Biology of Microorganisms, 2003)

A face externa da membrana externa rica em lipopolissacardeos (LPS), inexistentes na membrana citoplasmtica. Estes componentes so tambm denominados de endotoxina, uma vez que provocam febre, choque e eventualmente morte, quando injetados em animais. O LPS uma molcula complexa, composta por 3 regies distintas: lipdeo A,

polissacardeo central e cadeia polissacardica lateral O, ou Antgeno O.

Esquema do lipopolissacardeo, encontrado na face externa da membrana externa

(Adaptado de Madigan et al., Brock Biology of Microorganisms, 2003)

O lipdeo A corresponde poro mais interna da molcula, ancorando o LPS poro hidrofbica da membrana externa. Este componente corresponde poro txica do LPS e geralmente composto por cido esterico, palmtico, mirstico, lurico ou caprico. Estes cidos graxos esto ligados a um dissacardeo de NAcGlicosamina-P. A poro polissacardica localiza-se acima do lipdeo A, em direo ao exterior, sendo composta por duas regies, o polissacardeo central e polissacardeo O, que mais externo, de natureza repetitiva. Em Salmonella, o cerne composto por 10 acares pouco usuais. Conectado ao cerne, h o Ag O, que geralmente composto por 3 a 5 acares bastante peculiares e variveis. A natureza destes acares pode ser modificada pelos microrganismos, resultando em um mecanismo de evaso do sistema imune. O LPS tambm confere carga nagativa superfcie celular.

O LPS se associa a protenas, formando a face externa da unidade de membrana. A membrana externa apresenta um grupo especializado de protenas, denominadas genericamente de porinas, que atuam como canais para a passagem de pequenas molculas hidroflicas, participando assim do processo de nutrio. As porinas podem ser especficas, contendo stios de ligao para 1 ou mais substratos, ou inespecficas, compondo canais aquosos. A maioria das porinas correspondem a protenas transmembrnicas, com 3 subunidades idnticas, que formam orifcios de cerca de 1 nm, sendo que, aparentemente, possuem mecanismos para a abertura e fechamento. Para algumas substncias, a membrana externa mais restritiva.

Compostos que afetam a Integridade da Parede Celular

Ao da Lisozima na PC: Esta enzima, sintetizada por alguns organismos e por glndulas endcrinas do homem, age clivando as ligaes do tipo -1,4, presentes no peptideoglicano. Nas clulas Gram positivas, o tratamento com lisozima origina protoplastos (clulas sem parede celular), enquanto nas

Gram negativas, a lisozima origina esferoplastos (clulas com resqucios de parede celular).

Ao da penicilina na PC: Este antibitico impede a ligao dos tetrapeptdeos. A droga se liga irreversivelmente s PBPs, que so protenas envolvidas no processo de biossntese do peptideoglicano. Paralelamente, as autolisinas, que atuam em conjunto com a maquinaria de biossntese, passam a degradar pores do peptideoglicano. Como a sntese est bloqueada, o resultado lquido a formao de uma parede defeituosa.

Camada

Algumas bactrias e vrias Archaea apresentam uma camada de natureza protica ou glicoprotica estruturada (como um piso de tacos), denominada camada S. Esta camada, as bactrias, encontra-se acima da parede celular e at o momento, suas funes no se encontram totalmente esclarecidas. Acredita-se que esta camada proteja a clula contra flutuaes osmticas, de pH e ons, alm de auxiliar na manuteno da rigidez da parede. Alguns autores especulam que a camada S pode mediar a ligao dos orgnaismos a superfcies.

Microscopia eletrnica de uma clula contendo a camada S.

(Adaptado de Prescott et al., 2002)

Morfologia e ultraestrutura bacterianas (Parte 2)

Cpsula, Glicoclix e camada limosa - A cpsula pode ser

definida como uma como camada um externa parede celular, geralmente associado apresentando-se material viscoso, fortemente

superfcie celular, geralmente de natureza polissacardica e raramente protica. Por outro lado, o termo camada limosa algumas vezes definido como uma uma zona difusa, contendo material pouco organizado, sendo facilmente removida.

A presena da cpsula normalmente confere vantagens s bactrias, pois suas principais funes incluem: ligao s clulas do hospedeiro, fator de virulncia por dificultar a fagocitose e tambm a proteo, seja aumentando a resistncia ao dessecamento, uma vez que armazena grandes quantidades de gua, fonte de nutrientes e proteo contra a infeco por bacterifagos, ou interao com anticorpos.

Em odontologia, a presena da cpsula pode ser considerada como um importante fator de virulncia para o principal agente cariognico - S. mutans, que sintetiza um cpsula composta por um homopolissacardeo denominado glucano (produto da degradao da sacarose em glicose e frutose). Tal polmero adere-se firmemente parede celular do

microrganismo e permite sua aderncia ao esmalte, favorecendo sua colonizao. Outros microrganismos apresentam cpsula de natureza heteropolimrica S. pneumoniae. Eventualmente, a cpsula pode ser de natureza

polipeptdica, como em B. anthracis (cido glutmico, na forma D).

Micrografia ptica, empregando a tcnica revelando de colorao clulas

Micrografia

eletrnica a a

de delgada clula

negativa, transmisso, capsuladas. cpsula

revelando circudando

(Adaptado de Tortora et al., Microbiologia, 1998)

(Adaptado de "An eletctronic companion to microbiology")

Fmbrias e Pili - Muitas bactrias Gram negativas apresentam

apndices finos (3 a 10 nm), retos e curtos, denominados fmbrias. Geralmente estas so bastante numerosas, podendo atingir nmeros de 1000 ou mais por clula. Como so muito pequenas e delgadas, somente podem ser visualizadas pela microscopia eletrnica. As fmbrias s o de natureza protica, compostas por subunidades repetitivas de uma protena denominada genericamente de pilina. As fmbrias possuem, geralmente em sua extremidade, e algumas vezes ao longo da estrutura, protenas distintas, denominadas adesinas, as quais mediam a adeso especfica da clula bacteriana a diferentes substratos.

Micrografia varredura fmbrias de

eletrnica bacilos

de Esquema ilustrando a organizao estrutural de uma fmbria, assinalando a presena de molculas do tipo adesina, situadas na extremidade da estrutura

apresentando

(Adaptado de An Electronic Companion to Microbiology)

Muitas

bactrias

podem

ainda

apresentar

outro

tipo

de

apndice,

denominado pilus F ou fmbria sexual, o qual exibe semlhanas estruturais com as fmbrias. No entanto, este tipo de fmbra normalmente encontrado em um menor nmero nas clulas, variando de 1 a 10. O pilus F corresponde a uma estrutura bastante longa e menos rgida que as fmbrias convencionais, estando envolvido no reconhecimento de outras bactrias, em um processo de transferncia de genes denominado conjugao.

Micrografia

eletrnica

colorizada,

revelando

longa

fmbria

sexual

(pilus

F).

Observar tambm a presena de fmbrias.

Atualmente,

diferentes

tipos

diferentes

de

fmbrias vm

sendo

descritos, sendo vrios destes associados adeso, ou virulncia. Bactrias Gram positivas podem, muitas vezes, apresentar estruturas fibrilares (diferentes de fmbrias) em sua superfcie, provavelmente tambm

envolvidas

nos

processos

de

adeso

substratos.

Flagelos - Estruturas longas, delgadas e relativamente rgidas,

apresentando cerca de 20 nm de espessura e 15 a 20 responsveis pela locomoo das bactrias. m de comprimento, sua pequena Devido

espessura, os flagelos somente podem ser visualizados por meio de coloraes especficas, microscopia de campo escuro, ou por icroscopia eletrnica. De acordo com o nmero e distribuio dos flagelos, as bactrias podem ser classificadas como: atrquias (sem flagelos), monotrquias (um nico flagelo), anfitrquias (um flagelo em cada extremidade) , lofotrquias (um tufo de flagelos em uma, ou ambas as extremidades) e peritrquias (apresentando flagelos ao longo de todo o corpo bacteriano).

Bactria
(Adaptado de Atlas, 1997 Microbiology)

monotrquia Bactria
Principles

anfitrquia

of (Adaptado de Tortora et al., 1998 - Microbiology)

Bactria
(Adaptado de Tortora et Microbiology)

lofotrquia
al., 1998 -

Bactria
(Adaptado de Atlas, 1997 Microbiology)

lofotrquia
Principles of

Bactria
(Adaptado de Tortora et Microbiology)

peritrquia Bactria
al., 1998

peritrquia

- (Adaptado de Tortora et al., 1998 - Microbiology)

Estrutura - Estruturalmente, o flagelo pode ser subdivido em 3 regies: filamento, corpo basal e gancho, sendo estas duas ltimas importantes para a insero e movimento do filamento. O filamento dos flagelos apresenta estrutura helicoidal, com comprimento de onda constante para cada espcie. Este corresponde a um cilindro longo e oco, composto por unidades repetitivas de uma protena denominada genericamente de flagelina, que pode variar de 30 a 60 kDa, dependendo do microrganismo. Sua extremidade distal revestida por uma protena seladora. Algumas bactrias apresentam bainhas de diferentes naturezas revestindo o filamento, tal como em Vibrio cholerae, ou Bdellovibrio. O gancho apresenta maior espessura que o filamento, sendo composto por diferentes subunidades proticas. O corpo basal corresponde poro mais complexa do flagelo, apresentando 4 anis ligados a um basto central em bactrias Gram negativas, enquanto em Gram positivas so observados apenas 2 anis. Os anis externos L e P associam-se ao LPS e peptidioglicano, respectivamente, enquanto os anis S e M esto associados membrana citoplasmtica.

Esquema

da

estrutura

dos

flagelos

bacterianos,

em

clulas

Gram

negativas

esquerda)

Gram

positivas

direita)

(Adaptado de Prescott et al., Microbiology, 2000)

Detalhe

ampliado

da

estrutura

de

um

flagelo

de

clulas

Gram

negativas

(Adaptado de Madigan et al., Brock Biology of Microorganisms, 2003)

Sntese flagelar - Muitos genes esto envolvidos na sntese do flagelo e na mobilidade celular. Em E. coli e Salmonella foram identificados mais de 40 genes (fla), que codificam protenas estruturais, de exportao de

componentes para o exterior e de regulao de muitos eventos bioqumicos envolvidos na sntese de novos flagelos. A sntese de flagelos fortemente regulada, tanto por fatores metablicos como por sinais emitidos durante a diviso celular. Acredita-se que as subunidades de flagelina sejam

transportadas ao longo do filamento e se autoarranjam espontaneamente, quando atingem a ponta.

Movimentao - A movimentao dos flagelos ocorre atravs de um mecanismo de rotao do filamento, em velocidades que podem atingir at 270 ou 1100 rps, o que permite uma locomoo de at 100 m/segundo,

correspondendo a 100 vezes o seu comprimento/minuto. Os flagelos atuariam de maneira anloga a propulsores de um barco, sendo o sentido da rotao importante para o tipo de movimentao resultante. Em muitas clulas monotrquias, a rotao no sentido anti-horrio promove a

movimentao para frente, enquanto a rotao no sentido horrio faz com que a clula se locomova no sentido oposto.

Em outras monotrquias, quando o flagelo gira no sentido horrio promove a locomoo.

Tipos

de

movimentao

de

clulas

monotrquias

(Adaptado de Madigan et al., Brock Biology of Microorganisms, 2003)

No caso de bactrias peritrquias, quando os flagelos giram no sentido antihorrio as clulas se movem para frente. Estes dobram seus ganchos e seus filamentos se agrupam, formando um feixe, que gira e propele a clula. Quando a rotao ocorre no sentido horrio, os flagelos se separam e a bactria passa a vibrar somente, at que os flagelos voltem a girar no sentido anti-horrio, impulsionando novamente a clula para frente.

Para que haja a movimentao, o basto localizado entre o gancho e o anel M tem a capacidade de rodar livremente na membrana citoplasmtica. Acredita-se que o anel S esteja fixo na parede celular, sem a possibilidade de rodar. Os anis P e L sustentariam o basto. H evidncias que o corpo basal atuaria como uma estrutura passiva que giraria no interior de um complexo proteco inserido na membrana, semelhante a um rotor de um motor eltrico, que gira no centro de um anel de eletromagnetos (estator). A energia necessria para a rotao provida pela fora prton motiva. A dissipao do gradiente de prtons cria uma fora que gira o flagelo no sentido anti-horrio, impelindo o microrganismo. O rotor seria composto pelo basto central, pelo anel M e por um anel C, ligado ao M atravs da membrana citoplasmtica. Estes anis so formados por vrias protenas, sendo a FliG bastante importante. No estator, temos as protenas MotA e

MotB, que formam um canal de prtons, sendo que MotB tambm ancora o complexo ao peptideoglicano.

Esquema

ilustrando

movimentao

de

bactrias

peritrquias

(Adaptado de Tortora et al., 1998 - Microbiology)

Flagelos periplasmticos - Estes flagelos so encontrados apenas nos espiroquetas (sendo muitas vezes denominados de filamentos axiais). Como o prrpio nome indica, estes flagelos situam-se no periplasma, localizandose abaixo da membrana externa destas bactrias. Os flagelos

periplasmticos originam-se a partir dos polos celulares, voltando-se em direo ao centro da clula, envolvendo a membrana citoplasmtica do corpo bacteriano.

Micrografia Micrografia eletrnica flagelos colorizada, revelando os

eletrnica

revelando

flagelo

periplasmtico, situado abaixo da membrana externa (Adaptado de An Electronic Companion to Microbiology)

periplasmticos

(amarelo)

(Adaptado de Tortora et al., 1998 Microbiology)

Movimentao

por

meio

de

deslizamento

Muitos procariotos so mveis, apesar de no possurem flagelos. Estas bactrias so capazes de se movimentar sobre superfcies slidas, por um processo denominado deslizamento. A motilidade por deslizamento apresentada por vrios membros de Bacteria, sendo, no entanto, estudada somente em alguns poucos grupos. O movimento deslizante

consideravelmente mais lento 10

m/seg para algumas bactrias, quando

comparado s velocidades atingidas pelo movimento flagelar mas, da mesma forma, permite a locomoo das bactrias em seus habitats. Mecanismos da Motilidade Por Deslizamento

Embora at o momento nenhum mecanismo de deslizamento tenha sido comprovado, existem alguns modelos definindo o processo, alm de evidncias sugerindo a existncia de mais de um tipo de mecanismo. Em cianobactrias, medida que as clulas deslizam, secretam um

polissacardeo limoso em sua superfcie externa. Aparentemente, este polissacardeo estabelece o contato entre a superfcie celular e a superfcie slida, contra a qual a clula desliza. medida que o polissacardeo limoso excretado se adere superfcie, a clula gradativamente puxada. Esta hiptese sustentada pela observao de poros excretores de compostos limosos na superfcie de vrias cianobactrias filamentosas. Em Flavobacterium johnsoniae, provavelmente o mecanismo de

deslizamento envolve a movimentao de protenas na superfcie celular. De acordo com este modelo, protenas especficas de motilidade, ancoradas nas membranas citoplasmtica e externa, parecem propelir a clula para frente por um mecanismo de cremalheira contnua. Ao que parece, o movimento das protenas da membrana citoplasmtica promovido pela liberao de energia oriunda da fora prton motiva que, de alguma maneira, transmite esta energia s protenas da membrana externa, localizadas ao longo de uma pista de corrida na superfcie celular. Acredita-se que o movimento

das protenas da pista de corrida contra uma superfcie slida, literalmente empurre a clula para frente. Assim como as outras formas de motilidade, o deslizamento apresenta grande relevncia ecolgica. Este movimento permite que a clula explore novos recursos, ou interaja com outras clulas, de maneira benfica.

Esquema proposto para a movimentao deslizante de Flavobacterium

(Adaptado de Madigan et al., Brock Biology of Microorganisms, 2003)

Morfologia e ultraestrutura bacterianas (Parte 3)

Periplasma (gel periplasmtico) - Corresponde a um espao situado entre a membrana externa e membrana citoplasmtica, encontrado em clulas Gram negativas. Embora questionveis, relatos espordicos descrevem a existncia de um espao observado entre o peptideoglicano e a membrana citoplasmtica de organismos Gram positivos. O periplasma apresenta consistncia de gel, provavelmente devido ao grande nmero de protenas presentes nesta regio. Em virtude disto, este "espao" passou a ser denominado gel

periplasmtico. O periplasma pode atingir de 1 a cerca de 70 nm de espessura, correspondendo a at 40% do volume total da clula. Em Gram negativas, tem grande importncia, pois vrias enzimas e outras protenas esto localizadas, incluindo hidrolases, protenas de ligao envolvidas no transporte e quimiorreceptores. Bactrias quimiolitotrficas e denitrifcantes apresentam muitas vezes protenas transportadoras de eltrons no periplasma, outras apresentam enzimas envolvidas na sntese de peptideoglicano. A presena do periplasma bactrias Gram positivas ainda motivo de controvrsias, devido ao enorme potencial secretor que este grupo apresenta. Membrana Citoplasmtica - Estrutura delgada, com cerca de 8 nm, composta por uma bicamada fosfolipdica (podendo apresentar 7 tipos de fosfolipdeos diferentes), entremeada de protenas (cerca de 200 tipos distintos), atuando como importante barreira osmtica, altamente seletiva. Normalmente, as membranas de organismos procariotos apresentam maiores concentraes de protenas que as membranas eucariticas, tendo em vista a ausncia de organelas citoplasmticas nas bactrias. A bicamada fosfolipdica composta por glicerol ligado a duas cadeias de cidos graxos, atravs de ligaes do tipo ster, com protenas entremeadas. Tanto as protenas como os fosfolipdeos podem mover-se lateralmente ao longo da membrana. Esta estabilizada principalmente por interaes hidrofbicas e por pontes de H. Paralelamente, os ons Ca+2 e Mg+2 tambm participam, interagindo ionicamente com as cargas negativas dos fosfolipdeos. Via de regra, os fosfolipdeos bacterianos contm cidos graxos com cadeias no ramificadas de 16 a 18 tomos de carbono. Esta composio pode ser varivel, de acordo com as condies ambientais. Assim, quando cultivadas em temperaturas baixas, h um aumento da proporo de cidos graxos insaturados, aumentando consequentemente a fluidez da membrana. Por outro lado, aumetando o grau de saturao, as cadeias tornam-se mais rgidas, pois as molculas tm maior capacidade de associao.

Esquema

da

membrana

citoplasmtica

bacteriana

(Adaptado de Madigan et al., Brock Biology of Microorganisms, 2003) Via de regra, exceto no caso dos micoplasma (bactrias desprovidas de parede celular), micoplasmas, as membranas procariticas no apresentam esteris, como observado em eucariotos. Entretanto, muitas bactrias apresentam molculas pentacclicas, semelhantes a esteris, denominadas hopanides, talvez conferindo maior rigidez membrana. A presena de esteris na membrana citplasmtica de micoplasmas pode ser justificada pela ausncia da parece celular, neste grupo de organismos.

Similaridade estrutural entre os esteris (a), colesterol (b) e hopanides (c) (Adaptado de Madigan et al., Brock Biology of Microorganisms, 2003)

Mesossomos - correpondem a extensas invaginaes da membrana citoplasmtica, em forma de vesculas, lamelas ou tbulos. Geralmente so encontrados com maior abundncia em Gram positivos, mas tambm presentes em Gram negativos. At hoje, sua existncia e funes so ainda debatidas pelos pesquisadores. Diversas funes tm sido atribudas aos mesossomos, tais como a participao na segregao dos cromossomos durante a diviso, papel respiratrio, papel na esporulao, ou at mesmo como sendo um mero artefato decorrente dos procedimentos utilizados para a preparao microscpica dos espcimes. A partir do acahado de extensos mesossomos em bactrias de grandes dimenses, acredita-se que sua principal funo seja de aumentar a superfcie da membrana, aumentando assim o contedo enzimtico das clulas. Matriz Citoplasmtica - composta por cerca de 70% de gua, alm dos demais compostos celulares, tais como o DNA, incluses e plasmdeos. Caracteristicamente, o

citoplasma celular apresenta um grande concentrao de ribossomos e protenas, tais como protenas atuando como um sistema de citoesqueleto. Nucleide e plasmdeos- Os procariotos so organismoshaplides, geralmente apresentando apenas 1 nico cromossomo no envolto por carioteca. Eventualmente, algumas bactrias podem apresentar 2 ou 3 cromossomos. O cromossomo bacteriano normalmente cirucular e encontra-se bastante enovelado, em uma regio celular denominada nucleide. Em bactrias, o cromossomo no apresenta-se associado a histonas, sendo estabilizado por outras protenas de natureza bsica. Geralmente o DNA cromossomal corresponde a uma molcula bastante grande, podendo ser 1000 vezes maior que a prpria clula. Em E. coli, o DNA possui cerca de 4,7 Mb, exibindo aproximadamente 1 mm de comprimento, quando linearizado.

(Adaptado Microbiology)

de

An

Electronic

Companion

to

Vrias

bactrias

apresentam

tambm

molculas

de

DNA

extracromossomal,

denominadas plasmdeos, as quais so geralmente circulares, contendo muitas vezes genes que conferem caractersticas adaptativas vantajosas ao microrganismo. Seu nmero e dimenses so bastante variveis. Corpsculos de incluso - So grnulos de armazenagem, de diferentes naturezas, sendo geralmente utilizados como fonte de material de reserva ou energia, muitas vezes insolveis. Estes podem apresentar-se sem qualquer envoltrio ou envoltos por uma nica camada lipdica delgada (diferente de uma membrana), ou por protenas. Dentre os compostos orgnicos armazenados temos o glicognio, o amido e poliidroxibutirato. J dentre os inorgnicos temos polifosfatos (volutina ou metacromticos) e enxofre.

Grnulos de poliidroxibutirato (Adaptado de Madigan et al., Brock Biology of Microorganisms, 2003)

Os magnetossomos so partculas intracelulares de magnetita (Fe3O4), que originam um dipolo magntico na clula, que pode responder aos campos geomagnticos. Estes foram descritos em algumas bactrias aquticas e algas. Outras bactrias aquticas apresentam vesculas de gs, que conferem mobilidade nas diferentes camadas de gua. So estruturas em forma de fuso, ocas, compostas por protenas, tendo tamanhos variveis (30 - 300 nm de dimetro e at 1000 nm de comprimento). Consistem de um orifcio oco envolto por uma membrana (armao) protica extremamente delgada (2 nm). Nesta membrana encontram-se por 2 tipos de protenas que originam uma estrutura rgida, impermevel agua e permevel a gases. A protena predominante tem cerca de 7.5 kDa, contendo 50% de resduos de aminocidos hidrofbicos (Ala, Val, Leu, Ile), provavelmente voltados para o interior da partcula, evitando a entrada de gua.

Clulas apresentando magnetossomos em seu interior (corpsculos negros enfileirados)

(Adaptado de Prescott et al., Microbiology, 2000)

Preparao de magnetossomos
(Adaptado de Prescott et al., Microbiology, 2000)

Esquema de uma vescula de ar, indicando como as protenas que a formam se associam Bactrias se movendo em direo a um campo magntico
(Adaptado de Prescott et al., Microbiology, 2000) (Adaptado de Madigan et al., Brock Biology of Microorganisms, 2003)

Domnio Archaea
Consideraes Gerais Por volta da dcada de 70, vrios organismos procariticos foram isolados a partir de uma srie de ambientes considerados extremamente inspitos, quase que incompatveis com a presena de seres vivos. Estes ambientes naturais caracterizavam-se por apresentar temperaturas bastante elevadas (prximas a 100C), extrema acidez (pH prximo a 2), altas salinidades (cerca de 10 a 15%) e, muitas vezes, ausncia completa de oxignio. Como vrias destas caractersticas correspondiam s possveis condies encontradas na Terra primitiva, os pesquisadores acreditavam que os organismos procariticos presentes nestes ambientes deveriam corresponder a clulas primitivas, talvez "fsseis vivos", representando as formas de vida ancestrais das bactrias modernas. Por esta razo, estes organismos foram denominados "arqueobactrias". No entanto, a partir dos trabalhos de Carl Woese e colaboradores (h cerca de 25 anos), realizando estudos comparativos de sequncias de DNA que codificavam rRNA (16S e 23S) de diferentes organismos, foram definidos 3 grandes domnios compreendendo todos os seres vivos. Assim, de acordo com a proposta de Woese, os seres vivos poderiam ser agrupados em trs grandes domnios: Bacteria (anteriormente denominadas eubactrias), Archaea (as "arqueobactrias") e Eucarya (Eucariotos). Estes trs domnios teriam derivado de um hipottico ancestral comum de todas as clulas. A anlise da rvore filogentica apresentada abaixo, revela como a denominao "arqueobactrias" inadequada e quo obsoleta a idia de que as "arqueobactrias" seriam

os ancestrais das bactrias atuais, pois estes organismos no correspondem aos ancestrais da bactrias atualmente conhecidas.

rvore filogentica universal, apresentando os trs domnios da vida (Adaptado de Madigan et al., 2003 - Brock Biology of Microorganisms)

Esta rvore revela claramente que as "arqueobactrias" no correspondem aos ancestrais das bactrias atuais, visto que sua possvel origem ocorre quase que concomitantemente origem das bactrias mais primitivas. Outro aspecto que a rvore permite deduzir o fato das "arqueobactrias" ocuparem uma posio intermediria entre os domnios Bacteria e Eucarya, sugerindo que estas correspondem a um grupo de organismos diferentes de bactrias e de clulas eucariticas. De fato, estudos genticos e fisiolgicos posteriormente revelaram que tais organismos apresentam caractersticas de bactrias, de eucariotos, alm de caractersticas exclusivas, no encontradas em qualquer outro domnio. Por esta razo, deixaram de ser denominadas "arqueobactrias", recebendo a denominao archaea. Uma questo ainda no elucidada refere-se ao porqu de encontrar-se um grande variedade de archaea extremfilas, habitanto ambientes de altas temperaturas, salinidade, ou extremos de pH. Por outro lado, o acmulo de conhecimentos sobre este grupo vem mostrando que as archaea podem ser encontradas nos mais diversos ecossistemas, desde ambientes aquticos frios, sistema digestrio do homem e outros animais, em tecidos vegetais. Certamente no absurdo cogitar que no futuro sejam descobertas archaea patognicas ao homem ou outros seres vivos.

As caractersticas apresentadas por alguns dos membros deste domnio parecem refletir as condies primitivas da Terra, quando tal domnio comeou a evoluir como um ramo filogenticio distinto. Ao que parece, vrias archaea conservaram mais do que as eubactrias estas caractersticas fisiolgicas primitivas, o que seria responsvel pela distribuio atual no planeta. Assim, as archaea compreendem um grupo heterogneo de microrganismos que podem ser caracterizados, em sua maioria, como habitantes de ambientes inspitos, geralmente crescendo em condies consideradas at ento como extremas e limtrofes para a vida. Classificao das Archaea Atualmente, considera-se que este domnio apresente trs filos: Crenarchaeota, Euryarchaeota e Korarchaeota.

rvore filogentica do domnio Archaea (Adaptado de Madigan et al., 2003 - Brock Biology of Microorganisms)

O filo Crenarchaeota, separa-se muito prximo da raiz da rvore universal, sendo composto por organismos hipertermfilos (Thermoproteus, Pyrolobus e Pyrodictium), compreendendo os organismos capazes de crescer nas maiores temperaturas conhecidas. Estes hipertermfilos so, em sua maioria, quimiolitotrficos autotrficos, sendo ento classificados como produtores primrios. Neste grupo h tambm organismos isolados (mas ainda no cultivados em laboratrio) de ambientes frios, tais como guas ocenicas.

Lagoa

quente,

rica

em

enxofre, que convertido a cido sulfrico, por espcies de archaea.

Sulfolobus, exemplo de uma archaea do filo Crenarchaeota, habitante da lagoa ilustrada acima.

(Adaptado de Madigan et al., 2003 - Brock Biology of Microorganisms)

O filo Euryarchaeota um grupo fisiologicamente diverso, sendo composto por dois grupos: 1) as archaea metanognicas, que so anaerbias, (Methanococcus, Methanobacterium e Methanosarcina), encontradas em ambientes de condies extremas, e 2) as haloflicas extremas, que so aerbias (Halobacterium, Halococcus). As metanognicas compreendem os organismos mais anaerbios conhecidos, ou seja, o oxignio mesmo em concentraes baixssimas, exerce um efeito extremamente letal sobre estes organismos. Neste filo h ainda o gnero Thermoplasma, composto por bactrias acidfilas, termoflicas, que no apresentam parede celular. As haloflicas geralmente coram-se como Gram negativas, no apresentam esporos e, em sua maioria, so imveis, geralmente apresentando grandes plasmdeos, contendo cerca de 25 a 30% do DNA da clula. Dentre as metanognicas, encontra-se o gnero Methanopyrus, que cresce em temperaturas de at 110C.

Lago hipersalino no Egito, rico em carbonato de sdio. O pH destas guas encontra-se na faixa de 10, sendo habitado extremas, por tais archaea como

halfilas

Halobacterium salinarum. A colorao vermelha decorrente da presena de pigmentos carotenides, presentes nestes organismos.

Pilha de refugo da minerao de Thermoplasma, uma archaea desprovida de parede celular. carvo, que muitas vezes sofre autocombusto. Hbitat da archaea Thermoplasma. (Adaptado de Madigan et al., 2003 - Brock Biology of Microorganisms)

O filo Korarchaeota composto quase que somente por isolados identificados apenas a partir do sequenciamento de 16S rRNA, sendo considerado um grupo de hipertermfilos. At o momento, poucos espcimes de Korarchaeota foram cultivados em laboratrio. Pesquisas realizadas em uma fenda termal localizada no fundo do mar da Islndia, em 2002, levaram identificao de uma nova espcie de archaea apresentando caractersticas bastante distintas, quando comparada aos demais membros desse domnio. A espcie Nanoarchaeum equitans diferencia-se das demais archaea por ser aparentemente muito primitiva (ou modificada), sendo encontrada em associao com outra archaea (Igniococcus sp.). Este organismo de morfologia arredondada bastante diminuto, apresentando cerca de 400 nm de dimetro e um pequeno genoma, de 0,5 Megabases. De acordo com seus descobridores, as grandes diferenas apresentadas por Nanorachaeum em relao seqncia de RNA ribossomal, sugerem que tal organismo seja classificado em um novo filo, proposto como Nanoarchaeota.

Micrografia de fluorescncia, empregando um corante especfico para DNA, revelando as clulas de Igniococcus (maiores) e de

Nanoarchaeum equitans (menores). No quadro direita, micrografia a estreita eletrnica evidenciando

associao das duas archaea. Boucher & Doolittle (2002) Nature, 417:27-28

(clique no autor, caso deseje ver o artigo original)

Micrografia

de

fluorescncia

empregando corantes especficos para os rRNAs de Igniococcus (verde) e Nanoarchaeum

(vermelho)

Huber

et

al.

(2002)

Nature,

417:63-67.

(clique no autor, caso deseje ver o artigo original)

Estrutura

celular

das

Archaea

Quanto morfologia, podem ser esfricas, bacilares, espiraladas, achatadas, quadradas, discides e muitas vezes de morfologia irregular ou pleomrficas. Suas dimenses so extremamente variveis, de 0,1 a 15 m, com alguns filamentosos atingindo 200 m. As archaea apresentam vrias caractersticas especiais, que permitem seu

desenvolvimento em uma vasta gama de ambientes. Estas incluem alteraes de composio de membrana, composio variada de paredes celulares, presena de protenas tipo histonas, ntrons, mecanismos de splicing, entre outros. Parede celular: Apresenta composio e estruturao extremamente variveis neste grupo de microrganismos. Esta variabilidade sugere que o ancestral comum seria desprovido de parede, sendo as diversas paredes resultantes de evoluo independente, de acordo com os diferentes ambientes e grupos de archaea.

Diferentes composies de parede celular presentes em archaea. (Adaptado de Atlas, R.M. (1997) - Principles of microbiology)

Quando coradas pelo mtodo de Gram, algumas archaea comportam-se como Gram positivas e outras como Gram negativas, embora suas paredes sejam completamente distintas daquelas de eubactrias. Como observado na figura acima, suas paredes celulares apresentam uma grande diversidade quanto composio qumica e, diferentemente das eubactrias, no apresentam peptideoglicano. Alm disso, existem tambm outras archaea que no exibem parede celular (Thermoplasma). O gnero Thermoplasma cresce bem em temperaturas de 55C e pH 2, em meios complexos. Estes organismos apresentam a membrana citoplasmtica bastante diferente, contendo compostos semelhantes a lipopolissacardeos, contendo ligaes tetrater. Um outro gnero, filogeneticamente relacionado a Thermoplasma, Picrophilus, que cresce em pHs de 0,06 a 0,7. Vrias archaea exibem uma parede espessa, rgida, semelhante parede Gram positiva (Methanobacterium, Methanopyrus, Halococcus), entretanto, os polmeros que compem a estrutura podem ser: pseudopeptideoglicano ou metanocondroitina. O pseudopeptideoglicano diferencia-se do peptideoglicano pela ocorrncia de cido talosaminurnico em substituio ao murmico, pela ligao do tipo b-1,3 ao invs de b-1,4 entre os acares e pela ausncia de D-aminocidos nas pores peptdicas da molcula. Nestas bactrias, a lisozima no exibe qualquer atividade de degradao da parede, uma vez que seu stio de ao so as ligaes b-1,4. Da mesma forma, a penicilina ineficaz contra estes organismos porque o mecanismo de sntese de parede distinto nas archaea.

A metanocondroitina um polmero de 4 acares (galactosamina, cido glucornico, N-acetil-galactosamina e glicose), muito semelhante ao tecido conectivo animal, composto por sulfato de condroitina. Aquelas archaea que coram-se como Gram negativas podem ter paredes compostas por protenas, polissacardeos ou glicoprotenas. As paredes proticas podem variar entre si, podendo ser do tipo monocamada de natureza cristalina, ou policamadas, de protenas tubulares. As glicoprotenas so tambm comuns, muitas vezes contendo grandes quantidades de aminocidos carregados negativamente. As halobactrias so um exemplo do modelo descrito acima, onde as cargas negativas da parede interagem com os ons Na+ do ambiente, estabilizando a parede. O gnero Halococcus apresenta a parede celular composta por um

heteropolissacardeo altamente sulfatado, nunca observado em qualquer outro ser vivo. Eventualmente, algumas archaea exibem uma camada protica adicional ao redor da parede celular, ou compondo a prpria parede, denominada camada S, em um estado cristalizado.

Membrana Citoplasmtica: corresponde a uma estrutura nica, apresentando composio qumica e arranjo totalmente diferentes das membranas citoplasmticas de quase todas as bactrias e de todos eucariotos.
Membrana Contedo protico Bacteria alto Archaea alto Sulfolipdeos, glicolipdeos, Composio lipdica fosfolipdeos hidrocarbonetos ramificados, isoprenoides, fosfolipdeos Estrutura dos lipdeos Ligao dos lipdeos cadeia linear ster cadeia ramificada ter (di e tetraeter) cadeia linear ster Fosfolipdeos Eucarya baixo

As membranas de archaea geralmente apresentam um alto contedo protico e vrios lipdeos: glicolipdeos, sulfolipdeos, fosfolipdeos (raros) e lipdeos apolares do tipo isopreno. A presena de hidrocarbonetos ramificados aumenta a fluidez da membrana, uma vez que dificultam a formao de estruturas cristalinas. Dentre os principais lipdeos esto aqueles do tipo glicerol-ter-isopreno (hidrocarbonetos de 20, 25 ou 40 Carbonos).

Uma caracterstica da poro lipdica da membrana o fato desta no ser composta por cidos graxos convencionais. Em seu lugar encontram-se longas cadeias de hidrocarboneto ramificadas. Os hidrocarbonetos ligam-se ao glicerol por ligaes do tipo ter (ao invs de ster) e podem apresentar-se como bicamadas (como em todas as membranas) ou como monocamadas. Quando formam bicamadas, denominam-se glicerol diter e quando originam monocamadas, da cadeia de diglicerol hidrocarboneto, formando anis tetrater. pentacclicos. Quando h a monocamada, esta modula sua fluidez atravs da ciclizao de alguns elementos As protenas de membrana podem ser tambm bastante diferentes daquelas observadas em outros tipos celulares.

Estrutura e composio da membrana presente em vrias archaea. (Adaptado de Madigan et al., 2003 - Brock Biology of Microorganisms)

Cromossomo: bastante semelhante ao cromossomo das eubactrias, uma vez que nico e, na maioria dos casos, circular. Por outro lado, sua organizao semelhante aos eucariotos, uma vez que observam-se protenas (do tipo histona) associando-se ao DNA, atuando na manuteno da estrutura do DNA, afetando tambm a expresso gnica. Foi observado que em muitos hipertermfilos a associao das protenas ao DNA promove um enovelamente do tipo positivo no DNA, enquanto em eucariotos, este negativo.

Foi tambm relatada a presena de introns no cromossomo de Archaea, em genes de RNA de hipertermfilos e halfilos, sendo processado atravs de endonucleases. Transcrio: Em relao aos promotores, aparentemente sua estrutura tem maior semelhana com promotores de eucariotos que de procariotos. A RNA polimerase mais complexa que a de bactrias, podendo ser composta por 8 polipeptdeos em metanognicas e haloflicas (enquanto em Bacteria so 4). Nas hipertermfilas, podem existir 10 polipeptdeos distintos (assemelhando-se RNA polimerase de eucariotos). Ribossomos: So do tipo 70S, semelhantes aos de bactrias, entretanto, sua composio protica bastante distinta, tornando-os resistentes aos antibiticos que afetam a sntese protica bacteriana. A traduo tambm diferentes das Bacteria, assemelhando-se mais aos Eucarya, sem a participao da formil-metionina no incio do processo. A toxina diftrica, que inibe a traduo de clulas eucariticas tambm inibe o processo em Archaea. Flagelos: Muitas archaea, inclusive aquelas sem parede celular, podem apresentar flagelos. Estes diferem totalmente dos flagelos bacterianos, uma vez que no apresentam a estruturao em corpo basal, gancho e filamento. Nas Archaea, o flagelo no apresenta os anis observados nas bactrias e, geralmente, composto por vrios tipos de flagelina, que exibe composio similar a vrias fmbrias. Ao que parece, o flagelo composto por flagelina, que se organiza a partir da membrana citoplasmtica, projetando-se para o exterior da clula. Metabolismo As archaea apresentam com uma enorme diversidade s metablica. clulas, Muitas outras so so

quimiorganotrficas,

metabolismo

semelhante

demais

quimiolitotrficas, utilizando o H2 como doador de eltrons nas reaes de oxi-reduo. Vrias archaea so anaerbias e geralmente termfilas e suas vias para obteno de energia geralmente envolvem 1) Reduo do CO2 a metano ou converso do acetato a CO2 e ento metano; sendo incorporado pela via do Acetil-Coa CO2 + 4H2 k CH4 + 2H2O nas metanognicas 2) Reduo de SO4 a H2S;

SO42- + H+ + 4H2 k HS- + 4H2O 3) S + H2 k HS + H

+

Reduo

de

Enxfre

elementar

H2S.

Assim, pode-se notar que muitas archaea exibem metabolismo quimioautotrfico. Ecologia de archaea Embora inicialmente fossem consideradas organismos restritos a ambientes extremos, muitas archaea vm sendo isoladas de ambientes favorveis aos demais organismos procariticos e eucariticos. No entanto, dentre as vrias archaea descritas at o momento, a maioria encontrada em poucos ambientes especializados terrestres e aquticos, tais como lagos extremamente salinos, ambientes estritamente anaerbios e/ou ambientes extremamente quentes. At pouco tempo, a menor temperatura onde foi possvel se fazer o cultivo in vitro de archaea era de 30C. Dados recentes indicam, por outro lado, que este grupo de microrganismos pode tambm ser isolado de ambientes frios. Atualmente sabemos que estes organismos so importantes membros da microbiota aqutica de regies frias do planeta. Ao que parece, as archaea podem corresponder a at 34% da biomassa procaritica das guas costeiras superficiais da Antrtida. De maneira geral, e pelo fato da maioria das archaea conhecidas serem isoladas de ambientes quentes, salinos e/ou anaerbios, este domnio didaticamente dividido em trs grandes grupos: termoflicos, halfilos e metanognicos. No entanto, vale ressaltar mais uma vez que dados mais recentes comprvam a ampla distribuio geogrfica e ecolgica desse grupo de organismos. Termofilia: Sabe-se que vrias archaea tm temperatura tima superior a 80C e temperatura mxima de crescimento acima de 100C (Pyrodictium brockii tem timo de 105C e Pyrolobus fumarii de 106C, embora cresa em at 113C). Ainda no se sabe at onde pode ir esta faixa de temperatura. Pyrolobus fumarii foi isolado de uma fenda no Oceano Atlntico, a uma profundidade de 3.650 metros, crescendo em uma faixa de temperatura de 90 a 113C, pH de 4 a 6.5 e concentraes de NaCl variando de 1 a 4%. Experimentos realizados em laboratrio mostram que culturas na fase exponencial de crescimento sobrevivem ao tratamento em autoclave (121C) por 1 hora. A termofilia requer adaptaes fisiolgicas especializadas, pois as protenas e cidos nuclicos no podem ser desnaturados e a membrana deve manter-se funcional nestas temperaturas.

Curiosamente, a estrutura primria (seqncia de aminocidos) de vrias protenas de Archaea no exibem diferenas significativas quando comparada a outros organismos. Provavelmente, o principal fator para esta caracterstica seja o dobramento destas protenas. Uma caracterstica das protenas de termoflicos refere-se substituio de aminocidos mais flexveis por aqueles que conferem maior rigidez molcula. Alm disso, foi sugerido que as protenas poderiam ser estabilizadas pela presena de altos teores de aminocidos hidrofbicos. As archaea termfilas tambm exibem um enorme nmero de chaperonas, que garantem o dobramento correto das protenas nas temperaturas mais elevadas. Em termos de genoma, observa-se muitas vezes valores maiores de G+C nas hipertermfilas, estabilizando assim os cidos nuclicos. Entretanto, tal caracterstica no pode ser considerada como regra. Muitas termoflicas apresentam altas concentrao de 2,3difosfoglicerato cclico, um composto que protege contra a depurinizao. Vrias outras produzem uma DNA girase reversa, que enovela o DNA no sentido positivo, que mais estvel que o negativo, o qual encontrado na maioria das outras clulas. Alm disso, muitas vezes so encontradas protenas do tipo histona ou outras, que se ligam fortemente ao DNA, protegendo-o. Quanto membrana, sua funcionalidade decorrente da presena de isopreno e da ciclizao de seus componentes, alm da alta frequncia de membranas do tipo tetrater. As termfilas podem ser encontradas em fontes geotrmicas, fontes vulcnicas (que expelem vapores e compostos sulfurados), fontes termais marinhas, onde erupes vulcnicas elevam a temperatura para mais de 100C. Nestes casos, estas bactrias requerem, adicionalmente, presses elevadas para o seu desenvolvimento. Estes organismos so muito utilizados em biodigestores de esgoto e tambm como fonte de insumos laboratoriais (Taq pol). Halofilia: Este grupo de archaea habita locais denominados hipersalinos, requerendo grandes quantidades de sal para seu desenvolvimento. Um halfilo extremo requer pelo menos 1,5M de NaCl (9%), podendo variar de 2 a 4M (12 a 23%) para outras espcies. Foram descritos organismos capazes de crescer na presena de 5,5M de NaCl, o que equivale a 32%, correspondendo ao limite de saturao para este sal. Embora ambientes salinos sejam comuns, os hipersalinos so raros, encontrando-se em reas quentes e secas do mundo (lagos salgados, salinas, mar morto). Nestes ambientes, as clulas tenderiam a perdem gua, devido elevada concentrao externa de sal. Entretanto, exibem uma adaptao fisiolgica que corresponde ao acmulo de sais ou ons em seu citoplasma, ou pela sntese de compostos orgnicos intracelulares, denominados solutos compatveis. Assim, o gnero de halfilos Halobacterium bombeia grandes quantidade de K+

para o interior da clula, superando a concentrao externa de Na+. Nestes organismos, as enzimas devem exibir maior tolerncia ao sal, tendo em vista que seu funcionamento dever ocorrer em um ambiente muito concentrado. Muitas apresentam bombas de cloro, que constantemente bombeiam este on para o interior da clula. As paredes podem conter uma grande quantidade de aminocidos carregados negativamente, ou polissacardeos sulfatados, para interagir com ons Na+ presentes no meio, sendo esta interao essencial integridade da parede. Metanognicos: Este foi o primeiro grupo de archaea descrito, sendo nico por sua capacidade de sintetizar metano. Sua distribuio geogrfica muito ampla, sendo encontrados no intestino de ruminantes, em cupins, em lagoas, lodos de esgoto, etc. Podem ser quimiolitotrficos ou quimiorganotrficos e, via de regra, so anaerbio estritos, exibindo enorme sensibilidade ao oxignio. Interaes microbianas Ao que parece, as archaea interagem intensamente com outros organismos, embora sejam eventos menos frequentes que aqueles observados para as eubactrias. As archaea metanognicas realizam associaes com outros microrganismos, uma vez que necessitam de substrato (principalmente H) para a produo de metano. Assim, em processos de degradao anaerbia de resduos de indstrias de papel, que ocorrem em rios e lagos e tambm no intestino de ruminantes, pode-se observar a ocorrncia de comunidades microbianas contendo metanognicas, havendo a produo de metano e gs carbnico. Um dos principais produtos da fermentao de muitos anaerbios o H2, que prontamente utilizado pelas metanognicas, que associado ao CO2, origina o metano. O cido frmico pode tambm ser utilizado como doador de eltrons para a reduo do CO2. A produo de metano, por sua vez, garante um ambiente anaerbico. J foi descrita a ocorrncia de metanognicas endossimbiontes em protozorios que habitam o rumen de vertebrados. Foi descrita a associao de archaea com animais e em alguns tecidos vegetais, embora at o momento no tenha sido comprovada a capacidade de invadir tecidos ou manifestar potencial patognico nesses organismos. Em muitos casos a presena de metanognicas no rumen pode levar a prejuzos ao gado, uma vez que competem pelo acetato produzido na fermentao da celulose. H ainda um problema ambiental associado produo de metano pelas archaea, pois este metano expelido pelas archaea contribui ao agravamento do efeito estufa. Estudos

recentes indicam que a quantidade de metano expelida pelas Archaea pode ser de 400 ton3/ano (cerca de 50 litros por dia). Dados recentes revelam a deteco de archaea em amostras de placa dental subgengival, embora nada tenha sido provado em relao ao potencial patognico dos organismos isolados.

Nutrio de microrganismos
Introduo Os microrganismos exibem os mais diversos mecanismos nutricionais. Em relao aos procariotos (Bacteria e Archaea), a nutrio ocorre predominantemente pela absoro, uma vez que a grande maioria destes organismos possui uma espessa parede celular, impossibilitando a realizao de fagocitose. Os seres vivos podem ser classificados de acordo com as fontes de energia e de carbono que utilizam para seu crescimento. Assim, em relao s fontes de energia, tempos os organismos fototrficos (que utilizam a energia luminosa) e os quimiotrficos (que utilizam a energia proveniente de reaes qumicas). Em relao s fontes de carbono, temos os organismos autotrficos (fontes inorgnicas) e os heterotrficos (fontes orgnicas). Dentre os procariotos, iremos encontrar exemplos em todas as possveis classes de organismos.

Classificao dos seres vivos, de acordo com as fontes de energia e carbono (Adaptado de Tortora et al., Microbiology - An Introduction, 1997)

Composio qumica da clula procaritica As clulas procariticas so compostas, essencialmente por macromolculas (protenas, cidos nuclicos, polissacardeos e lipdeos), apresentando tambm uma menor quantidade de outros compostos orgnicos e inorgnicos. Alm destes, encontramos ons e gua. Relativamente, podemos consideram a clula como sendo 90% de gua, 10% de macromolculas e o restante compreendido pelos demais componentes. A maioria das pequenas molculas obtida a partir do meio, sendo as macromolculas sintetizadas em seu interior.

Nutrientes Os nutrientes so definidos como as substncias encontradas no ambiente, que participam do anabolismo e catabolismo celular, podendo ser divididos em dois grandes grupos: macronutrientes, que so necessrios em grandes quantidades e micronutrientes, necessrios em pequenas quantidades. Alguns nutrientes so utilizados como fonte de material para a biossntese das molculas, enquanto outros correspondem a fontes de energia, necessria aos processos biossintticos e de manuteno dos organismos. Muitas vezes, diferentes nutrientes podem apresentar os dois papis descritos acima. Principais Macronutrientes Carbono: corresponde base de todas as molculas orgnicas. Entre os procariotos melhor estudados at o momento, a maioria requer algum tipo de composto orgnico como fonte de carbono, o qual pode ser de diferentes variedades (aminocidos, cidos orgnicos, acares, bases nitrogenadas, etc). Nitrognio: corresponde ao segundo elemento mais abundante nas clulas, compondo protenas, cidos nuclicos e peptideoglicano. Podemos encontrar o nitrognio sob a forma de compostos orgnicos ou inorgnicos, sendo ambas as formas prontamente utilizadas por um

grande nmero de procariotos. Assim, a partir da degradao de protenas e cidos nuclicos, bem como a partir de amnia e nitrato, os organismos utilizam o nitrognio presente na natureza. Embora o nitrognio esteja em grandes concentraes na atmosfera, este no amplamente utilizado, exceto por aqueles organismos denominados fixadores de N2. Hidrognio: elemento presente em protenas, acares e demais molculas orgnicas. Fsforo: encontrado em compostos orgnicos (cidos nuclicos) ou inorgnicos (fosfatos), sendo importante na composio de cidos nuclicos e fosfolipdeos. Em sua maioria, os microrganismos utilizam o fsforo sob a forma de compostos inorgnicos. Enxofre: compondo a cistena e metionina, estando presente tambm em vrias vitaminas (tiamina, biotina). Na natureza, o enxofre sofre uma srie de transformaes, as quais so exclusivamente realizadas por microrganismos. A principal fonte de enxofre para os microrganismos corresponde aos sulfatos inorgnicos ou H2S. Potssio: necessrio para todos os microrganismos, devido ao seu papel ativador de vrias enzimas, tais como aquelas envolvidas na traduo. Magnsio: necessrio geralmente em grandes quantidades, uma vez que tem papel na estabilizao de ribossomos, membranas e cidos nuclicos, sendo tambm importante para o funcionamento de diferentes enzimas, especialmente aquelas envolvidas na transferncia de fosfato. Clcio: embora no seja essencial ao crescimento da maioria dos microrganismos, tem papel de estabilizao da parede celular e de termorresistncia nos esporos. Sdio: importante, especialmente para microrganismos marinhos e certas archaea halfilas. Ferro: presente em um grande nmero de protenas, especialmente aquelas envolvidas na respirao. Principais Micronutrientes: Embora necessrios em pequenas quantidades, tm papel to importante quanto os macronutrientes. Cobalto: necessrio apenas para a formao da vitamina B12. Zinco: tem papel estrutural em vrias enzimas (DNA e RNA polimerases) e outras protenas de ligao ao DNA.

Molibdnio: presente em certas enzimas como a nitrato redutase assimilativa. Cobre: importante para enzimas respiratrias. Mangans: ativador de muitas enzimas. Nquel: presente em hidrogenases.

Fatores de crescimento: correspondem a compostos orgnicos especficos, que so necessrios em quantidades muito pequenas devido incapacidade das clulas os sintetizarem (vitaminas, aminocidos, purinas e pirimidinas), os quais so geralmente fornecidos como componentes dos meios de cultura (peptonas, extrato de levedura) utilizados para o crescimento in vitro dos microrganismos. Na natureza, tais fatores so normalmente encontrados nos hbitats naturais dos microrganismos. Por exemplo, bactrias do gnero Porphyromonas requerem vitamina K como fator de crescimento, sendo esta fornecida pelo prprio hospedeiro eucarioto. As vitaminas correspondem ao fator de crescimento mais comum para os microrganismos. Estas so definidas como compostos orgnicos necessrios em pequenas quantidades, para o crescimento e funes no relacionadas nutrio, atuando na maioria das vezes como parte de coenzimas. Esto descritas abaixo algumas das funes desempenhadas pelas principais vitaminas requeridas pelos microrganismos: biotina - Biossntese de cidos graxos, b-decarboxilaes, fixao de CO2; tiamina (B1) - a-decarboxilaes e transcetolase piridoxina (B6) - transformaes de aminocidos e ceto cidos

cobalamina (B12) - reduo e transferncia de fragmentos nicos de carbono, sntese de desoxirribose. As bactrias dos gneros Streptococcus e Lactobacillus tm uma necessidade por vitaminas maior do que aquela exibida pelo homem. O processo de nutrio em procariotos Nos procariotos contendo parede celular os processos de nutrio ocorrem atravs da absoro dos nutientes, a partir do ambiente externo. Entretanto, devido s caractersticas diferenciais na composio e estrutura da parede celular dos organismos Gram positivos e Gram negativos, este processo apresenta algumas diferenas nestes dois grupos de organismos. Nutrio em Gram positivos: Estas bactrias caracterizam-se por sintetizar uma srie de exoenzimas, as quais so liberadas no meio, clivando os nutrientes, que so capatados por protenas transportadoras. Os fungos (clulas eucariticas), posuem um sistema de nutrio semelhante ao das bactrias Gram positivas, nutrindo-se pela absoro, aps a clivagem extracelular de compostos complexos. Nutrio em Gram negativos Papel da parede celular em Gram negativas A parede celular das bactrias Gram positivas composta por vrias camadas de peptdeoglicano, enquanto nas Gram negativas observa-se uma maior complexidade qumica e estrutural da parede, decorrente da presena de camadas lipoprotica e lipopolissacardica, localizadas externamente camada de peptdeoglicano, originando a membrana externa. Estas diferenas, por si s, contribuem em grande parte s diferenas observadas na forma de captao dos nutrientes. Devido presena de uma membrana externa de carter hidrofbico (LPS), as bactrias Gram negativas apresentam um grande nmero de porinas associadas camada lipopolissacardica. As porinas correspondem a protenas, formadas por trs subunidades idnticas, que originam um canal de cerca de 1 nm de dimetro, cujo mecanismo de abertura e fechamento permanece ainda desconhecido. Desta forma, as porinas permitem a passagem de molculas hidroflicas, de baixa massa molecular.

Estas protenas podem atuar de forma inespecfica, formando canais aquosos, ou especfica, exibindo stios de ligao para substratos de at 5 kDa, ou ainda, acopladas a protenas transportadoras. Papel das protenas periplasmticas em bactrias Gram negativas O periplasma corresponde poro celular localizada entre a membrana plasmtica e a membrana externa, geralmente exibindo constituio gelatinosa, provavelmente devido ao grande nmero de enzimas e protenas presentes, assim como pela prpria presena do peptdeoglicano e lipoprotenas. De forma geral, so encontrados trs tipos de protenas no periplasma de clulas Gram negativas: hidrolases, que atuam na degradao inicial dos nutrientes; protenas de ligao, que iniciam os processos de transporte e os quimioreceptores, envolvidos em processos de quimiotaxia. O transporte inicial das molculas para o citoplasma, a partir do periplasma, um processo que requer gasto energia, por meio da utilizao de ATP. Papel da membrana citoplasmtica na nutrio de Gram positivos e negativos A membrana citoplasmtica, estrutura vital para qualquer tipo de clula, uma barreira que separa o contedo celular do meio externo. A membrana corresponde a uma barreira altamente seletiva, permitindo que as clulas concentrem metablitos especficos em seu interior. No domnio Bacteria, a membrana apresenta-se como uma bicamada fosfolipdica, contendo protenas dispersas por toda sua superfcie. A estutura global da membrana estabilizada atravs de interaes do tipo pontes de hidrognio, interaes hidrofbicas e pela presena de ons Ca++ e Mg++, os quais se combinam com as cargas negativas dos fosfolpides. Embora em archaea, a membrana apresente estrutura totalmente distinta, podendo ser do tipo bicamada ou monocamada, muitas vezes desprovida de fosfolipdeos, tal estrutura desempenha os mesmo papis fisolgicos descritos para as membranas de qualquer ser vivo. Assim, a membrana tem papel essencial nos processos de nutrio procaritica, uma vez que todos os nutrientes e produtos de degradao devem atravess-la. Devido sua permeabilidade seletiva, a maioria das molculas so incapazes de simplesmente atravessar a membrana de forma passiva. Ao contrrio, estas devem ser ativamente transportadas atravs da membrana. O interior de uma clula procaritica consiste em uma soluo aquosa hipertnica em relao maioria dos hbitats onde os procariotos so geralmente encontrados. Assim, a gua tem a capacidade de passar livremente para o citoplasma, pelo processo de osmose. Outros compostos, tais como pequenas substncias apolares e lipossolveis (cidos graxos, lcoois, benzeno) so capazes de solubilizar-se na membrana e entrar na clula. Molculas carregadas

como ons, aminocidos, compostos polares, devem ser transportados especificamente uma vez que, devido sua natureza, no so capazes de atravessar a membrana. Processos de transporte atravs da membrana A presena de protenas transportadoras na membrana permite que a clula capte compostos que naturalmente no penetrariam na clula, devido natureza semi-permevel da membrana. Estas protenas podem ser agrupadas em trs classes: uniportadoras, simportadoras e antiportadoras. As protenas uniportadoras so aquelas que que transportam uma nica substncia de um lado para outro da membrana. As duas outras classes so descritas como cotransportadoras, uma vez que para transportar uma substncia qualquer, necessitam transportar outra, concomitantemente. As simportadoras so aquelas que carreiam ambos os compostos em uma mesma direo enquanto nas antiportadoras o transporte se d em direes opostas. Este tipo de transporte, mediado por protenas, permite clula apresentar concentraes internas de determinados compostos superiores quelas encontradas no meio externo. Uma das principais caractersticas do processo de transporte mediado por protenas reside na sua elevada especificidade, assim, determinados transportadores carreiam apenas um nico tipo de molcula, embora a maioria apresente afinidade por uma classe de molculas Tipos de transporte mediado por protenas Difuso facilitada Neste tipo de processo, a ligao do nutriente protena transportadora induz uma mudana de conformao na protena, formando um canal pelo qual o nutriente tem acesso ao citoplasma. Embora haja a participao de transportadores neste processo, a ao das leis das massas impede que ocorra a formao de um gradiente de concentrao, mantendo assim as concentraes intra e extracelular semelhantes. Este processo de difuso mediada por transportadores denominado difuso facilitada, o qual no envolve gasto de energia. Os mecanismos descritos a seguir caracterizam-se por requerem um gasto de energia, uma vez que estes permitem um acmulo dos compostos transportados no interior da clula. Desta forma, estes mecanismos envolvem o transporte contra um gradiente de concentrao,

sendo a energia necessria para o bombeamente dos compostos para o interior da clula. Nestes casos, a energia pode advir da clivagem de ATP ou pela dissipao de gradientes de prtons ou ons Na+ atravs da membrana. Este gradiente inico estabelecido durante reaes que liberam energia e podem ser utilizados como fonte potencial de energia para a captao de nutrientes contra um gradiente de concentrao. Translocao de grupo Neste tipo de transporte, o nutriente sofre uma alterao qumica durante sua passagem atravs da membrana. Uma vez que o produto translocado para o interior da clula agora diferente daquele presente no meio externo, no h a formao de um gradiente de concentrao. Molculas de acares tais como glicose, frutose, N-acetilglicosamina, purinas e pirimidinas so exemplos de translocao de grupo, sendo fosforiladas durante o processo pelo sistema fosfotransferase. Em E. coli, o sistema fosfotransferase composto por 24 protenas, sendo 4 necessrias para o transporte de um dado acar.

O sistema fosfotransferase tem tambm papel na regulao do transporte dos acares, uma vez que na presena de glicose e outro acar, o sistema fosforila preferencialmente as molculas de glicose. Tranporte ativo Alguns acares, a maioria dos aminocidos, vrios ons inorgnicos e cidos orgnicos so transportados atravs deste tipo de mecanismo. A energia necessria para efetuar os processos advm ou do ATP ou, mais comumente, da formao de um gradiente de prtons (ons hidrognio) por toda a membrana, denominado fora prton motiva. Como resultado, a membrana fica energizada e este potencial eletroqumico responsvel pela captao dos nutrientes. Cada transportador tem stios especficos tanto para o substrato como para os prtons. Com a entrada do nutriente, o prton tambm atravessa e membrana e com isso vai diminuindo o gradiente
+

fora

motiva.

Ctions tipo K

podem ser transportados ativamente por uniportadores, em resposta

diferena de cargas, uma vez que o interior da clula fica carregado negativamente. Os tambm nions por provavelmente simportadores, so transportados com juntamente um ou com prtons, por

simportadores. Molculas no carregadas, como aminocidos ou acares, so transportadas juntamente mais prtons.

Alm da fora motora resultante do gradiente de prtons, o transporte ativo tambm pode ser executado utilizando a energia liberada pela hidrlise de ATP, como no caso do transporte de maltose em E. coli. A Cultura de microrganismos in vitro: A partir do conhecimento dos requerimentos nutricionais, podem ser confeccionados meios que permitam o crescimento microbiano in vitro. Cultura pura: corresponde a uma cultura contendo um nico tipo de organismo. Esta importante, uma vez que permite o estudo dos microrganismos isoladamente. Para isso, precisamos conhecer as necessidades nutricionais e ambientais dos microrganismos. Os meios de cultura consistem em meios aquosos, adicionados de nutrientes e, eventualmente, gar (polissacardeo = ster sulfato de galactana, retirado de algas - Gelidium), caso se deseje a consistncia slida. H duas classes de meios: os quimicamente definidos (sintticos) e os indefinidos (complexos). Tipos de meios em relao consistncia: Lquidos, Semi-slidos e Slidosn Tipos de meios, quanto composio: Simples, Enriquecidos, Seletivos, Diferenciais.

Crescimento microbiano
Introduo ao Crescimento Microbiano Em microbiologia, o termo crescimento refere-se a um aumento do nmero de clulas e no ao aumento das dimenses celulares. Crescimento Populacional: definido como o aumento do nmero, ou da massa microbiana. A taxa de crescimento a variao no nmero ou massa por unidade de tempo. O tempo de gerao o intervalo de tempo necessrio para que uma clula se duplique. O tempo de gerao varivel para os diferentes organismos, podendo ser de 10 a 20 minutos at dias, sendo que em muitos dos organismos conhecidos, este varia de 1 a 3 horas. O tempo de gerao no corresponde a um parmetro absoluto, uma vez que dependente de fatores genticos e nutricionais, indicando o estado fisiolgico da cultura. O tempo de gerao pode ser calculado quando uma cultura encontra-se em fase exponencial, pela frmula abaixo: N=No.2n, onde N= nmero final de clulas, No= nmero inicial de clulas, n= nmero de geraes.

n=
t

log(N)

log(No)/0.301

g = /n , onde g= tmpo de gerao, t= tempo de crescimento e n= determinado acima. Medidas do crescimento microbiano O crescimento dos microrganismos pode ser mensurado por diferentes tcnicas, tais como pelo acompanhamento da variao no nmero ou peso de clulas, por exemplo. Dentre as diferentes tcnicas utilizadas, descreveremos alguns exemplos. Contagem total de clulas: esta metodologia envolve a contagem direta das clulas em um microscpio, seja de amostras fixadas (e coradas) ou analisadas a fresco, (sendo aplicados cerca de 10 l da suspenso, na maioria dos casos), utilizando-se cmaras de contagem. A contagem direta uma tcnica rpida, mas tem como principais limitaes a impossibilidade de distino entre clulas vivas e mortas (o que pode ser contornado pelo uso de corantes vitais, para leveduras) e contagens errneas, devido s pequenas dimenses de algumas clulas, ou pela formao de agregados celulares. Em preparaes no coradas, deve-se utilizar microscpio de contraste de fase, o qual deve ser empregado apenas quando as clulas no esto muito diludas (<106 clulas/ml).

Exemplo ilustrando o procedimento de contagem direta (Adaptado de Madigan et al., Brock Biology of Microorganisms, 2003)

H tambm os contadores eletrnicos (do tipo Coulter) usados em hematologia, que podem ser empregados na contagem de clulas microbianas. Em determinadas situaes, por exemplo quando se requer apenas uma estimativa da quantidade de microrganismos, pode-se empregar a contagem proporcional, que corresponde a uma anlise comparativa das culturas com suspenses padro. Como exemplo de uma suspenso padro podemos citar a escala de MacFarland, que corresponde a uma srie de tubos contendo uma soluo de BaSO4 em diferentes concentraes, apresentando assim, graus de turvao distintos. Desta forma, comparando-se a turvao da cultura em estudo com os tubos de MacFarland, pode-se obter uma estimativa do nmero de clulas presentes na amostra.

Contagem de viveis: Procedimento tambm conhecido como contagem em placa, que estima o nmero de clulas viveis (isto , capazes de se reproduzir) em uma amostra. Esta metodologia envolve a coleta de alquotas de uma cultura microbiana em diferentes tempos de crescimento, as quais so ento inoculadas em meio slido. Aps a incubao dos meios, geralmente por uma noite, o nmero de colnias contado. Como uma colnia normalmente originada a partir de um organismo, o total de colnias que se desenvolvem no meio corresponde ao nmero de clulas viveis presentes na alquota analisada. Esta tcnica deve sempre realizada empregando-se vrias dilues (100 a 104 clulas) das amostras. A contagem de viveis pode ser feita pela semeadura em superfcie ou em profundidade ("pour plate"). Geralmente o volume a ser inoculado no deve ultrapassar 0,1 ml, para evitar a confluncia das colnias. Se a tcnica de semeadura em profundidade for utilizada, pode-se inocular de 0,1 a 1,0 ml de clulas. Esta tcnica precisa quando o nmero de colnias (ou placas de lise, no caso de partculas virais ) contadas situa-se entre 30 e 300 e quando as condies culturais e ambientais esto adequadas para os microrganismos analisados. Este tipo de contagem est sujeito a grandes erros (agregados, duas clulas prximas, originando uma colnia), que podem ser minimizados pela realizao de triplicatas para cada diluio. Esta metodologia amplamente utilizada, exibindo elevada sensibilidade, detectando baixos nmeros de clulas e permitindo tambm a contagem de diferentes tipos de microrganismos, pelo emprego de meios seletivos (meios que favorecem o crescimento de um determinado tipo ou grupo de organismo) e/ou seletivos e diferenciais (meios que alm de favorecerem o desenvolvimento de um tipo ou grupo de organismo, tambm permite sua distino, a partir de alguma caracterstica fenotpica). Tambm podem ser usadas membranas filtrantes, onde os lquidos so filtrados e as membranas colocadas diretamente sobre os meios de cultura.

Tcnica de contagem de viveis (Adaptado de Madigan et al., Brock Biology of Microorganisms, 2003)

Massa de clulas: pode ser determinada a partir da estimativa do peso seco ou do peso mido de uma cultura. Este tipo de procedimento realizado quando no necessrio determinar o nmero preciso de microrganismos presentes.

Peso seco: Muito utilizado na quantificao de fungos, onde o miclio retirado da cultura, lavado e transferido para um frasco e submetido secagem. Realizam-se ento sucessivas pesagens, at o momento onde no observa-se mais variaes. Este procedimento pode tambm ser realizado centrifugando-se a cultura e pesando o sedimento, ou ento secando-o (100 - 150C/16 horas) e depois pesando-o. Turbidimetria: quantificao em espectrofotmetro ou colormetro a 660 nm, uma vez que neste comprimento de onda, a cor geralmente parda dos meios de cultura no interfere com os resultados. Nestes comprimentos, a absoro de luz por componentes celulares corados desprezvel mas, se necessrio, outros comprimentos de onda podem ser usados. Tal metodologia requer a confeco de uma curva padro. Embora a anlise turbidimtrica seja menos sensvel, de rpida e fcil execuo, no destruindo a amostra. Entretanto, no permite a determinao de clulas viveis.

Anlises qumicas: A partir da quantificao de protenas ou de nitrognio, ou por meio da anlise de diferentes atividades metablicas. Nmero Mais Provvel (NMP): Amplamente utilizado em laboratrios de microbiologia de alimentos ou ambiental, na quantificao de microrganismos em gua, leite e outros produtos. Esta metodologia basicamente utilizada para a pesquisa de coliformes totais e coliformes fecais, que so microrganismos indicadores de poluio fecal, o que pode ter como consequncia a presena de outros organismos, tais como protozorios e vrus. Esta tcnica foi desenvolvida aps anlises estatsticas complexas. A determinao do NMP realizada inoculando-se 3 sries de 5 tubos, com 10, 1 e 0,1 ml da gua ou do produto homogeneizado em soluo salina, em meios seletivos para coliformes totais contendo tubos de Durham invertidos em seu interior. Estes so incubados por 48 hs/37C sendo ento analisados quanto ao crescimento e presena de gs no interior dos tubos de Durham. Tal resultado considerado como positivo para a presena de coliformes totais. Amostras dos tubos positivos so ento repicados para caldos seletivos para coliforme fecais, tambm contendo tubos de Durham, os quais so incubados por mais 24 ou 48 hs a 42C. De todos os tubos positivos faz-se uma semeadura em placa com meio seletivo e posterior identificao bioqumica. De acordo com o nmero de tubos que apresentam gs determina-se o NMP, pela consulta de uma tabela desenvolvida por Hoskins (1934). Este um teste apenas presuntivo para a presena de coliformes. Curva de crescimento (cultura descontnua)

Quando uma cultura microbiana desenvolve-se em um sistema fechado, pode-se confeccionar uma curva de crescimento. Esta pode ser dividida em diferentes etapas: lag, log, estacionria e de declnio.

Curva de Crescimento Padro, em um sistema fechado

Lag: perodo varivel, onde ainda no h um aumento significativo da populao. Ao contrrio, um perodo onde o nmero de organismos permanece praticamente inalterado. Esta fase apenas observada quando o inculo inicial proveniente de culturas mais antigas. A fase lag ocorre porque as clulas de fase estacionria encontram-se depletadas de vrias coenzimas essenciais e/ou outros constituintes celulares necessrios absoro dos nutrientes presentes no meio. A fase lag tambm observada quando as clulas sofrem traumas fsicos (choque trmico, radiaes) ou qumicos (produtos txicos), ou quando so transferidas de um meio rico para outro de composio mais pobre, devido a necessidade de sntese de vrias enzimas. Assim, durante este perodo observa-se um aumento na quantidade de protenas, no peso seco e no tamanho celular. Log ou exponencial: nesta etapa, as clulas esto plenamente adaptadas, absorvendo os nutrientes, sintetizando seus constituintes, crescendo e se duplicando. Deve ser levado em conta tambm que neste momento, a quantidade de produtos finais de metabolismo ainda pequena. A taxa de crescimento exponencial varivel, de acordo com o tempo de gerao do organismo em questo. Geralmente, procariotos crescem mais rapidamente que eucariotos. Nesta fase so realizadas as medidas de tempo de gerao. Geralmente, ao final da fase log, as bactrias passam a apresentar fentipos novos, decorrentes do processo de comunicao denominado "quorum sensing". Estacionria: Nesta fase, os nutrientes esto escasseando e os produtos txicos esto tornando-se mais abundantes. Nesta etapa no h um crescimento lquido da populao, ou seja, o nmero de clulas que se divide equivalente ao nmero de clulas que morrem. Na fase estacionria que so sintetizados vrios metablitos secundrios, que incluem antibiticos e algumas enzimas. Nesta etapa ocorre tambm a esporulao das bactrias. Foram detectados alguns genes (sur) que so necessrios sobrevivncia das clulas na fase estacionria. Alm destes, existem outros genes (fatores s alternativos da RNA polimerase, protenas protetoras contra dano oxidativo). Declnio: A maioria das clulas est em processo de morte, embora outras ainda estejam se dividindo. A contagem total permanece relativamente constante, enquanto a de viveis cai lentamente. Em alguns casos h a lise celular. Culturas descontnuas tendem a sofrer mutaes que podem repercutir na populao como um todo. As prprias condies ambientais tendem a promover variaes de carter fenotpico (reversvel) nas culturas.

Crescimento em culturas contnuas: tcnica muito usada nos processos industriais de obteno de produtos microbiolgicos. Nestes casos, tem-se o interesse em manter as clulas em fase log ou estacionria. Utilizam-se fermentadores ou quimiostatos, que permitem um crescimento em equilbrio dinminco, havendo assim um controle da densidade populacional e da taxa de crescimento. Estes so respectivamente controlados pela concetrao do nutriente limitante (fonte de C ou N) e pela taxa de fluxo (taxa de diluio). Em baixas concentraes do nutriente limitante, a taxa de crescimento proporcional concentrao do nutriente (que virtualmente zero). Crescimento sincronizado: inicialmente obtido por processos que retardavam a sntese de DNA. Atualmente, utiliza-se mtodos de separao mecnica das clulas menores, recm-divididas. Pode ser feita pela filtrao em vrios papis de filtro, que retm clulas maiores, em fase de diviso. Efeito dos fatores ambientais no crescimento O crescimento dos microrganismos grandemente afetado pelas condies fsicas e qumicas do ambiente onde se encontram, sendo que estas podem influir positivamente ou negativamente de acordo com o microrganismo em questo. Temperatura: Corresponde a um dos principais fatores ambientais que influenciam o desenvolvimento bacteriano. A medida que h um aumento da temperatura, as reaes qumicas e enzimticas na clula tendem a tornar-se mais rpidas, acelerando a taxa de crescimento. Entretanto, em determinadas temperaturas inicia-se o processo de desnaturao de protenas e cidos nuclicos, inviabilizando a sobrevivncia celular. Assim, todos os microrganismos apresentam uma faixa de temperatura onde desenvolvem-se plenamente. Nesta faixa de temperatura podemos determinar as temperaturas mnima, tima e mxima (temperaturas cardeais), para cada microrganismo. A temperatura mxima provavelmente reflete os processos de desnaturao mencionados acima, enquanto os fatores que determinam a temperatura mnima ainda no so bem conhecidos, embora certamente a fluidez da membrana seja um dos fatores determinantes destes nveis trmicos baixos.

Temperaturas cardeais dos microrganismos (Adaptado de Madigan et al., Brock Biology of Microorganisms, 2003)

Dentre os diferentes microrganismos observa-se uma ampla variedade de faixas de temperatura, onde para alguns o timo encontra-se entre 5 e 10C, enquanto para outros de 90 a 100C. Assim, os microrganismos podem ser classificados em quatro grupos, de acordo com os timos de temperatura: psicrfilos (0 a 20C, timo de 15C - Flavobacterium), mesfilos (12 a 45C, 37C - E. coli), termfilos (42 a 68C, 62C - Thermococcus), e hipertermfilos (80 a 113C, 105C - Pyrodictium brockii).

Tipos de bactrias em relao temperatura (Adaptado de Madigan et al., Brock Biology of Microorganisms, 2003)

Psicrfilos: os ambientes frios so predominantes na Terra (oceanos, polos, solos) entretanto este grupo (bactrias, fungos e algas) muito pouco estudado. Destes, os mais

conhecidos so as algas que crescem sob o gelo ou em geleiras (Chlamydomonas nivalis), dando colorao vermelha. H os microrganismos psicrotolerantes que so aqueles cujo timo encontra-se entre 20 e 40C e que sobrevivem a 0C. So um grupo amplo (bactrias, fungos, algas e protozorios) que podem contaminar alimentos e outros substratos refrigerados. Mesfilos: crescem numa faixa de 20 a 40C, com um timo em torno de 37C, sendo os principais microrganismos encontrados em animais de sangue quente. Termfilos e Hipertermfilos: timos de 45 e 80C, respectivamente. So encontrados nos solos, silagem, fontes termais e no fundo ocenico, em fontes. Geralmente so procariotos, sendo as Archaea as mais resistentes, apresentando enzimas e protenas termoestveis, provavelmente devido substituio de aminocidos, conferindo um novo folding. Tm tambm uma maior concentrao de cidos graxos saturados na MC. As Archaea no tem cidos graxos na MC, mas sim hidrocarbonetos de cadeias com diferentes comprimentos, compostas por unidades repetitivas de 5 C (fitano), ligadas a glicerol fosfato, por ligao ter. Os termfilos e hipertermfilos tem grande interesse biotecnolgico porque tendem a fazer os processo mais rapidamente, com menor contaminao por outros microrganismos e possuem enzimas mais termoestveis.

pH: Os ambientes naturais tem uma faixa de pH de 5 a 9, o que comporta o crescimento de 3,5) e diferentes outras tipos alcaliflicas de (Bacillus e microrganismos. Archaea). Bactrias - faixa entre 7, com algumas acidfilas (Thiobacillus de 0,5 a 6,0 com timo entre 2 e Fungos - tendem a ser mais acidfilos que as bactrias (pH <5).

Distribuio de alguns microrgansmos, de acordo com o pH (Adaptado de Madigan et al., Brock Biology of Microorganisms, 2003)

Tenso de O2: Extremamente importante no desenvolvimento, uma vez que os microrganismos comportam-se de forma bastante distinta, sendo classificados como aerbios, anaerbios facultativos, anaerbios estritos, anaerbios aerotolerantes e microaerfilos (requerem concentraes baixas de O2). As condies de anaerobiose podem ser conseguidas pelo uso de agentes redutores nos meios de cultura, tais como o tioglicolato de sdio, que reage com o oxignio, formando gua; pela remoo mecnica do oxignio, sendo substitudo por nitrognio e CO2; pelo uso de sistemas comerciais do tipo "GasPak", que gera hidrognio e CO2 com um catalisador de paldio. Adiciona-se gua ao sistema, a qual gera hidrognio, que reage com o oxignio na superfcie do catalisador, formando gua; ou ainda pelo uso de "glove box" anaerbias ou a mesa inoculadora desenvolvida pelo VPI.

Classes de organismos, em relao tenso de oxignio (Adaptado de Madigan et al., Brock Biology of Microorganisms, 2003)

gua: Essencial a qualquer microrganismo, embora as necessidades sejam variadas. o solvente universal, mas sua disponibilidade varivel (solues com acares ou sais tm menos gua disponvel). Aw: presso do vapor em equilbrio com a soluo/ pv da gua, variando de 0 a 1. Os organismos que vivem em ambientes onde a disponibilidade de gua baixa desenvolvem mecanismos para extrair gua do ambiente, pelo aumento da concentrao de solutos internos, seja bombeando ons para o interior ou sintetizando ou concentrando solutos orgnicos (solutos compatveis), que podem ser aucares, lcoois ou aminocidos (prolina, betaine, glicerol). Presso osmtica: Fator extremamente importante, principalmente a partir do maior conhecimento sobre as Archaea, visto que vrios membros deste domnio requerem altas concentraes de sais para seu desenvolvimento.

Classes de organismos, em relao salinidade

Fatores adicionais: Fonte luminosa para fototrficos autotrficos. Presso atmosfrica, para aqueles que vivem em profundidades.

Reproduo em procariotos
Introduo A diviso celular um processo complexo, que ocorre de variadas maneiras, dependendo do tipo de organismo. Em eucariotos, os microtbulos do fuso mittico atuam como a fora motriz durante a segregao cromossomal. Nas clulas animais e em fungos, um

anel de actina-miosina se forma na poro mediana de uma clula em diviso, sendo que a fora gerada pela interao entre estas duas protenas promove o crescimento interior do septo de diviso. Nas plantas, a formao do septo complexa, devido parede celular espessa. Assim, surge na regio central da clula um disco, que cresce de forma centrfuga. Em todos estes casos o stio de diviso celular definido indiretamente pelos microtbulos, pois o posicionamento do fuso mittico parece ser crucial no direcionamento do plano de diviso. Nas plantas um feixe transiente de microtbulos envolve a clula no plano de diviso, com um possvel papel na seleo do stio de diviso. Embora intensamente estudado, o processo de diviso celular em procariotos ainda pouco conhecido, existindo alguns modelos propostos. Uma das principais concluses obtidas destes estudos refere-se ao fato da diviso celular em procariotos corresponder a um processo extremamente complexo e regulado, tanto em termos espaciais como temporais. Assim, h uma srie de mecanismos que regulam os eventos de duplicao e segregao do cromossomo e a formao do septo de diviso, garantido a eficincia do processo. Outro importante achado refere-se intensa participao de protenas citoplasmticas, atuando como anlogos do citoesqueleto de clulas eucariticas, no processo de diviso celular. At o momento, os estudos indicam que a maioria dos procariotos se divide por fisso binria, originando duas clulas filhas idnticas logo aps a duplicao e segregao cromossomal. O ciclo celular bacteriano pode ser divido em duas fases: 1) Um ciclo de DNA, que inclui a replicao e segregao dos cromossomos e 2) um ciclo de diviso, com a citocinese e separao das clulas filhas. No entanto, estudos com outras bactrias, tais como a bactria pedunculada Caulobacter crescentus, revelam um processo mais complexo de diviso, originando clulas distintas morfolgica e fisiologicamente. Relatos mais recentes da literatura descrevem a ocorrncia de diferentes procesos de reproduo no domnio Bacteria. Assim, em Epulopiscium, uma bactria "gigante" simbionte intestinal do peixe cirurgio, foi observada a ocorrncia de viviparidade, com a formao de 1 a 7 clulas filhas ativas metabolicamente, as quais so liberadas aps a lise da clula me. Neste mesmo gnero e em Metabacterium polyspora, foi descrita a formao de mltiplos esporos intracelulares. Tais relatos deixam claro o quanto ainda desconhecemos sobre a reproduo em procariotos e que estes organismos so capazes de exibir mais de um mecanismo de reproduo. Visando abordar de maneira geral os eventos associados reproduo procaritica por meio da fisso binria, passaremos a descrever os principais resultados obtidos a partir de pesquisas realizadas especialmente com Escherichia coli e Bacillus subtilis.

O processo de fisso binria - Uma viso geral Fisso binria em B. subtilis Esta bactria corresponde a um excelente modelo de estudo devido sua capacidade de originar endsporos, quando em condies desfavorveis. Neste sentido, um dos aspectos que mais chamou a ateno dos pesquisadores foi que durante a reproduo o septo de diviso era formado na regio mediana da clula, enquanto na esporulao o septo localizava-se na regio prxima a um dos plos celulares (Fig. 1). A fisso binria ocorre quando a clula cresce, atinge cerca do dobro de seu comprimento e se divide. Paralelamente, h a duplicao e segregao do DNA (Fig. 1a). Por outro lado, na esporulao, h a duplicao do cromossomo, mas o septo formado tem localizao polar, sendo esta a regio de formao do endsporo (Fig. 1b).

Adaptado de Angert (2005) Nature Rev. Microbiol., 3:214-224.

Fig. 1 Ciclos de vida em B. subtilis. Em (a) ciclo vegetativo. Em condies favorveis, a clula aumenta de tamanho, replica o cromossomo (azul) e se divide por fisso binria. O aparato de diviso montado, com a protena FtsZ (verde) formando um anel no meio da clula, onde ocorre a diviso. Em condies de exausto ambiental (Fig. 1b), a clula forma esporos. As duas cpias do cromossomo assumem uma nova configurao, que se estende de um plo a outro. A maquinaria de diviso montada nos dois plos, mas a diviso ocorre somente em um deles. Parte de um dos cromossomos fica presa por um septo de diviso, sendo empacotado pelas protenas do septo, em um compartimento fechado (presporo). O pr-esporo ento englobado pela clula me. O pr-esporo preparado para a dormncia, pois protenas se ligam, protegendo o DNA, o citoplasma mineralizado e formada uma barreira protica ao redor da estrutura. Vrios so os aspectos ainda pouco elucidados sobre a diviso celular. Por exemplo, como ocorre a segregao do DNA? Como o septo de diviso localizado corretamente? Os estudos vm mostrando que as bactrias possuem uma srie de protenas citoplasmticas que atuam como um verdadeiro citoesqueleto, sendo responsveis pela correta migrao do DNA e posicionamento do septo. Existem autores que vm utilizando o termo "replissomo" para descrever a complexa maquinaria celular envolvida no processo de diviso. Alm disso, dados

recentes tambm revelam que os lipdeos de membrana so importantes componentes do replissomo. Dentre os diversos componentes da maquinaria, uma protena denominada MreB, semelhante actina, est implicada na segregao do DNA.

Um dos componentes mais estudados corresponde protena FtsZ, um homlogo estrutural da tubulina que, durante a fisso binria, se organiza como um anel no centro da clula e atua como ponto de ancoragem de outros elementos do aparato. Estes outros componentes redirecionam o crescimento da parede celular e protegem o DNA de danos enquanto o envelope invagina. FtsZ uma protena muito conservada e uma das primeiras protenas a se organizar no fututro stio de diviso. Nos prximos tpicos discutiremos a protena FtsZ em maior detalhe. Em condies normais, o septo de diviso somente formado aps a segregao do DNA duplicado. Vrios so os processos que resultam em tal situao. Um deles corresponde prpria ocluso do futuro stio de diviso pelo nucleide ainda no segregado. Ao que parece, o DNA se liga a uma srie de lipdeos da membrana, no permitindo que o anel FtsZ seja montado. Outras protenas, denominadas sistema MinCD, impedem a montagem do complexo FtsZ nos plos.

Alm destas, vrias outras vm sendo estudadas, tais como EzrA, que afeta a estabilidade dos polmeros FtsZ, otimizando sua montagem apenas nos locais corretos. No caso de danos ao DNA, as protenas YneA e SulA desestabilizam o anel, impedindo a diviso. O processo de segregao dos cromossomos bacterianos

Esta etapa da diviso celular procaritica foi analisada a partir dos estudos com B. subtilis, como mencionado anteriormente, uma bactria capaz de esporular. A partir dos estudos com mutantes incapazes de realizar o processo completo de segregao cromossomal, foi verificado que sempre um mesmo segmento de DNA era o primeiro a atingir os plos celulares. O mapeamento deste segmento de DNA revelou que tal seqncia correspondia regio situada adjacente oriC, que a origem de replicao do DNA cromossomal. Em E. coli, a replicao do cromossomo ocorre quando o complexo protena DnaA-ATP se liga a stios em oriC. A ligao promove o desenovelamento da oriC, o recrutamento de uma helicase (DnaB) e a montagem de um replissoma. A iniciao da replicao regulada, ocorrendo uma vez a cada ciclo celular. A Figura 2 esquematiza o ciclo de iniciao da duplicao do DNA mediado pela protena DnaA.

Adaptado de Boeneman, K. & Crooke, E. (2005) Curr. Op. Microbiol., 8:143148.

Fig. 2 Regulao da atividade de DnaA. Quando na presena de excesso de ATP, a protena DnaA se liga ao ATP e se complexa em oriC, iniciando a replicao do DNA. A DnaA hidrolisa o ATP, originando ADP e passando para a forma inativa. Nesta forma, h a interao de DnaA-ADP ligada a oriC com fosfolipdeos cidos da membrana citoplasmtica, promovendo a reciclagem de DnaA para sua forma ativa, ligada ao ATP. O conjunto DnaA/oriC/lipdeos de membrana encontra-se situado na poro mediana da clula e, medida que a sntese das molculas de DNA ocorre, estas migram para os plos, liberando assim a regio central para a formao do septo de diviso. Em eucariotos, o movimento e segregao dos cromossomos controlado pelos centrmeros. Estes, ligam-se aos microtbulos do fuso mittico atravs de conjuntos proticos denominados cinetcoros. O movimento do cromossomo ao longo do fuso ocorre como resposta a uma fora exercida nos cinetcoros, seja pela ao de protenas motoras ou pela montagem-desmontagem dos microtbulos que formam o fuso. O fato da regio oriC estar sempre localizada nas vizinhanas do polo celular sugere que esta regio poderia conter uma sequncia do tipo centrmero. Alm disso, pela sua localizao sempre igual, foi especulado que deveria haver a participao de uma ou mais protenas, desempenhando o papel dos cinetcoros ou das protenas motoras dos eucariotos. A partir de outros estudos, foi identificada um protena, denominada Spo0J que, em linhagens mutantes, promovia alteraes na segregao dos cromossomos de clulas

vegetativas. Em clulas onde o gene spo0J foi deletado, a oriC deixava de se localizar nos plos celulares, indicando que a protena Spo0J poderia estar envolvida no posicionamento polar da oriC. Por meio de estudos microscpicos,verificaram que a protena Spo0J forma focos se se ligam ao DNA em um ou mais stios, nas proximidades de oriC. Assim, cada cpia da regio onde est a origem de replicao parece ter seu prprio conjunto de Spo0J. O achado mais marcante em relao a estes eventos de segregao corresponde rpida migrao deste conjunto (DNA-Spo0J) ao longo do eixo celular. Tal fenmeno sugere a existncia de protenas geradoras de fora e a presena de alguma estrutura anloga a um citoesqueleto. Dados mais recentes sugerem a participao de uma protena, denominada RacA, no processo de migrao dos cromossomos para os plos. Ao que parece, esta protena exerce um papel anlogo ao desempenhado pelo fuso mittico.

A replicao bacteriana seria como uma mitose? O conjunto de Spo0J poderia ser comparado funcionalmente aos cinetcoros, que so as organelas envolvidas na ligao dos centrmeros aos microtbulos do fuso.

Alternativamente, Spo0J poderia atuar em uma fase inicial, transformando as regies oriC recm-replicadas em estruturas com um dobramento tal que seriam ento separadas por outras protenas (talvez RacA). Isto poderia ter um papel importante, pois sabe-se que em bactrias, os eventos de replicao se sobrepem. Nestes casos, a separao correta evitaria o emaranhado de cromossomos. Tais achados no so surpresa, uma vez que os eucariotos e os procariotos devem ter evoludo a partir de um ancestral comum, que era eficiente na segregao cromossomal. Assim, no teria porque este evento ser to distinto nas bactrias, onde a grande maioria dos processos ocorrem de forma similar aos eucariotos.

Modelo proposto para a segregao cromossomal, em bactrias (Adaptado de Errington, J. ASM News 64:210-217, 1998)

Seleo

do

stio

de

diviso

durante

diviso

celular

simtrica

Como a clula seleciona o stio mediano ainda no est precisamente estabelecido, entretanto muitos dados j existem para explicar esta etapa do processo de diviso celular. Estudos com mutantes de E. coli indicam que as clulas contm trs stios potenciais de diviso: na regio central e nos plos. Normalmente, para que ocorra uma diviso na regio central, os stios polares devem ser inibidos, sem a inibio do stio potencial mediano. Nestas clulas, parece que tal processo se d pela ao cooperativa de um inibidor de diviso com um fator topolgico de especificidade, os quais so codificados pelos genes minC, minD e minE.

Papel das protenas Min, na localizao do septo de diviso (Adaptado de Rothfield & Zhao. Cell, 84:183-186, 1996)

Parece que, inicialmente, as protenas MinC e MinD atuariam em conjunto, como um inibidor inespecfico de diviso, capaz de bloquear todos os stios possveis de septao. Esta observao se baseia no fato que a diviso fica completamente bloqueada quando minC e minD so expressos, na ausncia de minE. A protena MinE, de alguma forma, conferiria a

especificidade topolgica ao sistema, de forma que MinCD bloquearia somente os stios polares, sem interferir com o stio mediano.

MinE teria duas funes: 1) Como antagonista de MinCD e 2) Como fator de especificidade topolgica pois quando se liga ao stio central, restringe o conjunto MinCD aos stios polares, no desejados para a diviso. Estudos indicam que estas funes de MinE esto localizadas em domnios distintos na sequncia de 88 aminocidos da protena. A funo antagnica sobre MinCD est localizada em um pequeno domnio N-terminal (MinE1-22). A funo topolgica esta associada a um domnio C-terminal (MinE23-81). Assim, o domnio N-terminal atuaria como um antagonista de MinCD, enquanto o Cterminal atuaria, direta ou indiretamente, como um sensor topolgico, capaz de distinguir o stio potencial mediano daqueles nos polos. Os autores especulam que existiriam uma molcula alvo (topolgico) que marcaria o stio mediano como sendo diferente dos stios polares. A elevada afinidade da regio Carboxiterminal de MinE por este alvo levaria localizao preferencial da protena na regio mediana, enquanto a poro amino-terminal impediria a ao bloqueadora de MinCD. Como a MinE estaria sequestrada na regio mediana, a protena no estaria disponvel para interferir com a atividade de MinCD nos polos. Dados mais recentes indicam que alm das protenas Min, os fosfolipdeos de membrana tambm teriam papel na seleo do stio de septao. Uma das primeiras protenas que participam do processo de septao, FtsA ou ZipA, poderiam reconhecer e interagir com um domnio fosfolipdico situado da poro central da membrana da clula, permitindo assim a ligao de FtsZ.

Adaptado de Mileykovskaya, E. & Dowhan, W. (2005) Curr. Op. Microbiol., 8:135142.

Esquema do ciclo celular. (a) A nova clula filha apresenta a origem e a terminao de replicao do DNA ("o" verde, oriC e "T" vermelho, de lado, respectivamente); o sistema Min (bolas verdes e rosas) ligado aos plos, ou oscilando entre os plos; domnios lipdicos nos plos (vermelho). (b) O cromossomo sofre uma rotao, trazendo a oriC para a poro central, onde formado um domnio lipdico rico em cardiolipina (vermelho). O DNA comea a ser replicado pela DnaA, e pela montagem do replissomo (pentgono). (c,d) As origens recmreplicadas se movem em direo aos plos, liberando o domnio lipdico central para agora interagir com FtsZ (prpura). (e) Organizao da maquinaria de diviso (multicolorida) e converso do domnio central em futuros plos. (f) Em E: coli, MinD (rosa) e seu domnio Cterminal (cinza) trocam ADP por ATP (direita), expondo a poro C-terminal, que interage com lipdeos de membrana nos plos. O polmero de MinD-ATP pode crescer em direo ao centro. Prximo ao centro, a ligao de MinE (verde) induz a hidrlise de ATP, levando MinD para a conformao MinD-ADP, despolimerizando-o e voltando para os plos. (g) Vrias molculas de DnaA (amarelo) associadas a ATP ou ADP. Somente quando ligada a ATP a DnaA (diagrama da direita) capaz de se ligar prximo oriC (azul e verde), abrir o DNA e permitir a montagem do replissomo. A forma inativa, DnaAADP ligada oriC reciclada na membrana (vermelho). Formao do septo de diviso e a separao das clulas filhas Estudos indicam que uma protena presente em E. coli, denominada FtsZ, desempenha importante papel na formao do septo e separao das clulas filhas, durante o processo de

diviso

celular.

A protena FtsZ forma um anel no stio da diviso celular, sugerindo um papel estrutural para esta protena neste processo. Atualmente sabe-se que a FtsZ tem homologia com as pores que se ligam ao GTP da tubulina, sendo os cristais das duas muito semelhantes e que tambm atua como GTPase. A FtsZ hidrolisa o GTP aps formar estruturas semelhantes a polimeros de tubulina e vem sendo encontrada (ou homlogos) em um grande nmero de espcies de Bacteria e Archaea estudadas at o momento, formando um anel no stio de diviso.

Homlogos de FtsZ j foram detectados em clulas vegetais, onde mutaes nestes genes impedem a diviso dos cloroplastos, reforando a hiptese de sua participao na diviso celular e tambm a teoria da endossimbiose. Componentes da maquinaria de diviso celular Durante a diviso, vrias protenas so recrutadas para o anel formado por FtsZ: FtsA, FtsQ, FtsW, FtsL, FtsN, FtsK, FtsI (PbP3) e ZipA, que se organizam em um complexo para realizar a diviso. Exceto por FtsZ, FtsA e ZipA, todas as demais apresentam dominnios transmembranosos e periplasmticos, indicando que atravessam a membrana citoplasmtica. O anel FtsZ localiza-se exatamente no centro de uma clula vegetativa bacilar, como E. coli, sugerindo uma pr-determinao do local, provavelmente mediada por MinE. Durante a diviso o anel FtsZ comea a se contrair, pela remoo sucessiva de suas subunidades, as quais migram para as futuras regies centrais das novas clulas filhas. Assim, acredita-se que os stios de diviso da prxima gerao j esto presentes nas clulas me, sendo o processo de montagem e desmontagem bastante rpido.

Formao do septo e separao das clulas filhas (Adaptado de Margolin, W. ASM News 65, 1999)

Seleo do stio de diviso durante a diviso celular assimtrica Em B. subtilis, os stios polares so utilizados para a formao do septo apenas durante a esporulao. Quando crescendo vegetativamente, B. subtilis utiliza a regio mediana para a formao do septo de diviso entretanto, em condies desfavorveis, o stio de septao passa para um dos polos, permitindo a esporulao. Durante o crescimento vegetativo, B. subtilis seria semelhante a E. coli, com MinCD atua conjuntamente, provavelmente com a protena de funo igual MinE, ainda no descoberta, que suprimiria o uso dos stios polares para a diviso. Havendo um estmulo para a esporulao, a especificidade topolgica do sistema seria revertida, ocorrendo liberao dos stios polares. Um modelo explicativo implicaria na existncia de duas MinE, com diferentes propriedades topolgicas, que determinariam a localizao central ou subterminal do septo. Reproduo pela formao de esporos mltiplos, inativos - Metabacterium polyspora Esta bactria Gram positiva habita o trato GI de cobaias e produz mltiplos (at 9) endosporos. O ciclo de vida desta bactria requer que o organismo circule pelo trato GI, ou seja, depende da natura coprfaga de seu hospedeiro. Esporos de M. polyspora so isolados das fezes do hospedeiro e somente estes esporos maduros sobrevivem passagem pelo estmago, indo germinar no intestino delgado (figura abaixo). Algumas clulas fazem fisso

binria neste estgio, mas a maioria esporula. A partir do intestino delgado, as bactrias se depositam no ceco, ondem terminam de esporular. Ao que parece, os pr-esporos ou endosporos maduros no so capazes de realizar fisso binria. Os esporos passam pelo ceco e finalmente so eliminados nas fezes, podendo ser novamente ingeridos pelo hospedeiro, recomeando o ciclo. A esporulao em M. polyspora diferente, com uma diviso iniciada nos dois plos e o DNA vai para os dois compartimentos. Aps o englobamento, o pr-esporo pode se dividir, produzindo outros pr-esporos que amadurecem. Assim, existem 3 ou mais cpias do genoma.

Adaptado de Angert, E.R. (2005). Nature Rev. Microbiol., 3:214-224.

Formao de mltiplos esporos em M. polyspora. a-g: fluorescncia especfica para membrana e capas de esporos. a: as clulas se dividem nos dois plos. b: pr-esporos englobados pela clula me. c. pr-esporos capazes de fazer fisso binria (a seta indica um novo septo de diviso formado). d: diviso e crescimento do pr-esporo. e: amadurecimento do pr-esporo, f: M polyspora com 7 pr-esporos. g: clula que emerge do esporo, se divide nos plos e comea a esporular. h: micrografia de contraste, mostrando fisso binria em M. polyspora, um evento raro.

O processo de reproduo em Epulopiscium fischelsoni - uma bactria vivpara Desde a sua descoberta, o gnero Epulopiscium tem fascinado os microbiologistas, por suas caractersticas extremamente diferentes daquelas observadas nas bactrias comumente estudadas. Alm de ser nica por suas dimenses (podendo atingir cerca de 600 a 800 nm), estes organismos apresentam um tipo vivparo de reproduo. Dados recentes da literatura revelam que as clulas de Epulopiscium so capazes de gerar de 1 a 7 clulas filhas ativas, em seu interior. Ao que parece, o processo se assemelha esporulao, envolvendo a condensao da molcula de DNA duplicada, que normalmente dirige-se aos plos da clula me. Estudos envolvendo anlises microscpicas revelam que aps o perodo de condensao e migrao do DNA para as extremidades celulares, este se apresenta descondensado, com as clulas filhas ativas metabolicamente. Geralmente, so produzidas 2 clulas filhas, estando uma em cada polo. No entanto, quando so geradas mais que 2 clulas filhas, observa-se a condensao do DNA em regies medianas da clula me, situadas imediatamente abaixo da parede celular.

Esquema geral de uma clula de Epulopiscium originando uma clula filha (Adaptado de Angert & Clements (2004) Mol. Microbiol., 51:827835)

Estes resultados so bastante recentes, embora em 1998 tenha sido publicado um artigo descrevendo a ocorrncia de "vesculas contendo nucleides" neste organismo. Muito

pouco se sabe ainda sobre o processo de reproduo neste organismo, embora os dados obtidos no estudo referente figura acima descrevam tambm a ocorrncia do anel formado pelas protenas FtsZ. Assim, possivelmente em um futuro no muito distante, novas informaes estaro disponveis acerca do processo vivparo de reproduo neste procarioto.

Metabolismo Microbiano
Classes de organismos, quanto s fontes de energia e carbono Energia: definida como a capacidade de produzir trabalho

Os organismos podem ser classificados em dois grandes grupos, de acordo com a forma que obtm sua energia:os fototrficos, que obtm sua energia a partir da energia luminosa, pela fotossntese e os quimiotrficos, que obtm sua energia a partir da utilizao de compostos qumicos, envolvendo especialmente reaes de oxidao e reduo. Em relao s fontes de carbono, os organismos podem ainda ser classificados como autotrficos, quando utilizam fontes inorgnicas de carbono (CO2) e heterotrfico, quando as fontes de carbono so de natureza orgnica.

Inicialmente, sero discutidos os processos de produo de energia em organismos quimiotrficos heterotrficos, uma vez que estes so bastante conhecidos e estudados metabolicamente. Nos organismos quimiotrficos, a energia obtida basicamente atravs de reaes de oxirreduo, tendo como substratos os nutrientes adquiridos pelas clulas. Todo e qualquer nutriente, exibem uma energia associada aos eltrons presentes nas ligaes interatmicas e, dependendo da estabilidade na distribuio desta energia, podemos ter compostos com ligaes ricas em energia, ou seja, ligaes instveis, que facilmente liberam a energia contida. Assim, nos organismos quimiotrficos, pode-se falar em energia qumica: aquela liberada quando compostos orgnicos ou inorgnicos so oxidados. Reaes de oxi-reduo Oxidao => remoo de eltrons (ou tomos de hidrognio) de um tomo ou molcula. Reduo => Ganho de eltrons (ou tomos de hidrognio) de um tomo ou molcula. Tal definio decorre do fato de que frequentemente, estas reaes envolvem a transferncia no somente de eltrons, mas sim de tomos de hidrognio (na forma de H+). Como os eltrons no podem ficar isolados, soltos, estes devem fazer parte de tomos ou molculas. Assim, toda reao de oxidao requer acoplada uma reduo. Assim, o composto que foi oxidado denomina-se de doador de eltrons, enquanto aquele reduzido o aceptor de eltrons. Mecanismos de gerao de ATP Os organismos apresentam trs mecanismos de fosforilao para a gerao de ATP: 1) Fosforilao em nvel de substrato: onde o ATP gerado pela transferncia de um grupamento fosfato de alta energia a partir de um composto fosforilado ao ADP. Esta ligao rica em energia geralmente foi adquirida na reao onde o substrato foi oxidado. 2) Fosforilao oxidativa: Neste caso, os eltrons so tranferidos do composto orgnico, atravs de uma srie de carreadores a um aceptor final, sendo que a transferncia dos eltrons entre os diferentes carreadores libera energia, onde parte utilizada na gerao de ATP, pela quimiosmose. 3) Fotosforilao: que ocorre em clulas que contm pigmentos que absorvem luz. Neste caso, a energia luminosa, convertida em ATP e NADPH, que sero utilizados para a biossntese, empregando tambm uma cadeia de transporte de eltrons.

Processos onde h a produo de energia, em quimiotrficos A produo de energia nos organismos quimiotrficos: pode, a grosso modo, ser dividida em trs categorias: fermentao, respirao aerbia e respirao anarbia. - Fermentao: processo que ocorre na ausncia de aceptores finais (anaerbio). - Respirao: oxignio ou outro agente oxidante atua como aceptor final (aerbia ou anaerbia). Uma vez que estes trs processos envolvem reaes de oxirreduo, podemos diferenci-los genericamente, de acordo com os doadores inciais e aceptores finais de eltrons. Assim, temos: Fermentao: processo onde o doador inicial e o aceptor final de eltrons correspondem a molculas orgnicas. Desta forma, a fermentao um processo onde ocorre oxidao parcial dos compostos orgnicos, que podem ser acares, protenas, cidos, entre outros. Como o processo parcial, h apenas uma pequena frao de energia liberada. Nas fermentaes, o ATP gerado a partir da fosforilao em nvel de substrato. Por exemplo, aps a quebra da glicose, originando cido pirvico, este pode ser convertido a outro composto orgnico, por um processo de fermentao. Assim, a fermentao um processo que no depende do ciclo de Krebs, ou da cadeia de transporte de eltrons. Neste tipo de reao, os eltrons so transferidos das coenzimas reduzidas (NADH, NADPH) ao cido pirvico ou derivados, regenerando-os para novos ciclos de gliclise. Vrios tipos de fermentao so observados em diferentes microrganismos, sendo os exemplos mais conhecidos a fermentao alcolica e a fermentao ltica. Tipos bsicos de fermentao: Ltica (homo ou heteroltica) => cidos ltico, actico, frmico, etanol (Lactobacillus, Streptococcus, Leuconostoc). Propinica: Propinico, actico e CO2 (Propionibacterium, Veillonella).

Acetona-Butrica: cido butrico, acetona, butanol, isopropanol, cido actico, cido frmico, etanol, H2 e CO2 (Clostridium, Eubacterium, Bacillus).

Actica:

actico,

glucnico

(Acetobacter).

Aerogenes-coli-tfico: Frmico, actico, ltico, succnico, etanol, 2,3-butilenoglicol, H2 e CO2 (Escherichia, Enterobacter, Salmonella).

Exemplos de fermentaes (Adaptado de Tortora et al., Microbiology, an introduction, 1996)

Respirao: Processo onde o doador inicial de eltrons oxidado, tendo como aceptor final de eltrons um composto inorgnico. Quando o aceptor final o oxignio, a respirao denominada aerbia e quando o aceptor outro composto (Sulfato, nitrato), denominada anaerbia. Em todos os processos de respirao temos a participao de uma cadeia de transporte de eltrons. Respirao Aerbia Aps a gliclise, o cido pirvico convertido a actil-CoA, que entra no ciclo de Krebs, onde ocorrem uma srie de reaes de oxirreduo, que transferem a energia para coenzimas, principalmente NAD+, reduzindo-as. Esta energia armazenada ser transferida, levando formao de ATP, pela cadeia de transporte de eltrons, localizada na membrana citoplasmtica. Esta cadeia de transporte corresponde a uma srie de molculas transportadoras (flavoprotenas, citocromos e ubiquinonas), que sofrem reaes de oxirreduo, as quais promovem uma gradual liberao de energia, que dirigir a gerao quimiosttica de ATP.

As cadeias de transporte snao bastante variveis nas diferentes bactrias e uma mesma bactria pode apresentar diferentes cadeias de transporte de eltrons.

Durante o transporte h a produo de ATP, atravs da fosforilao oxidativa, que est ligada ao estabelecimento de um gradiente de prtons atravs da membrana.

Quimiosmose: Estas protenas transportadoras de prtons esto orientadas na membrana de tal forma que possibilita a separao entre prtons e eltrons, sendo os eltrons mandados para a face citoplasmtica da membrana, por transportadores especficos e os prtons para o lado de fora da clula. Ao final do processo, os eltrons so carreados ao aceptor final (O2 na respirao aerbia), que reduzido, formando gua. Para formar gua, precisa de ons H+ do citoplasma, vindos da dissociao da gua. Em decorrncia destes processos, gerada uma formao lquida de OH- no interior da clula, resultando em um gradiente de pH e um potencial eltrico ao longo da membrana (dentro fica negativo e alcalino e fora, positivo e cido). A membrana fica ento energizada (fora motora de prtons). Esta energia eltrica pode ento ser utilizada transporte de ons, movimentao flagelar ou na formao de ATP. Formao de ATP: A enzima ATPase (um canal para o transporte de prtons), ligada membrana, possui 2 partes: uma cabea em multi-subunidades, presente na face interna, e uma cauda, condutora de prtons, que atravessa a membrana. Ela cataliza a reao entre ATP e ADP + Pi. Atuando em uma direo, ela cataliza a formao de ATP (fosforilao oxidativa) pela entrada controlada de prtons (a formao do gradiente dada com gasto de energia, enquanto sua dissipao controlada libera energia).

Exemplos da respirao aerbia (Adaptado de Tortora et al., Microbiology, an introduction, 1996)

Respirao anaerbia: Neste processo, o aceptor final de eltrons no o oxignio, sendo substitudo por nitrato, sulfato ou carbonato. Uma vez que parte do ciclo de Krebs no funcional em condies de anaerobiose, e tambm pelo menor nmero de molculas transportadoras de eltrons presentes, este processo rende menor quantidade de energia, mas ainda fornece mais que na fermentao. Eventualmente, ocorre em organismos que realizam respirao aerbia. Fotossntese: Um dos processos mais importantes na terra, realizado por organismos autotrficos, que possibilita a converso da energia luminosa em energia qumica, a qual ento utilizada para a converso do CO2 da atmosfera em compostos de carbono reduzidos, especialmente acares. Neste processo, os eltrons so obtidos a partir dos tomos de hidrognio da gua. A fotossntese pode ser dividida em duas etapas: fase clara a energia luminosa utilizada na converso de ADP a ATP e na reduo de NADP a NADPH. H ainda a fase escura, os eltrons so utilizados, juntamente com o ATP, para reduzir o CO2 a compostos orgnicos. Reaes luminosas: correspondem fotofosforilao, onde a energia luminosa absorvida pelos pigmentos (clorofila, bacterioclorofila), excitando os eltrons, que passam para a primeira de uma srie de molculas transportadoras, semelhante cadeia de transporte de eltrons. Com isso, h a passagem de prtons pela membrana, com a converso de ADP em ATP. A fotofosforilao pode ser de dois tipos: cclica e acclica. No processo cclico, o eltron retorna clorofila, enquanto na acclica, processo mais comum, os eltrons liberados no retornam clorofila, sendo incorporados ao NADPH. Os eltrons perdidos so subsitudos por outros, provenientes da gua ou outro composto oxidvel, tal como H2S. (Na cclica, quanto h a absoro dos quanta pela bacterioclorofila, a molcula se excita, perdendo um eltron, tornando-se um agente oxidante potente. O eltron transferido num processo semelhante a CTE (Ferredoxina-ubiquinona-cit b-cit f) e retorna bacterioclorofila. Entre b e f h a produo de ATP. Na acclica (algas) h dois sistemas de pigmentos que tambm perdem eltrons, passam por um processo semelhante CTE, mas o eltron usado para reduzir o NADP a NADPH). Reaes escuras: no requerem a luz, para que ocorram e incluem o ciclo de Calvin-Benson, onde o CO2 fixado.

Exemplos da fotossntese (Adaptado de Tortora et al., Microbiology, an introduction, 1996)

Outros tipos metablicos Fotoautotrficos: Utilizao de compostos inorgnicos como doadores: Ocorre nos quimiolitotrficos, sendo as fontes o H2S, H2 e NH3. Os processos so similares respirao aerbia. A fonte de carbono geralmente o CO2. Quimiolitotrficos: O CO2 reduzido a gliceraldedo 3P (fixao), que ser metabolizado via o ciclo de Calvin. A energia para a realizao destes processos advm da oxidao de compostos inorgnicos (H2, NH4, NO3).

As bactrias prpuras e verdes usam a luz para produzir ATP; produzem NADPH a partir da oxidao de H2S ou compostos orgnicos (fotossntese anoxignica). As algas e cianobactrias geralmente obtm o NADPH pela hidrlise da gua, sendo um evento mediado pela luz (oxignica).

Biofilmes Microbianos
Introduo Nossa percepo de bactrias como organismos unicelulares baseia-se essencialmente no conceito de culturas puras, nas quais as clulas podem ser diludas e estudadas a partir de culturas lquidas. Como praticamente todos os conceitos e conhecimentos microbiolgicos foram adquiridos a partir do estudo de organismos em culturas puras, somente h alguns anos comeamos a entender que, na realidade, a maioria das bactrias se encontra na natureza vivendo em comunidades, de maior ou menor estruturao. O tipo de "ecologia" que imaginvamos em relao aos procariotos, ou seja, clulas individuais crescendo de maneira planctnica (livres, em suspenso), raramente encontrado na natureza. Sabe-se atualmente que, quando em seus habitats naturais, via de regra as bactrias so encontradas em comunidades de diferentes graus de complexidade, associadas a superfcies diversas, geralmente compondo um biofilme, isto , um ecossistema estruturado altamente dinmico, que atua de maneira coordenada. Assim, embora possam ter uma existncia planctnica independente, este tipo de vida parece ser eventual. Os biofilmes, complexos ecossistemas microbianos, podem ser formados por populaes desenvolvidas a partir de uma nica, ou de mltiplas espcies, podendo ser encontrados em uma variedade de superfcies biticas e/ou abiticas. Desta maneira, muitos autores definem biofilmes como associaes de microrganismos e de seus produtos extracelulares, que se encontram aderidos a superfcies biticas ou abiticas. Geralmente, a dinmica de formao de um biofilme ocorre em etapas distintas. Inicialmente temos or organismos denominados colonizadores primrios, que se aderem a uma superfcie, geralmente contendo protenas ou outros compostos orgnicos. As clulas aderidas passam a se desenvolver, originando microcolnias que sintetizam uma matriz exopolissacardica (EPS), que passam a atuar como substrato para a aderncia de microrganismos denominados colonizadores secundrios. Estes colonizadores secundrios podem se aderir diretamente aos primrios, ou promoverem a formao de coagregados com outros microrganisos e ento se aderirem aos primrios.

(Adaptado de Rickard et al., Trends Microbiol., 11:94-100, 2003)

Desenvolvimento de um biofilme. (a) Colonizao primria de um substrato; (b) crescimento, diviso celular e produo do exopolissacardeo (EPS), com o desenvolvimento de microcolnias; (c) coadeso de clulas individuais, de clulas coagregadas e grupos de clulas idnticas, originando um biofilme jovem, de mltiplas espcies; (d) maturao e formao de mosaicos clonais no biofilme maduro. Assim, o biofilme corresponde a uma "entidade" dinmica pois, de acordo com os microrganismos que o compem, teremos consies fsicas, qumicas e biolgicas distintas. Estas alteraes fazem com que cada biofilme seja nico, de acordo com os microrganismos presentes. Neste sentido, ao longo do tempo a composio microbiana dos biofilmes geralmente sofre alteraes significativas. A figura abaixo ilustra no somente a estruturao fisico-qumica de um biofilme, mas tambm sua evoluo e amadurecimento, dependendo das relaes estabelecidas pelos microrganismos presentes.

Estgios de formao e vida de um biofilme, determinados por fatores fsicos, biolgicos e ambientais (Adaptado de Jenkinson & Lappin-Scott, Trends Microbiol., 9:9-10, 2001)

Comportamento coletivo H vrias dcadas, foi proposto que as bactrias poderiam corresponder a organismos interativos, capazes de atuar coletivamente, facilitando sua adaptao s alteraes ambientais. Para que um biofilme de uma ou vrias espcies seja formado, necessrio o estabelecimento de um comportamento multicelular, que se reflete em atividades coordenadas de interao e comunicao dos vrios organismos. Assim, os biofilmes no so simples camadas viscosas contendo organismos. Estes representam sistemas biolgicos altamente organizados, onde as bactrias estabelecem comunidades funcionais estruturadas e coordenadas. Um dos mecanismos de comunicao interbacteriana que vem se mostrando extremamente importante na formao e desenvolvimento de biofilmes corresponde ao quorum sensing. Comunidades associadas s superfcies Os procariotos podem habitar qualquer ambiente adequado s formas de vida superiores, assim como vrios ambientes inspitos maioria das formas de vida. Tal fato decorrente de sua inigualvel diversidade metablica e plasticidade fenotpica. Um dos importantes aspectos associados a esta ubiqidade est relacionado capacidade destes organismos migrarem para diferentes nichos, onde podem se propagar. O mecanismo mais comum que permite a migrao dos procariotos corresponde motilidade, seja de origem flagelar, deslizante, ou de outro tipo. No entanto, so conhecidos mecanismos que tambm permitem a migrao bacteriana.

Por exemplo, algumas espcies podem sintetizar celulose, originando uma pelcula que mantm as clulas prximas interface r-gua, ou na superfcie de plantas. Bactrias fotossintetizantes podem se posicionar nas colunas de gua, em resposta intensidade luminosa, pela produo de vesculas de gs. Outras, apresentam magnetossomos,permitindo movimentaes ao longo dos campos magnticos da Terra. Um importante mecanismo na formao de comunidades corresponde agregao ou aderncia, que otimiza tanto as interaes celulares como tambm as taxas de sedimentao dos organismos. As comunidades bacterianas tm importantes papis na natureza, seja na produo e degradao de matria orgnica, na degradao de poluentes, ou na reciclagem de nitrognio, enxofre e vrios metais. A maioria destes processos requer o esforo coletivo de organismos com diferentes capacidades metablicas. Assim, os biofilmes participam metabolizando esgotos e guas contaminadas com petrleo, na nitrificao, na reciclagem de enxofre oriundo de drenados cidos de minas (onde o pH 0) e em vrios outros processos. Outro tipo de biofilme est associado s partculas em suspenso, muitas vezes denominadas neve marinha, extremamente importante nas transformaes biogeoqumicas do carbono em ambientes pelgicos, na metanognese, fixao de nitrognio e produo de enxofre. Estes achados revelam que nos biofilmes podem ser criadas condies de anaerobiose, em ambientes normalmente aerbios.

(Adaptado de Davey & OToole, Microbiol. Mol. Biol. Rev., 64:847-867, 2000)

Exemplo da ecologia de comunidades microbianas. As quatro microcolnias centrais correspondem a organismos que geram e consomem hidrognio. Os fermentadores utilizam acares e produzem cidos orgnicos, utilizados pelos produtores de hidrognio. Alm das

interaes metablicas, a comunicao intra e intercelular pode ser mediada por molculas sinalizadoras.

As interaes que permitem a agregao de diferentes espcies, ou mesmo gneros microbianos em um biofilme geralmente envolvem a participao de adesinas (molculas de adeso presentes em fmbrias ou dispersar ao longo da superfcie celular), que reconhcem receptores especficos na superfcie de outras clulas, ou em diversos tipos de substratos. Assim, a figura abaixo esquematiza a formao de um biofilme aqutico, revelando a complexidade tanto estrutural como temporal deste ecossistema. As horas correspondem ao tempo mdio necessrio adeso dos diferentes microrganismos, revelando a dinmica de formao e estruturao deste biofilme.

Esquema de coagregaes envolvendo bactrias aquticas. (Adaptado de Rickard et al., Trends Microbiol., 11:94-100, 2003)

Estrutura dos Biofilmes A maioria dos biofilmes exibe uma certa heterogeneidade, existindo conjuntos de agregados celulares distribudos ao longo da matriz exopolissacardica, que exibem densidades variveis, originando aberturas e canais por onde a gua pode trafegar.

Corte lateral, revelando a estrutura de um biofilme artificial de V. cholerae. A intensidade da cor est associada densidade celular. (Adaptado de Davey & OToole, Microbiol. Mol. Biol. Rev., 64:847-867, 2000)

As microcolnias que compem um biofilme podem ser de uma ou vrias espcies, dependendo das condies ambientais. Por exemplo, em locais de grande stress mecanico, tais como a superfcie dental, o biofilme bastante compactado e estratificado. Os espaos intersticiais (canais) tambm so parte importante dos biofilme, pois permitem a circulao de nutrientes e a troca de metablitos. Por que formar um biofilme? Acredita-se que a formao de biofilmes esteja associada, por exemplo, proteo contra o ambiente, ou seja, bactrias em um biofilme encontram-se abrigadas e em relativa homeostase, graas presena da matriz exopolissacardica. A matriz contm vrios componentes: exopolissacardeo, protenas, cidos nuclicos, entre outros. O exopolissacardeo secretado para o meio externo, sendo de diferentes composies. Ao que parece, o EPS tem diferentes estruturas e funes, dependendo das comunidades e/ou condies ambientais. Este polmero pode impedir fisicamente a penetrao de agentes antimicrobianos no biofilme, principalmente aqueles hidroflicos e carregados positivamente. Em alguns casos o EPS capaz de sequestrar ctions, metais e toxinas. Por estas razes, os biofilmes podem corresponder a excelentes mecanismos de transferncia de metais nos ecossistemas, pois vrios organismos marinhos pastadores se alimentam de biofilmes. Foi tambm descrito que o EPS teria papel de proteo contra radiaes UV, alteraes de pH, choques osmticos e dessecao. Disponibilidade de nutrientes e cooperatividade metablica Os canais aquosos dos biofilmes podem ser comparados a um sistema circulatrio primitivo, permitindo a troca de nutrientes e metablitos, assim como a remoo de metabtilos potencialmente txicos. Em um biofilme, torna-se possvel a cooperao metablica. Por exemplo, a degradao de compostos orgnicos complexos, originando metano e CO2 durante

uma digesto anaerbia, requer pelo menos trs grupos de organismos. As bactrias fermentativas iniciam o processo, gerando cidos e lcoois, que so utilizados por bactrias acetognicas. Finalmente, as metanognicas convertem o acetato, CO2 e hidrognio, produzindo metano. Os biofilmes so ambientes ideais para o desenvolvimento de relaoes sintrficas, que um tipo de simbiose onde dois tipos de organismos metabolicamente distintos dependem um do outro para utilizarem certos substratos, na produo de energia.

Sintrofia em um grnulo de lodo de um reator metanognico. Corantes fluorescentes revelam organismos metanognicos (em verde) e bactrias que oxidam propionato (em vermelho). A cor amarela resulta da combinao verde e vermelho, revelando microcolnias sintrficas interligadas a cadeias de metanognicos.
(Adaptado de Davey & OToole, Microbiol. Mol. Biol. Rev., 64:847-867, 2000)

Aquisio de novas caractersticas genticas Vrias bactrias possuem plasmdeos, conferindo as mais diversas caractersticas. Estes podem ser transferidos horizontalmente por conjugao, para diferentes espcies presentes em um bioflme. Estudo foram realizados com placas dentais artificiais, formadas inicialmente por bactrias do gnero Streptococcus. Uma linhagem de Bacillus, contendo um transposon conjugativo albergando genes de resistncia tetraciclina, foi inserida no sistema e transferiu este transposon para clulas de Streptococcus. A transduo pode, teoricamente, ser responsvel pela transferncia horizontal de genes em biofilmes. Tal hiptese baseia-se no fato de sistemas marinhos e de gua doce

contm uma enorme abundncia de bacterifagos (cerca de 108/ml), sendo responsveis pela lise de um grande nmero de bactrias. Diariamente, de 10 a 20% da populao bacteriana lisada por fagos, os quais tm relevante impacto na cadeia alimentar microbiana uma vez que podem aumentar as taxas de mortalidade e/ou reduzir as taxas de crescimento em todos os nveis trficos. Estudos recentes revelam que os fagos podem estruturar ou restruturar comunidades microbianas. Em uma anlise, onde uma populao de cianobactrias foi praticamente exterminada pelos fagos, observou-se a presena de novas espcies capazes de degradas os compostos orgnicos que surgiram. Papel dos biofilmes nas doenas At o momento, a vasta maioria das doenas infecciosas vem sendo tratada eficientemente com antibiticos entretanto, de acordo com as pesquisas mais recentes, sabemos que tal tipo de estratgia pode ser ineficaz em duas situaes: 1) com organismos exibindo resistncia inata droga e 2) em bactrias presentes em biofilmes. Em um biofilme, as bactrias podem ser 1000 vezes mais resistente a um antibitico, quando comparadas s mesmas clulas planctnicas, embora os mecanismos envolvidos nesta resistncia sejam ainda pouco conhecidos. Dentre os possveis mecanismos, acredita-se que possa haver a inativao da droga por polmeros ou enzimas extracelulares, ou a ineficincia da droga em decorrncia de taxas de crescimento muito lentas no interior dos biofilmes.

Infeces assciadas a biofilmes geralmente so de natureza recorrente, visto que as terapias antimicrobianas convencionais eliminam predominantemente as formas planctnicas, deixando as clulas ssseis livres para se reproduzir e propagar no biofilme aps o tratamento. Para tornar o quadro ainda mais grave, as bactrias presentes nos biofilmes encontram-se mais protegidas contra o sistema imune do hospedeiro. Exemplos tpicos de doenas associadas a biofilmes incluem as infeces de implantes tais como vlvulas cardacas, catteres, lentes de contato, etc.

Os biofilmes podem ainda promover doenas se formados em tecidos, tais como nas infeces pulmonares provocadas por Pseudomonas aeruginosa, em pacientes com fibrose cstica, que so suscetveis a infeces crnicas por esta bactria. A periodontite outro exemplo de doena provocada por biofilmes. O principal microrganismo associado a esta doena, Porphyromonas gingivalis, coloniza uma grande de superfcies orais direta ou indiretamente, sendo ento capaz de invadir as clulas das mucosas e liberar toxinas.

Biofilmes e resistncia s drogas, devido densidade e tipos celulares, excluso fsica da droga, expresso de genes de resistncia, quorum sensing e alteraes da superfcie celular. (Adaptado de Mah & OToole, Trends Microbiol., 9:34-39, 2001)

Esquema do desenvolvimento temporal de uma placa dental. (Adaptado de Rickard et al., Trends Microbiol., 11:94-100, 2003)

Gentica da formao dos biofilmes Quatro organismos, P. aeruginosa, P. fluorescens, E. coli e V. cholerae, vm sendo intensamente estudados, como modelos na formao de biofilmes de espcies nicas. Este processo pode ser subdivido em etapas: a) Aderncia inicial superfcie, b) Formao das microcolnias, c) maturao das microcolnias em um biofilme contendo a matriz de EPS.

Estudo microscpico da formao de um biofilme por (Adaptado de V. Watnick & Kolter, J. cholerae Bacteriol., Etapas que uma nova espcie bacteriana realiza, durante sua incorporao em um biofilme

182:26752679, 2000)

(Adaptado de Watnick & Kolter, J. Bacteriol., 182:2675 2679, 2000)

Ao que parece, o processo se inicia quando as bactrias percebem determinadas condies ambientais, que disparam o fenmeno de transio de clulas planctnicas em ssseis. Assim, Pseudomonas aeruginosa e P. fluorescens parecem ser capazes de formar bioflmes sob quase todas as condies, enquanto E. coli somente os forma se estiver em meios mnimos suplementados com aminocidos, ou em meios pobres em nutrientes. Diferentes vias genticas podem ser utilizadas na formao de biofilmes. Por exemplo, V. cholerae parece ter diferentes vias para realizar a aderncia inicial, dependendo da superfcie. Assim, quando no intestino, este organismo utiliza a fmbria Tcp para realizar a colonizao, embora tal estrutura no tenha papel na etapa inicial de formao de biofilmes em superfcies abiticas, sendo o processo mediado por um outro tipo de fmbria, denominada Msh. Incio de formao do biofilme A partir de estudos com linhagens mutantes de P. aeruginosa, foi relatado que, quando as clulas no sintetizam flagelos, so incapazes de realizar as interaes iniciais com as

superfcies. Mutantes que no produzem a fmbria tipo IV (associada movimentao das clulas em uma superfcie) so capazes de se aderir formando uma monocamada, ao invs de microcolnias. Existem uma protena, denominada Crc que, alm de atuar regulando o metabolismo das clulas, tambm regula a expresso de dois genes que codificam protenas importantes na montagem da fmbria tipo IV. O LPS da membrana externa tambm tem papel na adeso inicial. Em E. coli, os flagelos tambm so importantes nesta primeira etapa de formao do biofilme. H ainda a participao de fmbrias do tipo I, uma protena de membrana externa, Ag43 e do LPS. Em V. chloreae acredita-se que o processo seja bastante similar ao de E. coli. Maturao do biofilme

Aps a etapa de interaes iniciais, comea a haver a formao das microcolnias, normalmente associada produo de EPS. Outra etapa importante corresponde organizao da arquitetura do biofilme que, em P. aeruginosa parece ter a participao do "quorum sensing".

Estgios iniciais na formao de biofilmes de Gram negativos (P. aeruginosa, E. coli, e V. cholerae). (A) Em P. aeruginosa, os flagelos so necessrios para aproximar a bactria da superfcie, enquanto o LPS media as primeiras interaes, havendo talvez a participao de protenas da membrana externa. Quando formam monocamadas, fmbrias tipo IV mediam o

movimento pulsante, necessrio formao de microcolnias. A produo destas fmbrias regulada, em parte, por sinais nutricionais (Crc), havendo ainda a ativao de genes envolvidos na sntese de alginato e represso de genes flagelares. A formao do biofilme maduro envolve a participao de homoserina lactonas sinalizadoras. (B) Em E. coli, os flagelos aproximam as clulas do substrato, enquanto as primeiras interaes so mediadas por fmbris tipo I e a protena de membrana externa Ag43. O EPS, cido colnico resonsvel pela arquitetura do biofilme. (C) V. cholerae, tambm usa os flagelos na aproximao, sendo a ligao mediada por fmbrias MshA e talvez outras protenas.
(Adaptado de Davey & OToole, Microbiol. Mol. Biol. Rev., 64:847-867, 2000)

Disperso Em determinados momentos, os biofilmes sofrem disperso, liberando microrganismos que podem vir a colonizar novos ambientes. s mecanismos genticos associados disperso no so ainda bem conhecidos.

Existem trs tipos de processos de disperso: expansiva, quando parte das clulas de uma microcolnia sofrem lise e outras retomam a motilidade, sendo ento liberadas da estrutura. Outro tipo de disperso envolve a fragmentao do biofilme, onde pores de matriz extracelular associadas a microrganismos so liberadas. Finalmente, o terceiro tipo de disperso, denominada superficial, ocorre pelo crescimento do prprio biofilme como um todo.

Quorum Sensing
Introduo

O quorum sensing (sensor de quorum) corresponde a um processo de comunicao intra e interespcies microbianas, que permite aos microrganismos apresentarem alteraes fenotpicas marcantes quando estes se encontram em altas densidades populacionais. A descoberta deste tipo de interao microbiana tornou evidente o conceito que, embora geneticamente e estruturalmente mais simples, os microrganismos tm a capacidade de se comportar como organismos complexos, capazes de se comunicar e agir coordenadamente, respondendo a diferentes estmulos de modo unificado. Este interessante processo foi descoberto em bactrias luminescentes marinhas, habitantes de orgos luminescentes de lulas e certos peixes.

Lula exibindo luminescncia

H muitos anos conhecia-se a existncia de bactrias marinhas (por exemplo Vibrio fischeri) capazes de emitir luminescncia. No entanto, este fenmeno era apenas observado quando os microrganismos encontravam-se confinados nos orgos de luz dos animais. Quando tais bactrias encontravam-se livres na gua do mar, a luminescncia no era observada. Estudos posteriores revelaram que durante o dia as lulas expeliam as bactrias de seus orgos de luz mas, medida que a noite se aproximava, estas passavam a acumumular os microrganismos, que aps um determinado perodo de tempo tornavam-se luminescentes. Em outras palavras, a emisso de luminescncia estava associada densidade populacional bacteriana. Posteriormente o processo que resultava na luminescncia foi esclarecido, sendo denominado quorum sensing, uma vez que correspondia a um mecanismo de comunicao onde os microrganismos monitoravam sua densidade populacional. O mecanismo de Quorum Sensing Atualmente est bem definido que este sensoriamento populacional realizado por meio de pequenas molculas, denominadas autoindutores (AI). Os autoindutores podem ser de diferentes naturezas qumicas: em organismos Gram negativos, via de regra os autoindutores so do tipo N-acil homoserina lactonas (AHL), que correspondem a pequenas molculas que se difundem livremente para dentro e para fora das clulas. Em Gram positivos, normalmente os autoindutores correspondem a pequenos petdeos (hepta ou octapeptdeos) que se ligam a receptores localizados na superfcie das clulas bacterianas. Nos diferentes organismos que realizam o quorum sensing, o processo segue, essencilamente, as mesmas etapas.

Durante o crescimento microbiano, todas as clulas produzem e liberam uma pequena quantidade de autoindutores. Quando a populao se encontra no meio da fase logartmica ou no incio da fase estacionria de crescimentno, a quantidade de autoindutor produzido alcana uma concentrao limite, suficiente para disparr o processo de alterao da expresso gnica. Em termos bastante simples: os autoindutores se ligam a protenas receptoras que so ento ativadas, promovendo a ativao da expresso de certos genes, podendo ainda inibir a expresso de outros genes que se encontravam ativos. Assim, o quorum sensing ativado quando a concentrao de autoindutor atinge um nvel tal que sua ligao a uma protena receptora eficiente, permitindo a ativao transcricional de uma srie de genes. Regulao da bioluminescncia em Vibrio fischeri Para melhor ilustrar o mecanismo de quorum sensing, descreveremos o fenmeno de bioluminescncia apresentado por Vibrio fischeri. Nealson et al., (1970) revelaram que o sobrenadante de culturas densas de V. fischeri continha um composto capaz de induzir a luminescncia em culturas de baixa densidade, sendo por isso denominado "autoindutor". Este autoindutor (VAI - Vibrio AutoIndutor) foi identificado em 1981, como uma N-(3-oxohexanoil)homoserina lactona (OHHL), enquanto os genes regulatrios e estruturais necessrios ao processo de luminescncia (regulon lux) foram descritos em 1984, estando localizados em um segmento de DNA de 9 kb. O regulon lux composto por dois operons que so transcritos em direoes opostas, sendo separados por uma regio intergnica regulatria. O operon da esquerda contm o gene luxR, que codifica o ativador transcricional LuxR, que tambm atua como receptor do autoindutor. O operon da direita contm o gene luxI, que codifica a OHHL sintase. Abaixo do gene luxI, encontram-se os genes estruturais luxCDABE, que codificam as protenas necessrias ao desenvolvimento da bioluminescncia (subunidades a e b da luciferase - luxA e luxB, a redutase - luxC, transferase - luxD e sintetase - luxE). Assim, em qualquer etapa de seu ciclo de vida, as clulas de V. fischeri esto produzindo pequenas quantidades do autoindutor (VAI), que se difunde livremente atravs das membranas da bactria. Nestes estgios onde a populao microbiana ainda pequena, est ocorrendo a ligao do VAI ao seu receptor, LuxR, no entanto, tal ligao ainda transiente. No entanto, medida que a populao aumenta, a quantidade de VAI tambm aumenta, at que atinge uma concentrao limiar, que dispara o processo, resultando na ativao da tanscrio dos operons lux. A protena LuxR modular, sendo constituda por um domnio C-terminal de ligao ao DNA e um domnio N-terminal de ligao OHHL. A OHHL, produzida pelo gene luxI, liga-se

protena LuxR, ativando-a. Esta quando ativada liga-se ao DNA, em um stio especfico, denominado lux box, que corresponde a uma regio de 20 nucleotdeos invertidos repetidos, situada entre os dois operons lux.

O complexo VAI-LuxR liga-se ao lux box e estimula a transcrio dos operons, promovendo uma maior sntese de autoindutor, de protena LuxR e de todo o aparato necessrio luminescncia.

Regulao do operon lux pelo autoindutor de V. fischeri

Outras atividades microbianas associadas ao Quorum Sensing Atualmente so conhecidas centenas de espcies microbianas que realizam o processo de quorum sensing, revelando que tal tipo de comunicao resulta em uma srie de alteraes fenotpicas apresentadas pelas culturas. Dentre as principais atividades microbianas associadas ao quorum sensing temos: - produo de antibiticos - expresso de fatores de virulncia - aquisio do estado de competncia (a capacidade de captar DNA do meio) - transferncia de DNA para outros organismos - fixao de nitrognio Alm destas atividades, cada vez mais est se tornando claro o papel ecolgico desempenhado pelo quorum sensing. Sabe-se que os microrganismos sintetizam autoindutores bastante especficos, reconhecidos apenas por membros da mesma espcie. No entanto, pesquisas revelam que organismos de espcies prximas podem sintetizar autoindutores

semelhantes, capazes de interferir no quorum sensing de outros organismos. Por exemplo, Staphylococcus epidermidis, um habitante da microbiota normal, sintetiza autoindutores que interferem no quorum sensing de S. aureus, um microrgnaismo potencialmente patognico. Acredita-se que este tipo de interferncia tenha como principal funo impedir ou dificultar a colonizao do hospedeiro por organismos invasores. H alguns anos foi descoberto um segundo tipo de autoindutor, denominado AI-2, que parece estar envolvido em um processo mais "geral" de cominucao microbiana. Este AI-2 seria reconhecido por um grande nmero de espcies, talvez atuando como uma molcula que sinaliza aos diferentes organismos a presena de outros microrganismos. Este seria um tipo de molcula que realizaria um "censo" geral da populao. A descoberta do quorum sensing trouxe novas e interessantes perspectivas para o controle microbiano, especialmente no que se refere ao tratamento de doenas infecciosas.

Controle Microbiano
Definies Esterilizao: Destruio ou remoo de todas as formas de vida de um objeto ou habitat. Desinfeco: Processo que promove a inibio, morte ou remoo de vrios microrganismos patognicos e saprfitas, sem eliminar todas as formas de vida. Sanitizao: Processo que leva reduo dos microrganismos, a nveis seguros, de acordo com os padres de sade pblica (elimina 99,9% das formas vegetativas). Anti-sptico: Produto que evita a infeco em tecidos, seja inibindo ou matando os microrganismos. Como so aplicados em tecidos vivos, os anti-spticos so, geralmente, menos txicos que os desinfetantes (agentes aplicadas em materiais inanimados). Germicida: mata microrganismos, mas no endosporos. Cida: Qualquer agente que promova a morte (ex: bactericida, fungicida, algicida) Sttico: Qualquer agente que promova a inibio do crescimento (ex: bacteriosttico, fungisttico) Padro de morte microbiana

Da mesma forma que no crescimento, a morte microbiana um evento que ocorre de forma exponencial. Assim, aps uma rpida reduo do nmero, a taxa de morte pode tornarse mais lenta, devido sobrevivncia de clulas mais resistentes. Condies que afetam a atividade de um agente antimicrobiano, especialmente se tal agente de natureza qumica. 1. Tamanho da populao: Quanto maior a populao, maior o tempo necessrio sua eliminao. 2. Natureza da populao: Se nesta populao de microrganismos existirem endosporos, os quais so muito mais resistente que formas vegetativas, sua eliminao no ocorrer to facilmente. No caso de clulas em diferentes estgios de crescimento - clulas mais jovens tendem a ser mais suscetveis que clulas em fase estacionria. Havendo a presena de membros do gnero Mycobacterium, sua eliminao mais difcil que de outras bactrias no esporuladas, etc. 3. Concentrao do agente: Geralmente, quanto mais concentrado, melhor (exceto lcool). A relao entre a concentrao e a eficincia via de regra no linear. 4. Tempo de exposio: De acordo com normas da OMS, o tempo mnimo de exposio deve ser de 30 minutos. Em casos de agentes esterilizantes, a exposio deve ser tal que a chance de haver sobreviventes de 1 em 106. 5. Temperatura: Dentro de limites, o aumento da temperatura torna o processo mais eficiente. Para agentes qumicos, geralmente o aumento de 1C da temperatura aumenta em 10 vezes a eficincia do processo, o que tambm permite a diluio do agente. 6. Condies "ambientais": pH do meio - quando cido, favorece a eliminao trmica; presena de matria orgnica - dificulta a ao do produto (necessidade de lavagens dos materiais antes do controle por agentes qumicos), seja por proteger o microrganismo ou competir pelo produto em uso. Altas concentraes de acar, protenas ou lipdeos diminuem a penetrabilidade do calor, enquanto o sal pode aumentar ou diminuir a resistncia ao calor. A consistncia do material ou soluo tambm interfere. Controle microbiano por agente fsicos Os principais agentes fsicos que promovem o controle microbiano so: Calor, Filtrao e Radiaes. Eventualmente, outros agentes, tais como as baixas temperaturas, dessecao, podem ser utilizados.

CALOR - Uso disseminado desde pocas remotas, correspondendo ainda um dos agentes fsicos mais prticos e eficientes para a esterilizao e/ou desinfeco. O calor pode ser empregado sob duas formas: seco e mido, tendo a vantagem de apresentar, basicamente, apenas 2 parmetros a serem controlados: tempo e temperatura. Para todos os organismos so definidas as temperaturas cardeais, ou seja, as temperaturas mnima, mxima e tima de crescimento. Assim, quando estes so submetidos a temperaturas superiores temperatura mxima de crescimento, os efeitos letais tornam-se aparentes. A morte um fenmeno que ocorre de forma exponencial, sendo proporcional apenas concentrao inicial da populao. J o tempo para uma determinada frao da populao a ser morta independente da populao inicial. Processos empregando calor: A morte se d pela oxidao de constituintes celulares e desnaturao de protenas e cidos nuclicos. No a melhor maneira de utilizao do calor, uma vez que o ar menos condutor da temperatura que a gua. Calor seco Incinerao (E): processo drstico de eliminao de microrganismos, que destri o produto. Ao rubro (E): processo onde os materiis so levados incadescncia, promovendo a destruio de todos os microrganismos. Flambagem (D): processo onde o material submetido diretamente ao fogo, seja seco ou embebido em lcool. Bastante utilizado na desinfeco de alas de vidro. Estufa esterilizante (E: 160C/2 hs ou 180C/1 h). Amplamente utilizado para vidrarias e outros materiais. Calor mido - Como mencionado anteriormente, um processo mais eficiente devido ao maior poder de penetrao do vapor dgua. A morte decorrente da desnaturao de cidos nuclicos e protenas, podendo tambm romper membranas. Alm disso, o vapor tem maior capacidade de romper as pontes de hidrognio. Autoclave (E - 121C/20 min./1 atm) - Destri esporos, em um pequeno volume, em 10 a 12 minutos. Com volumes maiores, o tempo maior (5 litros => 70 minutos). Frequentemente so utilizados indicadores da eficincia de esterilizao, por exemplo, ampolas contendo esporos de B. stearotermophilus ou de Clostridium PA3679, os quais so inoculados em meios

de cultura aps o processo de esterilizao. Caso haja o desenvolvimento de clulas vegetativas, o processo no foi realizado adequadamente, uma vez que no houve a esterilzao. gua em ebulio (D 100C/30 min.)

A ttulo de comparao, a eliminao de esporos de C. botulinum pela fervura, requer cerca de 5,5 horas. Por outro lado, a 120C, estes esporos so eliminados aps 4 a 5 minutos. Pasteurizao (D - 62,8C/30 min - pasteurizao lenta, ou 71,7C/15 seg pasteurizao rpida) UHT (E): 141C/2 segundos - processo bastante utilizado para o leite e outros alimentos lquidos. FILTRAO - Processo muito til na esterilizao de materiais termolbeis, sendo empregado para lquidos e gases. Estes filtros so geralmente compostos por celulose, acetato, policarbonato, teflon, ou outro material sinttico. Embora o dimetro dos poros possa variar, os mais utilizados so aqueles de 0,2 vrus) das solues e do ar. Dentre os principais tipos de filtros podemos citar: Filtros de profundidade: Correspondem aos filtros mais antigos, constitudos de malha fibrosa ou granular, base de papel, asbestos ou fibra de vidro, arranjados de forma a criar uma srie de camadas aleatrias sobrepostas, formando pequenos canais sinuosos. Assim, os microrganismos ficam retidos nas malhas e/ou adsorvidos superfcie do material. Estes filtros so feitos tambm de terra de diatomceas (Berkefield) ou porcelana (Chamberlain). Na prtica, so usados como pr-filtros, para a remoo de partculas maiores. Muitas vezes so tambm usados na filtrao de ar. Membranas Filtrantes: Correspondem ao tipo mais comum de filtro esterilizante, em microbiologia. So membranas porosas de acetato de celulose, nitrocelulose ou policarbonato, tendo espessura de 0,2 mm, contendo poros variando de 0,1 a 0,5 m de dimetro, que ocupam cerca de 80 a 85% da membrana. Filtros Isopore (nucleopore): Correspondem a filmes extremamente delgados de policarbonato (10 m de espessura) que so tratados com radiao nuclear, seguida de m, que removem os microrganismos (exceto

cauterizao (marcao) qumica. A radiao provoca danos localizados na membrana e o tratamento qumico aumenta essas falhas, formando orifcios, cujo tamanho pode ser controlado pela fora da soluo cauterizadora e pelo tempo de tratamento. Estes filtros

funcionam como verdadeiras peneiras, removendo todas as partculas maiores que os orifcios. Tm, entretanto, baixa porosidade, sendo muito usados na preparao de amostras para a microscopia de varredura, onde os organismos so retidos no filtro, sendo mantidos em um plano uniforme, no topo do filtro. O ar tambm pode ser filtrado, em fluxos laminares contendo filtros HEPA (High Efficiency Particulate Air filters), que removem 99,97% de partculas de 0,3 m.

Bactrias retidas na superfcie de um filtro do tipo Isopore (Adaptado de Prescott et al., Microbiology, 1997)

RADIAES - Ionizante e no ionizante Radiao No-Ionizante: A radiao ultravioleta (de 4 a 400 nm - sendo 260 nm o comprimento mais eficiente) bastante letal, mas exibe baixa penetrabilidade, no atravessando vidros, filmes sujos e outro materiais. Assim, a radiao UV extremamente eficiente na eliminao de microrganismos presentes em superfcies. Como sua maior eficincia se d a 260 nm, que corresponde ao comprimento de onda onde se d a maior absoro pelo DNA, a radiao UV afeta primariamente este tipo de molcula. Sua ao principalmente decorrente da formao de dmeros de pirimidinas (timina), efeito este que pode ser revertido por sistemas de fotorreativao (enzima de reparo ativada pela luz) ou por sistema de reativao independente da luz (polimerase). Por outro lado, no podem ser descartados outros efeitos deletrios do UV, uma vez que quando a 340 nm, observa-se dano celular, sem estar primariamente relacionado s mutaes, uma vez que neste comprimento de onda os cidos nuclicos no tm mais uma grande capacidade de absorver este tipo de radiao. Radiao Ionizante: Radiaes de pequeno comprimento de onda, portanto, de altssima energia e penetrabilidade. Os dois principais tipos so a radiao gama e os Raios X. Estas, so bastante eficientes, uma vez que promovem a ionizao de tomos, fazendo-os

perderem eltrons. Como consequncia so gerados radicais livres extremamente reativos, que podem destruir pontes de hidrognio, duplas ligaes, estruturas em anel. Quando na presena de oxignio, geram radicais hidroxila livres, absolutamente txicos para as clulas. A radiao gama originada geralmente a partir de fontes de
60

Co ou

137

Ce.

Estas radiaes vm sendo amplamente utilizadas em produtos termolbeis, tais como plsticos e alguns tipos de alimentos (frutas, vegetais, alimentos marinhos). Nos alimentos seu uso interessante, uma vez que inativam enzimas autocatalticas que participam do processo de degradao natural. Outros agentes Fsicos de controle

Baixas temperaturas: A refrigerao ou o congelamento so amplamente utilizados no controle microbiano de alimentos e produtos biolgicos, pois levam a uma diminuio ou interrupo do metabolismo. Como, na maioria dos casos, os microrganismos patognicos ao homem so mesoflicos, estas baixas temperaturas so eficientes no controle. Entretanto, deve-se ter cuidado porque clulas de Clostridium botulinum, quando incubadas a 5C, so ainda capazes de produzir e secretar a toxina do tipo E. Dessecao: Liofilizao ou dessecamento natural, que atua diferentemente nos organismos, dependendo do tipo de meio, do material dessecado e da intensidade do processo. Via de regra, os cocos Gram negativos so mais sensveis que os Gram positivos, sendo M. tuberculosis um dos exemplos clssicos de organismo resistente dessecao (vrias semanas em escarro seco). Presso osmtica: conservas com altos teores de sal ou acar. Controle de Microrganismos por Agentes Qumicos Durante muito tempo foram mais empregados em processos de desinfeco e antisepsia, entretanto, atualmente estes vem sendo cada vez mais amplamente utilizados em processos de esterilizao. Cuidados prvios: lavagem adequada do material, garantia de pleno contato com o agente. Caractersticas de um agente qumico ideal: boa atividade antimicrobiana, toxicidade seletiva, solubilidade, estabilidade, inocuidade, no interao com a matria orgnica, temperatura de ao adequada, alto poder de penetrao, sem poder corrosivo ou tintorial,

desprovido

de

ao

danosa

ao

meio

ambiente.

Principais Tipos de Agentes Qumicos: 1) Compostos orgnicos: Fenis e derivados (cresis (metil-fenol), xilenis): Primeiros a serem usados (Lister, 1867 - salas de cirugia). O fenol no mais usado como desinfetante ou anti-sptico devido sua toxicidade para os tecidos. Os derivados fenlicos (hexaclorofeno, hexilresorcinol) so empregados principalmente como anti-spticos ou desinfetantes hospitalares. Estes atuam desnaturando protenas e rompendo membranas. So tuberculocidas, efetivos na presena de matria orgnica, permanecem ativos por muito tempo. Entretanto tem odor desagradvel e so irritantes para pele. Hexaclorofeno -associao de fenol a halognio (Cl) que bastante eficaz, sendo bastante usado em pastas dentifrcias e sabes. No passado, pesquisas indicaram que tal composto era cumulativo e carcinognico. lcoois: Muito usados, efetivos, confiveis e baratos, atuando como bactericidas, fungicidas e contra vrus envelopados. Os mais usados so etanol e isopropanol, nas concentraes entre 70 e 80%. Atuam desnaturando protenas e dissolvendo lipdeos de membrana. Compostos Quaternrios de Amnio: so detergentes catinicos, molculas orgnicas derivadas de gorduras, atuando como umectantes e emulsificadores. Apenas os detergentes catinicos so detergentes efetivos, que desnaturam protenas (Ex: cloreto de benzalcnio, que mata a maioria das bactrias). 2) Halognios: Iodo: anti-sptico para a pele a 2%, ou em soluo gua-etanol de iodeto de potssio, para procedimentos pr-operatrios. Eficaz contra bactrias, fungos, vrus e protozorios parasitas. Atua oxidando componentes celulares e iodinando protenas. Em concentraes elevadas elimina esporos. Tem como desvantagens: danos pele, manchar e alergnico. Iodforos: Complexao de iodo a carreador orgnico (agentes tensioativos, como a PVP). So solveis em gua, estveis, sem propriedades tintoriais, liberando o iodo lentamente, minimizando a irritao cutnea. Usado na assepsia pr-operatria e tambm como desinfetante.

Cloro: Muito utilizado no tratamento de guas e nas indstrias de laticnios e alimentos. Pode ser aplicado na forma de gs, hipoclorito de sdio ou de clcio, que geracido hipocloroso e ento O2, promovendo a oxidao de materiais celulares e causando a morte em cerca de 30 minutos. Eficaz contra fungos, bactrias e vrus, com a desvantagem ser descorar alguns materiais. eficiente, barato, de fcil uso, mas altamente reativo com a matria orgnica. Como desvantagem, o uso do cloro em guas pode produzir pequenas quantidades de compostos organoclorados, particularmente o trihalometano (THM), um possvel agente carcinognico. Como alternativa pode ser usada a cloramina (monocloramina), que reduz drasticamente os nveis de THM. A monocloramina pode ser gerada diretamente na gua pela adio simultnea de amnio e cloro ou hipoclorito. O tratamento da gua presente nas torres de resfriamento de aparelhos ar condicionado extremamente importante para o controle de Legionella pneumophila.

3) Metais Pesados: Foram muito usados no passado como germicidas (prata, mercrio, zinco e cobre), sendo atualmente substitudos por compostos menos txicos. Os mais usados so compostos orgnicos de mercrio, prata, cobre e zinco. Nitrato de prata: usado em soluo 1%, para prevenir a oftalmia neonatorum, sendo substitudo em vrios hospitais pela eritromicina (que protege contra Chlamydia tambm). Temos ainda o Mercurocromo e mertiolate, usados como como preservantes de soros e vacinas. O sulfato de cobre usado na desinfeco de guas, especialmente contra algas. Estes atuam combinando-se com protenas, geralmente nos grupos SH, inativando-as. 4) Outros Perxidos: principalmente gua oxigenada, sobre organismos anaerbios, atuando pela sua ao oxidante. Oznio: Vem sendo empregado na desinfeco de gua, com sucesso, na Europa e Estados Unidos. Embora seja um tratamento mais caro, tem a vantagem de no produzir compostos organoclorados. Por outro lado, devido sua instabilidade, a gua submetida a este tipo de tratamento est mais sujeita contaminao que quando clorada. Corantes: dividem-se em dois grupos, acridina (que interage com o DNA) e derivados de rosanilina (Cristal violeta, verde malaquita), que atuam inibindo G+, Candida e Trichomonas.

Tem ao aparentemente ao nvel da parede celular das bactrias.

Comparao da eficincia de diferentes anti-spticos (Adaptado de Prescott et al., Microbiology, 1997)

Agentes Qumicos Esterilizantes: Aldedos: Formaldedo e Glutaraldedo, molculas muito reativas, combinam-se com protenas, inativando-as. Formaldedo 8% dissolvido em gua ou lcool (irritante e deixa resduos) e glutaraldedo 2% (menos irritante). Em 12 horas, destroem esporos. Gases esterilizantes: xido de etileno, atua pela interao com protenas, com alta capacidade de penetrao. Como explosivo, dissolvido em misturas de 10 a 20% com CO2 ou freon. Importante a presena de umidade no ambiente e tambm temperatura. Condies: 38C/5-8 hs ou 54C/3-4 hs, com 50% de umidade e EtO de 400 a 800 mg/litro. Betapropiolactona: eventualmente usado. No penetra to bem e pode ser carcinognico. Atua em concentraes muito menores que o EtO. Abaixo temos uma tabela, listando alguns dos principais agentes qumicos utilizados no controle microbiano.

Antibiticos e Quimioterpicos
Introduo Os antibiticos so produtos de enorme importncia no apenas na rea de sade, como tambm na economia, visto que apenas nos Estados Unidos, cerca de 100.000 toneladas so produzidas anualmente. Embora aproximadamente 8000 substncias com atividade antimicrobiana sejam conhecidas e, a cada ano, centenas de novas substncias sejam descobertas, pouqussimas so efetivamente aproveitadas e utilizadas como agentes antimicrobianos, visto que muitas destas no atendem aos requisitos mnimos para seu emprego teraputico. Paralelamente, no podemos deixar de mencionar o crescente problema em relao ao surgimento de espcies bacterianas resistentes aos diferentes antibiticos. Este talvez corresponda ao principal desafio dos pesquisadores, visto que a multirresistncia vem se tornando diariamente mais disseminada nas populaes microbianas, sejam patognicas ou no. Mais recentemente, outro aspecto que vem sendo cada vez mais levado em considerao refere-se ocorrncia dos biofilmes e sua importncia na teraputica antimicrobiana, pois o conhecimento sobre a ocorrncia de biofilmes microbianos em nosso organismo levou a uma quebra do paradigma de tratamento das doenas infecciosas. Certamente, para que os antibiticos possam ser empregados de forma mais eficaz, ser necessrio um maior conhecimento acerca dos biofilmes formados naturalmente em nosso organismo. Pois, somente a partir da elucidao da ecologia dos biofilmes naturais do homem,

teremos maiores chances de tratar de forma adequada as vrias doenas infecciosas.

Conceitos Agente Antimicrobiano: Composto qumico que mata ou inibe o crescimento de microrganismos, podendo ser natural ou sinttico. Agentes Quimioterpicos (Antimicrbicos): Agentes qumicos, naturais ou sintticos, usados no tratamento de doenas. Atuam matando ou inibindo o desenvolvimento dos microrganismos, em concentraes baixas o suficiente para evitar efeitos danosos ao paciente. Antibiticos: Grupo de agentes quimioterpicos (maioria), que constituem-se em produtos microbianos ou derivados. So produtos do metabolismo secundrio (quando a clula entra em fase estacionria), no essenciais para o crescimento ou reproduo, sendo sua sntese dependente da composio do meio (podem ser super produzidos). So geralmente compostos complexos, cuja sntese envolve vrias etapas enzimticas, sendo as enzimas reguladas separadamente das do metabolismo primrio. Via de regra, a produo de antibiticos est associada ao fenmeno de quorum sensing. Quimioterpico: Agente qumico sinttico, exibindo as mesmas atividades de um antibitico.

Histrico dos antibiticos e descobertas relacionadas Paul Ehrlich (1854 - 1915): Desenvolveu o conceito de toxicidade seletiva, indicando que determinado agente exibia uma ao danosa aos microrganismos, sem afetar as clulas do hospedeiro. Tal conceito tem importante reflexo prtico, pois indica se um agente pode, teoricamente, ser til no tratamento de doenas infecciosas. Este pesquisador trabalhava com corantes e tcnicas de colorao de microrganismos, quando verificou que alguns compostos coravam os microrganismos, mas no os tecidos animais. Esperava encontrar um corante txico aos microrganismos ("bala mgica"). 1904 - Uso prtico do vermelho de tripan, composto ativo contra o tripanossoma que causava a doena africana do sono. Ehrlich & Hata: realizao de testes com compostos arsenicais, em coelhos com sfilis. Descobriram que o composto 606, arsfenamida, era ativo => Em 1910, foi lanado o medicamento Salvarsan (nome comercial da arsfenamida), para o tratamento da sfilis.

1927 - Na I. G. Farbenindustrie (Bayer) - G. Domagk: testava corantes e outros compostos qumicos, quanto ao em microrganismos e toxicidade em animais. 1935 - Vermelho Prontosil: incuo para animais, protegendo camundongos contra estafilococos e estreptococos patognicos. Neste mesmo ano, foi descoberto que o prontosil era clivado no organismo, originando a sulfanilamida como um dos produtos. Na realidade, a droga eficaz era a sulfanilamida. 1939 - Nobel para Domagk 1896 - E. Duchesne: descobriu a penicilina, mas raramente tal pesquisador citado, pois seus achados nunca foram devidamente publicados ou notificados, sendo esquecids durante vrios anos. A. Fleming: Busca de um tratamento eficaz para os feridos na II Guerra Mundial. Foi o "segundo" descobridor da penicilina e tentou, sem sucesso, purific-la em quantidades suficientes para ser utilizada como medicamento. 1939 - H. Florey & E. Chain - testavam atividade bactericida de vrias substncias (lisozima, sulfonamidas). Obtiveram a cultura de fungo isolada inicialmente por Fleming, passando a trabalhar na purificao da penicilina. Injetarama penicilina em camundongos infectados com estafilococos ou estreptococos e observaram que quase todos sobreviveram. (Trabalho publicado em 1940). 1945 - Nobel para Florey, Chain e Fleming 1944 - S. Waksman: descobrimento da estreptomicina (Streptomyces griseus), a partir do teste de cerca de 10.000 linhagens de bactrias e fungos do solo. 1952 - Nobel para Waksman. At 1953 - Isolamento de microrganismos produtores de cloranfenicol, neomicina, terramicina e tetraciclina. A partir de 1953 - a indstria investiu centenas de milhares de dlares na busca de novas drogas antimicrobianas, sendo que tal linha de pesquisa perdura at hoje em todo o mundo, empregando diversos tipos de abordagens.

Caractersticas

gerais

das

drogas

antimicrobianas

 Toxicidade Seletiva: caracterstica que todo antimicrobiano deveria apresentar, pois reflete-se na capacidade de atuar seleivamente sobre o microrganismo, sem provocar danos ao hospedeiro. Esta expressa em termos do ndice teraputico: relao B/A, onde A) Dose teraputica: concentrao p/ tratamento B) Dose txica: concentrao a partir da qual txica

Drogas que atuem sobre funes microbianas inexistentes em eucariotos geralmente tem maior toxicidade seletiva e ndice teraputico (Penicilina). Espectro de ao: Refere-se diversidade de organismos afetados pelo agente. Geralmente os antimicrobianos so de pequeno ou de amplo espectro. Atualmente, uma srie de laboratrios vem trabalhando em busca de isolar e purificar antimicrobianos de espectro restrito, que atuam especificamente sobre um ou um pequeno nmero de microrganismos. No entanto, atualmente os antibiticos comercializados enquadram-se nas categorias de pequeno e amplo espectro de ao.

Exemplos de diferentes drogas antimicrobianas, classificadas de acordo com o espectro de ao. (Adaptado de Madigan et al., Brock Biology of Microorganisms, 2003)

Quanto

sntese:

Microbiana,

qumica

ou

semi-sinttica

Microbiana - geralmente por uma ou poucas bactrias (actinomicetos) e vrios tipos de fungos filamentosos. Geralmente correspondem a produtos do metabolismo secundrio. Qumica - Sulfonamidas, Trimetoprim, Cloranfenicol, Isoniazida alm de outros antivirais e antiprotozorios.

Semi-sintticos - so antibiticos naturais, modificados pela adio de grupamentos qumicos, tornando-os menos suscetveis inativao pelos microrganismos (ampicilina, carbencilina, meticilina).

Quanto ao: "stticos" ou "cidas" Os "cidas" podem ser "stticos" dependendo da concentrao, ou do tipo de organismo. Os "staticos" tem sua ao vinculada resistncia do hospedeiro.

CMI e CML: 2 parmetros que indicam a eficincia da droga. A droga "cida" geralmente elimina o agente em concentraes de 2 a 4 vezes maior que a "sttica", sendo o inverso falso. Atingir concentraes efetivas nos tecidos e entrar em contato com o microrganismo. No alterar os mecanismos naturais de defesa do hospedeiro.

Mecanismos de ao dos antimicrobianos Vrios so os possveis alvos para os agentes antimicrobianos. O conhecimento dos mecanismos de ao destes agentes permite entender sua natureza e o grau de toxicidade seletiva de cada droga.

Exemplos das principais estruturas ou etapas metablicas afetadas por antibiticos (Adaptado de Madigan et al., Brock Biology of Microorganisms, 2003)

1) Inibio da sntese da Parede Celular: estes agentes antimicrobianos correspondem aos mais seletivos, apresentando um elevado ndice teraputico.

penicilinas, ampicilina e cefalosporinas: contm em sua estrutura um anel b-lactmico, que interage com protenas denominadas PBPs (Penicillin Binding Protein), inibindo a enzima envolvida na transpeptidao, responsvel pela ligao entre as cadeias de tetrapeptdeos do peptideoglicano. Com isso, h o impedimento da formao das ligaes entre os tetrapeptdeos de cadeias adjacentes de peptideoglicano, ocasionando uma perda na rigidez da parede celular. Acredita-se tambm que tais drogas podem atuar promovendo a ativao de enzimas autolticas, resultando na degradao da parede.

Mecanismo de ao dos antibiticos b-lactmicos (Adaptado de Atlas, R.M., Principles of Microbiology, 1997)

bacitracina: Interfere com a ao do carreador lipdico que transporta os precursores da parede pela mebrana. Resulta na no formao das ligaes entre o NAM e NAG. vancomicina: liga-se diretamente poro tetrapeptdica do peptideoglicano. ainda a droga de escolha para linhagens resistentes de S. aureus. 2) Ligao Membrana Citoplasmtica: so agentes antimicrobianos que muitas vezes exibem menor grau de toxicidade seletiva. polimixinas: Ligam-se membrana, entre os fosfolipdeos, alterando sua permeabilidade (detergentes). So extremamente eficientes contra Gram negativos, pois afetam tanto a membrana citoplasmtica como a membrana externa. Ionforos: Molculas hidrofbicas que se imiscuem na Membrana citoplasmtica, permitindo a difuso passiva de compostos ionizados para dentro ou fora da clula.

Exemplo de um antibitico que atua como ionforo (Adaptado de Atlas, R.M., Principles of Microbiology, 1997)

3) Inibio da sntese de cidos nuclicos: seletividade varivel. Novobiocina: se liga a DNA girase, afetando o desenovelamento do DNA, impedindo sua replicao. quinolonas: Inibem a DNA girase, afetando a replicao, transcrio e reparo. Rifampicina: Ligao RNA polimerase DNA-dependente, bloqueando a transcrio.

4) Inibio da traduo: So geralmente bastante seletivos. Correspondem a um dos principais grupos de agentes antimicrobianos, uma vez que a sntese protica corresponde a processo altamente complexo, envolvend vrias etapas e diversas molculas e estruturas.

Diferentes etapas da traduo que podem ser afetadas por agentes antimicrobianos (Adaptado de Atlas, R.M., Principles of Microbiology, 1997)

estreptomicina e gentamicina: Liga-se subunidade ribossomal 30S, bloqueando-a e promovendo erros na leitura do mRNA. Interferem com a formao do complexo de iniciao. tetraciclina: Liga-se subunidade ribossomal 30S (stio A), impedindo a ligao do aminoacil-tRNA. cloranfenicol: Liga-se subunidade ribossomal 50S e inibe a ligao do tRNA e da peptidil transferase, inibindo a elongao. eritromicina: Liga-se subunidade ribossomal 50S e inibe a elongao.

Exemplos de drogas que interferem com a sntese protica (Adaptado de Atlas, R.M., Principles of Microbiology, 1997)

5) Antagonismo metablico: geralmente ocorre por um mecanismo deinibio competitiva. Sulfas e derivados: inibio da sntese do cido flico, pela competio com o PABA. Trimetoprim: bloqueio da sntese do tetrahidrofolato, inibindo a dihidrofolato redutase.

Similaridade estrutural entre a sulfanilamida e o PABA (importante precursor da sntese de purinas) (Adaptado de Atlas, R.M., Principles of Microbiology, 1997)

Isoniazida: afeta o metabolismo do NAD ou piridoxal, inibe a sntese do cido miclico "fator corda". Resistncia microbiana Este tema tornou-se um motivo de preocupao crescente entre os profissionais da rea de sade, pois a cada ano observamos o aumento de linhagens resistentes aos mais diversos agentes antimicrobianos.

Proporo indivduos antibiticos.

de

bactrias

fecais,

isoladas aos

de

normais,

resistentes

diferentes

Aumento

na

proporo

de

linhagens

de

N.

gonorrhoaea resistentes penicilina.

(Adaptado de Madigan et al., Brock Biology of Microorganisms, 2003)

A resistncia microbiana aos antimicrobianos pode ser de dois tipos: Natural: ausncia da estrutura, ou via metablica alvo.

Adquirida: Atravs de mutaes espontneas e seleo, ou por recombinao aps transferncia de genes. Dentre os principais mecanismos de resistncia podemos citar: Impermeabilidade droga: Muitas bactrias Gram negativas so resistentes penicilina G por serem impermeveis droga, ou por apresentarem alteraes em protenas de ligao penicilina. No caso das sulfonamidas, o microrganismo pode tambm apresentar uma menor permeabilidade droga.

Inativao: muitas drogas so inativadas por enzimas codificadas pelos microrganismos. Por exemplo, a penicilinase (b-lactamase) uma enzima que cliva o anel b-lactmico inativando a droga. Outras drogas podem ser inativadas em decorrncia de modificaes introduzidas pelo microrganismo, tais como a adio de grupamentos qumicos. Assim, muitos microrganismos so capazes de promover a fosforilao ou acetilao de antibiticos. Modificao de enzima ou estrutura alvo: Por exemplo, alteraes na molcula do rRNA 23S (no caso de resistncia eritromicina e cloranfenicol), alterao da enzima, no caso de drogas que atuam no metabolismo, ou uso de vias metablicas alternativas. Bombeamento para o meio: Efluxo da droga - No caso da resistncia s tetraciclinas, em bactrias entricas.

Processos de transferncia de genes entre bactrias

Introduo Sabemos que, embora as mutaes sejam responsveis pela expresso de vrias novas caractersticas por uma clula, muitos dos fentipos expressos pelos microrganismos procariticos so decorrentes da aquisio de novos fragmentos de DNA, por meio de processos de transferncia horizontal de genes. Trs processos de transferncia gentica entre bactrias so bastante conhecidos: transformao, conjugao e transduo. H ainda um quarto processo, a converso lisognica, que envolve a transferncia de DNA de uma partcula viral para uma bactria, sendo um evento importante na aquisio de genes muitas vezes associados virulncia. Transformao - definida como um processo de incorporao de DNA na forma livre, geralmente decorrente da lise celular. A partir de seu descobrimento, foi demonstrado formalmente que o DNA era a molcula envolvida na hereditariedade (experimentos iniciados por F. Griffith, 1928). Vrias bactrias Gram positivas e negativas so naturalmente transformveis, entretanto, dentro de um gnero, nem todas as espcies o so. Na natureza, o processo ocorre quando uma clula sofre lise, liberando seu DNA. Este, por ser de grande tamanho tende a sofrer quebras, originando centenas fragmentos de aproximadamente 15 kb (o equivalente a cerca de 15 genes, em Bacillus subtilis). Como uma clula absorve poucos fragmentos, apenas uma pequena proporo de genes podem ser transferidos.

Inicialmente, para que o processo ocorra, necessrio que a cl. encontre-se competente, isto , deve apresentar stios de superfcie para a ligao do DNA da clula doadora e apresentar a membrana em uma condio que permita a passagem deste DNA. Esta propriedade , provavelmente, uma caracterstica inerente de certas linhagens e, ao que parece, envolve o mecanismo de quorum sensing. O estabelecimento da competncia um fenmeno controlado, envolvendo a participao de diferentes protenas (protena de ligao ao DNA, presente na membrana, autolisinas, nucleases), sendo um processo varivel entre os microrganismos. Aparentemente, o nmero de stios disponveis para a ligao do DNA limitado. Esta captao parece estar relacionada a uma pequena sequncia, de 10 a 12 pares de bases, presente no DNA exgeno. Em Haemophilus, foi demostrada a presena de uma protena que reconhece e liga-se a uma sequncia 5 - AAGTGGGTCA - 3, muito comum no genoma deste microrganismo, garantindo que somente ocorrer a captao de DNA de espcies muito similares. A competncia um processo que depende de vrias condies distintas nos diferentes microrganismos. Sabe-se que a fase de crescimento e as condies ambientais desempenham um papel de extrema importncia no processo. Alm destes, a temperatura e a concentrao de ctions tambm influenciam a eficincia do processo. A captao do DNA tambm diferente entre Gram positivos (G+) e Gram negativos (G-): Nas G+ o DNA captado como dupla hlice e absorvido como fita simples, sendo uma das fitas degradadas. Nas G-, o DNA absorvido como fita dupla, embora apenas uma das fitas participe do processo de recombinao. Independente do tipo celular, a ligao do DNA clula mais eficiente quando est como fita dupla. Ligao do DNA: inicialmente reversvel, tornando-se irreversvel depois. As clulas competententes ligam o DNA com muito mais eficincia que clulas no competentes (1000 vezes mais). Streptococcus pneumoniae capaz de ligar apenas cerca de 10 molculas de DNA de dupla fita, de 15 a 20 kb. Quando so absorvidas, como DNA de fita simples, estas passam para cerca de 8 kb. Em Haemophilus influenzae, necessrio que o DNA tenha uma sequncia especfica de 11 pb, para que haja a ligao irreversvel e o DNA seja captado.

Integrao do DNA: O DNA liga-se a protenas na superfcie celular, sendo em seguida absorvido ou tendo uma de suas fitas degradadas por nucleases antes da absoro. medida que o DNA absorvido no interior da clula, este se associa a protenas de ligao ao DNA de fita simples, protegendo-o de degradao. A protena RecA tambm participa deste processo,

associando-se fita e promovendo a recombinao. H ento a degradao do que resta da fita simples e formao de um DNA hbrido, que na replicao originar uma molcula parental e outra recombinante.

Esquema dos eventos envolvidos na transformao em Streptococcus, um organismo Gram positivo. O autoindutor (1) ao encontrar o receptor (2) interage com este, promovendo a ativao de vrios genes (3, 4 e 5) dentre eles as autolisinas, nucleases e protena de ligao ao DNA. Uma das fitas do DNA passa a ser captada pela clula, enquanto a outra degradada (6). Ao penetrar na clula a fita simples protegida por protenas. Caso este DNa encontre uma regio complementar, a protena RecA auxiliar sua recombinao com o DNA endgeno (7). Conjugao - Processo de transferncia de DNA de uma bactria para outra, envolvendo o contato entre as duas clulas (descoberta por Tatum & Lederberg, 1946). A conjugao est associada presena de plasmdeos de natureza F. Estes plasmdeos contm

genes que permitem a transferncia do DNA plasmidial de uma clula para outra ou, em outras palavras, a capacidade conjugativa. Quando a clula porta um plasmdeo de natureza F denominada F+, doadora, ou macho, enquanto clulas desprovidas de tais plasmdeos so denominadas F-, receptoras, ou fmeas. A capacidade conjugativa est associada presena de determinados genes localizados em um operon denominado tra. Estes genes conferem uma srie de caractersticas envolvidas na conjugao tais como a sntese do pilus F, responsvel pelo reconhecimento e contato entre as clulas, assim como a transferncia do DNA plasmidial. Eventualmente, os plasmdeos podem ser integrados no cromossomo, sendo este processo mediado por pequenas seqncias de DNA denominadas IS (insertion sequences). As clulas apresentados tais plasmdeos integrados so denominadas Hfr (do ingls High Frequency of Recombination). Quando integrados, esses plasmdeos podem mobilizar a transferncia de genes cromossomais tambm.

Exemplo de um plasmdeo do tipo F

Em gram negativos, a conjugao pode ser de dois tipos: entre clulas F+ e F-, resultando em duas clulas F+ e entre clulas Hfr e F-, resultando em uma clula Hfr e outra F. Nos dois processos, acredita-se que o mecanismo provvel de transferncia do DNA seja pelo crculo rolante, onde apenas uma das fitas transferida, sendo a fita complementar sintetizada pela clula receptora. Provavelmente, o estmulo para o disparo do processo seja o contato das clulas. Assim, a conjugao envolve a passagem de DNA de uma clula F+ para outra F-, que torna-se ento F+ tambm.

Quando o plasmdeo encontra-se incorporado ao cromosso, a conjugao passa a envolver a transferncia de genes cromossomais, sendo que nestes casos, a clula receptora permanece F-, porque a regio tra a ltima a ser transferida, o que raramente ocorre na natureza. Nestes casos, passam grandes blocos de DNA da clula Hfr para a receptora, promovendo extensas recombinaes.

(b) (a)

(c) (d)

Esquema dos eventos associados conjugao entre clulas F+ e F-.

Eventos associados conjugao entre uma clula Hfr e outra F-. Observe que a clula F- permanece como receptora, uma vez que a regio tra normalmente no transferida.

Transduo: (Lederberg & Zinder, 1952) transferncia mediada por vrus, podendo ser generalizada (qualquer fragmento de DNA) ou especializada (determinados genes, passados por fagos temperados). Transduo generalizada: Descoberta em Salmonella typhimurium com o fago P22, embora este processo tambm ocorra em outras bactrias, tais como E. coli. Este tipo de processo requer a ocorrncia de um ciclo ltico, onde eventualmente pode haver o empacotamento de fragmentos de DNA da clula hospedeira, gerando partculas denominadas partculas transdutoras, que correspondem ao capsdeo viral contendo em seu interior DNA bacteriano. Embora no possam ser descritas como vrus, as partculas transdutoras exibem a capacidade de adsoro superfcie de outras clulas bacterianas. A frequncia com que um determinado gene transferido baixa uma vez que cada partcula transdutora leva apenas um determinado fragmento de DNA (1 em 106 ou 108 cl. recebem um determinado gene).

Transduo generalizada: durante um ciclo ltico, pode haver a incorporao de DNA bacteriano no capsdeo viral. Este DNA poder ser transferido para outra bactria, pois os processos de adsoro e injeo de DNA dependem da estrutura do vrus, independente do tipo de DNA contido em seu interior. Transduo especializada: Evento raro, embora bastante eficiente. O exemplo melhor conhecido e primeiramente descoberto foi a transferncia de um genes que codificam produtos envolvidos na degradao de galactose pelo fago l de E. coli. A etapa inicial no processo corresponde infeco e lisogenizao do fago, que ocorre em stios especficos do genoma. Neste caso, a integrao do fago ocorre adjacente ao conjunto de genes envolvidos na utilizao de galactose. Pela ao de algum indutor (ex: UV) h a separao do fago do genoma (integrao reversa), que normalmente ocorre perfeitamente. Entretanto, em alguns casos, essa separao defeituosa, promovendo a remoo de genes bacterianos e deixando parte do genoma viral na clula. Essas partculas podem ser de dois tipos: aquelas que carregam genes gal e outras que carregam genes bio. Aquelas partculas levando genes gal so denominadas ldgal (defectivas, contendo o gene gal), porque so incapazes de formar partculas virais maduras (porque deixam no hospedeiro o gene que codifica a protena integrase). Quando estas partculas infectam novas clulas, juntamente com

fagos normais (helper), pode haver a transferncia de genes gal, a partir da infeco e lisogenizao dos dois fagos.

Transduo especializada: este processo dependente da ocorrncia de um ciclo lisognico. O fago integra seu DNA ao DNA bacteriano e aps um determinado perodo de tempo e de acordo com certos estmulos, este fago pode iniciar um ciclo ltico. Caso a exciso do DNA viral ocorra de maneira defeituosa, poder haver a transferncia de um pequeno fragmento de DNA bacteriano (porque parte do DNA viral ficar incorporado ao genoma bacteriano). Este vrus "defeituoso" poder transferir o DNA bacteriano para outras clulas. Converso lisognica: Transferncia de genes de fagos para bactrias. A prpria lisogenizao torna a bactria imune a outras infeces por este fago, mas alm disso, outros fentipos podem ser adquiridos. O exemplo mais clssico consiste na converso de clulas

atoxignicas de Corynebacterium diphtheriae em toxignicas, pelo fago . Assim, a bactria recebe um gene que codifica uma toxina, sendo este gene de origem viral.