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Anvisa - Guia de Validação - Resolução 2003

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14/06/12

Anvisa - Legislai;:80 - Resolucoes

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Resolu.;ao

- RE n° 899, de 29 de maio de 2003

D.O.U. 02/06/2003

o Adjunto da Diretoria Colegiada da Agencia Nacional de Vigilancia Portaria n.? 238, de 31 de marco de 2003,

Sanitaria, no uso da atribuicao, que Ihe confere a

considerando 0 disposto no art.111, inciso II, alfnea "a" § 3° do Regimento Interno aprovado pela Portaria n° 593, de 25 de agosto de 2000, republicada no DOU de 22 de dezembro de 2000, considerando que a materia foi submetida a apreciacao da Diretoria Colegiada, que a aprovou em reuniao realizada em 6 de marco de 2003, resolve: Art. 1° Determinar a publicacao do "Guia para validaC;80 de rnetodos analiticos e bioanalfticos" Art. 2° Fica revoqada a Resoluy80 RE no 475, de 19 de marco de 2002. Art. 3° Esta Resolucao entra em vigor na data de sua publicacao, DAVI RUMEL anexo

ANEXO GUIA PARA VALlDAC;Ao METODOS ANALiTICOS 1. Consideracoes gerais DE METODOS ANALiTICOS E BIOANALiTICOS

1.1. As informacoes contidas nesse Anexo apresentam as caracterfsticas a serem consideradas durante a validacao de procedimentos analiticos. 0 objetivo de uma validacao e demonstrar que 0 rnetodo e apropriado para a finalidade pretendida, ou seja, a determinacao qualitativa, semi-quantitativa e/ou quantitativa de farmacos e outras substancias em produtos farmaceuticos. 1.2. Essas informacoes aplicam-se a: gasosa (CG) ou cromatografia Ifquida de alta

1.2.1. tecnicas analfticas que facarn uso de rnetodos de cromatografia eficiencia (CLAE); 1.2.2. rnetodos nao-cromatoqraficos, espectrofotometria UV-VIS); 1.2.3. testes imunol6gicos estas tecnicas,

desde que estes ofere yam uma seletividade aceltavel (por ex. titulometria,

ou microbiol6gicos,

desde que observado 0 grau de variabilidade usual mente associado que 0 rnetodo atenda as exiqencias das

a

1.3. A validacao deve garantir, por meio de estudos experimentais,
www.anvisa.gov.br/legis/resol/2003/re/899_03re.htm

1/13

htm para a validacao do metoda analftico.Resolucoes aplicacoes analfticas. Precisao 1. Para tanto.br/legis/resol/2003/re/899_03re. sera admitido a usa de pad roes de trabalho. sensibilidade. Para a garantia da qualidade analftica dos resultados.anvisa.7. devidamente reconhecidos 1.7. desde que a identidade e a tear sejam devidamente comprovados.6. llberacao do ativo) Testes de identificacao na Tabela 2.8. 1.8. como prova de que a metodologia foi original mente validada e devera canter. e Seletividade dos testes.3. condicoes de utilizacao e em intervalo de tempo curto entre as medicoes. C6pia de toda a docurnentacao original da validacao da metodologia devera ser anexada. considera-se corrida analftica as rnedicoes sucessivas de um mesmo anal ito. a metodologia sera considerada validada. No caso da inexistencia dessas substancias. Classiflcacao Categoria Finalidade em 4 categorias. local. Deve-se utilizar substancias de refer€mcia oficializadas pela Farmacopeia Brasileira au. Especificidade 1. a metodologia sera considerada validada.10. deve apresentar especificidade.5. No caso de metodologia analftica descrita em farmacopeias pela ANVISA.2. a metodologia sera considerada validada. todos as parametres relacionados no item 1. conforme a Tabela 1.7. exatidao. 1.7. instrumentacao. Linearidade 1.7.7. Limite de deteccao (sensibilidade) 1.1. desde que sejam avaliados as parametres relacionados a seguir.7. Interval a 1. 1. 1.7. segundo sua finalidade: 2/13 . na ausencia destas. adequados a analise. efetuadas nas mesmas condicoes: metoda.4.4. precisao. todos as equipamentos utilizados na valldacao devem estar devidamente calibrados e as analistas devem ser qualificados e adequadamente treinados. Para cada categoria sera exigido um conjunto de testes. Os testes sao classificados Tabela 1. devidamente reconhecidos pela ANVISA. 1. intervalo.:80 .7. no mfnimo. Ensaios necessaries www.7.11. analista.14/06/12 Anvisa . especificidade e linearidade. au formularies oficiais.Legislai. 1. Para efeito desse guia.9. 1. No caso da transferencia de metodologias da matriz para suas subsidiarias no Brasil e/ou das empresas nacionais para as centro de estudos de equivalencia farmaceutica. Exatidao 1.gov. relacionados Tabela 2. limite de quantificacao. par outros c6digos autorizados pela leqislacao vigente. Limite de quantificacao 1. assegurando a confiabilidade dos resultados. desde que sejam avaliados as parametres de precisao. No caso de metodologia analftica nao descrita em farmacopeias au formularies oficiais. Robustez 1. segundo sua finalidade: do teste I II III IV Testes quantitativos para a deterrninacao do principia atbo em produtos farmaceuticos au materias-primas Testes quantitativos au ensaio limite para a determinacao de impurezas e produtos de deqradacao em produtos armaceuticos e rnaterias-prirnas Testes de performance (par exemplo: dissolucao.6. conforme especificado nas Tabelas 1 e 2. linearidade.5.7.

produtos de deqradacao e componentes da matriz. Para analise qualitativa (teste de identificacao) necessario demonstrar a capacidade de selecao do rnetodo entre compostos com estruturas relacionadas que podem estar presentes.12.Resolucoes Pararnetre Categoria Categoria I II Categoria Categoria III IV Ensaio Quantitativo Especificidade Linearidade Intervalo P . Para analise quantitativa (teor) e analise de impurezas.1.2. Linearidade E a capacidade de uma metodologia analitica de demonstrar que os resultados obtidos sao diretamente proporcionais a concentracao do anal ito na amostra. comparativamente com resultados neqativos obtidos com amostras que nao contern 0 farmaco. 2.1. nao ** se houver cornprovacao da reprodutibilidade e necessaria a cornprovacao da Precisao lntermediaria.sa d" . _ _lRepetibilidade rec.14/06/12 Anvisa .:80 . rnudancas no procedimento analitico.htm .1. Em rnetodos cromatoqraflcos. dependendo da natureza das mudancas.12. com auxilio de detector de arranjo de fotodiodos ou espectrometria de massas) sao interessantes para demonstrar que 0 pico cromatoqrafico atribuido a um s6 componente. 1.1. oxidacao). Quando a impureza ou 0 padrao do produto de deqradacao nao estiverem disponiveis. 5 concentracoes diferentes.3.1. a especificidade pode ser determinada pela cornparacao dos resultados obtidos de amostras (farmaco ou medicamento) contaminadas com quantidades apropriadas de impurezas ou excipientes e amostras nao contaminadas.1. 3/13 2. Estas cornparacoes devem incluir amostras armazenadas sob condicoes de estresse (por ex.2.br/legis/resol/2003/re/899_03re.2. Metodologia outras rnudancas podem requerer valldacao tarnbern. rnudancas na slntese da substancia ativa. 11 nterme iana Li mite de deteccao Limite de quantificacao Exatidao Robustez * pode ser necessario. e 2. mas compostos estruturalmente semelhantes. dentro de um intervalo especificado. A utilizacao de testes de pureza de pico (por exemplo. pode-se comparar os resultados do teste das amostras contendo impurezas ou produtos de deqradacao com os resultados de um segundo procedimento bem caracterizado (por exemplo metodologia farrnacopeica ou outro procedimento validado).12. que a linearidade seja determinada pela analise de. 2.2.gov. Especificidade e Seletividade tais E a capacidade que 0 rnetodo possui de medir exatamente um composto em presenca de outros componentes como impurezas. e deve-se tomar as precaucoes necessarias para garantir a pureza dos picos cromatoqraficos. 1. Isto deve ser confirmado pela obtencao de resultados posithos (preferivelmente em relacao ao material de referencia conhecido) em amostras contendo 0 farmaco. calor umidade. Recomenda-se www.3. no rnlnirno. metodologia analitica devera ser revalidada nas seguintes circunstancias: 1. Sim Sim Sim Sim ** Nao Nao Sim Sim Sim Sim Sim Sim ** Nao Sim Sim Sim limite Sim Nao .anvisa. e 2.1. Determinadas 2. hidr61ise acida/basica.12. 1. luz. rnudancas na cornposicao do produto acabado. para demonstrar que 0 resultado do teste nao afetado por esses materiais. 2. * Nao Nao Sim Nao Sim · · · · · · Sim Nao Nao Nao Nao Nao Nao Nao Nao ** Sim Nao dependendo da natureza do teste especffico.Legislai.

Quando apresentarem irnportancia oxicoloqica ou efeitos farmacoloqicos Determinacao de impurezas inesperados.2. com 3 (tres) replicas cada ou mfnimo de 6 determinacoes a 100% da concentracao do teste. 2. realizar transformacao rnaternatica. os limites de quantiflcacao e deteccao devem ser adequados as quantidades de impurezas a serem controladas De 70% a 130% da concentracao Uniformidade de conteudo eorica do teste De ±20% sobre 0 valor especificado para 0 intervalo. Precisao intermediaria (precisao inter-corridas): concordancla entre os resultados do mesmo laboratorio.4. os resultados dos testes deverao ser tratados por rnetodos estatfsticos apropriados para determlnacao do coeficiente de correlacao.4.14/06/12 Anvisa . mas obtidos em dias diferentes.gov. Precisao A precisao e a avaliacao da proximidade dos resultados obtidos em uma serie de medidas de uma amostragem multi pia de uma mesma amostra. Para a deterrninacao da precisao intermediaria recomenda-se um mfnimo de 2 dias diferentes com analistas 4/13 www. p alcance do rnetodo deve incluir _ ~O% sobre 0 menor valor e +20% sobre 0 maior valor. ou seja. 2. Repetibilidade (precisao intra-corrida): concordancia com 0 mesmo analista e mesma instrurnentacao.99. 0 criterio mfnimo aceitavel do coeficiente de correlacao (r) deve ser 2. entre os resultados dentro de um curto perfodo de tempo A repetibilidade do rnetodo e verificada por. Esta e considerada em tres nfveis. Limites porcentuais do teor do anal ito que devem estar contidos no intervalo de linearidade para alguns rnetodos analiticos.2.Legislar.htm .Resolucoes Estas concentracoes devem seguir os intervalos da Tabela 3. baixa. E estabelecido pela confirmacao de que 0 rnetodo apresenta exatidao. Tabela 3. e a resultante do tratamento o intervalo 2. coeficiente angular.4. contemplando 0 intervalo linear do rnetodo. no mfnimo.3.1. media e alta.2. 2.:ao . 5e n80 houver relacao linear. Caso a especificacao para a dissolucao envolva mais que Ensaio de dissolucao um tempo. com analistas diferentes e/ou equipamentos diferentes.2. = 0. 9 (nove) determinacoes. matemattco). Normalmente e derivado do estudo de linearidade e depende da aplicacao pretendida do rnetodo (Tabela 3).2. Ensaio Alcance Determ ina980 quantitativa do De 80% a 120% da concentracao anal ito em rnaterias-primas ou em eorica do teste ormas farmaceuticas Do nfvel de impureza esperado ate 120% do limite maximo especificado. Deve-se apresentar as curvas obtidas (experimental 2. 3 (tres) concentracoes.anvisa. 5e houver relacao linear aparente apos exame visual do grafico.br/legis/resol/2003/re/899_03re. soma residual dos quadrados mfnimos da reqressao linear e desvio padrao relative. precisao e linearidade adequados quando aplicados a amostras contendo quantidades de substancias dentro do intervalo especificado.3.4. tnterseccao com 0 eixo Y. Intervalo especificado e a faixa entre os limites de quantificacao superior e inferior de um rnetodo analftico. 2.

a A precisao de um rnetodo analftico pode ser expressa como 0 desvio padrao ou desvio padrao relative (coeficiente de variacao) de uma serie de medidas. 2.3.4. para inclusao de metodologia em farmacopeias. www. A precisao pode ser expressa como desvio padrao relative (DPR) ou coeficiente de variacao (CV%). CG. 0 limite de quantificacao e estabelecido por meio da analise de solucoes contendo concentracoes decrescentes do farmaco ate 0 menor nivel determinavel com precisao e exatidao aceitaveis. titulacao.2. a estimativa do limite de deteccao pode ser feita com base na relacao de 3 vezes 0 ruldo da linha de base.1. Estes dados n80 precisam ser apresentados para a concessao de registro. n80 se admitindo valores superiores a 5%. 2.:80 . 3 curvas de calibracao construidas contendo concentracoes do farmaco pr6ximas ao suposto limite de quantificacao. No caso de rnetodos n80 instrumentais (CCD. porcentagem pIp ou p/V.5.anvisa. Pode ser expresso pela equacao. absorcao at6mica).6. 2. principalmente. segundo a formula. concentracao 2. Limite de Deteccao Limite de deteccao e a menor quantidade do anal ito presente em uma amostra que pode ser detectado. partes por rnilhao) na amostra. Reprodutibilidade (precisao inter-laboratorial): concordancia entre os resultados obtidos em laborat6rios diferentes como em estudos colaborativos. necessariamente quantificado.gov. No caso de rnetodos instrumentais (CLAE. LD DPax3 Ie em que: DPa e 0 desvio padrao do intercepto com 0 eixo do Y de. do anal ito na em que. no minimo.6.htm 5/13 .br/legis/resol/2003/re/899_03re. Limite de Ouantificacao a menor quantidade do anal ito em uma amostra que pode ser determinada as condicoes experimentais estabelecidas. a concentraeao amostra.14/06/12 Anvisa . onde 0 limite de deteccao e 0 menor valor de concentracao capaz de produzir 0 efeito esperado (rnudanca de cor. por exemplo.Legislai. a concentracao o valor maximo aceitavel deve ser definido de acordo com a metodologia empregada. Este desvio padrao pode ainda ser obtido a partir da curva de calibracao proveniente da analise de um nurnero apropriado de amostras do branco.3. etc). 2. para ensaios quantitativos de impurezas.Resolucoes diferentes. DP eo desvio padrao e CMD. 0 tipo de matriz e a finalidade do rnetodo. Pode ser determinado pela equacao. 2. turvacao. E com precisao e exatidao aceitaveis sob o limite de quantificacao e um pararnetro determinado.5. sob as condicoes experimentais estabelecidas.1. ate 0 menor nivel detectasel: porern n80 conhecidas e 2. esta determinacao pode ser feita visual mente. produtos de deqradacao em farmacos e produtos de deqradacao em formas farmaceuticas e e expresso como do anal ito (por exemplo. 0 limite de deteccao e estabelecido por meio da analise de solucoes de concentracoes decrescentes do anal ito. geralmente aplicados padronizacao de metodologia analitica. cornparacao de cor).5.5. DPR _D_P-xlOO CMD media determinada. IC e a inclinacao da curva de callbracao.

-_. quantidades conhecidas de impurezas e/ou 2.1. baixa. 2. aplicando-se reterencla): a metodologia analftica proposta na analise de uma substancia de pureza conhecida (padrao de para a determinacao dos resultados obtidos pelo rnetodo em estudo em relacao ao da exatidao estao disponiveis: 2.8. -. determina-se 0 ruido da linha de base e considera-se como limite de quantificacao aquela concentracao que produza relacao sinal-ruido superior a 10: 1.2..----. com 3 (tres) replicas cada. concertracac 2.2. na analise de uma amostra.:80 . media e alta.2. --.htm teo rica x 100 6/13 ..7. Impurezas 2. comparacao dos resultados obtidos com aqueles resultantes caracterizada. --. ou como a diferenca porcentual entre as medias e 0 valor verdadeiro aceito. Robustez www._-. Varias metodologias 2.anvisa.7. Exatidao A exatidao de um rnetodo analftico e a proximidade valor verdadeiro.2.1.2. Neste caso..1.7. na qual quanti dade conhecida de farmaco foi adicionada a uma mistura dos componentes do medicamento (placebo contaminado). acrescida dos intervalos de confianca. A exatidao e calculada como porcentagem de recuperacao da quantidade conhecida do anal ito adicionado amostra.-.3.Exattd:a 0 . Este desvio padrao pode ainda ser obtido a partir da curva de calibracao proveniente da analise de um apropriado nurnero de amostras do branco.1. A exatidao e expressa pela relacao entre a concentracao media determinada experimentalmente e a concentracao te6rica correspondente: a e oncentr:2~aO medi a e:.7.-.3.--. no minimo.---. analise pelo rnetodo de adicao de padrao. nos casos em que amostras de todos os componentes do medicamento estao indisponiveis. aceita-se a analise pelo metodo de adicao de padrao.---.Resolucoes LD em que: DPa e 0 desvio padrao do intercepto com 0 eixo do Y de. 2.7.7. no minimo. Forma Farmaceutica de uma segunda metodologia bem 2.gov. aceita-se a cornparacao dos resultados obtidos com um segundo rnetodo bem caracterizado (metodologia farmacopeica ou outro procedimento analitico validado). sendo verificada a partir de.3. 3 curvas de calibracao construidas contendo concentracoes do farmaco pr6ximas ao suposto limite de quantificacao. Ie e a inclinacao da curva de calibracao.7. no caso da indisponibilidade de amostras de certas impurezas e/ou produtos de deqradacao.:peri mental .7. 2. cuja exatidao tenha side estabelecida. 9 (nove) determinacoes contemplando 0 intervalo linear do procedimento.Legislai.2.1.br/legis/resol/2003/re/899_03re. -. 2.----.7. Tambern pode ser determinado por meio do ruido. no qual adiciona-se quantidades conhecidas do anal ito (padrao de referencia) ao medicamento.6.2. 3 (tres) concentracoes.7. do intervalo linear e da especificidade do mesmo. 2.~. Farrnaco 2. ou seja.1. no qual adiciona-se produtos de deqradacao ao medicamento ou ao farmaco.-.14/06/12 Anvisa . A exatidao do rnetodo deve ser determinada ap6s 0 estabelecimento da linearidade.

..::.. I a uma faixa de concentracao..conjunto completo de amostras em estudo. Amostra desconhecida .amostra biol6gica que e objeto de analise...__ . estas deverao ser controladas e precaucoes ser incluidas no procedimento.....anvisa. Definicoes Amostra .termo geral que abrange: controles.. utilizada para avaliar a Amostra branco ... Constatando-se a susceptibilidade do metoda a variacoes nas condicoes analfticas.. Fatores que devem ser considerados na determinacao da robustez do metoda analitico. concentracao)....::..pararnetro que visa determinar se um anal ito rnantem-se quimicamente sob condicoes especificas..amostra de uma matriz biol6gica na qual nenhum anal ito foi adicionado.....::.. em resistir a pequenas e deliberadas variacoes dos Durante a desenvolvrnento da metodologia..br/legis/resol/2003/re/899_03re..J .. seu derivado... Amostra processada .. deve-se considerar a avaliacao da robustez.. .. . ._ www.. em determinados intervalos de tempo. com um nurnero apropriado de padroes e CQs para sua validacao e que tem sua analise completa nas mesmas condicoes.:80 . __ 1 . especificidade do metoda bioanalitico.. Faixa de quantificacao ...... devem Preparo das Amostras Espectrofotometria Cromatografia Uquida Cromatografia Gasosa ·Estabilidade das solucoes analiticas ·Tempo de extracao -Variacao do pH da solucao ·Temperatura ·Diferentes fabricantes de solventes -Variacao do pH da fase m6vel -Variacao na cornposicao da fase m6vel ·Diferentes lotes au fabricantes de colunas ·Temperatura ·Fluxo da fase m6vel ·Diferentes lotes au fabricantes de colunas ·Temperatura -Velocidade do gas de arraste METODOS BIOANALiTICOS 1.. Indica sua confianca durante a usa normal. amostras processadas e desconhecidas..amostra de matriz biol6gica adicionada do anal ito.. Exatidao ._ .14/06/12 Anvisa ..... Tabela 4.::. usada para monitorar a desempenho de um metoda bioanalitico e para avaliar a integridade e validade dos resultados das amostras desconhecidas analisadas numa corrida individual._ . A Tabela 4 relaciona as principais parametres que podem resultar em variacao na res posta do metoda....extrato final (anterior analise instrumental) manipulacoes (ex. que pode ser confiavel e .. _ _ inalterado numa dada matriz entre as resultados individuais encontrados e um valor ace ito como . "':.... biornolecula au a de uma amostra que foi submetida a varias Analito . _1 __ .. . metab61ito au prod uta de deqradacao em uma matriz biol6gica.: diluicao.:. __ ..corresponde :+.. Corrida analitica (au late) . brancos..htm 7/13 ....J.. __ .. tais como metab6litos.J_ .. Amostra de Controle de Qualidade (CQ) ..gov.. _ . _ .representa a grau de concordancia referencla.Legislai. podendo ser a farmaco nao-transformado.composto quimico especifico a ser mensurado. impurezas.habilidade do metoda bioanalitico de medir e diferenciar a anal ito de componentes que possam estar presentes na amostra. __ .. compostos de deqradacao au componentes da matriz.Resolucoes A robustez de um metoda analitico e a medida de sua capacidade parametres analiticos. ... . __ :_ incluindo a LSQ e a UQ. _ _ .__ : ... Estabilidade . Especificidade .1.._ . extracao..

. _1 .... .. : .:_...1.. us ados em analises de amostras..JU~li:l.. de um anal ito que 0 procedimento bioanalftico consegue diferenciar Limite Inferior de Ouantiflcacao (UQ) .estabelecimento analise das amostras.. nestes casos.. reprodutibilidade. : • I:. soro.. j.descricao com preens f\tel de todos os procedimentos de modo reprodutlvel.. parcial . pode-se observar um alto grau de variabilidade... Para tanto... Serao admitidos estudos utilizando pad roes secundarios desde que seja comprovada sua certificacao... ..Resolucoes e j.:80 . obtida da cornparacao dos resultados analfticos de amostras branco acrescidas de padrao e submetidas ao processo de extracao.. 1 . tais como sangue. :1:. tais como rnetodos microbiol6gicos e imunol6gicos. : ....br/legis/resol/2003/re/899_03re..representa 0 grau de repetibilidade entre os resultados de analises individuais.Jrt:lir~i:lU. -1 ...... exatidao.. do rnetodo de fornecer resultados diretamente proporcionais a concentracao Matriz biol6gica . . com a qual sao determinadas as concentracoes do anal ito nos CQs e nas amostras desconhecidas em estudo.. e importante ressaltar que todos os equipamentos e materiais devern apresentarse devidamente calibrados e os analistas devem ser qualificados e adequadamente treinados..precisao entre dois laborat6rios.. cromatografia Ifquida de alta eficlencla (CLAE) e estas combinadas com espectrometria de massa (MS) tais como LC-MS. expressa como a porcentagem da quantidade conhecida de um anal ito. CG-MS-MS... vauoacao total.. limite de deteccao e limite de quantificacao.. quando aplicado diversas vezes numa mesma amostra hornoqenea. LC-MS-MS.. Tarnbem se aplica a outras tecnicas analfticas. para facilitar a deterrninacao do anal ito.modlficacao no rnetodo bioanalftico validado que nao requer a necessidade de uma revalldacao Validacao total ....menor concentracao confiavelrnente do rufdo de fundo. Padrao de calibracao .it n .htm 8/13 ... com os resultados analfticos de solucoes padrao nao extraidas. Padrao Interno (PI) ......3.composto.. Tambern representa a precisao do rnetodo sob as mesmas condicoes operacionais.maior quanti dade de um anal ito numa amostra que pode ser determinada quantitativamente com precisao e exatidao. :I:. 1 ... especificidade.:::. 2.menor quantidade de um anal ito numa amostra que pode ser determinada quantitativamente com precisao e exatidao aceitaveis... Limite de Deteccao (LD) . estabilidade e recuperacao adequadas a analise..J_ . adicionado aos padrnes de calibracao e amostras em concentracoes conhecidas e constantes. A validacao de\te garantir..J .material distinto de origem biol6gica. em identicas condicoes de ensaio. 0 procedimento e Recuperacao . 2....2. www............eficiencia de extracao de um rnetodo analftico.. Reprodutibilidade ......corresponde a capacidade da substancia em exame (anal ito).. -1 . As informacoes contidas neste guia aplicam-se a rnetodos bioanalfticos._ . que 0 rnetodo atenda as exigencias das aplicacoes analfticas.._ : ... Limite Superior de Ouantificacao (LSQ) . Deve-se utilizar substancias quimicas de referencla e lou padroes biol6gicos oficializados pela Farmacopeia Brasileira ou por outros c6digos autorizados pela leqislacao vigente.i:llrUi:lU Anvisa . Os padroes de calibracao sao usados para construir a curva de calibracao.. linearidade.. Desse modo... num curto perfodo de tempo.. embora. Oonsideracoes gerais de todos os parametres de validacao de um rnetodo bioanalftico. deve apresentar precisao... -I_ ..14/06/12 reprouuuveuuetue 4Ui:lrrllfflii:lUi:lliUrrr t:Jl._: . _.Jur rrrt:ru Ui:I rt:ri:lyi:lU liUrrlit:rrlli:lyi:lU-rt:~j.J_ I. plasma ou urina. na ausencia de substancias qufmicas de referencta e/ou padroes biol6gicos farmacopeicos... tais como cromatografia gasosa (CG)...gov.Legislai._I~ . Precisao ._ .. _ .anvisa.. assegurando a confiabilidade dos resultados... "l.. Linearidade .. utilizados na determinacao quantitativa de farrnacos e/ou metab61itos em matrizes biol6gicas.. geralmente com caracterfsticas estruturais similares ao anal ito... aplicaveis a 2..J: . ou para outras matrizes biol6gicas...matriz biol6gica a qual foi adicionada uma quantidade conhecida de anal ito. CG-MS.. 2.. por meio de estudos experimentais... que pode ser amostrado e processado Metodo .

6. rnudancas na metodologia analitica.htm 0 9/13 orooostas.7. rnudanca de matriz.6.anvisa.6.6.7.5.7. Devern ser realizadas validacoes parciais quando ocorrerem modiflcacoes no rnetodo bioanalftico ja validado. Especificidade 3. 2.7.estudo 3.5.€ ser considerada durante a fase de desenvolvrnento do rnetodo. 2. Exemplos de variacoes: 2. 2. 2. A avaliacao da robustez de\. uma lipernica e uma hemolisada. entre outras: 2.1. 2. 2.10.7. De\. 2. para a quantificacao de um 2. por exemplo. Constatando-se suscetibilidade a variacoes nas condicoes analiticas. especificos.7.6. rnudancas relevantes na faixa de concentracao: 2. ate proximo de uma validacao total.3. como a deterrninacao da exatidao e precisao intra-ensaio.8.7.9. estabilidade das solucoes analiticas. Validacao pre .6.7.1.4. alirnentacao e outros fatores importantes para 0 estudo. substituicao 2.'+. 2.7.br/legis/resol/2003/re/899_03re. Variacoes tipicas em cromatografia gasosa: 2.6. soro.7. diferentes colunas (diferentes lotes e/ou fabricantes). sob condicoes controladas referentes ao tempo. Os ensaios de validacao parcial podem ser desde uma pequena determinacao. \. de um rnetodo bioanalitico 2. rnudancas de instrumentos 2. do sistema de deteccao.€-se justificar a impossibilidade de sua utilizacao. ri::lri::l U~ t:~lUUU~ ue Anvisa . De\.2. estas deverao ser adequadamente controladas ou precaucoes deverao ser incluidas no procedimento.1. diferentes colunas (diferentes lotes e/ou fabricantes).8. dernonstracao e/ou "softwares".gov.7. 2. plasma.2. temperatura. Os resultados de\Sm ser comoarados com aaueles obtidos . sendo quatro amostras normais. 3. 2.6.5.6.6. ou outra) obtidas de seis individuos.€Iocidade de fluxo.1.14/06/12 L.:80 .7.6. Cada amostra branco de\.Resolucoes UIUUI~fJurIlUIIIUi::IUt: rt:li::IlIvd/ulut:llulvdlt:rllOli::I ut:Vt:-~t: UlIlILi::Ir fJi::Iuri::lu uueu to. tempo de extracao. por exemplo. Deve-se analisar amostras da matriz bioloqica (sangue. 2. influencia da variacao de pH da fase movel.9.3.€ ser realizada validacao total antes da irnplernentacao farrnaco e/ou metabolitos.1. influencia da variacao da cornposlcao da fase rnoeel.€ ser testada utilizando orocedimento e as condicoas cromatonraficas www.Legislai.€Iocidade de fluxo.7. urina. temperatura. dernonstracao 2. rnudanca de anticoagulante na coleta das amostras. ~t:rrrfJrt: que rnetodos crornatoqraficos forem utilizados. de seletividade do anal ito na presence de rnedicacoes de seletividade do anal ito na presenca de metabolitos 2. rnudanca no procedimento de preparacao da amostra.4. de plasma para urina.6. As rnudancas tipicas que podem requerer uma validacao parcial incluem. \. transferenclas de rnetodos entre laboratorios e analistas. Variacoes tipicas em cromatografia liquida: 2. concomitantes.

1. 3. nao se admitindo valores superiores a 15%... _ . 3.4.2. Os interferentes podem ser componentes da matriz biol6gica.2.--. desvio menor au igual a 15 % (quinze par cento) em relacao concentracoes da curva de calibracao.anvisa.Resolucoes . A interferencia da nicotina.. A repetibilidade do metoda e verificada utilizando-se. em concentracao proxima ao LlQ..2. contemplando a limite de variacao esperado.1._--_ .:80 .2. Pode ser expressa como desvio padrao relative (DPR) au coeficiente de variacao (CV%). cafeina.--'-'-. nominal para a LlQ. em que um maior nurnero de concentracoes de padroes serao necessaries.. Caso uma au mais das amostras analisadas apresentarem tal interferencia.4. . cada um deve ser injetado separadamente para determinar as tempos de retencao individuais e assegurar que impurezas de um farmaco nao interfiram na analise do outro.-_. Para a determinacao da curva de calibracao.5. Procedimentos alternatives devern ser justificados. Caso a metoda seja destinado a quantificacao de mais de um farmaco. 3.br/legis/resol/2003/re/899_03re.2. Qualquer amostra branco que apresentar interferencia significativa no tempo de retencao do farmaco. Curva de calibracao/Iinearidade 3.. A resposta de picas interferentes no tempo de retencao do farmaco de\e ser inferior a 20% da resposta do LlQ. par exemplo. metab61ito au padrao interno.3. a 20% e 5% da res posta na concentracao utilizada. deve-se analisar amostras extraidas da matriz apropriada. 3. novas amostras de outros seis individuos devern ser testadas..1.3. a coeficiente angular e a intercepto da reta. -_.3.3. do LlQ ate 120% da concentracao mais alta que se pretende analisar. -. Deve-se apresentar as curvas obtidas (experimental e a resultante do tratamento matematico). como na obtencao de uma correlacao nao-linear.~------_ . Precisao 3. respectivamente.1. 3._--_..-.3.. -~-~. no minima. desvio menor au igual a 20% (vinte par cento) em relacao a concentracao 3. produtos de decornposicao e medicamentos utilizados concomitantemente ao estudo.1. 3.. produtos de venda isenta de prescricao e metab61itos deve ser considerada sempre que necessaria. no minima quatro de seis concentracoes da curva de calibracao devern cumprir com as criterios anteriores._-- com solucao aquosa do anal ito.gov. 3.2. Caso uma au mais das amostras deste grupo apresentarem interferencia significativa no tempo de retencao do farmaco. A curva de calibracao de\e incluir a analise da amostra branco (matriz biol6gica isenta de padrao do farmaco e do padrao interno).2. 5 (cinco) determinacoes par concentracao.4. contemplando a faixa de variacao do procedimento.Legislai.---.- Anvisa .. segundo a formula: www. a qual sera usada para calcular a concentracao do farmaco nas amostras.2. para a qual se admite valores menores au iguais a 20%.4.. nominal para as outras a concentracao 3. -_ . 6 (seis) amostras contendo padrao do farmaco e padrao interno. media e alta). 3. utilizando-se a mesma matriz biol6gica proposta para a estudo. Criterios de aceitacao da curva de calibracao: 3.2.3.. A curva de calibracao representa a relacao entre a res posta do instrumento e a concentracao conhecida do anal ito. a coeficiente de correlacao linear.14/06/12 . ~--_. a metoda de\e ser alterado visando elirninala.98.. a calculo de reqressao linear pelo metoda dos minimos quadrados. 3.4. no minima. realizando-se. de\e ser rejeitada.---~--' -.htm 10/13 .2. De\e-se gerar uma curva de calibracao para cada farmaco e corrida analitica. 3. Os resultados devern ser analisados par metodos estatisticos apropriados como. '_'y---. no minima.4. metab6litos. a coeficiente de correlacao linear deve ser igual au superior a 0. 3 (tres) concentracoes (baixa. A precisao deve ser determinada (preclsao inter-corridas)..4. exceto para a LlQ. 3. da amostra zero (matriz biol6gica mais a padrao interno) e de. no minima 6 (seis) concentracoes diferentes.1. em uma mesma corrida (preclsao intra-corrida) e em corridas diferentes 3.._---_ . As respostas de picas interferentes no tempo de retencao do farmaco e do padrao interno devern ser inferiores. incluindo a LlQ e a maior concentracao da curva de calibracao.3.2..3.2.1.2.

120 % (oitenta a cento e vinte par cento).7. 3. 3.gov. no mfnimo. 3.5.anvisa.5.:ao te6rica (LlQ) x 100 3. Limite de deteccao (LD) Estabelecido par meio da analise de solucoes de concentracoes conhecidas e decrescentes do farmaco.4.4. admite-se valores menores.1.3. no mfnimo.htm 11/13 .4. devendo-se especificar a metoda utilizado para determinacao do LlQ. Porcentagens de recuperacao do anal ito e do padrao interno pr6ximos a 100% sao desejaveis. exceto para a limite de quantiflcacao.Legislai. 0 calculo da recuperacao deve ser feito em funcao da relacao de area do padrao extrafdo e nao extrafdo.0 desvio nao deve exceder 15%. 0 LlQ deve ser.7.5. 5 (cinco) amostras de padroes. Controle de qualidade (CQ) www. desde que a recuperacao seja precisa e exata. D Pea desvio padrao e C M D.8.1. que representam 100% de recuperacao.4. 3. 3. 0 pica de resposta do farmaco no LlQ deve ser identificavel e reprodutfvel com precisao de 20% (vinte par cento) e exatidao de 80 . media e alta). media e alta).br/legis/resol/2003/re/899_03re. tanto para a anal ito quanta para a padrao interno separadamente. 3. Limite inferior de quantificacao 3. em uma mesma corrida analftica (exattdao intra-corrida) e em corridas 3.1. cinco vezes superior a qualquer interferencia da amostra branco no tempo de retencao do farmaco.Resolucoes OPR = OP -C-M-O. 3.5. contemplando a faixa de variacao do procedimento. 3.14/06/12 Anvisa . 3.:80 . Exatidao 3.4. Recuperacao A recuperaeao mede a eficiencia do procedimento de extracao de um metoda analftico dentro de um limite de variacao. ate a menor nfvel detectavel. A exatidao e expressa pela relacao entre a concentracao concentracao te6rica correspondente: para a qual se admite desvios menores media determinada experimentalmente ea Exatidao = --------------- co ncentracao m ed ia experim ental concentra-. A exatidao do metoda deve ser determinada utilizando-se.7. tambern.5. no mfnimo. 3 (tres) concentracoes (baixa. contemplando a faixa de linearidade do metoda. au iguais a 20%.2.4. utilizar a razao de 5: 1 entre a sinal e a rufdo da linha de base. A exatidao deve ser determinada diferentes (exatidao inter-corridas). Estabelecido par meio da analise de matriz biol6gica contend a concentracoes menor nfvel quantificavel com precisao e exatidao aceitaveis. 3.3.6.4. a concentracao media determinada. Este teste deve ser realizado comparando-se as resultados analfticos de amostras extrafdas a partir de tres concentracoes (baixa.2. no mfnimo. porern. realizando-se.2. Recomenda-se que a LD seja de 2 a 3 vezes superior ao rufdo da linha de base. Pode-se. decrescentes do farmaco ate a 3. atraves da analise de. com as resultados obtidos com solucoes padrao nao extrafdas.X 100 onde. 5 (cinco) determinacoes par concentracao.

sendo entao submetidas ao descongelamento a temperatura ambiente. tres amostras das concentracoes baixa e alta determinadas na validayao do rnetodo analftico. As condicoes de realizacao dos ensaios de estabilidade devem reproduzir as reais condicoes de manuseio e analise das amostras.anvisa. a 3.9.8. CQ do limite inferior de quantlficacao 3. adicionado a matriz biol6gica isenta de interferencia.8. das amostras.2. CQ de alta concentracao (CQ-LlQ): mesma concentracao de LlQ. especificidade. linearidade.2.5.9. As determinacoes de estabilidade devem utilizar um conjunto de amostras. na www.4.4. incluindo 0 padrao interne. Quando completamente descongeladas. assim sucessivamente. ap6s ciclos de congelamento e descongelamento e nas condicoes de analise. Estabilidade de longa duracao 3. As concentracoes de todas as amostras de estabilidade devem ser comparadas com a media dos valores anteriormente calculados para as amostras do primeiro dia do teste. CQ de media concentracao 3.Legislai. Estabilidade de curta duracao Para veriflcacao dessa estabilidade utilizam-se. CQ de baixa concentracao 3.9. A estabilidade do farmaco em Ifquidos biol6gicos depende de suas propriedades qulrnicas. (CQB): menor ou igual 3 x LlQ. da matriz biol6gica e do material de acondicionamento utilizado. tres amostras das concentracoes baixa e alta determinadas na validacao do rnetodo analftico. A estabilidade determinada para um tipo de matriz e de material de acondicionamento especffico nao pode ser extrapolada para outros. no minimo.1.1.4.Resolucoes 3. Estabilidade ap6s ciclos de congelamento e descongelamento Deve-se testar a estabilidade do farmacc ap6s tres ciclos de congelamento e descongelamento. Os resultados devem ser comparados com aqueles obtidos da analise das amostras recernpreparadas. tres amostras das concentracoes baixa e alta determinadas na validacao do rnetodo analftico. no minimo.3. 3. (CQM): aproximadamente a media entre CQB e CQA da curva de calibracao.3.1. 3.9. 0 tempo de armazenamento para 0 estudo de estabilidade de longa duracao deve exceder 0 intervalo de tempo compreendido entre a coleta da primeira amostra e a analise da ultima.9. 3. limite de varlacao e robustez. Estudo de estabilidade do farmaco em Ifquidos biol6gicos: 3. utilizando-se.9.14/06/12 Anvisa . Deve ser avaliada a estabilidade do anal ito durante a coleta e manuseio da amostra.9. de acordo com 0 cronograma apresentado no protocolo de estudo de biodisponibilidade relativa/bioequivalencia. quantificando-se 0 farmaco nas amostras ap6s 0 terceiro cicio.2. 3. Para verificacao dessa estabilidade utilizam-se.8. limite de deteccao. ate contemplar os tres ciclos.9. ap6s armazenagem de longa curacao (congelamento) e curta duracao (a temperatura ambiente).:80 . Consideracoes especificas relevantes Para a realizacao do estudo de estabilidade devem ser observados os parametres de exatldao. Deve-se incluir tarnbern avaliacao da estabilidade do anal ito nas solucoes-padrao. no minimo. preparadas com solvente apropriado em concentracoes conhecidas.4. nas seguintes condicoes: as amostras devem ser congeladas a temperatura indicada para 0 armazenamento e mantidas por 24 horas.br/legis/resol/2003/re/899_03re.htm 12/13 . as amostras devem ser novamente congeladas a temperatura indicada para 0 armazenamento. A temperatura utilizada no ensaio deve reproduzir a recomendada para armazenamento normal mente igual a -20 DC.3. preparadas a partir de uma solucao estoque recente do farmaco em analise. Estabilidade p6s-processamento Em caso de utilizacao de equipamentos que empregam sistemas autornaticos de amostraqern/injecao. limite de quantificacao.8. (CQA): 75 a 90% da maior concentracao 3. na amostra processada para analise. precisao.4. Cada uma delas devera permanecer temperatura ambiente de 4 (quatro) a 24 (vinte e quatro) horas (baseado no tempo em que as amostras do estudo serao mantidas a temperatura ambiente) e analisadas.9. previamente validados. por 12 a 24 horas e. deve-se realizar estudo de estabilidade do farmaco.gov. Os resultados devem ser comparados com aqueles obtidos da analise das amostras recem-preparadas. 3.

4.3. exceto para a LlQ. mas nao para a mesma concentracao. 4.14/06/12 Anvisa . Qualquer que seja a metoda estatistico utilizado para avaliar as resultados dos estudos de estabilidade. No minima. contemplando a temperatura e a periodo de armazenamento das mesmas. em cada corrida analitica. Em caso de tais solucoes serem armazenadas sob refriqeracao au congelamento.6.9.2. sempre em igual nurnero de replicatas de cada concentracao (CQB.6. as resultados devem ser comparados com aqueles obtidos da analise das amostras recem-preparadas. 6 (seis) horas ap6s preparacao. sua precisao e exatidao devem ser monitoradas regularmente assegurar a continuidade do desempenho satisfat6rio. para 4. mantidas temperatura ambiente par.:80 . www.htm 13/13 .7. a curva deve ser redefinida au as amostras de concentracoes superiores devem ser diluidas e re-analisadas. padrnes de calibracao e amostras desconhecidas de um au mais voluntaries do estudo.7. Uma corrida analitica deve canter: amostras de CQ. Em vez disso.3. As amostras de CQ devem ser incorporadas em intervalos adequados. 3. amostras de CQ devem ser analisadas juntamente com as demais amostras. 4. no minima.1.2. 33% (duas de seis) amostras de CQ podem estar fora destes limites. no minima.9. 67% (quatro de seis) das amostras de CQ devem estar dentro de mais au menos 15% dos seus respectivos valores nominais. Estabilidade das solucoes-padrao 3.anvisa. 4. com excecao do LlQ.Legislai. 3. Criterios de aplicacao do metoda bioanalitico validado 4.6. A analise de todas as amostras de um anal ito em matriz biol6gica deve ser concluida dentro do periodo de tempo para a qual a estabilidade tenha sido determinada. este desera estar descrito claramente no procedimento operacional padrao (POP). para a qual se aceita desvio de ate 20%.9. E prefe riveI que todas as amostras de um mesmo voluntario sejam analisadas numa (mica corrida. dependendo do nurnero total de amostras da corrida.Resolucoes temperatura sob a qual a teste sera realizado e par period a de tempo superior a curacao da corrida analitica.1. Deve ser avaliada a estabilidade das solucoes-padrao do farmaco e do padrao interno. No usa rotineiro do metoda analitico validado.9.br/legis/resol/2003/re/899_03re. 4. a nurnero de amostras de CQ (em multiples de tres) a ser incorporado em cada corrida analitica nao deve ser inferior a 5% (cinco par cento) do nurnero de amostras desconhecidas. as resultados desse teste devem ser comparados preparadas do farmaco e do padrao interno. Analise dos resultados com aqueles obtidos utilizando-se a tarnbern solucoes recentemente As amostras serao consideradas estaveis quando nao se observar desvio superior a 15% do valor obtido das amostras recern-preparadas. pelo menos 6 (seis) CQs (uma duplicata de cada concentracao) devem estar presentes. para a qual se admite desvios menores au iguais a 20%.9. 3. Para corridas analiticas constituidas de ate 120 amostras. 4. as resultados das amostras de CQ servrao de base para aceitacao au rejeicao da corrida analitica. tres amostras das concentracoes baixa e alta determinadas na validacao do metoda analitico. Nao e permitido estimar a concentracao das amostras atraves de extrapolacao da curva de calibracao abaixo do LlQ au acima do maior padrao.5. Para atingir este objetivo. 3. CQM e CQA). Utilizase. 4.6.gov.6. a estabilidade deve ser avaliada.

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