2 Curso Muestars 2012

Memorias del Curso Importancia de la muestra clnica para el diagnstico de laboratorio Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia Comit Organizador
HISTORIA CLNICA
Daz Zarco Soledad* Zamora Espinosa Jos Luis* Gutirrez Castillo Adriana del Carmen**
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Integrante del Cuerpo Acadmico en Salud Animal Integrante del Cuerpo Acadmico en Patognesis Microbiana
INTRODUCCIN Entre los elementos imprescindibles para la integracin de un buen diagnstico se encuentra la historia clnica o anamnesis, pilar fundamental en la toma de decisiones para la solicitud del anlisis clnico pertinente y el establecimiento del diagnstico definitivo. La historia clnica es un instrumento de investigacin clnica; se puede definir como un documento donde se recoge la informacin que procede de la prctica clnica relativa a un enfermo. Es el conjunto de datos obtenidos a travs de un interrogatorio para conocer los antecedentes de la enfermedad desde su inicio hasta su posible pronstico, con la finalidad de identificar las motivaciones (causas) de la alteracin morfolgica o funcional y los sentimientos (sntomas), la posible causa de muerte y la conexin entre ambas. As tenemos una idea clara de que rganos y sistemas se deben estudiar con mayor detalle y las tcnicas diagnsticas especficas. Estos datos se vierten en un formulario, instrumento bsico para establecer un orden en la obtencin de informacin. La historia clnica es el elemento clave para el ejercicio clnico profesional, pues acta como recordatorio para el manejo clnico del paciente, permitiendo el anlisis retrospectivo del quehacer mdico. En toda institucin mdica, de salud o de diagnstico, la historia clnica es el archivo ms importante, contiene informacin vital para la gestin mdica, administrativa y legal. A la informacin bsica se pueden integrar mdulos de diferentes especialidades como el de laboratorio y estudios complementarios de diferentes especialidades o especficos segn las necesidades de cada usuario. Es importante considerar todos los datos del propietario, por ejemplo: domicilio, telfono, correo electrnico, referencias del predio en caso de que se requiera llevar a cabo actividades de vigilancia epidemiolgica, etc. El valor de la historia clnica radica en saber obtener, ordenar, analizar y relacionar la informacin de manera lgica, pues de esta forma orienta las investigaciones a una direccin determinada para llegar al diagnstico. CONSIDERACIONES PARA LA OBTENCIN DE LA INFORMACIN La persona encargada de elaborar la historia clnica debe evitar en lo posible las preguntas capciosas, saber conducir el interrogatorio para evitar datos confusos y de poca importancia, infundir confianza al cliente, tambin contar con habilidad para el interrogatorio y obtener de manera metdica y completa la informacin sin omitir datos importantes y evitando la necesidad de repetir la investigacin, cobrando mayor relevancia en aquellos casos en donde el diagnstico corresponde con una enfermedad zoontica, extica o de alto impacto a la salud animal. 1
Es conveniente permitir al dueo que narre la historia con sus propias palabras y completarla con preguntas especialmente orientadas. Las anotaciones de lo que se refierea, deben ser descriptivas y no interpretativas. Es conveniente que se compruebe la validez de los datos ya que puede ser que nos enfrentemos ante un caso de negligencia por parte de alguno de los posibles responsables. Debe advertirse si la informacin es tendenciosa debido a posibles contradicciones cuando lo sugerido no concuerda con los resultados de los exmenes clnicos y posmortem. Recordar que en algunos casos como peritaje, reclamaciones, determinacin de incapacidad total o permanente, etc., este documento podr tener valor legal. La exactitud de los datos muestra no solo la preparacin tcnica del mdico y su acuciosidad para obtenerlos, sino tambin su capacidad de relacin, su inteligencia para entender al individuo que sufre y su habilidad para conseguir la informacin necesaria. La informacin puede obtenerse por diferentes vas como: Anamnesis, es la informacin surgida de la entrevista clnica proporcionada por el propio encargado/dueo. Exploracin fsica o clnica. Pruebas o exmenes complementarios realizados por el mdico. Juicios de valor que el propio mdico extrae o de documentos que l elabora para fundar un diagnstico, prescribir el tratamiento y, finalmente, dejar constancia del curso de la enfermedad.
FUNCIONES DE LA HISTORIA CLNICA Permite conocer los antecedentes de la enfermedad. Orienta hacia la seleccin de muestras para el estudio de laboratorio. Conduce a resultados confiables y exactos. Indica cmo manejar al animal en casos de riesgo a la salud pblica, reforzando las medidas de bioseguridad. Permite valorar el impacto ambiental. Permite seleccionar la tcnica de eutanasia (NOM-033-ZOO-1995, Sacrificio Humanitario de los animales domsticos y silvestres). Permite realizar la disposicin zoosanitaria adecuada de los residuos peligrosos biolgicos infecciosos relacionados con cadveres o muestras biolgicas (Norma Oficial Mexicana NOM087-ECOL-1995). Realizar una serie de estudios estadsticos de reas seleccionadas para tal fin. Permite realizar listados de clientes, enfermedades, especies afectadas, etc., dependiendo del campo de inters, indicando la caracterstica de los mismos. 2
La historia clnica es una fuente de informacin que debe estar relacionada con los elementos que integran el proceso epizotico, es decir, agente, hospedero y ambiente relacionado con el animal o con las poblaciones animales. Esta informacin debe ser ordenada cronolgicamente y registrarse en los formatos que para tal efecto se elaboran Para ello se sugiere que la informacin recopilada en la historia clnica, satisfaga aspectos importantes como: Administrativos y de gestin. Son datos utilizados para el control interno, es el elemento fundamental para el control y gestin Mdico-legal. De vigilancia epizootiolgica. La informacin recopilada en la historia clnica, debe responder en un momento dado a las necesidades requeridas por el formato del Sistema de Informacin y Vigilancia Epidemiolgica (SIVE), publicado en el Diario Oficial de la Federacin el 6 de diciembre de 1995; as como en aquellos padecimientos normados a travs de campaas nacionales y en cuyo caso se debe emplear el formato especfico y en aquellas enfermedades con caractersticas exticas o en problemas en donde est involucrada la salud pblica. Los datos as recopilados, deben poder ser procesados en paquetes de cmputo con fines de anlisis del proceso saludenfermedad, caracterizando la problemtica de la salud animal o de la salud pblica para la implementacin de programas control y de medicina preventiva. Docencia e investigacin. A partir de las historias clnicas pueden realizarse estudios e investigaciones sobre determinadas patologas. Mejora continua de la calidad. La historia clnica es un fiel reflejo de la relacin mdico-paciente as como un registro de la actuacin mdica prestada al paciente De diagnstico. La informacin deber ser obtenida de acuerdo a los perodos que integran la historia natural de la enfermedad; el prepatognico y el patognico con la finalidad de relacionarla cronolgicamente. En el perodo prepatognico (antes de que inicie la enfermedad) es cuando interactan los tres elementos de la triada epizootiolgica del proceso epizotico (hospedero, agente y ambiente). A travs del interrogatorio, se busca identificar el momento en que tal interaccin rompe con el equilibrio y predomine el agente etiolgico sobre el hospedero, bajo condiciones adversas del medio ambiente o la susceptibilidad del hospedero. Agente. Es todo elemento bitico o abitico que al estar en contacto con el hospedero y que bajo condiciones ambientales adversas para el hospedero, tiene la capacidad de producir desequilibrio entre la homeostasis del hospedero y el ambiente. La Norma Oficial Mexicana NOM-056-SSA-11993 lo define como toda substancia qumica, microorganismos, tipo de energa, actividad o relacin social que puede alterar la salud. Hospedero. Es todo ser vivo que puede albergar un agente o bien, sufrir los efectos de este. El hospedero puede caracterizarse desde el punto de vista individual y poblacional, bajo diferentes factores de riesgo como edad, raza, sexo, funcin zootcnica, inmunizaciones, alimentacin, tipo de explotacin, densidad de poblacin, posibles agentes etiolgicos, micro y macroclima. Eventos individuales. Son los datos en detalle del hospedero afectado de manera individual que incluyen desde la identificacin hasta la evolucin de la enfermedad. Eventos poblacionales. Comprende la historia sanitaria del rebao o parvada en lo que se refiere a su perfil epizootiolgico, estudios diagnsticos retrospectivos. Total de la poblacin, nmero de 3
animales enfermos (morbilidad), nmero de animales muertos del total de la poblacin (mortalidad), nmero de animales muertos de los que enfermaron (letalidad), con estos indicadores nos damos idea de la patogenicidad, virulencia, forma de transmisin del agente en la poblacin o la susceptibilidad del hospedero, nmero de especies animales existentes, edades, movilizacin de animales y visitas, lugar de procedencia, tratamientos indicados y evolucin, inicio y duracin de la enfermedad. Ambiente. El examen del hospedero debe estar acompaado por el estudio de su ambiente considerado como todo aquello que lo rodea. Se puede abarcar desde dos puntos de vista: 1. Macroambiente. El cual se refiere a condiciones ambientales generales tomando en cuenta ubicacin geogrfica, topografa, hidrologa, precipitacin pluvial, altitud, humedad relativa, orografa, clima, temperatura, etc. 2. Microambiente. Es el medio ambiente ms cercano al hospedero y puede abarcar desde un local hasta la unidad de produccin en su totalidad. El perodo patognico se compone de dos etapas; la preclnica que manifiesta el efecto predominante del agente sobre el hospedero, iniciando con alteraciones morfolgicas en diferentes niveles que para fines de diagnstico son: celular, tisular, orgnico, individuo o poblacin y como consecuencia alteraciones funcionales en el correspondiente nivel, a partir de este momento termina esta etapa e inicia la etapa clnica en donde rebasa la lnea imaginaria conocido como horizonte clnico, en donde se identifican a travs de la manifestacin de los signos e interpretacin de los mismos, los sntomas por parte de la persona encargada o del clnico, los indicadores de enfermedad. Este perodo termina de acuerdo con la interrelacin de los elementos de la triada, en particular la patogenicidad y virulencia del agente, la resistencia o susceptibilidad del hospedero y las condiciones medioambientales existentes, con la recuperacin del hospedero en diferente grado, quedar incapacitado o llegar a la muerte. De la caracterizacin de ste perodo depende en gran medida la orientacin diagnstica que se elabore y por lo tanto las medidas contraepizoticas que se implementen. BIBLIOGRAFA
Blood DC, Studdert VP. (1988): Diccionario de veterinaria Vol. I. Interamericana Mc Graw-Hill, Mxico. Doxey DL. (1978): Patologa Clnica y Procedimientos de Diagnstico en Veterinaria. El Manual Moderno, Mxico. http://www.biocom.com/sistema/historias_clinicas/historia_clinica_informatica.html (2010) McCurnin DVM. (1987): Tcnicas Veterinarias. El Manual Moderno, Mxico. Perusquia JMT, Paasch ML. (1985): Necropsia en Aves. Radostits OM, Mayhew IG, Houston DM. (2002): Examen y diagnstico clnico en veterinaria. Saunders, Espaa.
MUESTRA
Diaz Zarco Soledad* Velzquez Ordez Valente* Alonso Fresn Ma. Uxa*
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Integrante del Cuerpo Acadmico en Salud Animal
INTRODUCCIN El mantener la salud de los animales domsticos en forma ptima es un requisito indispensable para el proceso de produccin de la economa planificada. Las enfermedades infecciosas y no infecciosas adquieren en este contexto una importancia especial, la cual debe tomarse en consideracin por medio de un diagnstico rpido y eficiente, as como una valoracin epizootiolgica y respectivas medidas contraepizoticas. El conocimiento de las enfermedades que afectan a los animales domsticos ha aumentado considerablemente en los ltimos aos. Para reconocer verdaderamente a las enfermedades debe tenerse conocimiento especial sobre su etiologa, epizootiologa, patogenia, diagnstico, inmunologa y medidas profilcticas para su utilizacin racional en el trabajo prctico. Las enfermedades de los animales domsticos representan un papel importante desde el punto de vista econmico y de salud pblica. Mientras la amenaza de algunas enfermedades ha sido totalmente eliminada o en parte reducida en los pases desarrollados, en algunos pases en desarrollo todava se sufre un incremento en la incidencia de diversas enfermedades o el desconocimiento de la existencia de algunas otras, debido principalmente a la falta de una base slida para el diagnstico. Esto, aunado a la escasa informacin sobre la presencia de enfermedades y a la poca comunicacin entre los profesionistas expertos en el rea, repercute en prdidas econmicas a corto y largo plazo, lo cual debe tomarse en consideracin y establecer sistemas de diagnstico rpido y eficiente para determinar la presencia y distribucin de enfermedades as como investigacin continua para identificar brotes de enfermedades nuevas y una valoracin epizootiolgica y respectivas medidas de prevencin y control, que garanticen la salud animal. MUESTRA PARA EL DIAGNSTICO La consulta de laboratorios privados u oficiales para el control de enfermedades, a travs del envo de muestras es una herramienta auxiliar para el Mdico Veterinario en la solucin de problemas. Con frecuencia este esfuerzo es intil por un manejo inadecuado o por la recoleccin de la muestra no representativa. Para lograr los mejores beneficios en cuanto al apoyo de los laboratorios de diagnstico, es necesario tener en cuenta los principios bsicos sobre la correcta seleccin, empaquetado y envo de la muestra. Criterios de seleccin: Es el procedimiento que se requiere para elegir el material a analizar a partir de la totalidad de los individuos objeto de estudio, este procedimiento depender del tipo de producto y de la finalidad del examen. 5
Muestra: Es todo aquel material biolgico obtenido del individuo vivo o muerto, de la poblacin susceptible o de su ambiente y representativa del problema de estudio. En procesos morbosos, la seleccin de la muestra debe recaer en el animal que se encuentre en etapa temprana de la fase aguda de la enfermedad y acorde a los datos de la historia clnica. Es preferible remitir varios especmenes de la poblacin, sobre todo en brotes epizoticos y en animales cuyo costo por unidad no sea tan elevado, deben elegirse animales recientemente muertos y varios en diversos estados de la enfermedad. Es conveniente sealar que el envo de los especmenes para el laboratorio deber realizarse tan rpido como sea posible, ya que se corre el riesgo de su inutilizacin por descomposicin, tenemos entre las causas ms frecuentes, las siguientes: Hemlisis, en las muestras de sangre impide los exmenes serolgicos o hematolgicos y puede ser causada por: Empleo de jeringa o aguja hmeda. Vaciado brusco a travs de la aguja. Agitacin indebida. Calentamiento o enfriamiento excesivo. Descomposicin bacteriana. Contaminantes qumicos. Llenado excesivo (que hace que se pierda la proporcin sangre: anticoagulante o bien no se forme cogulo).
Descomposicin o desarrollo bacteriano, las principales causas son: Contaminacin ambiental, con material fecal o intestinal. Temperaturas elevadas durante el transporte. Transporte de larga duracin. Autolisis, se debe a la digestin de tejidos por sus propias enzimas y se presenta en tejidos que han sido empacados en conservadores de accin leve, volumen inadecuado o por temperaturas elevadas. Desecacin, puede presentarse sobre todo por: Muestra escasa. Cerrado no hermtico que permita la evaporacin. Fragmentacin, da por resultado un examen histopatolgico inadecuado, puede ser causada por: Emplear tijeras o cuchillos sin filo para el corte de los tejidos. Forzar la muestra en envases de poca capacidad. Utilizar fijadores o conservadores en cantidad insuficiente o inadecuada. Congelar la muestra o tejido.
Conservacin de la muestra Existen numerosas sustancias conservadoras, cada una tiene sus propias ventajas o limitaciones, sin embargo el criterio de seleccin deber basarse en el tipo de anlisis que se requiera, tipo de muestra y tiempo desde la obtencin de la muestra hasta su procesamiento. La refrigeracin, es til en las muestras donde se requieren procesos bacteriolgicos, serolgicos y anatomopatolgicos. Para la refrigeracin es recomendable el uso de recipientes que contengan el material refrigerante, como bolsas de plstico impermeables para evitar que el agua del deshielo o el refrigerante alcance directamente a la muestra, para la refrigeracin puede usarse: Hielo natural. Hielo seco. Lquido refrigerante. Conservadores qumicos, se clasifican segn sus efectos como deshidratantes y fijadores y son utilizados en muestras para estudios histopatolgicos, entre los que destacan: CONSERVADOR CONCENTRACIN Formaldehdo 4 al 10 %. Acido actico 0.3 a 0.5 %. Acido pcrico 100 % (solucin saturada). Acido crmico 0.5 al 2 %. Dicromato de potasio 1 a 2 %. Tetraxido de osmio 1 a 2 %. Acetona 73 al 100 %. Soluciones bactericidas, sern utilizadas cuando sea necesario mantener el desarrollo bacteriano en un nivel mnimo y tomando en cuenta el tipo de proceso requerido. Formalina al 10 %. Fenol al 0.5 %. Tolueno. ENVO El manejo y transporte de la muestra debe efectuarse de tal manera que se evite la ruptura y filtracin de los empaques y que esto altere o contamine la misma. Durante el envo, las muestras no debern exponerse a la luz solar directa. Los especmenes deben ser empacados en materiales impermeables, stos a su vez introducidos en recipientes de mayores dimensiones a prueba de fugas de agua donde se llena el espacio vaco con la unidad de refrigeracin y empacados nuevamente en cajas que contengan material absorbente como papel o aserrn. Las muestras deben ser enviadas debidamente cerradas, etiquetadas y acompaadas por la historia clnica que contenga los datos de: Tipo y nmero de muestras, tipo de conservador, fecha y hora de obtencin de la muestra, tratamiento indicado, dosis, frecuencia, evolucin y diagnstico presuntivo.
CONSIDERACIONES PARA DETERMINAR EL TAMAO DE MUESTRA Cuando el proceso patolgico est afectando a varios individuos de la poblacin, es necesario obtener indicadores epidemiolgicos a travs de un diagnstico de situacin que den a conocer con mayor precisin el comportamiento de la enfermedad, la informacin se obtiene a partir de encuestas y estudios. Por lo general, una encuesta supone realizar el recuento de los miembros de un conjunto agregado de unidades y valorar sus caractersticas tales como peso, produccin, presencia de una enfermedad, niveles de anticuerpos, etc. Un estudio sin embargo, supone realizar la comparacin de grupos y por lo general se efecta para poner de manifiesto la causa de la enfermedad. Si la encuesta se planifica correctamente, puede hacerse una estimacin razonablemente precisa de una variable mediante el examen de algunos de los individuos de la poblacin principal, es decir de una muestra, para tal efecto puede recurrirse a la seleccin intencionada que consiste en la eleccin de una muestra cuyas medias de sus caractersticas cuantitativas o cuya distribucin de sus caractersticas cualitativas sean similares a las de la poblacin. Su objetivo consiste en seleccionar una muestra en las que las caractersticas estn equilibradas con las de la poblacin. Para determinar el tamao de la muestra en necesario considerar los objetivos del estudio, las circunstancias de la investigacin, la precisin deseada de la estimacin de la prevalencia y la frecuencia esperada de la enfermedad. El diseo de la muestra es un componente esencial de las encuestas y estudios analticos. Por ejemplo, los datos de investigaciones de brotes o datos recogidos rutinariamente de registros de hospitales o de clientes, pueden ser considerados como procedentes de una muestra de la poblacin, aunque no se ha empleado un muestreo metdico; hay menos problemas en la extrapolacin de los datos obtenidos de un muestreo planificado que de los datos, cuya obtencin no fue planeada previamente. Los datos de una muestra planificada procedentes de la poblacin describen los caracteres (es decir frecuencia o distribucin de la enfermedad o de niveles de produccin) de una poblacin y permite comprobar asociaciones especficas entre sucesos y factores de la poblacin. Si el estudio es una encuesta o un estudio analtico, la forma en que los individuos de estudio se obtengan de la poblacin, es decir, el mtodo de muestreo, determinar la precisin y la naturaleza de las extrapolaciones que vayan de la muestra a la poblacin. Aunque la muestra en s es solamente una parte del diseo del estudio analtico, su importancia radica en que los tipos de estudios que se realicen se basan en la estrategia de la seleccin de las muestras, considerando los siguientes puntos: - Establecer objetivos claros y concisos que incluyan los parmetros que van a estimarse y la unidad de inters. - Es importante que la muestra sea representativa de la poblacin diana. - Antes de seleccionar la muestra, la poblacin a muestrear debe dividirse en unidades de muestreo. El tamao puede variar desde un individuo a un conjunto de individuos, como camadas, piaras o rebaos. 8
- Finalmente, es importante los mtodos que se van a utilizar. Las determinaciones exactas del tamao de la muestra requerida para una encuesta pueden ser muy pormenorizadas y la mayora de las encuestas complejas pueden requerir la ayuda de un estadstico. BIBLIOGRAFA
Coffin DL. (1986): Laboratorio Clnico en Medicina Veterinaria. 3ed., La Prensa Mdica Mexicana, Mxico. Aluja SA, Casas FC. (2002): Tcnicas de necropsias en animales domsticos. El Manual Moderno, Mxico. FMVZ. (SF): Tcnica de Necropsia. Manual de Referencia Tcnica del Diagnstico No. 17. Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia de la UAEM. Salinas MJA. (1994): Las enfermedades Infecciosas del Ganado en Mxico. Enfermedades Infecciosas del Ganado y el TLC, Simposium Internacional, Monterrey, N.L. Secretara de Salud (1994). Proyecto de Norma Oficial Mexicana NOM -109-SSA1-1994, bienes y servicios. Procedimiento para la toma, manejo y transporte de muestras de alimentos para su anlisis microbiolgico. Diario Oficial de la Federacin, 4 de noviembre, 68-72. Thrusfield M. (1990): Veterinary Epidemiology. Butterworths, London.
BIOSEGURIDAD
M. en C. Ada Elia Daz Gonzlez Borja, Dra. Adriana del Carmen Castillo Gutirrez, M. en C. Valente Velzquez Ordoez, M. en C. Ral C. Fajardo Muoz.
La formacin es la clave de la eficacia de la bioseguridad, y debe ser facilitada a todas las personas que estn expuestas a los riesgos de tipo biolgico y no biolgico tanto en el laboratorio como en el campo. Estas deben responsabilizarse de su propia seguridad y de la de sus compaeros una vez que las normas de seguridad han sido establecidas, aprobadas, escritas y asumidas. Bioseguridad Es el manejo tcnico adecuado, en laboratorio y campo, por el personal expuesto a riesgos peligrosos biolgico infecciosos principalmente y cuya eficiencia refleja el entrenamiento del personal y se traduce en la proteccin del mismo, de las instalaciones y del medio ambiente. Objetivo: Proteger, proveer seguridad laboral, adopcin de prcticas seguras que eviten accidentes y disminuyan riesgos de exposicin (biolgicos, qumicos y fsicos), tener conocimiento de la conducta a seguir frente a un accidente con exposicin a dichos elementos y crear conciencia sobre la cultura de riesgos biolgicos infecciosos.
La bioseguridad est estructurada en tres barreras de proteccin, las cuales se dividen exclusivamente para fines acadmicos ya que en la prctica se consideran como un todo que debe abordarse de manera simultnea: Barrera de proteccin al agente: Esta barrera se refiere a la integridad de la muestra contra la degradacin o contaminacin que pudiese poner en peligro la validez de esta, para ello es necesario considerar los siguientes puntos: Informacin pertinente. Proteccin. Aislamiento. Identificacin Manejo.
Estos puntos ayudan a determinar la patogenicidad relativa, forma de transmisin, establecer el nivel de seguridad para un manejo adecuado e integridad del mismo. As como establecer la proteccin de la persona que lo est manejando y la proteccin al medio ambiente.
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Barrera de proteccin al personal que labora en el laboratorio. Consiste en proteger al personal del laboratorio contra exposiciones innecesarias e injustificadas a agentes infecciosos, y para ello debe seguir lineamientos como son: Conocer el manual de normas y procedimientos del rea de trabajo, porque todo profesional tiene el derecho y el deber de conocer a profundidad los riesgos de su profesin. Establecer buenas prcticas de trabajo y disciplina. Implementar medidas de seguridad en tcnicas y procedimientos a medida que se desarrollan. Dotacin de ropa y equipo de proteccin persona (REPP). Su uso reduce la probabilidad de lesiones y exposicin a agentes infecciosos y disminuye el riesgo de adquisicin de enfermedades ocupacionales, lo cual no significa que la REPP sea un substituto de una buena prctica de trabajo. La utilizacin de un equipo equivocado crear un riesgo adicional al operario al inspirar en ste un falso sentido de seguridad. La REPP debe ser seleccionado en funcin de la actividad a desarrollar y del mximo nivel de riesgo que se espera encontrar. Implementar un botiqun de primeros auxilios, con el material necesario para actuar inmediatamente ante un accidente de laboratorio de tipo biolgico. Este debe estar a la vista y de fcil acceso. Supervisin. Capacitacin. Sealamientos. Avisos.
Barrera de proteccin al medio ambiente: La funcin bsica de esta barrera es mantener a los agentes infecciosos confinados para evitar su diseminacin y se conviertan en un problema de salud pblica o animal. Control y manejo adecuado de residuos peligrosos biolgico infecciosos. Tratamiento y disposicin adecuada de residuos peligrosos biolgicos infecciosos. Control de visitas y del personal. Control de vectores. Control de vehculos. Saneamiento ambiental.
Para lograr el equilibrio de estas barreras, es necesario conocer los niveles de riesgo, grado de desarrollo tcnico del laboratorio y necesidades de personal de laboratorio para el desarrollo de los procesos tcnicos. CLASIFICACIN DE AGENTES INFECCIOSOS EN GRUPOS DE RIESGO BIOLGICO Los agentes infecciosos han sido clasificados en cuatro grupos de riesgo (Comit de Expertos OMS 1978), para facilitar el manejo adecuado de los agentes patgenos, as como la implementacin de prcticas seguras, tipo de contencin, uso de equipo de proteccin personal, considerando los siguientes puntos: la capacidad patgena del
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agente, su forma de transmisin, gama de hospederos, disponibilidad de medidas de prevencin eficaces, profilaxis (vacunas, antisueros, medidas de sanidad, control de vectores y reservorios etc.) y disponibilidad de un tratamiento eficaz. CLASIFICACIN DE AGENTES INFECCIOSOS EN GRUPOS DE RIESGO BIOLGICO
GRUPO DE RIESGO CARACTERSTICAS Escaso riesgo individual y comunitario I Son microorganismos que tienen pocas posibilidades de provocar enfermedades humanas o enfermedades de importancia veterinaria. Riesgo individual moderado y riesgo bajo de transmisin Agentes patgenos que pueden provocar enfermedades humanas o enfermedades en los animales, pero que tienen pocas probabilidades de entraar un riesgo grave para el personal que labora en la comunidad, el ganado o medio ambiente, pero se dispone de medidas eficaces de tratamiento y prevencin, por tanto el riesgo de propagacin es controlado. Riesgo individual elevado, riesgo comunitario bajo. Agente patgeno que suele provocar enfermedades serias en las personas o en los animales pero no se trasmite fcilmente de un individuo a otro, para las cuales existen tratamiento y medidas preventivas. Elevado riesgo individual y comunitario IV Agente patgeno que provoca enfermedades graves en las personas o en los animales y puede propagarse fcilmente, de un individuo a otro, directa o indirectamente. Y para las cuales no existe tratamiento ni medidas preventivas eficaces. EJEMPLO E. coli. Salmonella enteritidis. Salmonella dublin. Trichosporum cutaneum
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S. pyogenes. S. aureus. Coxiella burnetti Microsporum canis Aspergillus fumigatus Blastomyces dermatitidis Salmonella typhymurium Salmonella paratyphi Brucella abortus Mycobacterium avium P.aeruginosa Actinobacillus mallei Histoplasma capsulatum
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Bacillus anthracis
Es importante conocer el riesgo que representan los microorganismos infectantes, as como su correlacin que existe entre el grupo de riesgo y el tipo de laboratorio.
GRUPOS DE RIESGO CON RELACIN AL LABORATORIO

Grupo de riesgo I II Bsico De servicios primarios de salud De diagnstico. De enseanza universitaria De diagnstico Clasificacin del laboratorio Bsico Ejemplo de laboratorio De enseanza bsica Ejemplo de microorganismo E. coli. Bacillus subtilis Salmonella tiphy V. de la hepatitis B M. tuberculosis Brucella sp.
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III IV
Contencin Contencin mxima
especializado. Que trabajan con patgenos peligrosos o de alta seguridad (CPA)
V. de la Fiebre de Lassa V. de la Fiebre Aftosa V. Marburg
Las infecciones profesionales estn relacionadas con el trabajo y son el resultado de exposiciones a microorganismos como bacterias, virus, hongos y parsitos. Las infecciones se presentan en profesionales al cuidado de la salud, despus de un contacto con hospederos infectados, sus secreciones, excreciones, tejidos infectados y hospederos sintomticos. Es por ello que personas al cuidado de la salud (veterinarios, mdicos etc.) se encuentran en elevado riesgo de infeccin frente a microorganismos cuyos hospederos naturales pueden ser los animales y el hombre, un ejemplo de estas enfermedades son la brucelosis, dermatitis, ttanos, tuberculosis, candidiasis, histoplasmosis, dermatomicosis, enfermedades causadas por protozoarios y helmintos, toxoplasmosis, rabia, anquilostomiasis entre otras. anquilostomiasis entre otras.
FORMACIN DE AEROSOLES Y GOTAS

El riesgo de exposicin del personal al momento de tomar la muestra en campo o laboratorio es la formacin de aerosoles y gotas, ya que estos se difunden rpidamente en el rea de trabajo, este riesgo se minimiza evitando la manipulacin de materiales infectados y buenas prcticas de bioseguridad. Aerosol Es una suspensin de partculas muy finas secas y con frecuencia Infeccioso hmedas en un gas (neblina) menores a 5 de dimetro, que son producidas durante el curso de muchos procesos. Estos aerosoles no se asientan rpidamente y son dispersados por fuertes corrientes de aire a largas distancias en campo o en el laboratorio por los sistemas de ventilacin, que al ser inhalados son transportados a los alvolos pulmonares. Son partculas mayores a 5 de dimetro, por su tamao permanecen en el aire por perodos cortos de tiempo y no son respirables. Estas partculas se asientan rpidamente en superficies inanimadas, en piel o membranas mucosas, representando un riesgo de infeccin, asociado a la contaminacin directa de membranas mucosas, piel, ropa y equipo de proteccin personal. Gotas Los procedimientos que generan aerosoles y gotas son: al manipular muestras lquidas, slidas o polvos secos como: rganos y tejidos, mezclado, obtencin de orina, sangre y leche, eliminar tapones de rosca, apertura de envases con material infecciosos cuya presin interna es diferente a la del ambiente, inoculacin intranasal en animales.
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Ejemplo: la manipulacin de rganos, esta actividad favorece la formacin de aerosoles y gotas y contribuye a que se presente el riesgo de ingestin. Control Lavarse las manos con frecuencia. No tocarse los ojos o la boca. No consumir alimentos y bebidas. Usar el equipo de proteccin personal.
PREVENCIN DE LA EXPOSICIN A AEROSOLES El manejo seguro del agente infeccioso involucra utilizar una combinacin de estrategias como: Control del material peligroso y su fuente para prevenir la liberacin en el rea de trabajo, minimizar la posibilidad de presentacin de accidentes de material peligroso, proteccin de la persona que toma la muestra, como objetivo evitar el contacto de esta con la muestra (material infeccioso), conducta segura de trabajo, aunado a: BUENAS PRCTICAS DE TRABAJO La actitud y el modo de proceder de las personas que trabajan en el laboratorio o en el campo determinan su propia seguridad, as como la de sus compaeros y la de las personas en general. Es por eso que la aplicacin de las siguientes buenas prcticas de trabajo favorece su seguridad. 1. Manipular cuidadosamente fluidos infecciosos (orina, sangre, etc.), para evitar la formacin de aerosoles, goteo y la presentacin de derrames. 2. Restringir el uso de agujas y jeringas y solamente usarlos en aquellos procesos donde no hay alternativa. Esto es para evitar auto inoculacin, se recomienda contar con un contenedor resistente a pinchazos para disponer en l agujas, jeringas y otros artculos agudos. 3. Usar equipo de proteccin personal, que consiste de botas de hule, overol o bata, anteojos de seguridad (goggles) mascarilla y careta parcial. 4. Lavarse las manos despus de manipular animales enfermos, material infeccioso con jabn y abundante agua y para finalizar utilizar un desinfectante, como alcohol al 70%, solucin de yodo o cloruro de benzalconio. 5. Desinfeccin de superficies de trabajo, antes y despus de su uso e inmediatamente despus de un derrame. Se puede utilizar alcohol al 70%, solucin de hipoclorito de sodio (1 g/litro) para derrames de sangre y de 50 g/litro en presencia de materia orgnica 6. No comer, fumar, o almacenar comida en el rea de trabajo. Estas prcticas de trabajo son simples y efectivas, son a un mnimo costo y reducen grandemente el riesgo de exposicin y dan como resultado mayor eficiencia y seguridad .
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VAS DE ENTRADA DE LOS AGENTES BIOLGICOS

Para que se produzca una infeccin debe estar presente cuatro elementos: un hospedero susceptible, un agente infeccioso, una concentracin suficiente de ste y una va de entrada apropiada. De todos estos factores, el que mejor se puede controlar es la va de entrada. Las vas de entrada de los agentes biolgicos al cuerpo son contacto, la oral, ocular, la inoculacin directa, la va la oral y la respiratoria. Las vas de entrada indican el tejido por el cual el agente patgeno penetra al organismo. La exposicin a microorganismos dispersos o diseminados en forma de aerosoles o gotas infecciosas, es una importante fuente para adquirir una infeccin laboral. Mientras existan focos respirables, como primera fuente de infeccin, es esencial que las vas de entrada o acceso sean consideradas. A. Contacto D. Inoculacin A. Contacto. Existen microorganismos capaces de invadir el cuerpo a travs de la piel, sta acta como una barrera de defensa contra la infeccin microbiana. La piel al ser lesionada por: heridas, quemaduras, mordeduras de animales o cirugas, son una va de acceso por la cual pueden penetrar microorganismos patgenos, que pueden multiplicarse en la piel, ingresar al sistema circulatorio y a tejidos internos. Agentes patgenos que penetran al organismo por contacto y causan enfermedad.
Enfermedad ntrax Tularemia Brucelosis Leptospirosis Pioderma Micosis Ttanos Agente patgeno B. anthracis (endoesporas). Franciella tularensis Brucella abortus Leptospira interrogans Staphylococcus aureus Streptococcus pyogenes Microsporum canis. Trichophyton sp Clostridium tetani Nivel de Riesgo III II III II II II II
B. Oral E. Respiratoria
C. Ocular
EVITAR EL RIESGO Exposicin
PROCEDIMIENTOS Procedimientos que eviten la contaminacin del cuerpo, material y superficies de trabajo. Complementado con el uso de equipo de proteccin personal, como guantes, ropa protectora de trabajo,
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por contacto
materiales absorbentes. Usar guantes cuando se manipulen muestras o cultivos que contengan posibles patgenos. Estos deben ser desechados antes de salir del rea de trabajo, nunca tocar con ellos el telfono, equipo, etc. Desinfeccin de superficies de trabajo.
Procesos que favorecen la exposicin por contacto Goteo Manipulacin de rganos y tejidos. Obtencin de sangre, orina etc. Decantacin de lquidos. Remocin de tapas de recipientes de rosca Mezclar en recipientes sin sello Inoculacin de animales. Se presenta a travs de guantes contaminados y envo inadecuado de material o desechos contaminado
Contaminacin de superficies
B. Oral. Los microorganismos que penetran al tracto gastrointestinal (TGI) estn relacionados con la ingestin de alimentos y agua. Para que una infeccin se presente se requiere de una dosis infecciosa que sobrepase sus mecanismos de defensa. Numerosos procedimientos que se llevan a cabo, ofrecen exposicin potencial indirecta por va oral. Indirecta Se elimina con prcticas de higiene personal, como el lavado de manos y no llevar cualquier objeto incluyendo los dedos a la boca.
Enfermedad Gastroenteritis Hepatitis Salmonelosis Agente patgeno Rotavirus RNA V. de la hepatitis tipo A Salmonella typhi Nivel de Riesgo II II II
EVITAR EL RIESGO Exposicin Oral
PROCEDIMIENTOS
El uso de mascarilla o careta facial, que protege contra salpicaduras de material infeccioso al interior de la boca.
C. Ocular. El ojo es una va de acceso de patgenos, estos son capaces de provocar una infeccin cuando sobrepasan las barreras de defensa de este rgano, como son el arrastre de las lgrimas y al inactivar la lisozima y anticuerpos. Causas: Traumatismos del tejido ocular, penetracin de aerosoles y contaminacin con cuerpos extraos favorecen la presencia de infecciones oculares. Agentes patgenos que penetran al organismo por va ocular y causan Enfermedad
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Enfermedad Conjuntivitis
Agente patgeno Moraxella Staphylococcus aureus Streptoccoccus pyogenes Pseudomona aeruginosa
Nivel de Riesgo I II II III
Algunas de estas infecciones son autolimitantes, en 8 das desaparecen, pero otras causadas por la Pseudomona aeruginosa, ocasiona dao corneal, ulceracin y llega a perforarla. EVITAR EL RIESGO Exposicin ocular PROCEDIMIENTOS
Se recomienda el uso de lentes de seguridad o goggles, stos protegen contra aerosoles de sustancias biolgicas. Salpicaduras de material infeccioso dentro de los ojos. El uso de careta facial proporciona proteccin a los ojos, contra impacto moderado y partculas en vuelo.
D. Inoculacin. Un procedimiento simple que representa un riesgo de exposicin, es el empleo de agujas y jeringas, usadas principalmente para la transferencia de material infeccioso a recipientes o bien para inocular animales de experimentacin, procesos inadecuados dan como resultado la contaminacin de la superficie corporal. La manipulacin inadecuada de animales de experimentacin inoculados con material biolgico infeccioso, da como resultado la inoculacin por picaduras, rasguos y mordidas. EVITAR EL RIESGO Exposicin por inoculacin PROCEDIMIENTOS
El peligro inminente es la misma inoculacin debido al uso de agujas y jeringas, es por ello que se recomienda que su uso sea limitado y que se realice con cuidado. Nunca se debe volver a poner la capucha a las agujas y stas no deben ser torcidas ni separadas de la jeringa. Las agujas y jeringas usadas, as como los bistures, deben ser desechados slo en contenedores especiales diseados para este propsito.
E. Respiratoria. Diariamente inhalamos de 10 000 a 20 000 litros de aire, lo que la hace ser una va de acceso para muchos patgenos, permitiendo que muchos de ellos se queden en el sistema respiratorio provocando enfermedades infecciosas de tipo local o sistmica al ingresar al sistema circulatorio y diseminarse a otros sitios del organismo. Es importante mencionar que para que se establezca una infeccin, primero el agente patgeno debe sobrepasar las barreras de defensa inespecfica del tracto respiratorio
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inferior (macrfagos alveolares) y tracto respiratorio superior (cilios y secrecin mucosa que en conjunto forman la carpeta mucociliar) encargada de restringir el paso de las partculas incluyendo los microorganismos. El tracto respiratorio superior est en contacto con el aire que contiene muchos microorganismos, aunado a que el tracto respiratorio inferior tiene un rea bastante amplia que facilita el intercambio gaseoso adems del intercontacto entre el sistema respiratorio y el circulatorio que permite la oxigenacin de la sangre, es por ello que la posibilidad de infeccin es bastante alta. La transmisin por el aire ocurre con frecuencia cuando los aerosoles que contienen microorganismos patgenos se transfieren de un individuo a otro susceptible. Procedimientos que tienen el potencial para generar aerosoles respirables Estornudo* Tos * Apertura de preparaciones liofilizadas. * Son la causa principal de la diseminacin de agentes patgenos Agentes patgenos que penetran al organismo por va respiratoria oral y causan Enfermedad.
Enfermedad Neumona Neumona atpica Psittacosis Tuberculosis Meningitis bacteriana Fiebre Q Histoplasmosis Coccidioimicosis Blastomicosis Agente patgeno Staphylococcus aureus Klebsiella pneumonie Mycoplasma pneumonie Chlamydia psittaci Mycobacterium tuberculosis Neisseria meningiditis E. coli Coxiella burnetti Histoplasma capsulatum* Coccidioides inmitis* Blastomyces dermatitidis* Nivel de Riesgo II II II III II I II II II II
*inhalacin de esporas.
TOMA DE MUESTRAS
El primer riesgo de infeccin, es la toma incorrecta, su transporte y la recepcin de la misma. Para obtener resultados significativos y confiables de una muestra, se requiere que esta sea tomada en forma correcta para evitar alteraciones. Debe ser tomada la ms fresca posible. Ser representativa del padecimiento. Identificada con el nmero o nombre del animal.
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Acompaada de la historia clnica. Se recomienda que la historia clnica se coloque dentro de una bolsa plstica resistente, para evitar se contamine con la muestra, o bien atada firmemente en el exterior del paquete (paquete postal). o o o o o o o Nombre y domicilio del propietario. Identificacin del animal, sexo, edad. Signos clnicos del paciente. Nmero de animales en riesgo. Diagnstico presuntivo ( s es posible) Hallazgos anatomopatolgicos. Indicar tipo de examen que requiere.
TRANSPORTE Y ENVO DE MUESTRAS

El manejo, embalaje y envo de productos biolgicos y muestras para diagnstico, es muy importante, un embalaje adecuado, reduce grandemente el riesgo de exposicin accidental para personal que no trabaja en el laboratorio (encargados de hacer el envo) y adems asegura la validez de la muestra. La muestras biolgicas, deben ser embaladas apropiadamente y rotuladas (ver imagen), siguiendo siempre los lineamientos que marca el Gobierno Federal y Estatal. De una manera general, un sistema bsico de embalaje se compone de: Contenedor primario estanco, a prueba de filtraciones, etiquetado, que contiene la muestra. El recipiente debe envolverse en material absorbente. Contenedor secundario estanco, a prueba de filtraciones, que encierra y protege el recipiente primario. Se pueden colocar varios recipientes primarios envueltos en un recipiente secundario. Se debe usar suficiente material absorbente para proteger a todos los recipientes primarios y evitar choques entre ellos. Contenedor externo de envo. El recipiente secundario se coloca en un paquete de envo que protege al recipiente secundario y su contenido de los elementos externos, tales como dao fsico y agua. Los formularios con datos, cartas y otras informaciones de identificacin de la muestra deben colocarse pegados con cinta adhesiva en el exterior del recipiente secundario. Otras posibilidades de transporte de material biolgico incluyen: El traslado de muestras dentro de un hospital o centro, de un laboratorio a otro, de un hospital a otro de la misma ciudad o a otra ciudad. Los principios en los que se basa un transporte seguro son los mismos en todos los casos y su finalidad es que la muestra no tenga ninguna posibilidad de derrame en circunstancias normales de transporte. El transporte de material biolgico requiere una buena colaboracin entre el remitente, la compaa de transporte y el destinatario, y cada uno debe asumir sus responsabilidades
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para garantizar que el producto llega a su destino oportunamente y en buenas condiciones.
Transporte de la muestra al laboratorio Contenedor 1. Una muestra que no est marcada, ni identificada con el agente etiolgico est prohibida. 2. La muestra debe introducirse en un contenedor de cierre hermtico (tubo, vial etc.). 3. Cuidar que no queden residuos del material de la muestra en el exterior del contenedor. Para evitar derrames deben usarse recipientes secundarios tales como charolas o cajas, plsticas o metlicas, con gradillas para mantener las muestras en posicin vertical. Estos recipientes deben poderse esterilizar ya sea por autoclave o por desinfectantes qumicos y deben ser descontaminados regularmente.
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Recepcin de muestras Los laboratorios deben designar un rea especfica para tal fin. Debe ser recibida por personal capacitado. Nunca debe ser abierto en oficinas o reas que no sean el laboratorio. En el laboratorio se debe asignar el nivel de seguridad con el cual se va a manejar. Indicar que seguimiento se le va a dar (procesos bacteriolgicos, toxicolgicos etc.). Equipo de proteccin personal y equipo de contencin a utilizar. Disponer de una campana de seguridad biolgica para abrir el empaque. Muestras que muestren cualquier indicio de dao o derrame deben ser abiertos en una campana de seguridad biolgica, el personal que realice esta actividad deber portar equipo de proteccin. El laboratorio debe dar una clave de identificacin, para posteriormente asentar adecuadamente los resultados.
Apertura de paquetes El personal de recepcin debe conocer los posibles riesgos del trabajo que desarrollan y consultar cuando se encuentren con algn recipiente roto o derramado. Debe haber disponibilidad de desinfectantes. Si se trata de muestras marcadas con la etiqueta del smbolo universal de peligro biolgico infeccioso o fueron recibidas por correo areo, deben abrirse en una campana de seguridad biolgica.
NECROPSIA Y MUESTRAS PATOLGICAS

La necropsia y muestras biolgicas representan un riesgo a la salud, para el personal encargado de manejar este tipo de material. Las personas deben cuidar su salud contra los agentes infecciosos que puedan estar contenidos en fluidos corporales, tejidos, rganos y cadveres. Bacterias, virus, hongos, rickettsias y parsitos representan un riesgo potencial de infeccin. Durante la necropsia, el riesgo de adquirir una infeccin es: Cortes en la piel, causados por agujas, cortaduras o piquetes. Dermatitis severa por contaminacin de heridas. Contaminacin por inhalacin.
Disminucin del riesgo Prevenir lesiones en piel y evitar exposicin cuando existan lesiones de prdida de continuidad. Evitar la formacin de aerosoles y gotas que podran ser inhaladas y contaminar la piel, heridas y membranas mucosas.
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Utilizar equipo de proteccin personal (guantes, goggles, mascarilla bacteriolgica, careta facial, botas y mandil). El equipo es una barrera de proteccin, que asla a la persona del peligro de exposicin. Inmunizacin de personas que manejan tejidos frescos los cuales pueden estar infectados con agentes como Salmonella, M. tuberculosis y C. tetani (manejo de artculos de necropsia).
Rutina de necropsia Cuando no se cuenta con informacin, se recomienda que todos los casos sean considerados potencialmente peligrosos e infecciosos y la necropsia realizarla con cuidado, pasos a seguir: 1. Disminuir el uso de agujas, hojas y navajas, con el fin de evitar posibles cortaduras, piquetes por agujas y abrasiones. 2. Utilizar equipo de proteccin personal para evitar posibles riesgos de contaminacin de membranas mucosas. Necropsia de organismos, que se conoce estn infectados 1. Deben ser rotulados adecuadamente: Smbolo universal de peligro biolgico. Agente etiolgico de que se trate. Diagnstico presuntivo. 2. Los ayudantes y asistentes de necropsia, deben ser informados del diagnstico clnico. 3. Saber que desinfectante usar, el cual debe ser preparado antes de iniciar el proceso. 4. Ropa de proteccin que debe usarse: 5. 6. 7. 8. Overol, mandil, botas, guantes. Protector de ojos: goggles (para proteger la conjuntiva). Mascarilla facial y careta facial, (proteger la va oral y respiratoria de posibles aerosoles y gotas. Guantes resistentes o dobles para proteger la contaminacin de piel de las manos.
La diseccin debe ser hecha por el prosector a un solo tiempo. Disminuir la produccin de aerosoles y gotas. El uso de tijeras debe ser disminuido para reducir el riesgo de cortaduras. La toma de muestras para cultivo u otros exmenes debe hacerse en un rea de toma de muestras o en su caso lo ms estril posible y cuidando de no contaminar el exterior del recipiente. 9. Al finalizar la necropsia el cadver debe ser envuelto en papel absorbente para prevenir el escape de lquidos y rociarlo con el desinfectante previamente preparado, colocarlo en una bolsa plstica con un rotulo que indique: Precaucin Residuo peligroso biolgico infeccioso para su disposicin. 10. Al finalizar el proceso el ayudante circulante ser el encargado de desinfectar el rea para prevenir posibles contaminaciones.
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11. Los artculos usados durante la necropsia debern ser confinados en una mesa del rea para su desinfeccin. 12. Desinfeccin del rea. 13. Tanto prosector como ayudantes debern quitarse la ropa en el cuarto de necropsia y colocarla en un contenedor para su tratamiento apropiado, desinfeccin, lavado o bien si es necesaria la incineracin.
RESIDUOS PELIGROSOS BIOLGICO INFECCIOSOS (RBI)

Es aquel material de desecho que contiene microorganismos patgenos (virus, bacterias, hongos) con capacidad y cantidad suficiente para causar infeccin e impacto adverso sobre la salud de los seres vivos y el ambiente. Los residuos biolgico infecciosos representan la presencia de microorganismos patgenos viables en concentraciones suficientes, capaces de causar infeccin a un hospedero susceptible y se consideran los tejidos o desechos mdicos generados del cuidado del hospedero quienes tienen una enfermedad infecciosa, desechos slidos que incluyen artculos como manchas en el suelo, camas de animales enfermos, canales, alimentos contaminados. El responsable de manejar un desecho biolgico infeccioso debe anticipar su eliminacin y considerar los problemas que pueden ocasionar al pblico en general cuando se lleve a cabo esta. No olvidar que el riesgo est asociado solamente a formas indirectas de transmisin (a travs de reservorios y vectores), para que se produzca la infeccin es necesario tener en cuenta aspectos epidemiolgicos como la va de transmisin, la puerta de entrada, la virulencia del patgeno, la susceptibilidad del hospedero, que el agente sea capaz de sobrevivir en el reservorio por un perodo prolongado de tiempo, de esta forma existe la probabilidad para que el hospedero susceptible pudiese exponerse al agente. El riesgo de tipo ocupacional es para las personas, que generan, manipulan, tratan y procesan los RBI y estos son precisamente los que estn en riesgo potencial de exposicin directa a un agente infeccioso, las exposiciones ms frecuentes son la inoculacin (jeringas y agujas contaminadas) y la inhalacin (por procesos que generan la formacin de aerosoles infecciosos). Manejo de RBI. El empaquetado de RBI, debe estar identificado claramente de su peligro potencial, de forma que sea comprendido y entendido por todos con el smbolo universal de peligro biolgico. El empaquetado debe hacerse, para proteger de una exposicin al personal responsable del manejo y de la disposicin final. Las propiedades fsicas del contenedor para RBI deben ir acorde al proceso de tratamiento. Los RBI deben separarse de los desechos generales.
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Hasta donde sea posible deben ser tratados en el mismo sitio de generacin, para reducir la concentracin de agentes patgenos a un nivel aceptable. La persona encargada del manejo de RBI, debe utilizar equipo de proteccin personal y aplicar prcticas de higiene personal (lavarse las manos despus de trabajar con RBI, est prohibido fumar y comer mientras maneja RBI etc.).
Clasificacin de RBI y tipo de contenedor que debe usarse
RPBI
Slido
Caractersticas
Tejidos y rganos
Tipo de contenedor
Empaquetar en bolsas de plstico resistente Contenedores a prueba de pinchazos
Material Agujas hipdermicas, punzocortante pipetas Pasteur, porta y cubreobjetos Pesado
Muestras anatmicas y Contenedor rgido, y que el peso de camas de animales los RPBI no exceda su capacidad para evitar su ruptura. Leche, sangre y orina Contenedor de plstico para inactivacin qumica, y contenedor metlico para esterilizacin en autoclave.
Lquidos
Mtodos de tratamiento de RBI son.

Mtodo Autoclave Incineracin Forma de actuar Esterilizacin con vapor a presin Reduce significativamente el volumen a cenizas y produce un producto final libre de patgenos. Tipo de residuos biolgicos Jeringas, agujas y material de cristal Cadveres material de lechos, camas de animales infectados, tejidos y rganos.
Qumico
Eliminacin de Artculos usados para la realizacin de microorganismos patgenos necropsias, instalaciones, heces, sangre, etc.
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La esterilizacin, incineracin e inactivacin de los RBI elimina el riesgo de infeccin y facilita su transporte al sitio de disposicin final por el personal encargado de esta actividad.
SERVICIO MDICO PREVENTIVO.

La forma correcta de tomar una muestra biolgica, las medidas y estrategias de seguridad y el equipo de proteccin a utilizar, todos estos son pasos para evitar que se presente un accidente y disminuir el riesgo que representa la muestra. La inmunizacin se considera como un nivel adicional de proteccin, es difcil establecer un programa de vacunacin a menos que se trabaje con agentes especficos (laboratorio de investigacin), de lo contrario este programa se vuelve amplio y complicado. Por tanto en medicina veterinaria lo que se recomienda es la aplicacin del esquema profilctico antirrbico, del toxoide de difteria, ttanos, y aplicacin de la vacuna de tuberculosis. Las personas que estn expuestos a compuestos peligrosos deben formar parte de programas apropiados de un Servicio mdico preventivo o reconocimiento mdico. El cual debe incluir: Historia clnica y ocupacional previa. Exmenes fsicos general Pruebas fundamentadas. Plan de seguimiento y reconocimiento. Adems se recomienda la realizacin de otras pruebas como, prueba cutnea de tuberculosis, radiografa completa de trax, recuento sanguneo, anlisis de orina, electrocardiograma y una muestra de suero seriada, todas estas pruebas son el antecedente mdico, que permitir hacer comparaciones a futuro, en caso de que personas al cuidado de la salud adquieran una infeccin o enfermedad y saber si fue consecuencia de su actividad profesional o fue por otra causa. Es recomendable que personal al cuidado de la salud tenga siempre a la mano un botiqun de primeros auxilios (actividades de campo), debido a que est expuesto a sufrir un accidente (cortaduras, piquetes, mordidas etc.). Este debe incluir: 1 frasco de alcohol de 100 mL. 1 frasco de merthiolate de 100 mL. 5 sobres de gasas de 10x10 cm. 4 sobres de algodn. 1 tijeras. 1 carrete de tela adhesiva de 2.5 cm. 2 vendas elsticas de 5 y 10 cm. 1 caja de tabletas de analgsicos y antipirticos. 1 bolsa de detergente.
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La toma inadecuada de muestras, los errores humanos y las prcticas de trabajo incorrectas contrarrestan la eficacia de las medidas de seguridad y las del equipo de proteccin personal. Favoreciendo la presentacin de accidentes y la exposicin agentes patgenos que tiene como resultado la adquisicin de enfermedades de tipo profesional. Es por ello que un profesional preocupado por su salud y seguridad debe identificar los riesgos potenciales a los que est expuesto y son inherentes a su trabajo, as como adquirir el conocimiento de cmo combatirlos para prevenir infecciones profesionales e incluso la muerte.
BIBLIOGRAFIA
Manual de Bioseguridad de Referencia Tcnica. Edicin Especial Para el Curso de Adiestramiento Internacional en Servicios de Diagnstico.1992, Universidad Autnoma del Estado de Mxico. Hall, CH. T. 1986. Mtodos y Diagnsticos del Laboratorio Clnico: Seguridad en un Laboratorio de Microbiologa Clnica, 8 ed. Panamericana. National Research Council 1989. Biosafety in the laboratory Prudent Practices for the Handling and Disposal of infectious Materials. National Academy Press, Whashington DC. World Health Organization .1993: Laboratory Biosafety Manual. Genve 2 ed. Hanel E. and Halbert M M. 1983. Laboratory Safety: Pippeting. American Society of Microbiology, Washington D.C. Phillips G. B.; Baily S. P. 1966: Hazards the mouth pippeting. American Journal of medical Technology 32: 127-129. OMS. 1983. Laboratory Biosafety Manual. Handling, transfer, y shipment of specimen. Geneva, 15-18. Strain BA, Grschel DHM. 1995. Laboratory safety and infectious waste management. En: Murray PR, Baron EJ, Pfaller MA, Tenover FC, Yolken RH (eds.): Manual of clinical microbiology (6 ed.). American Society for Microbiology. Washington DC, pp 75-85 The World Health Organization (WHO). 1997. "Guidelines for the Safe Transport of Infectious Substances and Diagnostic Specimens". Manual de gestin interna para residuos de centros sanitarios. INSALUD (2 ed.) Madrid, 1992. Gua de gestin intracentro de residuos sanitarios. Departamento de Sanidad y Seguridad Social, Generalitat de Catalua. Barcelona, 1994. Residuos sanitarios. Departamento de Urbanismo, Vivienda y Medio Ambiente. Gobierno Vasco. Vitoria, 1994. 22. Gua de gestin de residuos qumicos en centros sanitarios. Departamento de Sanidad y Seguridad Social, Generalitat de Catalua. Barcelona, 1998.
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PARASITOLOGA
M. en C. Jorge Estrada Botello INTRODUCCIN Las parasitosis son importantes por su alta incidencia en el trpico, subtrpico y reas templadas, es sin duda, el problema nmero uno de los sistemas de produccin de leche y carne. Debido a los daos que ocasionan y el impacto econmico que se produce por estas. Quiroz R. H. (1992) citado por Carrillo, Barreto y Rodrguez, menciona que en Mxico se tiene estimado que se pierden anualmente 48 millones de kilogramos de carne y 44 millones de litros de leche debido al parasitismo gastrointestinal. La fasciolasis, producida por Fasciola heptica, es de las enfermedades que mayores prdidas ocasiona a la ganadera nacional. Los hospedadores ms frecuentes de ste parsito dentro de los animales domsticos son los rumiantes y de stos los bovinos presentan mayores frecuencias y los ovinos son los que se ven mayormente afectados, al menos por la forma aguda de presentacin clnica. Borchet (1969), citado por Gaxiola, Camacho, Rubio, Borbolla, report que la conversin alimenticia en bovinos infectados con 1000 metacercarias de Fasciola heptica es 36% ms baja y el aumento de peso es 40% menor. Yez, (1989) citado por Lepe, Michel, Villa, Rodrguez y Blanco, encontr que los becerros se infestan de parsitos gastrointestinales a partir de los 20 das de vida, antes de ello no es comn encontrar becerros infestados de parsitos que ingresan por la va oral. La solucin de una enfermedad es satisfactoria solamente cuando va precedida de un diagnstico preciso. La alteracin de resultados es significativa en cualquier procedimiento de laboratorio, por lo que se requiere que la muestra sea extrada en la forma correcta, representativa y que sea preservada de la mejor manera posible para evitar su deterioro. El usuario del laboratorio clnico se enfrenta a una completa variedad de exmenes que se pueden practicar en la sangre, plasma, orina, heces, rganos, exudados, trasudados y piel. CRITERIOS IMPORTANTES A TENER EN CUENTA INDEPENDIENTEMENTE DEL TIPO DE MUESTRA 1. Deben ser obtenidas lo ms frescas posibles y preservadas correctamente. 2. Cada muestra debe ser identificada y rotulada. 3. Junto con la muestra se debe incluir la historia clnica. 4. Determinar con claridad el tipo de estudio que se requiere. 5. Mencionar si existe programa de desparasitacin.
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ENVO DE MUESTRAS AL LABORATORIO
Las muestras a enviar al laboratorio deben ser colocadas en un recipiente hermtico de vidrio o plstico. El recipiente debe estar correctamente empaquetado para evitar que se rompa durante el transporte, por ejemplo, con aserrn, papel o algodn. En los casos en que se requiera refrigeracin sta se puede realizar de diferentes formas, como seran: Con hielo natural de un refrigerador en un recipiente hermtico y el frasco de la muestra colocarlo dentro del mismo (la conserva de 8 a 24 horas). El uso de refrigerante es de gran utilidad para la conservacin de cualquier tipo de muestra. Otro mtodo de refrigeracin ms prolongado consiste en el empleo de hielo seco (bixido de carbono slido). En este caso se coloca el recipiente que contiene la muestra en una bolsa de plstico, la que se rodea con hielo seco envuelto en papel. Nunca colocar el hielo seco en una caja hermtica pues la volatizacin del bixido de carbono puede causar una explosin. El recipiente ideal cuando se utiliza hielo seco es una caja de cartn. COLECTA, CONSERVACIN Y ENVO DE HECES MEDIDAS HIGINICAS. Aplicacin de medidas de proteccin personal e higinica para el personal que interviene en el proceso. Norma de cuidados y manejo para cada especie animal. Uso de recipientes limpios o estriles MATERIAL. Guantes de plstico. Bolsas de polietileno. Esptulas de madera. Recipientes de plstico con boca ancha, con tapa a rosca o tapa a presin. Tubo de ensaye con tapn. Formol al 10%. Marcadores o lpiz. Cinta adhesiva. Varilla de vidrio punta roma. Refrigerante o hielo. Dicromato de potasio al 2%. MTODO Obtencin de heces. En los bovinos y equinos es prctico e higinico obtener la muestra del recto con un guante de plstico, cuando se obtiene la cantidad de heces suficiente el guante es volteado hacia adentro, sirviendo de esta manera como recipiente de recoleccin, se cierra cuidadosamente tratando de eliminar todo el aire y se identifica con los datos necesarios para su posterior envo al laboratorio.
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Es posible obtener las muestras del piso siempre que sean limpias y frescas, tomando la muestra de la parte superior. Cantidad apropiada por especie. Ovino 30 g. Bovino 80-100 g. Equino 80-100 g. Cerdo 30-50 g. En equinos para ver si se tiene infestacin por Oxyuris se pueden considerar los siguientes pasos: Material necesario: cinta adhesiva transparente (celofn) de 2.5 cm de ancho por 15 cm de largo. Lavar el rea vecina a l ano para eliminar el exceso de cebo y suciedad el da anterior a tomar la muestra. Tomar fuertemente la cinta entre el pulgar y el ndice derechos, pararse al lado de la nalga izquierda del caballo y levantar la cola con la mano izquierda y que el codo del mismo lado apoye sobre la nalga, al mismo tiempo con el pulgar derecho adherir fuertemente la cinta adhesiva en los pliegues anales. A continuacin despegar la cinta y pegarla sobre un porta objetos. Para observar la preparacin se debe colocar una gota de agua debajo de la cinta, luego esta se adhiere fuertemente y se observa al microscopio. En ovinos, caprinos y porcinos se toma la muestra directamente del recto, previo masaje en la regin perianal o bien, introduciendo los dedos ndice y medio por va rectal. En caninos y felinos, se puede realizar la toma de la muestra introduciendo los dedos ndice y medio o bien una varilla de vidrio por va rectal, de no ser posible lo anterior colocar al animal en un local o superficie limpia y colectar las heces inmediatamente despus de la defecacin o bien de la parte superior de estas. La cantidad de heces requerida es de 3060 gr aproximadamente. En aves es posible obtener una muestra representativa colocando un papel marrn debajo de las perchas (8 hojas de 1 m x 0.5 m) por cada 1000 animales seleccionados al azar. Por la maana las muestras cecales y heces intestinales son recolectadas separadamente. Para 500 aves al menos deben tomarse 20 muestras y por cada 500 animales ms otras 10 muestras y as sucesivamente. Otras opciones para la toma de muestras en aves y conejos seran. Con la introduccin de una varilla de vidrio en cloaca o recto. Empleo de jaulas metablicas previa coleccin de algunos animales sintomticos Sacrificio de los animales ms afectados para el anlisis del contenido del tracto digestivo CONSERVACIN Si las muestras se trabajan inmediatamente despus de su colecta, no se requiere conservador, pero se recomienda mantenerlos en refrigeracin o en un lugar fresco, evitando los rayos solares. S las muestras van a ser transportadas durante varias horas, es necesario su refrigeracin o bien puede utilizarse formol al 10%.
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Si se desea el diagnstico de verminosis pulmonar, no utilizar ningn tipo de conservador, en refrigeracin. Si son muestras de heces de aves o de sus tractos digestivos, se recomienda una solucin de dicromato de potasio al 2% como conservador. ENVO Debern enviarse en das y horas hbiles utilizando el medio de transporte ms rpido y de preferencia, en cajas de poliuretano con la siguiente informacin: historia clnica indicando el tipo de conservador que se utiliz, el diagnstico presuntivo, tipo de muestra y estudio solicitado. COLECTA CONSERVACIN Y ENVO DE SANGRE Aparte de la observacin de los animales, en muchas ocasiones ser necesario enviar muestras sanguneas al laboratorio para completar o verificar el diagnstico de hemoparsitos. Es por ello fundamental para el MVZ, conocer las tcnicas y vas ms recomendables del sangrado. El mtodo ideal de sangrado debe ser: Rpido. Fcil de efectuar. Seguro para el animal y el operador. Minimizar el manejo fsico. Y lo ms importante, preservar las caractersticas biolgicas de la sangre. MATERIAL. Tubos vacutainer con y sin anticoagulante. Jeringas y agujas hipodrmicas de varios calibres. Alcohol metlico y del 96% Anticoagulante (EDTA) Caja de poliuretano Hielo o refrigerantes Aserrn Etiquetas auto adheribles y lpiz marcador. MTODO. En todos los casos el sitio de puncin debe ser recortado y frotado con alcohol para eliminar el riesgo de contaminacin de la muestra. Las agujas y jeringas deben ser estriles del tipo desechable o bien se puede utilizar tubos de auto llenado (vacutainer). Las jeringas y agujas a utilizar deben estar perfectamente secas. En caballos la sangre se extrae de las venas yugulares utilizando agujas finas (calibre 21) de 3.5 cm y una jeringa o por medio de vacutainer. La vena se eleva por presin aplicada con la mano izquierda en la mitad inferior del surco yugular, insertando la aguja en el centro de la vena en direccin ascendente.
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Una suave traccin sobre la jeringa resulta suficiente para facilitar la extraccin. En bovinos, ovinos y caprinos tambin se utiliza la vena yugular, que se eleva por presin digital y se inserta una aguja de 5 cm, calibre 16, (o con el uso del vacutainer). Cuando se cuenta con manga de manejo, el sitio ms conveniente para muestrear es la vena coccgea en la base de la cola. Se procede a elevar sta ltima y se inserta la aguja de dos a tres cm directamente en la lnea media, a la altura del segundo o tercer espacio intervertebral coccgeo. La profundidad de la penetracin vara dependiendo de la cantidad de grasa. Obtencin de muestras en el cerdo. El material bsico, adems de las agujas y jeringas, incluye: Laza trompas o cuerda para sujecin Agua, jabn y cepillo para lavar la zona de eleccin de sangrado Torundas y antisptico Frascos o tubos para depositar sangre Cinta adhesiva y marcador para identificar muestras Papel y lpiz El calibre y largo de las agujas vara segn la va elegida, el tamao del cerdo y la preferencia del operador. Las vas ms comunes para extraer sangre en cerdos de diferentes tamaos, son las siguientes: Vena yugular Vena coccgea Vena auricular marginal Vena cava anterior La extraccin de sangre en perros y gatos puede hacerse utilizando aguja y jeringa de la vena ceflica o tarsal recurrente que son elevadas utilizando una ligadura o bien por un asistente haciendo presin digital. Se puede aplicar una suave traccin sobre la jeringa ya que un aspirado excesivo provoca hemlisis en estas especies. No es muy recomendable el uso de vacutainer. En gatos y perros pequeos o debilitados un buen sitio de muestreo es la vena yugular. CONSERVACIN: La muestra de sangre debe conservarse en frascos o tubos estriles conteniendo anticoagulante, se debe agitar con movimientos suaves para lograr su homogeneizacin. Conservar las muestras en refrigeracin. Para evitar la hemlisis de la muestra se deben tomar las siguientes precauciones: Evitar que agujas y jeringas estn hmedas. Retirar la aguja antes de vaciar la muestra. Evitar el vaciado brusco de la muestra y realizarlo a travs de las paredes del tubo. Evitar el calentamiento de la muestra. Se recomienda, despus de la toma de la muestra realizar el frotisal pie del animal secar al aire y fijar inmediatamente con alcohol metlico, si fuese el caso. Si se desea la muestra para serologa, entonces no se debe emplear anticoagulante, debiendo dejar los tubos con la muestra con una inclinacin de 45, a temperatura ambiente o en
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refrigeracin durante 12-24 horas hasta la formacin del cogulo. Para posteriormente separar el suero, de no ser utilizado inmediatamente se debe meter al refrigerador. DIAGNSTICO DE LA Trichomona foetus La Tricomoniasis es una enfermedad altamente contagiosa, insidiosa y venrea, caracterizada por infertilidad, piometra y abortos. El microorganismo que produce la Tricomoniasis es un protozoario flagelado. Vive en el tracto reproductivo de las vacas y se localiza en las criptas (dobleces) de la superficie mucosa del pene de los toros. Los hallazgos ms comunes ante la infeccin de Trichomona son muertes embrionarias tempranas, que suceden entre los 30 y 60 das de gestacin. Comnmente cuando esto ocurre, la vaca absorber el embrin y entrar en celo nuevamente alrededor de los 90 a 100 das posteriores sin mostrar ningn otro signo. Si el feto est ms desarrollado, cuando la vaca adquiere la enfermedad, este morir por la infeccin de Trichomona y ser abortado. Los abortos tempranos suelen ocurrir entre los 90 y 130 das de la gestacin. La Tricomoniasis puede representar hasta un 50% de reduccin en la obtencin de becerras, por lo que las prdidas causadas por esta son asombrosas. Diagnstico El diagnstico positivo de la enfermedad depende de la observacin del protozoario vivo mvil en muestras de exudado genital, as como en tejidos y lquidos de los fetos abortados. Para obtener las muestras se emplean diversos mtodos de lavado, hisopos y pipetas. La identificacin precisa del organismo al examen microscpico directo, requiere de cierto adiestramiento tcnico. Diagnstico en el toro. El toro hace menos oposicin de la que se espera, aunque debe tenerse la seguridad de que esta sujeto con firmeza. Es necesario recomendar al ganadero que mantenga al toro en reposo sexual por lo menos 4 das antes de la colecta del moco, a fin de evitar acarreamiento de tricomonas de genitales femeninos, no es conveniente iniciar el muestreo en toros a los que se les efectuaron lavados prepuciales 7 das antes de la toma de la primera muestra. En el toro los mtodos ms prcticos para la toma de muestras son la colecta del moco y el lavado prepucial en orden de importancia. PROCEDIMIENTO PARA LA COLECTA DEL MOCO Material: Pipetas de inseminacin. Espejuelos de vidrio estriles. Jeringa desechable estril. Tubo ltex Medios de cultivo: Medio de Diamond Tioglicolato lquido
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Guantes de plstico para palpacin Mtodo: 1) Antes de iniciar el muestreo se deben cortar los pelos de la regin genital externa y lavar con agua corriente, evitando el empleo de detergentes ya que inmovilizan a las tricomonas (utilizar guantes de plstico). 2) Introducir al saco prepucial una pipeta de plstico de las usadas en inseminacin artificial (cubierta con un especulo de vidrio estril) mediante un trozo de manguera ltex a una jeringa desechable. 3) La pipeta se introduce hasta el fondo del saco prepucial y se dirige hacia adelante y atrs, entre el pene y la mucosa del prepucio. Al mismo tiempo se hace succin con la jeringa, ya que al ejercer una presin negativa, se obtendrn las muestras de moco, en volumen y consistencia variables. 4) La orientacin de la pipeta se controla a travs de la pared del prepucio con una mano moviendo la pipeta, y manipulando la jeringa con la otra. 5) Inocular la muestra obtenida en los medios de cultivo. IMPORTANTE Un toro se reporta como negativo a la infeccin, despus de seis exmenes negativos practicados uno por semana o bien si resultan negativos a la prueba de la vaquilla virgen, es decir si monta a dos vaquillas y estas resultan negativas a los exmenes realizados a las muestras de exudado vaginal o moco cervical colectando 10 a 19 das despus de la monta. Diagnstico en la vaca Es necesario recomendar al ganadero que las hembras no sean montadas por lo menos 4 das antes de la coleccin de las muestras, ni llevar a cabo lavados vaginales o toma de muestras de moco cervical 7 das antes del primer muestreo. Procedimiento para la colecta del moco cervical a) material (el mismo del procedimiento anterior). b) Mtodo 1) Se debe limpiar la vulva con agua corriente, eliminando las heces, no utilizar jabn ni antispticos (usar guantes). 2) Introducir en la vagina por la parte superior de la comisura vulvar una pipeta de inseminacin cubierta por un espculo de vidrio estril. Evitar que se introduzca por uretra, llevndola hacia adelante hasta el nivel del cuello uterino. La muestra ser tomada de la parte inferior del crvix, moviendo la pipeta hacia delante y atrs succionando la jeringa. 3) Observar en frotis directo o proceder inmediatamente a su cultivo. 4) El mejor momento para tomar muestras de moco uterino es durante la semana anterior al celo (el moco es fluido y claro) aunque puede contener copos de pus y tricomonas mviles si est infectada la vaca. No se debe tomar muestras de vacas en celo (donde el moco es claro y abundante) ya que normalmente no contiene tricomondidos. El moco vaginal cuando es denso, escaso y uniforme turbio, rara vez contiene tricomonas mviles, en los casos de piometra casi siempre se hallan los flagelados. En otros casos los parsitos se encuentran en las secreciones vaginales inmediatamente despus del aborto o poco antes del celo.
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IMPORTANTE En vacas, las tricomonas son ms numerosas en vagina 12 a 19 das despus de ser servidas por un toro infectado. Un simple examen directo no es suficiente para dar un diagnstico negativo. Se considera que una vaca no est infectada despus de tres exmenes negativos practicados uno por semana. PROCEDIMIENTO DE DIAGNSTICO EN EL FETO ABORTADO Material Pipetas Pasteur estriles. Bulbo de goma. Medios de cultivo: Medio de Diamond Medio de triglicolato lquido Solucin salina fisiolgica al 0.85% estril. Centrfuga Porta y cubreobjetos. Guantes Mtodo De ser posible se enva el feto abortado, el cual deber mantenerse fro, colocando hielo, pero no debe congelarse, as mismo se incluir una parte de placenta. 1) Se toman muestras de lquido amnitico y alantoideo as como contenido abomasal con pipetas Pasteur estriles. 2) De estas muestras se coloca por un lado aproximadamente 1ml de la muestra en 5 a 10 ml de solucin salina fisiolgica estril para centrifugarlo y hacer la primera observacin. Por otro lado tambin se colocar 1 mL. en un tubo que contenga 5 mL del medio de cultivo. ECTOPARSITOS Los artrpodos forman el grupo ms numeroso de especies animales que habitan la tierra, incluyen ms del 85% de ellas, con ms de un milln de especies. Algunas especies son benficas como los crustceos, las abejas, el gusano de seda, entre otras y un pequeo nmero es perjudicial al hombre y a los animales domsticos, ejerciendo un parasitismo temporal o permanente y otras ms que inyectan veneno con sus picaduras. Algunas de las especies de parsitos tienen gran importancia econmica debido al gran dao que causan en la salud de animales domsticos. El efecto patgeno puede deberse a lesiones traumticas al picar la piel para sustraer sangre, a bien accin traumtica al penetrar en la piel. La garrapata figura como uno de los ectoparsitos de mayor importancia econmica a escala mundial, por las mermas que ocasiona en la produccin de ganado bovino, caprino lanar y caballar. Al lesionar la piel para chupar sangre, muchas especies de garrapatas pueden transmitir los ms diversos agentes patgenos; como virus, bacterias, riquetsias y protozoos, lo que puede conducir a enfermedades agudas, crnicas e incluso la muerte.
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La prdida de peso de un bovino parasitado por garrapatas Boophilus spp. Se calcula en 0.26 Kg/garrapata/ao, y por Amblyomma spp. 1.09 Kg/garrapata/ao. Esto ocasiona prdidas de varios miles de millones de dlares en la economa pecuaria mundial. COLECTA DE ARTRPODOS En los casos en que se sospeche de infestacin por caros, deber recortarse el pelo de la zona a muestrear. La zona elegida debe ser la parte ms hmeda del borde de la lesin, debido a que la mayora de los caros prefieren la zona perifrica de las lesiones activas. En la sarna sarcptica es preferible recoger el raspado del borde del rea depilada y en otro punto de la piel sana donde se presenten pequeos granos. Es de gran utilidad humedecer la piel con glicerina para que los caros se adhieran al bistur y no se pierdan. Si se sospecha de sarna coriptica o psorptica, debe utilizarse un bistur afilado, raspando la parte externa de la epidermis, junto con las races de los pelos, la profundidad del raspado se realiza hasta que inicie a brotar la sangre. La muestra puede ser recogida directamente en un pequeo tubo que pueda cerrarse hermticamente. En los animales en los que se sospecha de sarna sarcptica o notodrica, se deber recortar el pelo y realizar el raspado ms profundo con un trocito de algodn sujetado por medio de unas pinzas. La sarna demodcica se presenta en forma escamosa o pustular. Las lesiones escamosas determinan el engrosamiento de la piel por la acumulacin de clulas epiteliales muertas por lo que se requiere de raspados profundos para llegar a los caros. En la sarna demodcica pustular los caros son por lo general abundantes pudiendo ser observados en el examen del contenido caseoso de una pstula presionada o incidida. RECOLECCIN DE CAROS DE LA PIEL Los caros del gnero Demodex forman ndulos como consecuencia de la dilatacin de los folculos pilosos, para la obtencin de estos caros se puede presionar y sacar el contenido de los ndulos. Cuando se sospeche de sarna coreptica o psorptica se deber realizar un raspado de piel con un bistur impregnado de aceite o glicerina, hasta que brote la sangre. Se deber buscar en las descamaciones epidrmicas localizadas en el nacimiento de las plumas si es el caso. RECOLECCIN DE GARRAPATAS Estas debern ser recolectadas procurando que al desprenderlas, las piezas bucales no se queden adheridas a la piel. Despus de desprendidas, deben ser depositadas en un recipiente que contenga un papel impregnado de solucin salina al 10 % para conservar la humedad. RECOLECCIN DE INSECTOS Preparar una solucin de alcohol-ter (97 ml de alcohol al 70% y 3 ml de ter), mojar una esptula o hisopo con esta solucin y pasarla sobre el pelo o las plumas en el sentido de estas, as un buen nmero de rtropodos quedarn adheridos al hisopo, posteriormente introducir la muestra en un frasco con cerrado hermtico.
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RECOLECCIN DE LARVAS Las larvas productoras de miasis se recogen directamente de las heridas y se colocan en solucin salina al 1%, en caso de querer conservarlas se depositan en solucin de etanol al 70% adicionando 5% de glicerol, de esta forma se previene la deshidratacin. Los nematodos deben ser recogidos y lavados por agitacin en solucin salina al 0.9%, pasndolos de inmediato a una mezcla de alcohol al 70% en caliente o formol al 5% en solucin salina, lo que permite su estiramiento y fijacin. VARROASIS La Varroasis es una parasitosis que deteriora la salud de las abejas y afecta la produccin de miel; cada apicultor debe controlarla, para lo cual necesita ser capaz de identificarla en sus apiarios. La Varroasis es una parasitosis externa de las abejas del gnero Apis, causada por el caro Varroa jacobsoni Oudemaus. La parasitosis se inicia cuando las hembras preadas de varroa se introducen en las celdillas de la cra de abejas que estn a punto de ser operculadas. Una vez entro, empiezan a ovopositar, primero un huevo del que se desarrollar un macho y posteriormente da origen nicamente a hembras. Las Varroas alcanzan su madurez sexual y se aparean dentro de la celda; de sta salen las hembras preadas para continuar el ciclo. El hospedador original de Varroa jacobsoni es la abeja oriental Apis cerana, a la que provoca trastornos menores, debido a: 1.- Las obreras se acicalan unas a otras para librarse de los caros. 2.-Son capaces de eliminar gran parte de los caros que se encuentran en su colonia. 3.-La hembra preada de Varroa, entra tanto en las celdillas de obreras como de zngano, favorecindose ms su reproduccin en estas ltimas. Las prdidas ms grandes se han reportado entre tres a cinco aos despus de su introduccin en un pas, es decir, el ao de su deteccin y los dos siguientes. Es de distribucin mundial a excepcin de Nueva Zelanda y de las Islas Hawaii. En Mxico se detect por primera vez el 8 de mayo de 1992 en Veracruz. La Varroasis ocasiona dos tipos de dao a la apicultura, que son: a).- El ejercido por el caro sobre las abejas en forma directa e indirecta. b).- Por erogacin econmica. DETECCIN La Varroa se puede detectar mediante el examen de las abejas adultas, de la cra, de los desechos de la colonia o del polen colectado en las trampas de polen. MUESTREO DE ABEJAS ADULTAS Colectar de 200 a 300 abejas de un bastidor del centro de la colmena en un frasco, es importante verificar que no se encuentre la reina entre estas. Se pueden utilizar tres mtodos para determinar si las abejas colectadas tienen caros: Por observacin directa, por lavado o utilizando ter (ter en aerosol, de forma comercial el arrancador de motores diesel).
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Observacin directa. Las abejas se examinan mientras se encuentran anestesiadas. Las abejas adultas se examinan individualmente con una lupa o con un microscopio estereoscpico (10x). La efectividad de este mtodo, en comparacin con el de lavado, es poco mayor de 85% debido en parte a que las Varroas son difciles de encontrar cuando estn adheridas entre los segmentos del cuerpo de la abeja. Lavado. Los caros se desprenden del cuerpo de las abejas si estas se agitan dentro de lquidos como agua caliente, alcohol al 70%, detergente, gasolina o hexano. Con agitacin de 20 minutos, se desprende el 100% de los caros, si el agitado es durante 1 minuto, se desprender aproximadamente el 90%. La muestra se pasa por una malla de 8 a 10 cuadros por pulgadas, para que las abejas se detengan en esta, pero que pasen los caros y el lquido; despus el lquido se filtra a travs de una tela blanca y limpia de algodn, que retendr a los caros si se encuentran presentes. Uso de ter. Las abejas se anestesian exponindolas durante uno o dos segundos al ter y luego se rotan dentro del recipiente que las contiene durante 10 segundos. Las abejas anestesiadas regurgitan el nctar contenido en su estmago, el cual se pega a las paredes del recipiente y los caros, que en su mayora se habrn desprendido del cuerpo de las abejas, tambin se adhieren a las paredes del recipiente. Las abejas se colocan sobre un trapo blanco, por si se desprenden ms Varroas. Las observaciones se efectan inmediatamente despus de aplicar el ter. Examen de la cra. Las Varroas se pueden observar fcilmente sobre el cuerpo blanco de las pupas de las abejas, se sugiere que se examinen por lo menos 100 pupas por colonia, de preferencia de znganos. O bien se cortan trozos de panal de 3 por 15 cm con cra (preferentemente de zngano) operculada y se enva al laboratorio envuelto en tela color blanco o en papel peridico y esta a su vez en bolsa de plstico para su posterior observacin con auxilio del microscopio estereoscpico. Inspeccin de los desechos de la colonia. Los desechos de la colonia: La cera, polen, abejas y cras muertas, as como los caros muertos en forma natural o por la aplicacin ex profeso de productos qumicos, caen continuamente en el piso de la colmena y las abejas limpiadoras los remueven. Esos desechos pueden examinarse en busca de Varroa. Si se decide aplicar tratamiento qumico se recomienda hacerlo inmediatamente despus de la cosecha, cuando hay menor cra. Para colectar el desecho de la colonia, se coloca un papel (cartulina), un cartn o una lmina de color blanco impregnada con aceite vegetal, aceite comestible o con vaselina y se coloca en el interior de una trampa de recoleccin con las siguientes caractersticas: Charolas de triplay de 33X45 cm y 3 mm de espesor, las cuales tienen un marco de 3 lados; el cual mide 1 cm de ancho por 1 cm de alto, cubierto con una malla de alambre cuadriculada, con abertura de 2 a 3 mm, dejando una abertura para la introduccin de la cartulina, el cartn o la lmina de 28X42 cm. La trampa se coloca sobre el fondo de la colmena a tratar y se deja al menos durante una semana, al trmino de la cual se retira la cartulina con el detritus teniendo cuidado de que no se tire nada, para posteriormente ser enviada al laboratorio con todos los datos del apiario y del apicultor. Para su envo al laboratorio se empaqueta en bolsa de plstico o de papel, lo ms pronto posible.
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BIBLIOGRAFA 1. Bayer (1996): Manual Bayer de la garrapata. Bayer, Mxico. 2. Carrillo, M.F., Barreto, V.J., Rodrguez, M.R. (1997): Evaluacin de las reinfestaciones parasitarias gastroentricas y pulmonares en el municipio de Zacualpan de Amilpa, Estado de Morelos. Memorias XXI Congreso Nacional de Buitra, Colima, Mxico. Pg. 81-83. 3. Cordero del Campillo, M.; Rojo V. F.A. (1999): Parasitologa Veterinaria. Gras Iatros, Barcelona, Espaa. 4. Domnguez, A. J.; Ramrez, C. G. T.; Rodrguez, V. R. y Cob, G. L. A. (1990): Manual de Tcnicas Parasitolgicas en Medicina Veterinaria. Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia, UAY, Mrida, Yucatn, Mxico. 5. Doxey D. L. (1987): Patologa Clnica y Procedimientos de Diagnstico en Veterinaria. 2ed. El Manual Moderno, Mxico. 6. Escutia S. I. (1985): Caracteres Morfolgicos de Trichomonas foetus. Memorias: Diagnstico de las Parasitosis Internas de los Rumiantes Domsticos y Cerdos. UNAM, Mxico. 7. Garca, P.T.B., (1997): Deteccin de Varroasis en las abejas (Apis mellfera), Instituto de Investigaciones Forestales Agrcolas y Pecuarias centro de investigacin regional Golfo centro, Campo Experimental la Posta Veracruz, Veracruz, Mxico. 8. Garza Q. C. (1996): Estudios sobre la dinmica poblacional de Varroa jacobsoni en clima subtropical., Memorias del 3er. Congreso Internacional de Actualizacin Apcola, Mxico. D.F. 9. Gaxiola, C.S.M., Camacho B.S.P., Rubio R.M.C., Borbolla, I.J.E. (1998): Prevalencia de Fasciola hepatica en bovinos del Municipio de Angostura, Sinaloa; Memorias del XXII. Congreso Nacional de Buiatra, Acapulco, Mxico. 10. Georgi J.R.; Georgi M.E. (1994): Parasitologa en Clnica Canina. Interamericana, Mc Graw-Hill, Mxico. 11. Huerta, P.R.A. (1990): Garrapatas del ganado bovino en Mxico, Universidad Autnoma Chapingo. Departamento de Parasitologa Agrcola. Chapingo, Mxico. 12. Jurez F. J. (1985): Diagnstico de Hemoparasitosis: Babesia ssp., Anaplasma ssp. y Eperythrozoon ssp. Memorias: Diagnstico de las Parasitosis Internas de los Rumiantes Domsticos y Cerdos. UNAM, Mxico. 13. Krupp, M. A.; Tierney, L. M.; Jawetz, E.; Roe, L.; Camargo, C. A. (1986): Manual de Diagnstico Clnico y de Laboratorio. 8 ed., El Manual Moderno, Mxico. 14. Lepe G.L.J. Michel P.J.G., Villa C. J., Rodrguez P.C.G., Blanco, D.R., (1997): Frecuencia de parsitos gastrointestinales en bovinos semiestabulados del Municipio de Autln de Navarro Jalisco, Memorias XXI. Congreso Nacional de Buitra, Colima, Mxico. 77-79. 15. Llorente, M.J. (1990): Principales enfermedades de las abejas. Ed. Servicio de extensin Agraria Ministerio de Agricultura, Pesca y Alimentacin 2 ed, Madrid. 16. Martnez, O.S. (1995): Varroasis de las abejas (Recopilacin bibliogrfica). Tesis de Licenciatura, Universidad Autnoma del Estado de Mxico, Toluca, Estado de Mxico.
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17. Mehlhorn, H; Dwel, D; Raether, W; (1994) Manual de parasitologa Veterinaria. Gras Iatros. Espaa. 18. Meja G. R. A. (1985): Colecta, Conservacin y Envo de Muestras de Heces, Sangre, Exudado y rganos. Memorias: Diagnstico de las Parasitosis Internas de los Rumiantes Domsticos y Cerdos. UNAM, Mxico. 19. Nez, J. L. (1987): Fundamentos de Parasitologa Veterinaria. Hemisferio Sur. Buenos Aires, Argentina. 20. Prez S.G., Gonzlez M.P., Marrufo O.J. Zapata M.S. (1997): Mortalidad de Varroa jacobsoni con tratamientos de Apistan y cido frmico en abejas Melferas, Memorias XI seminario Americano de Apicultura; Acapulco, Mxico. 21. Philippe, J.M. (1990): Gua de apicultor. Ed. Mundi-Prensa, Madrid, Espaa. 22. Quintero M.T., (1992): caros productores de sarna; primer curso terico-prctico de parasitosis ms frecuentes y su patogenia UNAM, FMVZ. Mxico. 23. Quiroz, R. H. (1994): Parasitologa y Enfermedades Parasitarias de Animales Domsticos. UTEHA, Mxico. 24. Ramrez, N. R. (1971): Coleccin de Muestras para Examen Clnico en Enfermedades del Cerdo. Memorias II, IV, V y VI Reunin de la Asociacin de Especialistas en Cerdos, Mxico. 25. Ruijter A., Eijnde J.V.D. (1991): Ensayo de campo para determinar la eficacia de las tiras (strips) de Bayvarol contra los caros Varroa en colonias de abejas, as como la accin del preparado sobre el desarrollo de la colonia en los meses siguientes a la aplicacin. Not. Med. Vet. 61, 30-35, Holanda. 26. Secretara de Agricultura y Recursos Hidralicos, Organismo Internacional Regional de Sanidad Agropecuaria, (1990) Patologa Apcola. SARH. Mxico. 27. Soulsby E. J. L. (1988): Parasitologa y Enfermedades Parasitarias en los Animales Domsticos.7 ed., Interamericana, Mxico. 28. Tarazona, V. J. M. (1973): Manual de Tcnicas de Parasitologa Veterinaria; Acribia, Zaragoza, Espaa. 29. Thienpont, D.; Rochette, F.; Vanparijs, O. (1979): Diagnstico de las Helmintiasis por Medio del Examen Coprolgico. Janssen Research Foundation, Blgica. 30. Valencia, M.E., Trujillo, H. J.J. (1999): Diagnstico y Comportamiento del caro Varroa jacobsoni, Oudemaus, mediante el tratamiento con fluvalinato (Apistan), en apiarios del Valle de Toluca. Tesis de Licenciatura, Universidad Autnoma del Estado de Mxico, Toluca, Estado de Mxico. 31. Vzquez C.R.D. (1997): Resultados y perspectivas de la Campaa Nacional contra la Varroasis de las abejas. Memorias del XI Seminario Americano de Apicultura. Acapulco, Mxico. 32. Velasco, C. O.; Aguirre, A. M. T. (1994): Toma, Transporte y Envo de Muestras para el Diagnstico Parasitolgico de Laboratorio de Infecciones Gastrointestinales. INDRE, Mxico.
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HEMATOLOGA Y QUMICA SANGUNEA

Dr. Martn Talavera Rojas* M. en C. Israel Alejandro Quijano Hernndez**
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Integrante del Cuerpo Acadmico de Patognesis Microbiana Integrante del Cuerpo Acadmico de Medicina y Ciruga de perros y gatos
CONSIDERACIONES GENERALES La hematologa es una de las ramas de la patologa clnica que mas estudios de laboratorio abarca, entre estos incluimos al hemograma, tiempos de coagulacin y pruebas especficas de antgenos por ejemplo: el factor de Von Willebrand; la bsqueda especfica de hemoparsitos y morfologa celular. Para un hemograma se requiere de sangre completa con EDTA como anticoagulante, la cual debe ser obtenida de un animal vivo que sea representativo de las condiciones propias de la enfermedad. La cantidad vara de acuerdo a la especie, pero se requiere un mnimo de 3 mL para efectuar el anlisis, ya que la proporcin anticoagulante sangre siempre debe mantenerse. El anlisis debe efectuarse con la sangre lo ms fresca posible, no exceder ms de 12 a 24 horas despus del muestreo. Es recomendable realizar el frotis sanguneo al momento de la toma de la muestra para que no sufran alteraciones morfolgicas principalmente los leucocitos. Tambin los eritrocitos sufren alteraciones al permanecer durante ms tiempo en contacto con el anticoagulante y sufrir los efectos del enfriamiento y deshidratacin, por mnimas que estas sean. Los exmenes bioqumicos permiten cuantificar o establecer diferencias con relacin a los rangos de referencia de diferentes analitos, a travs de los cuales podemos establecer enfermedades de rganos especficos. Existe una gran variedad de anlisis y es conveniente ponerse en contacto con los laboratorios para recibir instrucciones acerca del tipo de muestra, volumen, duracin, aditivos e interferencias que puedan afectar la interpretacin de los anlisis realizados. COLECCIN DE LA MUESTRA La seleccin del tubo o frasco (contenedor) apropiado as como el tipo de anticoagulante a emplear son determinantes para la coleccin de la muestra. El frasco debe identificarse con un nmero o clave y anotarla tambin en la historia clnica y datos generales del paciente, como especie, sexo, edad, raza y hasta variedad. Los tubos que se fabrican comercialmente contienen la cantidad apropiada del anticoagulante para el examen hematolgico o bioqumico. Estos tubos tienen el vaco necesario para la cantidad de sangre requerida y usando la aguja adecuada la sangre se recolecta directamente en el tubo, este es el mtodo preferido de recoleccin. Algunos veterinarios prefieren colectar la muestra en jeringas y pasar la muestra posteriormente al tubo con anticoagulante. Este mtodo debe tener ciertas consideraciones para evitar alteraciones que interfieran en los resultados del laboratorio.
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Cuando la sangre se utiliza para anlisis hematolgicos, debe retirarse la aguja de la jeringa antes de vaciarla en el tubo con anticoagulante, para evitar hemlisis y posteriormente se homogeniza en una forma suave para evitar la coagulacin de la misma. Para la obtencin de suero para anlisis bioqumicos se puede realizar de la misma manera, quitando la aguja y vaciando en un tubo sin anticoagulante o bien dejar la sangre en la jeringa para que se separe el suero y ya en el laboratorio se sella con calor y puede ser centrifugado en la misma jeringa, para este procedimiento se recomiendan las jeringas de 5 y 10 mL. MANEJO DE LA MUESTRA La mayora de los componentes qumicos son determinados en la porcin extracelular de la sangre (plasma o suero) por lo que cualquier entrada de una fuente intracelular puede influir en los resultados, algunas sustancias presentes en plasma o suero se encuentran dentro de los eritrocitos en una alta concentracin, por lo que la hemlisis puede influir en los resultados de laboratorio. Una vez obtenida la muestra de sangre para anlisis bioqumico o hematolgico, debe de trasladarse inmediatamente al laboratorio para su anlisis. La forma ms efectiva, es transportarla en refrigeracin, ya que es un mtodo sumamente efectivo y proporciona una temperatura aproximada de 4-8C. Para mayor seguridad la muestra debe colocarse en un recipiente a pruebas de fugas de agua y ste a su vez se encierra en otro recipiente tambin a prueba de fugas de agua y de dimensiones mayores. Se llena el espacio entre ambos recipientes con hielo o bien pueden utilizarse refrigerantes. Las cajas de unicel son adecuadas y pueden conservar la temperatura por mayor tiempo. Se debe evitar el contacto directo del hielo con la muestra, ya que pudiera ocasionar congelacin y a su vez producir hemlisis de la muestra. Para las mediciones de tiempos de coagulacin es importantsimo que la coleccin de sangre sea en forma precisa, evitando puncionar en repetidas ocasiones al paciente para obtener la sangre, ya que esto activar las vas de coagulacin, alterando los resultados in vitro. Tambin debe considerarse que el citrato de sodio al 3.8% se mezcle en una proporcin de 1:9 con sangre, ya que los reactivos se encuentran preparados para una cantidad conocida de anticoagulante. En el caso de el amoniaco, debe utilizarse heparina sdica, procurando separar inmediatamente el plasma del resto de las clulas para evitar la mayor formacin in vitro de amoniaco por los eritrocitos, al tiempo que debe ser refrigerada. Cuando se trata de medir gases sanguneos, el anticoagulante a utilizar es heparina de litio, ya que normalmente se analizan al mismo tiempo los electrolitos, la muestra despus de ser obtenida de la arteria de eleccin (Tarsal, femoral o carpal), se debe sumergir en hielo para evitar cambios de pH y CO2. En el caso de los frotis de sangre que se han realizado al momento del muestreo deben secarse al aire y enviarlos con su identificacin (se puede realizar sobre el mismo frotis
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con un lpiz) envueltos en papel tratando de no colocarlos frente a frente, ya que pueden borrarse por el roce entre stos. Para el caso de la obtencin del suero es recomendable si es que se va a tardar en llegar al laboratorio, separar el suero en otro tubo y enviarlo con su identificacin. ARTEFACTOS QUE ALTERAN LOS RESULTADOS DE LABORATORIO La hemlisis in vitro ocurre cuando: la sangre se deposita en el tubo rpidamente, se agita vigorosamente, se congela o se queda a temperatura ambiente durante un largo perodo. El curso de hemlisis in vivo es un signo crtico de una enfermedad. Cuando la hemlisis es observada, una segunda muestra debe obtenerse cuidadosamente y el plasma examinarse despus de la centrifugacin (microhematocrito). La importancia de este artefacto radica, en que ocasionalmente las lecturas espectrofotomtricas se ven alteradas, ya sea disminuyendo o aumentando los resultados de otros analitos; a la vez que puede variar las mediciones de hematocrito. La lipemia ocurre frecuentemente en muestras que no son tomadas en ayuno (animales monogstricos). La lipemia causa un aparente incremento en la concentracin de sustancias que son medidas por absorbancia (espectrofotometra). La lipemia postpandrial puede ser evitada en animales obesos realizando el muestreo con un mnimo de 6 a 12 horas de ayuno. Aunque la persistencia de lipemia sugiere un desorden metablico o endocrino. La lipemia predispone a hemlisis in vitro. FUENTES DE VARIACIN La calidad de los resultados de laboratorio depende de la preparacin del paciente, de la coleccin y el manejo de la muestra y finalmente del reporte analtico. El ejercicio puede influir dramticamente en los resultados hematolgicos particularmente en animales como el caballo que tienen una respuesta marcada de esplenocontraccin. Las muestras tomadas inmediatamente despus del ejercicio tienen un incremento en el volumen del paquete celular as como en el conteo de leucocitos. Estos cambios usualmente desaparecen horas despus del ejercicio. Si el ejercicio es prolongado se incrementa la actividad de enzimas musculares (creatin quinasa (CK), aspartato-amino-transferasa (AST), lactato-deshidrogenasa (LDH) en el suero. El estrs emocional es comn que se presente en animales y puede favorecer la liberacin de epinefrina, que causa incremento en la glucosa y linfocitos en la sangre (principalmente en el gato) o bien presentarse la frmula del estrs caracterizada por neutrofilia, linfopenia, eosinofilia y monocitosis especialmente en perros; este ltimo efecto slo se observar despus de 4 a 6 horas de que el paciente fue sometido a estrs, ya que el efecto es netamente esferoidal, y ese es el tiempo que tardan en hacer su efecto el cortisol y los dems esteroides, (endgenos o exgenos). La dieta influye en los resultados del laboratorio principalmente en los animales monogstricos, los alimentos concentrados ricos en protenas elevan la urea nitrogenada en sangre, al igual que las hemorragias gastrointestinales producen l mismo efecto.
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Los agentes teraputicos pueden alterar la actividad fisiolgica del paciente resultando cambios en la concentracin de sustancias medidas. Por ejemplo la administracin de glucocorticoides altera el conteo diferencial y total de leucocitos, incrementa la fosfatasa alcalina (ALP) y la alanin-amino-transferasa (ALT). SITIOS DE OBTENCIN DE SANGRE En la prctica veterinaria, los exmenes hematolgicos se realizan satisfactoriamente con sangre venosa. La puncin venosa mediante aguja y jeringa o con el sistema vacutainer se ejecuta en cualquiera de las venas superficiales prominentes. Si se requieren muestras en repetidas ocasiones en caso de conejos, es conveniente rasurar el rea del margen externo de la oreja y cortar la vena marginal con un bistur y tomar la muestra con una pipeta en el caso de otras especies como el visn y hurn, se recomienda cortar una vena de la membrana interdigital previa asepsia. En caso de lechones se sujeta al animal echado sobre el dorso y se introduce la aguja en el vrtice del cartlago cariniforme dirigiendo la aguja hacia adentro, abajo y atrs penetrando la aguja en la vena cava, debe utilizarse una aguja de 3.5 5 cm. de largo. a. Vena yugular, (grandes especies). b. Vena ceflica, (perros y gatos). c. Arteria femoral d. Arteria carpal o tarsal e. Vena auricular (conejos, cerdos). f. Dedo de pie o ua (aves). g. Vena coccgea (bovinos). h. Corazn (animales jvenes o de talla pequea). i. Vena safena (perros y gatos) j. Vena mamaria (vacas). k. Vena cava anterior (cerdos). l. Vena alar humeral (aves). m. Plexo venoso retroorbitario (ratones y ratas) BIBLIOGRAFIA 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. Meyer, D.J.; Embert H.C.; Lon J.R. (1992): Veterinary Laboratory Medicine. W.B. Saunders Company. Philadelphia. Busch. B.M. (1991): Interpretation of Laboratory Results for Small Animal Clinicians. Blackwell Scientific Publications, Oxford. Benjamin M.M. (1991): Manual de Patologa Clnica en Veterinaria. Limusa, Mxico. Paredes H.E.; Cubillos G.V. (1995): Manual de necropsia en animales domsticos. Universidad Austral de Chile, Chile. 8. Coffin. L. D. (1981): Laboratorio Clnico en Medicina Veterinaria, La Prensa Mexicana, Mxico
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UROANLISIS
Talavera Rojas, Martn.
INTRODUCCIN
El anlisis de orina es uno de los procedimientos de laboratorio ms comunes aplicados a la prctica veterinaria y es un mtodo utilizado frecuentemente como medio diagnstico de las enfermedades de las vas urinarias del tracto urinario alto o bajo. Para poder hacer un anlisis e interpretacin adecuada del Uroanlisis, es necesario conocer la funcin renal, regulacin del equilibrio cido-bsico, electrolitos y lquidos, la presin osmtica y eliminar los desperdicios del metabolismo y sustancias txicas.
El anlisis de orina con frecuencia revela alteraciones y caractersticas de enfermedades del rin y proporciona informacin de otros trastornos funcionales del organismo. La orina debe examinarse lo ms pronto posible y deben tomarse las muestras en las primeras horas de la maana.
RECOLECCIN DE MUESTRAS
Para la recoleccin de las muestras, es necesario emplear recipientes qumicamente limpios. Las muestras pueden tomarse de diferentes maneras, entre las principales se encuentran:
1.- Emisin natural: En casi todas las especies se puede recoger la muestra de orina mientras que el animal efecta la miccin. Es necesario a veces vigilar al animal para que en el momento de la miccin se recolecte la muestra.
Se utilizan tambin cajas con pisos hermticos o con otros dispositivos que permitan recoger la orina tales como las cajas con drenaje en el piso.
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En caso de animales como el bovino, ovino o equino se utiliza una bolsa hembra de hule que es atada al animal en tal forma que su abertura est colocada al orificio prepucial.
2.- Mediante comprensin manual de la vejiga: Para inducir a la miccin
3.- Cateterizacin transuretral: En lo posible debe evitarse esta tcnica en pacientes con susceptibilidad a padecer infecciones del tracto urinario, esto incluye pacientes con enfermedad urinaria del tracto urinario bajo y falla renal, hiperadrenocorticismo, diabetes mellitus y poliuria.
4.- Cistocentesis: Es una forma de paracentesis, consiste en punzar la vejiga acoplada a una jeringa. Es recomendada en los siguientes casos: Prevencin de contaminacin de la orina con bacterias, clulas o restos del tracto genital bajo. Ayuda a evaluar problemas como: hematuria, piuria y bacteriuria. Minimiza problemas iatrognicos causados por cateterizacin.
5.- Cateterizacin. Las muestras obtenidas por cateterizacin son preferibles para estudios tales como bacteriolgicos ya que estn libres de detritus celulares. Cateterizar a un perro por ms de una o dos veces al da no se recomienda, ya que la reaccin tisular al traumatismo ocasiona una inflamacin y disminucin en el lumen uretral.
Hay que impedir la contaminacin de la muestra con sustancias tales como vaselina, que interfieran en los resultados, tambin se debe tener en cuenta que debemos evitar la contaminacin del catter para no introducir un agente infeccioso en vas urinarias, se recolecta la orina dejando fluir libremente o haciendo una presin ligera para evitar traumatismos a la mucosa de la vejiga.
En la mayora de exmenes realizados de rutina (examen fsico, qumico y microscpico) es suficiente conservar la orina mediante refrigeracin utilizando el mismo mtodo de los recipientes que fue descrito para muestras de sangre.
Otras maneras de obtener la orina son a).- Jeringa hipodrmica directamente en vejiga, se utiliza sobre todo en gatos. b).- Caja de recoleccin para perros y gatos y c).- Presin sobre la vejiga urinaria hasta lograr que fluya esta ltima, en gatos y perros.
CONSERVACIN DE LA ORINA
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El anlisis de la orina se efecta lo ms rpido posible o se puede almacenar en refrigeracin, pero se debe mantener a temperatura ambiente antes de realizar el anlisis. En la mayora de exmenes realizados de rutina (examen fsico, qumico y microscpico), es suficiente conservar la orina mediante refrigeracin utilizando el mismo mtodo de los recipientes que fue descrito para muestras de sangre.
Cuando no es posible refrigerar se agrega 1 gota de formol al 40% en 30 mL de orina aadiendo antes de realizar el examen qumico y el urocultivo, tambin se le puede agregar tolueno en cantidad suficiente que forme una capa en la superficie de la orina.
PRESERVACIN IN VITRO DE LA ORINA El objetivo de todo proceso de preservacin es prevenir alteraciones que puedan ocurrir en las propiedades fsicas y qumicas. Los mtodos de preservacin son los siguientes:
Se usa para preservar las muestras cuando estas no pueden ser enviadas inmediatamente al Refrigeracin laboratorio. Se puede refrigerar mximo 2 horas despus de la recoleccin. Se usa para preservar las propiedades qumicas de la orina, inhibiendo y retardando el crecimiento Congelacin bacteriano y de la mayora de metabolitos. Conserva el calcio, sodio, potasio, cloro, magnesio y fsforo por lo menos 10 semanas. Algunos elementos como clulas, cilindros y algunos qumicos se preservan por acidificacin de Acidificacin la orina por medio del cido hidroclorhdrico (5-10 ml) o cido actico glacial. Formaldehdo Previene crecimiento microbiolgico. Una gota al 40% por 30 ml de orina es la adecuada. Es un agente antimicrobiano, usando 5 ml son suficientes para preservar una orina por 24 horas.
Cloroformo
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BIBLIOGRAFIA
1. Meyer, D.J.; Embert H.C.; Lon J.R. (1992): Veterinary Laboratory Medicine. W.B. Saunders Company, Philadelphia. 2. Busch. B.M. (1991): Interpretation of Laboratory Results for Small Animal Clinicians. Blackwell Scientific Publications, Oxford. 3. Benjamn M.M. (1991): Manual de Patologa Clnica en Veterinaria. Limusa, Mxico. 4. Paredes H.E.; Cubillos G.V. (1995): Manual de necropsia en animales domsticos. Universidad Austral de Chile, Chile.
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TOXICOLOGA
Valladares Carranza, Benjamn*. Zamora Espinosa, Jos Luis*. Velzquez Ordez Valente*. Gutirrez Castillo Adriana**. * Integrantes del Cuerpo Acadmico en Salud Animal. ** Integrante del Cuerpo Acadmico Patognesis Microbiana El diagnstico exacto de una toxicosis, al igual que el de otras enfermedades se realiza utilizando la informacin obtenida mediante criterios bsicos, los cuales incluyen: Historia clnica, Evaluacin clnica, Hallazgos posmortem (necropsia), Anlisis de laboratorio y Pruebas biolgicas. El diagnstico clnico se basa en el conocimiento de criterios pertinentes con el problema, valoracin calificada en el laboratorio de muestras apropiadas e interpretacin de los resultados obtenidos; segn la asociacin de circunstancias con el problema. Es importante evitar que el diagnstico se base en la informacin obtenida de un solo criterio, rehusando obtener o considerar la informacin de otros criterios esenciales para establecer un diagnstico correcto. El diagnstico exacto es el factor individual ms importante al intervenir en intoxicaciones de los animales, y una vez conocida la causa del problema puede iniciarse su prevencin, control o tratamiento especfico. A. HISTORIA CLNICA El conocimiento de las circunstancias asociadas con el envenenamiento resulta de gran utilidad y es clave para el diagnstico correcto. Debe investigarse la presencia de venenos y otros compuestos qumicos en la explotacin, pradera, establo o determinar si han sido utilizados, y la reciente exposicin a los mismos animales, esto con el fin de calcular el grado de exposicin, siendo examinados cuidadosamente los piensos y el agua de consumo por la presencia de plantas txicas, mohos, algas, hongos u otros txicos presentes en estos. En especies de mamferos domsticos o aves habr que considerar el nmero de animales en el hato o granja, animales afectados, curso de las alteraciones (descritos en horas o das), nmero de muertes, tipo de manejo, programa de alimentacin y datos de enfermedades anteriores. Otros datos que ayudan a orientar el diagnstico son: procedencia del alimento, fecha de preparacin, tiempo de consumo, permanencia de los animales en pradera as como la existencia o contacto con maquinaria agrcola. Descripcin detallada de signos clnicos, lesiones post mortem, tiempo transcurrido desde que el animal fue observado por ltima vez antes de su muerte y su estado en el momento de la observacin, tratamiento administrado antes de la muerte y en caso afirmativo cual fue la respuesta, datos relativos al tratamiento o pulverizaciones de otra naturaleza contra parsitos internos y externos.
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En pequeas especies deben incluirse datos como: zona donde vive el animal, si permaneci suelto o atado, historia del empleo de rodenticidas u otros pesticidas en su alojamiento, tratamiento contra parsitos e inmunizaciones. B. EVALUACIN CLNICA. Incluye las manifestaciones externas del desarrollo de la patogenia del txico en el hospedero. Debe realizarse con especial atencin en los detalles ya que el ms ligero signo visto por un observador atento puede constituir una clave para la identificacin de un txico, por ejemplo: la existencia de agentes txicos que influyen sobre sistema nervioso pueden dar como resultado muchas y variadas respuestas. Debe cuidarse con exactitud la actitud del animal, ya que por efecto de cientos de agentes txicos el animal reflejar diferentes reacciones en los distintos aparatos y sistemas, los cuales son patognmonicos de toxicosis, por lo cual la secuencia de los hechos y la gravedad de los sntomas son de relevancia para el diagnstico.
C. HALLAZGOS POST MORTEM Los exmenes anatomopatolgicos e histopatolgicos aportarn pruebas valiosas en caso de sospecha de intoxicacin, y deben realizarse antes de emprender cualquier accin de tipo legal. Algunos venenos provocan lesiones extensas, otros ligeras alteraciones e incluso otros no producen cambios morfolgicos apreciables. En este punto es importante considerar la cintica de las sustancias toxicas, considerando que durante el estudio anatomopatolgico se deben colectar las muestras suficientes y precisas para su determinacin analtica en el laboratorio. D. ANLISIS DE LABORATORIO La evidencia qumica suele ser una ayuda indispensable en los casos del diagnstico toxicolgico. Utilizados correctamente y con la perspectiva adecuada, los anlisis qumicos pueden proporcionar el criterio independiente ms importante para el diagnstico. La coleccin de la muestra est condicionada por la fisiopatogenia del compuesto y por el tiempo transcurrido desde el momento de la exposicin hasta la muerte, por lo cual, es necesario cumplir con tres puntos importantes. 1). Practicar el anlisis de la muestra adecuada. 2). Elegir el mtodo analtico y especfico. 3). Encontrar cantidades significativas del txico.
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MUESTRAS PRECISAS PARA ANLISIS TOXICOLGICOS ESPECFICOS

PROCESO TCNICO Clorhidrato de clenbuterol (CCL)* Aflatoxinas MUESTRA Suero sanguneo, orina Alimento Leche Hgado Contenido gstrico o ruminal Alimento Planta Suero Forraje Contenido gstrico o ruminal Hgado Rin Orina Forraje Alimento Hgado Rn Encfalo Contenido gstrico Suero Sangre Hgado Rin Grasa corporal Faneras Forraje fresco Orina Rin CANTIDAD MNIMA 3-5 mL 1000 gr 500 mL 500 gr 300 gr 1000 gr 1000 gr 20 mL 1000 gr 500 gr 50 gr 50 gr 50 mL 1000 gr 1000 gr 50 gr 50 gr 1000 gr 500 gr 20 mL 30 mL 50 gr 50 gr 100 gr 5 gr 1000 gr 1000 gr 50 mL 1 Rin RECIPIENTE Tubo Vacutainer Bolsa de papel Frasco estril Frasco estril Frasco estril Bolsa de papel Tubo estril Bolsa de papel Frasco estril CONSERVADOR Refrigeracin congelacin Congelacin o Refrigeracin Congelacin o Refrigeracin o
Alcaloides
Microminerales (Se, Zn, Cu, Fe)
Congelacin o Refrigeracin
Metales pesados (Cu, Pb, Cr, Ag, As). Organoclorados y Organofosforados
Bolsa de papel Frasco estril
Refrigeracin o Congelacin
Bolsa de papel Frasco estril Tubo estril Frasco estril Bolsa de papel
Congelacin
Oxalatos
Frasco estril Bolsa de papel Frasco estril
Congelacin, Refrigeracin Formol al 10% (cuando se determina valorar y correlacionar por HT lesiones en tejidos) Congelacin Refrigeracin
Nitratos, Nitritos
Cianidinas
Fluoracetato Sodio Urea
de
Ensilado Forraje Agua Orina Suero Forraje Ensilado Contenido gstrico o ruminal Contenido gastrointestinal E hgado Contenido ruminal Hgado Alimento
1000 gr 1000 gr 50 mL 50 mL 20 mL 1000 gr. 1000 gr 500 gr Todo el disponible
Frasco estril Bolsa de plstico Frasco estril Tubo estril Frasco estril
Refrigeracin o Congelacin
Frasco estril
Congelacin
200 gr.
Frasco estril
Solucin saturada de HgCl3
* CCL tambin se puede determinar en tejidos (hgado, rin, msculo y ojo) y otras muestras como: alimento, orina, suero sanguneo y pelo.
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La eleccin de la muestra es importante en la ejecucin del anlisis qumico. Las muestras debern obtenerse exentas de contaminacin y residuos qumicos, no ser lavas para evitar la posibilidad de arrastrar residuos del agente qumico o de contaminacin con el agua. Debe considerarse que frecuentemente se trabajara con cantidades vestigiales de un determinado producto qumico y que incluso la contaminacin ms ligera puede originar resultados errneos. D. PRUEBAS BIOLGICAS Otro apartado importante y necesario e indispensable para el diagnstico, en el que se administra el material txico sospechoso a un animal susceptible, para observar los efectos en detalle, y en el que en la mayora de los casos se utilizan animales de laboratorio (ratones, ratas, conejos, cuyos, etc.). Los resultados positivos pueden avalar directamente el diagnstico, sin embargo un resultado negativo no indica que el txico administrado no produjo reaccin (envenenamiento), ya que pueden intervenir mltiples factores en el caso natural que se desconocen o solo pueden reproducirse experimentalmente, adems de las variaciones entre animales de la misma especie, de la susceptibilidad del individuo o bien estar determinado por caractersticas propias del txico. LITERATURA REVISADA Blood, D.C.: (1996) Manual de Medicina Veterinaira. Mc. Graw-Hill- Interamericana, S.A. de C.V., Mxico, D.F. Buck, W.B.; Osweller, G.D. y Van Gelaer, G.A.: (1973) Clinical and Diagnostic Veterinary Toxicology. Kendall Hunt Publishing and Company, Iowa, U.S.A. Dreisbach, R.H. y Fraga, E.E.: (1987) Manual de toxicologa clnica; Prevencin, diagnstico tratamiento. El Manual Moderno. Mxico, D.F. Garner, R.J. y Papworth, D.S.: (1988) Garner, Toxicologa Veterinaria. 3 ed. Acribia. Zaragoza, Espaa. Jurado, C.R.: (1989) Toxicologa Veterinaria. 2 ed. Salvat. Barcelona, Espaa. Lorgue, G.; Lechet, J. y Riviere, A.: (1997) Toxicologa Clnica Veterinaria. Acribia. Zaragoza. Espaa. Plumlee, K.H.: (2004) Clinical Veterinary Toxicology. Mosby. Elsevier. U.S.A. Radeleff, R.D.: (1967) Toxicologa Veterinaria. Academia. Len, Espaa.
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MUESTREO DE ALIMENTOS PARA ANIMALES
M. en C. Susana Goi Cedeo
OBJETIVO Explicar el procedimiento general de muestreo (Normas oficiales) aplicable a alimentos terminados e ingredientes mayores para animales considerando su presentacin como unidades de producto, as como su importancia. INTRODUCCIN Los laboratorios de servicios analticos dedicados a cuantificar materias primas, premezclas y alimentos terminados, deben garantizar su trabajo mediante la adopcin de programas de aseguramiento de calidad, tal como la Norma ISO 17025, que especifica los requisitos generales para la competencia de laboratorios de ensayo, que se utiliza en nuestro pas para otorgar la certificacin ante la Entidad Mexicana de Acreditacin (EMA). En Mxico se cuenta con la norma NMX-Y-111-SCFI-2001 que marca los procedimientos generales de muestreo que se aplican a alimentos terminados e ingredientes mayores para animales. La seleccin de la muestra es un paso muy importante para el anlisis en laboratorio; tanto que puede mencionarse que por ms cuidado que se tenga en el proceso y uso de equipo de vanguardia, el anlisis no tiene valor si se utiliza una muestra no representativa de todo el material en observacin. No es fcil obtener una muestra representativa como se ejemplifica en seguida. Cuando se va a estimar el contenido de protena de un pasto, con el mtodo de Microkjeldalh, la muestra debe ser de 0.1 g. Esta cantidad tan pequea debe representar una pradera que en ocasiones puede tener una extensin de muchas hectreas productoras de varias toneladas del material; y an despus de recibir muestras en el laboratorio el problema de muestreo contina siendo enorme. En 200 g de pasto verde hay un promedio de 40 50 g de materia seca, unas 500 veces la muestra de 0.1 g requerida para determinar protena. De la misma pradera se pueden obtener varias muestras, tomadas en diferentes zonas y es necesario decidir si se hace el anlisis en conjunto o de cada muestra por separado. Cuando se reciben las gramneas del campo, se pueden picar o dejar en un tamao de tres metros, aunque con materiales de gran tamao no es posible homogenizar la muestra. Al hacer el anlisis qumico, es necesario picar la gramnea para facilitar el secado. Una vez seca la muestra se debe moler pasndola por una criba de 1 mm. As se evita el problema de las diferencias en tamao fsico que se presentara en el caso del pasto con tallos de 2.5 a 5.0 cm y hojas cortadas del mismo tamao. An cuando las longitudes son iguales, los volmenes relativos son muy diferentes.
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Es muy difcil mezclar materiales de diferentes tamaos fsicos debido a que tienden a separarse. Es ms fcil obtener una muestra objetiva despus de reducir el material al tamao de 1 mm y de mezclarlo totalmente. En el muestreo de forrajes se trata de medir la produccin y su valor nutritivo, protegiendo una porcin de la zona de pastoreo para propsitos de muestreo y anlisis. Las plantas se cortan a la misma altura que la porcin del campo en el cual el ganado ha pastoreado, luego se pesan y se analizan, para obtener el rendimiento. TOMA DE MUESTRAS, CONSERVACIN Y ENVO AL LABORATORIO. Antes de iniciar el anlisis de muestras es necesario considerar que para que los resultados sean tiles, las muestras debern ser homogneas y representativas del lote donde fueron tomadas, independientemente del tamao del lote, el tipo de muestreadores, y de la forma del empaque; debe tomarse suficiente nmero de muestras que representan a la totalidad de la masa del alimento del que fue tomado. Cuando el muestreo es para control de calidad en la produccin, existen mtodos basados en distribuciones especficas (Estadstica), para los cuales el nmero de muestras que se tomarn, se basa en ecuaciones que correlacionan ciertos parmetros tales como: La tolerancia permitida en la calidad del producto. El tamao del universo muestreado (productividad/unidad de tiempo). Desviacin estndar deseada, etc. Para fines de investigacin como es el caso de los anlisis en Nutricin Animal, es ms prctico y til un muestreo al azar. La seleccin al azar es un procedimiento definido y riguroso que asegura que cada parte o unidad de un universo particular tiene igual probabilidad de ser seleccionada. Los trminos que se utilizan en los muestreos segn la norma NMX-Y-111-SCFI-2001 son los siguientes:
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Defecto Granel Inspeccin
Nivel de calidad aceptable (NCA) Produccin (lote) unitaria
Cualquier discrepancia o no conformidad con relacin a requisitos especificados. Material consistente en unidades irregulares en su proporcin y distribucin. Proceso de medicin, examen, comprobacin u otra forma de comparacin de la muestra con las especificaciones establecidas. Corresponde al mximo % defectivo que se puede considerar como satisfactorio para una calidad promedio. Unidades de producto de composicin similar cuyas caractersticas se van a inspeccionar. Nmero de unidades de producto dentro de una produccin unitaria Toda unidad de producto que contiene uno o ms defectos.
Tamao del lote Unidad defectiva
ALIMENTOS BALANCEADOS, SUPLEMENTOS E INGREDIENTES ALIMENTICIOS SLIDOS. Para muestrear ste tipo de productos es necesario utilizar instrumentos diseados especialmente (ver figura 1), los cuales deben estar limpios y libres de contaminacin tanto interna como externamente. Sin embargo, si no se dispone de ellos se puede ingeniar una forma de obtener las muestras, y si se hace con cuidado se obtendrn resultados similares aunque se requiera ms tiempo para realizar el muestreo.
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Fig. 1 INSTRUMENTOS UTILES PARA REALIZAR EL MUESTREO
Una muestra que contenga vivos insectos o que se sospeche que los contiene debe ser fumigada para matarlos e impedir que aumente su nmero entre el momento de tomar la muestra y el de sus anlisis en el laboratorio. La muestra no debe ser expuesta a temperaturas extremas que puedan alterar el producto y por lo tanto afectar el resultado del anlisis previsto. Si el producto est envasado en bolsas o sacos cerrados, se tomar de cada bulto a muestrear, 500 a 1000 g de material, el cual se extraer colocando horizontalmente el bulto y se inserta de extremo a extremo el muestreador, el cual puede ser la lanza abierta o la boquilla vertedora. El nmero de sacos o ncleos depender del tamao del lote; para lotes menores de 10 unidades debern muestrearse todos los sacos. Si hay ms de 11 unidades, se toman 10 sacos al azar y se obtiene una muestra ncleo de cada uno. Se debe muestrear no menos del 20% de los sacos cuando se trata de lotes grandes. Si el producto a muestrear est a granel, ya sea en camiones, vagones de ferrocarril o en bodega, se utilizar un muestreador cilndrico siendo las muestras del mismo tamao que las obtenidas de 55
los sacos. Basndose en la capacidad del vagn transportador, se tomarn muestras a tres niveles de profundidad en cada punto, cuyo nmero y distribucin ser el siguiente: Vagones o bodegas rectangulares de hasta 15 toneladas: 5 puntos de muestreo, uno al centro, aproximadamente a 50 cm de las paredes laterales. Vagones o bodegas rectangulares de 15 a 30 toneladas: 8 puntos de muestreo, dos al centro, y seis aproximadamente a 50 cm de las paredes laterales. Vagones o bodegas rectangulares de 30 a 50 toneladas: 11 puntos de muestreo, tres al centro y ocho aproximadamente a 50 cm de las paredes laterales. Otra forma de muestrear los ingredientes a granel es en el momento de cargar o descargar un lote: slo basta introducir un recipiente adecuado bajo la tolva de descarga a intervalos de tiempo que sern proporcionales al volumen cargado o descargado. Las muestras primarias deben ser mezcladas y divididas al tamao de la muestra contractual. Una vez obtenidos los ncleos que constituyen la muestra, sta debe ser homogenizada, ya sea en recipiente o sobre papel extendido; despus, por medio de cuarteo, se reducir hasta tener el tamao adecuado para ser enviada al laboratorio. La manipulacin de la muestra debe ser lo ms rpido posible para evitar que pierda o absorba humedad, sobre todo en lugares con condiciones atmosfricas extremosas. Las muestras deben ser guardadas en recipientes hermticos y etiquetados debidamente.
MUESTREO DE FORRAJES Para muestrear correctamente un forraje deben considerarse las variables que influyen en su calidad: origen, estado fenolgico, tipo de suelo, condiciones atmosfricas, condiciones de manejo (fertilizacin, regado, pastoreo); dependiendo del parmetro a medir ser la forma de muestrear. Al muestrear un forraje se deber proporcionar la siguiente informacin: Material de que se trata. Nombre comn regional. Nombre cientfico: gnero, especie y variedad. Estado fenolgico. Lugar y fecha de coleccin. FORRAJES FRESCOS El muestreo de un forraje fresco depender de la extensin de la pradera. Se deben colectar pequeas cantidades de diferentes zonas del terreno tratando de que stas no queden alineadas, ya que muchas veces la formacin geolgica o la morfolgica de un terreno sigue patrones de bandas y la composicin del suelo o de su declive influyen para que haya diferencias en el desarrollo del forraje. La manera ideal de muestrear es en forma radial, partiendo del centro del potrero, el cual se puede marcar con un poste o mojonera, y de all, a distancias proporcionales y radialmente hacer las colecciones. Existen sin embargo definicin de puntos de muestreo alternativas como son en zig-zag, sinuosa, etc.
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Al colectar las plantas del pasto en cada punto hay que tomar uno o varios manojos de plantas, evitando seleccionarlas por tamao u otra caracterstica. Las plantas seleccionadas al azar deben de cortarse de preferencia a la altura que son arrancadas por los animales al pastorear. Cuando se desea hacer un muestreo a diferentes edades de la planta o diferentes estados fenolgicos, cuidar de no volver a cortar la misma planta del muestreo anterior pues ya no ser representativa. Cuando se obtuvieran varios kilos, conviene cuartear y homogenizar previamente. Cuando la muestra se ha subdividido hasta tener un kilo de materia fresca, se guarda en una bolsa de papel para su traslado al laboratorio. Cuando la muestra est contaminada por la tierra o basura, hay que tratar de eliminar los contaminantes sacudindola o limpiando las partes sucias. MUESTREO DE HIERBAS Y ARBUSTOS El muestreo de hierbas y arbustos es similar al de pastos en cuanto a seleccin de los puntos de recoleccin pero difiere en el corte de la muestra y preparacin de la misma. En el caso de una herbcea (leguminosas como alfalfa y otras similares) sta se cortar a la misma altura que un pasto y de una arbustiva se deben cortar nicamente las partes suculentas del tallo, que son las que consume el ganado. Cuando se desea hacer un estudio detallado de ciertas plantas es necesario analizar la proporcin de tallos y hojas, a su vez que el contenido nutricional de cada uno de ellos. Para ello, una vez recolectada la muestra, se procede a deshojarla manualmente teniendo cuidado de separar las hojas junto al peciolo dejando nicamente el tallo desnudo. Se deber anotar la proporcin tallo: hoja de cada especie considerada. FORRAJES ENSILADOS La obtencin de una muestra representativa del contenido total de un silo es sumamente difcil, ya que durante el llenado del silo hay parte que se compacta ms debido a mayor presin o mejor acomodo del material picado, lo que provoca que la fermentacin sea diferente de una zona a otra y por lo tanto su composicin. Si se desea muestrear el contenido total de un silo habr que tomar las muestras utilizando sondas cilndricas. Estas sondas son cilindros provistos de una broca o taladro, el cual al mismo tiempo que horada, arroja la muestra al exterior. Este mtodo tiene el inconveniente que al perforar el centro del silo entra aire que altera la fermentacin, lo que puede daar el ensilaje alrededor de las perforaciones. Una vez tomada y homogenizada la muestra debe colocarse rpidamente en un recipiente cerrado ya que los ensilados contienen sustancias voltiles como alcoholes y cidos grasos. La muestra debe compactarse lo mximo posible para conservar las condiciones de anaerobiosis y evitar cambios en el patrn de fermentacin y por lo tanto en su composicin. Una vez empacadas las muestras de ensilados, se trasladan al laboratorio para su anlisis; si no sern analizadas de inmediato, debern ser congeladas. 57
FORRAJES HENIFICADOS. El muestreo de forrajes henificados presenta el inconveniente del volumen y la poca densidad del material, pero tiene la ventaja de que las muestras no necesitan ningn tratamiento para su conservacin. TCNICAS DE CONSERVACIN DE MUESTRAS El envo de la muestra debe realizarse de modo que llegue en perfecta condicin al laboratorio; este envo puede hacerse en diferentes medios de transporte, por lo que el mtodo de conservacin y envase debern ser congruentes entre s. La conservacin adecuada es, despus del muestreo, uno de los factores ms importantes para el anlisis. Deshidratacin Es el mejor mtodo de conservacin. El agua contenida en el alimento no contribuye a su valor nutritivo, y si lo hace susceptible a fenmenos de descomposicin por bacterias, hongos y enzimas tisulares. No es posible deshidratar sin que la muestra sufra alteraciones. Se usa el trmino deshidratacin cuando se elimina la humedad por medios artificiales y secado cuando se realiza al sol o a temperatura ambiente. La temperatura elevada durante la deshidratacin altera la protena del alimento disminuyendo su digestibilidad y la disponibilidad de aminocidos debido a la formacin de compuestos insolubles entre los aminocidos y azcares por reaccin de Maillard, se conservan cambios de color y olor, registrndose oscurecimientos. En forrajes se ha observado que la temperatura altera el nitrgeno insoluble en cido detergente por formacin de compuestos semejantes a la lignina. Una modalidad de deshidratacin es efectuarla a bajas presiones y temperaturas (utilizacin de vaco) con lo que se logra fcil la sublimacin del agua, pero el mtodo es costoso. Se aplica para deshidratacin de carnes y quesos o sus subproductos. Refrigeracin o congelacin La refrigeracin a temperatura 1 - 5C, puede no ser lo suficientemente baja para prevenir deterioro por enzimas, bacterias y hongos, por lo tanto su almacenaje deber ser por perodos de tiempo cortos. La congelacin, que generalmente se realiza a -10C, s permite la conservacin de las muestras por perodos de tiempo ms largos, aunque no todas las muestras la resisten sin alterarse. La congelacin deber realizarse rpidamente para que no haya cambios en la composicin de nutrimentos. Si la congelacin se realiza lentamente se observan fenmenos de protelisis y enranciamiento de grasas; as mismo hay prdida de vitaminas. Cuando la muestra va a ser conservada por congelacin durante tiempo largo, la temperatura deber estar entre -20 y 30C. Identificacin de muestras
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La identificacin apropiada de las muestras es muy importante para los resultados de los anlisis. La identificacin debe ser clara y precisa y contener todos los datos que ayuden a su clasificacin. Debe estar en un lugar visible, escrita de manera legible sobre material que resista la humedad y adherido al envase; debe ser escrito con tintas indelebles para que no se borren durante el manejo y almacenaje.
TAMAO DE LA MUESTRA, TIPO DE ENVASES Y MTODOS DE CONSERVACIN PARA EL ENVO DE MUESTRAS AL LABORATORIO DE NUTRICIN ANIMAL. Tipo de alimento Alimentos balanceados, suplementos e ingredientes alimenticios slidos Alimentos e ingredientes lquidos Tamao de muestra 100 - 250 g Tipo de envase de conservacin Frascos vidrio, plstico o nalgeno con tapa de rosca, bolsas de polietileno, cerradas hermticamente. Frasco vidrio, plstico o nalgeno con tapa de rosca. Bolsas de papel grueso. Cuando se deshidrata sese bolsa de polietileno o frasco de vidrio, plstico o nalgeno con tapa de rosca. Frasco de vidrio, plstico o nalgeno con tapa de rosca. Bolsa de polietileno. Frasco de vidrio, plstico o nalgeno con tapa de rosca. Bolsa doble de polietileno grueso. Frasco de vidrio con tapa de rosca o tapa de hule bien asegurada. Mtodo general Menos de 10% de humedad, a temperatura ambiente. Secar al sol o estufa a 50 C por 10-12 H.
250-500 ml
Refrigeracin (1-5 C)
Forrajes frescos, pastos, herbceas y arbustivos.
150-250 g en base seca 500-1000 g
Adicionar preservador. Deshidratacin en estufa de aire forzado (50C durante 24 Hs).
Forrajes henificados
150-250 g
Forrajes ensilados
500-1000 g en base de humedad
Menos de 10% de humedad, temperatura ambiente. Secado al sol, o en estufa a 50C durante 8 H. Inmediatamente tomada la muestra, congelarla (-10 a 15C)
Lquido ruminal (LR)
50-75 ml
Orinas
50-75 ml
Seguir cualquiera de los siguientes mtodos: 1.- Centrifugacin a 3000 rpm/30 min; congelar sobrenadante (-10 a -15C). 2. Solucin sobresaturada de HgCl2 1 ml/100 ml LR; refrigrese. 3.- 5 ml de cido metafosfrico al 25% y 25 ml de LR en bao de hielo 30 min. Centrifugar 12000 rpm/min. Agregar al sobrenadante alcohol amlico al 1 %, 0.6 ml/10 ml LR. Refrigrese. Frasco de vidrio con tapa Agregar cualquiera de los de rosca preservadores; 5 ml/l: 1.- H2SO4 , 50%
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2.- HCl , 50% 3.- Sol. de K2Cr2O7 , 17.6 gr ms HgCl2, 6.25 g y agua destilada cbp 100 ml. Refrigrese. Sangre, plasma o suero Heces de bovino, ovino, cerdo o ave. Depende de la determinacin 150-200 g en base seca Frasco de vidrio con tapa de rosca o hule bien asegurado Frasco de vidrio, plstico o nalgeno con tapa de rosca; bolsas de polietileno. Refrigeracin (1-5C) Congelacin (-20 a -15C) Con 10% de humedad: refrigeracin o congelacin (10C) Ms de 10% de humedad, secar al sol ; secado posterior en estufa a 50C por 8-10 H.
Notas: Cuando se van a determinar minerales es preferible usar nalgeno. Cuando se va a determinar vitaminas, grado de enranciamiento, perxido o digestibilidad de la protena, preguntar al laboratorio antes de deshidratar o secar. No olvide el dato de humedad cuando se deshidrata o seca para referirlo al laboratorio. Pregunte al laboratorio antes de adicionar el preservador y no olvide indicar la cantidad empleada del mismo en la etiqueta.
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BIBLIOGRAFA 1. AOAC Oficial Method 950.02 Preparation of sample. (1996) AOAC International. 2. AOAC Official Method 965.16 Sampling of animal feed. (1996) AOAC International. 3. Behnke, K.C., Cmo mezclar alimentos de calidad: perspectiva sobre uniformidad de ingredientes. Asociacin Americana de Soya, Mxico.A.N. 104, 1992. 4. Cocks, L. V. and Van Rede. (1976). Laboratory Handbook for oil and fat analysis, 3th. ed., Academic Press, London. 5. FAO (1991). Manuales para el control de calidad de los alimentos 9. Muestreo. Organizacin de las Naciones Unidas para la Agricultura y la Alimentacin. 6. http://www.fao.org/infoods/announce/announ-e.htm 7. INIA Centro Sur-Sede Carillanca. (2005) Laboratorio de Diagnstico Nutricional de Suelos y Plantas. Informes. 8. INIA-NESTL S.A. 2003. Investigacin-demostracin en establecimiento y manejo de praderas en predios de agricultores lecheros de la provincia de Bo-Bo. Instituto de Investigaciones Agropecuarias. Centro Regional de Investigacin Quilamapu. CHILLAN. 9. INSTITUT NATIONAL DE LA RECHERCHE AGRONOMIQUE. Alimentacin de los Rumiantes. Ed. Ediciones Mundi- Prensa. Madrid. 1981. 10. National Research CounciL. Nutrient Requeriments of Dairy Cattle. 2001. 11. NRA. Reciclaje de Subproductos Animales Estadounidenses, Fuente de productos esenciales y de alta calidad. Nacional Renderers Assn., Inc. 1999 12. NOM-001 y NOM-002. Muestreo y Muestreo Instantneo. Direccin General de Normas 13. NMX-R-049-1965 14. NMX-Z-012/1,2,3-1987 15. PUBLICACIONES SERIADAS: Journal Of Dairy Science; Journal Of Animal Science, Animal Nutrition Abstracts (Serie B). 16. SARH. (1992). Manual de Tcnicas de Investigacin en Nutricin de Rumiantes. Instituto Nacional de Investigaciones Pecuarias. INIP, SARH 17. Underwood, E J (deceased) And Suttle, N. The Mineral Nutrition of Livestock, 3rd Edition Foundation for Animal Health and Welfare, Penicuik, Edinburgh, UK. 1999. 624 p.
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VIROLOGA
Mendoza Vilchis Roberto, Gutirrez Castillo, Adriana del Carmen INTRODUCCIN En el contexto del comercio internacional y nacional las exigencias para los alimentos de origen animal es que cuenten con un status sanitario favorable (ausencia de enfermedades de la Lista OIE que restringe el comercio). Por lo que la problemtica en Salud Animal debe resolverse a travs de un enfoque integral, identificando los riesgos derivados de las enfermedades limitantes de la produccin, previniendo aquellas que puedan ser transmitidas a la poblacin humana, asegurando la calidad sanitaria de los alimentos y disminuyendo el impacto al ambiente por las actividades de produccin y transformacin de los productos de origen animal, para bienestar del hombre. Lo que implica que los MVZ responsables de las unidades de produccin deben establecer programas de bioseguridad que impidan la entrada de enfermedades que afecten el status sanitario del ganado, garantizando su ausencia a travs de el monitoreo continuo. El diagnstico virolgico es una herramienta importante a utilizar tanto para garantizar el estado de salud de una unidad de produccin, as como para detectar o descartar agentes virales en caso de presentarse un problema de salud. Por tanto el conocer los mtodos y tcnicas adecuadas para la seleccin y envi de muestras para el seguimiento virolgico es de suma importancia, para que con la ayuda del laboratorio se pueda certificar el estado de salud de los animales o bien determinar el agente etiolgico involucrado con un problema de salud animal, con la finalidad de tomar las medidas pertinentes que eviten su difusin y propagacin en las poblaciones susceptibles. El rea de virologa cuenta con una gama de recursos para ser aplicados en el diagnstico los cuales son utilizados de acuerdo con el objetivo que se persigue con la muestra: 1. 2. 3. 4. Aislamiento e identificacin del agente viral. Demostracin de incrementos significativos de los ttulos de anticuerpos. Deteccin de cido nucleico viral: RT-PCR. Citologa, histopatologa, microscopa electrnica: ests tcnicas son utilizadas para examinar tejidos sospechosos infectados, con la finalidad de identificar lesiones resultado de la presencia viral o bien son utilizados para detectar virus presente en los tejidos.
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Cualquier muestra deber ser remitida con: Historia clnica. Debe colocarse en el exterior de la caja en sobre cerrado. Se deben incluir los siguientes datos: Nombre, telfono y direccin del propietario. Enfermedad sospechosa. Pruebas solicitadas. Especies animales en la explotacin y tiempo que llevan en la misma. Es muy importante sealar si ha habido alguna nueva incorporacin. Fecha de los primeros sntomas. Distribucin de la enfermedad por la explotacin. Nmero de bajas y de animales con sintomatologa. Tipo de alojamiento y sistema productivo. Medicacin y vacunaciones administradas en los ltimos das. Listado de las muestras remitidas.
Una vez recogidas y rotuladas las muestras, estas deben ser mantenidas a 4 C, siempre que el anlisis de laboratorio se efecte en menos de 72 horas, en el caso que anlisis se realice despus de las 72 horas, es mejor congelarlas a - 40 C y transportarlas en congelacin. Se debe utilizar un frasco distinto para cada animal y con cierre hermtico, tubos al vaco para la sangre o jeringas desechables de 20 ml y aguja apropiada para la edad del animal.
1. DETECCIN VIRAL: Existen diferentes tcnicas disponibles para la deteccin del virus o de sus antgenos virales (Aislamiento viral, inmunoflorescencia directa, inmunoperoxidasa directa, ELISA de captura de antgeno).
Aislamiento viral El aislamiento en cultivos celulares est considerado en la actualidad como la tcnica de referencia obligada en zonas exentas de la enfermedad o como tcnica confirmatoria en caso de dudas. Este mtodo est basado en la capacidad de multiplicarse de algunos virus en una la lnea celular conocida. Sobre esta lnea, se coloca un macerado extrado de los rganos sospechosos, lo que permitir ver si la muestra es positiva, ya que al replicarse el virus en las clulas se puede observar que el crecimiento este y el efecto que produce. Su presencia debe ponerse de manifiesto mediante un mtodo de marcado inmunolgico como la inmunoperoxidasa o fluorescena. Es una tcnica muy sensible, ya que aunque exista una pequea cantidad de partculas virales infecciosas podr multiplicarse en la lnea celular, y muy especfica gracias a los anticuerpos monoclonales. Presenta como nico problema que es muy laboriosa y lenta, pudiendo llevar entre 3 a 10 das.
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Especmenes para aislamiento virolgico Los especmenes se colectan preferentemente entre el tercero y sptimo da despus de iniciada la enfermedad. Los especmenes colectados de animales muertos se toman lo ms aspticamente posible y de ser posible despus de que ocurra la muerte. El aislamiento viral a partir de msculo, hgado y rin es poco comn pero se puede intentar. Los especmenes deben ser enviados a 4 C (hielo) si el traslado de la muestra es corto, es decir que tarden en llegar al laboratorio de 6 a 12 hrs., los especmenes que tarden en llegar ms tiempo se conservan a -70 C. La posibilidad de aislamiento viral depende crticamente del conocimiento, cuidado y atencin del MVZ para colectar la muestra, la posibilidad de xito de identificar el virus depende en gran medida de los signos clnicos y el conocimiento de la patognesis del agente involucrado. Recoleccin de sangre para aislamiento virolgico. La sangre es utilizada comnmente para pruebas serolgicas y para el aislamiento virolgico a partir del suero o de los componentes celulares de la sangre, cuando la recoleccin se hace en la fase aguda de la enfermedad en los 3 primeros das y no ms de 7. Material: Sistema vacutainer o jeringa, tubos de ensaye con tapn, con alcohol y algodn. Tcnica: Colectar 10 ml de sangre, conservarse a una temperatura de 4C. Recomendaciones: - No congelar suero junto con sangre, pues ocasiona hemlisis. Muestras para aislamiento virolgico a partir de hisopados. Los hisopados son obtenidos de mucosas oculares, nasales, vaginales y rectales. Material: hisopos estriles en tubos de ensayo con capuchn amarrado con hilo. Tubo con medio de Hanks o solucin fisiolgica. Tcnica: se frota el hisopo en la superficie a muestrear, luego se diluye el material colectado en tubo con el medio de Hanks o solucin fisiolgica y remitido a 4C. El hisopo debe sumergirse en una solucin desinfectante para luego ser incinerado inmediatamente despus. Muestras para aislamiento virolgico a partir de contenido intestinal. En animales vivos: Material: bolsa de polietileno. Tcnica: Colocar la mano dentro de la bolsa y as, dentro del recto, tomar la muestra fecal, cerrando la mano para retirarla del recto, invertir la bolsa, se anuda y se identifica. En animales muertos: Material: hilo, frasco estril con tapa hermtica. Tcnica: ligar el intestino en dos sectores separados a una distancia de 10 cm y cortar por fuera de la ligadura, colocarlo dentro del frasco y enviarse a 4C. Muestras para aislamiento virolgico a partir de lquido cefalorraqudeo. Material: jeringa, aguja de 60x20 y tapa protectora de la aguja en condiciones de esterilidad. Tcnica: Desinfectar y depilar la zona atlanto-occipital introducir la aguja en un ngulo de 45, extraer lquido de la cisterna magna. Enviar el lquido en tubo estril a -70 C ya que los virus en este medio son extremadamente lbiles.
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Muestras para aislamiento viral de lquido de vesculas. Material: jeringa y tubo de ensayo con tapn estril. Tcnica: extraer lquido de las vesculas y colocarlo en el tubo. Observaciones: Se envan trozos de epitelio de las vesculas en glicerina al 5% en agua destilada. Muestras para aislamiento virolgico de orina. En animal vivo. Material: sonda plstica rgida; para machos de 5 mm de dimetro y en hembras de 1 cm de dimetro, vaselina y tubo estril. Tcnica: lubricar la sonda en su parte exterior con vaselina, introducir la sonda por orificio uretral, colectar la orina en tubo. En animal muerto. Material: jeringa nueva estril. Tcnica: extraer la orina directamente del cuerpo de la vejiga y enviar las muestras a 4C. Muestras para aislamiento virolgico de lavado prepucial y uterino. Material: sonda, jeringa, recipiente estril con tapa hermtica medio Erle o Hanks con antibitico: 500 UI/ml de penicilina, 500 mg/ml de estreptomicina y 200 UI/ml de nistatina, con la finalidad de incrementar la tasa de aislamiento viral de las muestras. Tcnica: Lavado prepucial: introducir la sonda en el prepucio, aplicando la mano en el orificio prepucial para cerrarlo y colocar 250 mL del medio en la cavidad prepucial y finalmente extraer el lquido y colocndolo en el frasco. Lavado uterino: introducir la sonda por el orificio uterino externo a travs de ella colocar 500 cc de medio en la cavidad uterina, extraer por succin y colocarlo en el frasco.
Inmunofluorescencia (FD) e Inmunoperoxidasa Directa (IPD). Consisten en la deteccin de antgenos virales en cortes histolgicos de rganos sospechosos mediante la tincin con un conjugado policlonal (contra todas las protenas del virus, no permite la diferenciacin) o monoclonal (frente a una protena, permite la diferenciacin) marcado con isotiocianato de fluorescena (IFD) o peroxidasa (IPD). La ventaja de esta tcnica es su gran rapidez (dos a tres horas); el inconveniente es que no se puede realizar en un gran nmero de muestras. Su utilizacin est recomendada para diagnstico rpido en zonas ya infectadas o con altas sospechas de estar infectadas, o cuando el nmero de muestras no sea muy elevado. Elisa de captura: ELISA de captura para la deteccin de los antgenos virales a partir de rganos, leucocitos sanguneos y suero de animales sospechosos se ha utilizado recientemente con aceptable xito, dado el nivel de correlacin con el aislamiento viral sobre todo a partir de los 5 a 6 das post infeccin. La tcnica est basada en un sistema ELISA sandwich en el que se emplean anticuerpos monoclonales (AcM) especficos para capturar y revelar la captacin de los antgenos virales. Esta tcnica a diferencia de la anterior, la ventaja de ser utilizada para gran nmero de muestras, pues las diferentes etapas de la tcnica ELISA, incluyendo la lectura, estn automatizadas. El tiempo total de realizacin de este mtodo es de 4 a 18 horas, mayor que en la IFD e IPD, pero mucho menor que en el aislamiento vrico. La tcnica es recomendable utilizarla en zonas ya afectadas o con alta probabilidad de ser infectada as como cuando el nmero de muestras sea muy elevado.
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2. SEROLOGA: Sirve para monitorear ttulos de anticuerpos de los programas de vacunacin, pero tambin sirve para mostrar o no el contacto con algn agente viral por la ausencia o por el incremento de ttulos de anticuerpos especficos. En este caso las tcnicas ms utilizadas son la seroneutralizacin, la tcnica de ELISA e inhibicin de la hemoaglutinacin. El uso de estas tcnicas se recomienda para comprobar la presencia o no de zonas libres y no vacunadas, pero no cuando se sospecha de una infeccin reciente. En este caso se deben emplear adems tcnicas de deteccin viral. Para la interpretacin serolgica de las enfermedades virales es importante disponer de un antecedente de los ttulos de anticuerpos. Ya que el diagnstico se basa en demostrar anticuerpos especficos contra un virus en dos muestras de suero (muestras "pareadas") de un animal, de una misma poblacin obtenidas a determinado intervalo. La primera debera tomarse cuando se detecta la enfermedad (fase sintomtica), antes de que se formen anticuerpos, y la segunda debera obtenerse a las 3 semanas posteriores (fase convaleciente). Slo en la muestra en la que el ttulo de anticuerpos aumenta significativamente entre muestreos (ms tres diluciones del suero), la seroconversin tiene valor diagnstico. Frecuentemente se remite al laboratorio una muestra de suero, provocando que el resultado tenga un valor parcial en resultado diagnstico. Material y Mtodo: Material: jeringa, tubo de ensayo, tapn de goma, torundas de algodn con alcohol. Tcnica: desinfectar el rea de la vena a puncionar, extraer la sangre, colocar la sangre en el tubo de ensayo dejar reposar 2 hrs. a 22 23 C hasta coagular y luego a 4 C hasta que el cogulo se retraiga, separar el suero vertindolo en otro tubo, el suero es clarificado por centrifugacin durante 20 minutos y se congela a -20C hasta su utilizacin. Para el examen serolgico es necesario enviar dos muestras del mismo animal la primera es extrada al principio de la enfermedad y la segunda dos o tres semanas despus. ELISA
Los mtodos ms utilizados son los ELISAs de bloqueo, de competicin o indirectos, debiendo detectar anticuerpos del virus en estudio pero a su vez evitar reacciones cruzadas con otros. Como antgeno emplean protenas virales recombinantes o bien cepas de virus recomendadas por los Laboratorios de Referencia. ELISA de Competicin. Se trata de un ELISA de captura-competicin que emplea dos anticuerpos monoclonales (AcM) especficos frente a dos eptopos diferentes de la protena estructural E2, uno de ellos tapizando las placas (anticuerpo de captura) y el otro conjugado con peroxidasa (anticuerpo detector). Como antgeno utiliza una protena recombinante. ELISA de Bloqueo. Este tipo de ELISA emplea placas tapizadas con antgeno; los anticuerpos presentes en la muestra bloquearan la posibilidad de unin de un AcM conjugado con peroxidasa especfico frente a la protena que se aade en un paso posterior. En caso de que la muestra sea negativa el antgeno permanecer libre, por lo que podr unirse a l el AcM conjugado con peroxidasa, unin que se detectar mediante el color producido debido a la reaccin de la peroxidasa con el substrato aadido a continuacin. Otros ELISAs de bloqueo no emplean ni AcM ni protenas recombinantes. Las placas se encuentran sensibilizadas con antgeno del virus purificado e inactivado, y como antisuero utilizan un suero hiperinmune anti-virus producido en conejo o cerdo y conjugado con peroxidasa.
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ELISA Indirecto. Las placas de se encuentran tapizadas con antgeno viral, y tras la incubacin con el suero a testar, la reaccin se pone de manifiesto utilizando como conjugado protena A-peroxidasa. El gran inconveniente de los tres mtodos descritos es que algunos Kits comerciales no permiten diferenciar los anticuerpos de enfermedad de los anticuerpos vacunales, de las vacunas actualmente comercializadas en la actualidad. SERONEUTRALIZACIN:
El mtodo de seroneutralizacin (SN) consiste en determinar la capacidad que tiene el suero objeto de estudio de neutralizar el efecto de un virus sobre la lnea celular sensible (ejemplo PK 15). Para ello se utilizan diferentes diluciones del suero problema y se comparan sus resultados frente a un suero control. Las tcnicas de enzimoinmunoensayo ELISA, para la deteccin de anticuerpos especficos, que se utilizan hoy en da, son tcnicas rpidas, sensibles, especficas, de fcil ejecucin y permiten analizar un gran nmero de muestras a la vez, por lo que son las utilizadas habitualmente en los rastreos epidemiolgicos, sirvindonos de las tcnicas de SN para la confirmacin de aquellos sueros que han resultado positivos o dudosos en la tcnica de ELISA. 3. DETECCIN DEL CIDO NUCLEICO VIRAL: La tcnica PCR para la deteccin de cidos nucleicos virales resulta tremendamente prctica, rpida y eficaz en el diagnstico de gran nmero de enfermedades infecciosas. Consiste en la deteccin de un pequeo fragmento especfico cido ribonucleico viral mediante la amplificacin de la reaccin en cadena de la polimerasa. De manera que se puede hacer un diagnstico diferencial de gran sensibilidad y especificidad. Adems, es una tcnica relativamente rpida (6 horas) y econmica. Sin embargo tiene el inconveniente de la dificultad en el manejo de un nmero elevado de muestras, si bien es posible trabajar con "pools" de muestras en lugar de muestras individuales, sin prdida significativa de sensibilidad. 4. HISTOLOGA Y CITOLOGA: Se utiliza para examinar tejidos sospechosos infectados, con la finalidad de identificar lesiones y demostrar la presencia de agentes virales: . RECOLECCIN DE MUESTRAS Diagnstico virolgico por citologa e histopatologa e inmunofluorescencia microcopia electrnica: Ests tcnicas son utilizadas para efectuar el diagnstico el mismo da o al siguiente, el inconveniente es que no siempre se observan las lesiones, o bien la cantidad de virus en la muestra no es suficiente para demostrar la presencia del agente en los tejidos por la tcnica de inmunofluorescencia. Frotis. Est tcnica es utilizada para el diagnstico de distemper canino despus de raspar la cornea, mucosa bronquial o vesical, se fija y se tie con hematoxilina y eosina. Material: portaobjetos y alcohol. Tcnica: colocar una gota del material sospechoso en un extremo de un portaobjeto, apoyarlo sobre otro portaobjeto en un ngulo de 45 y deslizarlo hacia atrs, secar al aire, fijar con alcohol por 10 minutos, secar y envolver en papel para ser remitido al laboratorio.
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Improntas de rganos. Esta tcnica es utilizada para hacer el diagnstico a partir de biopsias o muestras de necropsias. Material: bistur, portaobjetos, alcohol, papel absorbente. Tcnica: despus de cortar un trozo de rgano, se apoya una de las caras el nmero de veces necesario hasta retirar la sangre y otros lquidos en papel absorbente y posterior a esto sobre el portaobjetos, se fija por 10 minutos en alcohol y se seca. Histopatologa de biopsias o muestras de necropsias: MATERIAL Y MTODOS Material: instrumental estril. Frascos estriles con tapa. Frasco con formol bufferado. Tcnica para la tincin de inmunoperoxidasa. Se colectan tejidos frescos de 1 cm. cbico, utilizando instrumental estril. En el caso de sistema nervioso deber enviarse mdula cervical y lumbar, corteza cerebral temporal y cerebelo. En casos de enfermedades respiratorias incluir pulmn y trquea. Las muestras se enviarn en refrigeracin. Para la tcnica de histopatologa los tejidos sern enviados en frascos con formol bufferado en una proporcin de 1 en 30 volmenes. Para el caso del estudio por microscopa electrnica igual se enva tejido de 1 cm3 en glutaraldehdo al 3% en una proporcin de 1 en 30 volmenes. VENTAJAS Y DESVENTAJAS DE LOS MTODOS DIAGNSTICO VIROLGICOS MTODO DE DIAGNSTICO Aislamiento viral VENTAJAS Permite estudios futuros del agente Disponible DESVENTAJAS
Consume tiempo, no siempre se logra el aislamiento Seleccionar el tipo celular Observacin directa. Rpido detecta virus que son Se requiere equipamiento Microscopio electrnico Difciles de aislar o que no limitado a pocas infecciones Microscopio inmunoelctrico son viables virales. Elisa Rpida y sensitiva - No es aplicable a todos los (identificacin serolgica) Kits diagnsticos virus. - La interpretacin puede dificultarse. - Pruebas de tratamiento mdico. PCR Rpida sensitiva Potencialmente aplicada a todos los virus Puede no estar fcilmente disponible Histopatologa Rpido, fcil, disponible Limitado a algunas infecciones virales Conversin de anticuerpos Es cuando en enfermedades Interpretacin puede que se comportan como dificultarse (suero en fase brote aguda y convaleciente) 68
BIBLIOGRAFIA: 1. Balows, Albert; Hauster William J.; Herman, Kenneth; Isemberg, Henry D.; Shandymy, Jean (1991) Manual of Clinical Microbiology 5a Ed. Library of Congress., U.S.A. 2. Coffin, D.L. (1987) Laboratorio Clnico en Medicina Veterinaria. La Prensa Mdica Mexicana, Mxico. 3. Doxey, D.L. (1987) Patologa Clnica y Procedimientos de Diagnstico en Veterinaria. El Manual Moderno, Mxico. 4. Fenner, Frank J.; Gibbs, Paul J.; Murphy, Frederik A.; Rott, Rudolf; Studdert, Michel J.; Write, David O. (1993) Veterinary Virology. 2a. Ed. Academic Press, Inc., U.S.A. 5. Medway, W.; Prier, J.E.; Wilkinson, J.S. (1986) Patologa Clnica Veterinaria. UTEHA, Mxico.
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ESTUDIO PATOLOGICO: HISTOPATOLOGA

Velzquez Ordez Valente Gutirrez del Castillo Adriana del Carmen Zamora Espinosa, Jos Luis Daz Zarco Soledad CUERPO ACADEMICO EN SALUD ANIMAL CUERPO ACADEMICO EN PATOGENESIS MICROBIANA FMVZ-UAEM. INTRODUCCIN La histopatologa es una tcnica empleada en el estudio patolgico, la cual permite identificar microscpicamente las alteraciones presentes en los tejidos derivadas de algn proceso patolgico detectado en el individuo. Las muestras para realizar el estudio histopatolgico, se obtienen de los diferentes rganos y tejidos obtenidos al efectuar el estudio posmortem en el cadver de un animal. Tambin se pueden obtener muestras de un animal vivo a partir de una biopsia, que es una pequea porciones de tejido, a partir de un sitio lesin. Este procedimiento se efecta mediante un mtodo quirrgico que al incidir permite obtener el tejido por un corte o bien a partir de una puncin exploratoria realizada mediante una aguja de centsis con un dimetro entre 3 a 8 mm dependiendo del tipo de estudio requerido. El procesamiento de tejidos para elaborar las preparaciones histolgicas, que permitan el examen microscpico del tejido, se realizan mediante dos procedimientos; el de inclusin en parafina con la que se obtienen laminillas de tejidos con cortes fijos de mayor duracin, aunque su proceso requiere de ms tiempo. Los cortes por congelacin tienen entre otras ventajas el permitir un diagnostico transquirrgico rpido, adems de la posible aplicacin de otras tcnicas de estudio; histoqumicas, inmunolgicas y moleculares, sin embargo la vida media til de estas laminillas es menor. La interpretacin de la histologa patolgica la realiza el patlogo, el cual emite el diagnostico histopatolgico de las lesiones microscpicas observadas sobre los tejidos estudiados. Confirmando o rectificando los hallazgos microscpicos, enunciados en el diagnostico anatomopatolgico emitido despus de efectuar el estudio posmortem, apoyado de la los antecedentes referidos en la historia clnica. MANEJO Y DISPOSICIN SANITARIA DEL CADAVER El cadver de los animales, constituye una fuente valiosa de informacin patolgica, que se obtiene al efectuar el realizar el estudio posmortem y el estudio histopatolgico. Por lo tanto es indispensable manejar de manera adecuada el cadver de los animales. No solamente por razones de bioseguridad con las cuales se disminuye el riesgo de diseminacin de las enfermedades la contaminacin del entorno ambiental por una deposicin inadecuada de los cadveres. Si no tambin por el procurar una conservacin del animal muerto, para evitar los cambios posmortem, relacionados con la autolisis y putrefaccin de los tejidos cambiando su integridad, este motivo impide concluir favorablemente el estudio de caso debido a las modificaciones de la apariencia histolgica. Para efectuar el estudio posmortem se procura remitir preferentemente el animal, bajo condiciones de refrigeracin generalmente inmediatamente despus de haber ocurrido la muerte, y en un lapso de tiempo no mayor no mayor de 12 hrs. en mamferos, y de no ms de 3 hrs. en las aves.
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Considerado este tiempo transcurrido entre el deceso del animal y su entrega a la sala de necropsias, con esto contribuimos a asegurar una seleccin adecuada de tejidos para el diagnostico patolgico. Lo anterior denota la importancia que tiene el manejo adecuado del cadver cuando este se destina para estudio de caso como muestra para el laboratorio de diagnstico en patologa animal, razn por la que se deben de reconocer los estadios de la rigidez cadavrica (rigor mortis) y los posibles cambios posmortem observados en el animal. Debemos sealar que algunas condiciones clnicas predominantes antes de haber ocurrido la muerte del animal (bacteriemia, procesos febriles, stress, deshidratacin y toxemia), contribuyen a acentuar la autolisis del cadver. De igual forma el incremento en la temperatura ambiental y la posible exposicin del animal muerto a los rayos solares aceleran los cambios posmortem y su invasin bacteriana por microorganismos saprofitos, propiciando la putrefaccin y posteriormente la licuefaccin del cadver, esta ltima fase se incrementa por la presencia de larvas de insectos necrfagos desarrolladas a partir de los huevecillos depositados en orificios corporales y lesiones superficiales de la piel. Los anteriores cambios no permiten realizar el estudio patolgico, salvo en algunas ocasiones bajo proceso legal y de bioconservacin de la fauna, se requiere una aproximacin mediante mtodos de patologa forense, complementados con tcnicas moleculares, toxicolgicas, bioqumicas y de microscopa especiales. Las cuales permiten identificar la especie animal, su morfometra y las posibles causas etolgicas de la muerte. En el caso de animales con avanzados cambios posmortem no se emplearan para el estudio patolgico y ser destinado, a una disposicin sanitaria mediante la incineracin con el equipo aprobado por las normas ecolgicas y sanitarias para tal efecto. Tambin es posible disponer del cadver y sus restos con otros procedimientos tcnicos sanitarios a proceder bajo condiciones de campo. OBTENCIN DE LAS MUESTRAS PARA HISTOPATOLOGA Durante la necropsia se observan las cavidades, la situacin de los rganos y su relacin anatmica. Posteriormente estos son extrados y aprecian posibles cambios externos en; tamao, forma, color, consistencia, volumen, peso y eventualmente alteraciones en su olor. Se inspecciona su apariencia superficial, e identifican las reas afectadas, las cuales son expresadas en porcentaje, la presencia de cavidades, masas y artefactos en el rgano daado. Para revisar la apariencia interna de los rganos, estos se palpan con suavidad y se seccionan longitudinalmente en pequeos trozos para apreciar lesiones profundas, cambios en apariencia y consistencia. Al efectuar las incisiones se emplean; cuchillos limpios y afilados, pinzas sin dientes, tijeras y bistur segn sea el caso. Al obtener las muestras de los tejidos destinados para el estudio histopatolgico, se procuran porciones de tejido afectados y otras sin cambios patolgicos aparentes, de aspecto aparentemente normal. En los casos en los que no es posible apreciar posibles cambios macroscpicos se envan muestras de los diferentes tejidos. La descripcin sistemtica, cuidadosa y objetiva las alteraciones en los rganos y tejidos, sin omitir ningn detalle significativo en el protocolo de necropsia, permite establecer una relacin macroscpica y microscpica entre las reas afectadas, en su caso determinar su relacin con la nosologa del caso, descrita en el resumen de la historia clnica.
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De pasar por alto las lesiones macroscpicas o seleccionar muestras inadecuadas para estudio, las lesiones, pueden no corresponder con el diagnstico emitido en funcin de que el diagnostico histopatolgico se basa en los hallazgos histolgicos ser exclusivamente de las lesiones que se identifiquen en el corte y que no necesariamente tienen relacin con el problema poblacional o de la causa de muerte, por carecer de elementos apropiados para emitir un diagnstico integral. MANEJO Y CONSERVACIN DE LA MUESTRA El envo de muestras para el estudio histopatolgico se efecta a partir de la remisin del animal completo, rganos conservados en una solucin de formalina amortiguada y biopsias de tejidos. En la obtencin y transporte de muestras se debe evitar colocar los tejidos en solucin salina antes del proceso de fijacin, debido a que se propicia la autolisis. De la misma manera se evitara la inclusin de tejidos en recipientes conteniendo alcohol etlico y otras soluciones no aptas para el proceso de fijacin de tejidos, las muestras para histopatologa no deben mantenerse en congelacin. PROCESO DE FIJACIN DE TEJIDOS La fijacin adems de preservar los tejidos detiene la autolisis y conserva la integridad tisular, al endurecerse ligeramente de tal forma que las estructuras titulares no se encogen y fragmentan permaneciendo en un estado cercano al in vivo. Adems de permitir que el tejido permanezca sin cambios luego de subsecuentes tratamientos durante el procesamiento histolgico de los tejidos. La fijacin puede lograrse por inmersin o por perfusin, misma que se realiza en forma rpida, ya que cualquier demora favorece que el tejido, se seque y acelere la autolisis del mismo. A tal efecto las muestras se colectan en un frasco de boca ancha, con agente fijador. Se recomienda colocar primero el fijador en el frasco y despus los tejidos para evitar que stos se adhieran a las paredes del recipiente, de lo contrario se puede interferir en la accin del fijador sobre el tejido. Las muestras se depositan inmediatamente en el agente fijador y deben permanecer por 24 hrs., si se emplea la solucin de formalina amortiguada, para lograr una correcta fijacin, cuyo objetivo es preservar la morfologa celular. Adems de facilitar el corte e inclusin de los tejidos en la rutina del procesamiento histolgico, as como el conservar los tejidos para estudios posteriores de referencia en patologa por tiempo indefinido, excepto si se requieren para el empleo de tcnicas de inmunohistoqumica. Se hace necesario destacar que la penetracin del fijador en el tejido es lenta (se sabe que la penetracin del fijador en el tejido es de aproximadamente 1 mm por hora) razn por la cual los cortes no deben sobrepasar mas de los 3 a 6 mm de grosor preferentemente. Es recomendable que cuando se remitan tejidos para histopatologa estos tengan una superficie no mayor de 1 cm. x 1 cm. x 5 cm. En el caso de muestras de vsceras no deben exceder ms de 2 cm. cuadrados de superficie y de 3 a 4 mm de grosor, efectuando un corte en sentido perpendicular a la cpsula del rgano. Cuando se obtiene una muestra de encfalo este se prefiere que de las reas predeterminadas de inters en el caso, se cortan en fresco transversalmente en delgadas rodajas de aproximadamente 0.6 a 1 cm. de espesor; utilizando un cuchillo largo y bien afilado para que el corte sea rpido y limpio, evitando su maceracin. Bajo este procedimiento despus de una hora el tejido estar lo suficientemente endurecido para resistir la manipulacin posterior. Cuando se toman muestras demasiado gruesas se fijarn exclusivamente las partes perifricas mientras que en el centro, donde no puede penetrar el fijador, los procesos autolticos avanzarn sobre el tejido.
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Si se cortan pedazos de tejido, pasados 20 a 30 min. Despus de concluir el proceso de necropsia, la muestra se puede cortase nuevamente despus de que los tejidos se han endurecido ligeramente, estos se cortan en trozos ms pequeos, para ser colocados nuevamente en frascos para su fijacin ulterior, sin el peligro de que se deformen. Los cortes frescos muy delgados tienden a retraerse, cuando se introducen en el fijador lo que dificulta su corte fino cuando se incluyen en los bloques de parafina; el excesivo encogimiento o abultado puede alterar las relaciones biplanares de los componentes tisulares. Los tejidos que flotan en la superficie, como el tejido adiposo y el pulmn, se procura envolver estos en gasa o algodn; una inclusin incompleta con frecuencia producir prdida del rea de un tejido durante el proceso de corte. El tejido nervioso se altera rpidamente despus de la muerte, lo que puede dificultar el distinguir estos cambios de lesiones degenerativas anteriores. Su precoz fijacin es an ms importante que para otros tejidos; es esencial que tejidos como cerebro o mdula sea sean muestreados antes de transcurrida una hora de la muerte, de lo contrario se dificulta la interpretacin histopatolgica. Para el caso de intestino se recomienda ligar en los extremos antes de cortar el segmento que se enve y con una jeringa se perfunde el fijador, evitando distender demasiado la vscera, posteriormente, se coloca en el frasco.
AGENTES FIJADORES DE L TEJIDO La formalina neutra al 10% pH 7.2 (formol 37-40 %, 100 ml; agua destilada 900 ml; fosfato monobsico, 4g; y fosfato difsico anhidro de sodio, 6.5 g), en tanto que en algunos laboratorios prefieren la solucin a un pH 7.4 para fijar los tejidos, se deben llenar completamente los frascos y no sobrepasar en unas 9 veces el volumen de la pieza (proporcin 1:9, tejido: formol). Los recipientes para las muestras deben ser de boca ancha para que puedan salir ntegros y fcilmente una vez fijados. Los tejidos fijados en formalina pueden ser tratados de nuevo con otro fijador permitiendo as la posibilidad de hacer microscopa electrnica. Muchas reacciones inmunohistoqumicas pueden tener efecto en tejidos previamente fijados en formalina. El glutaraldehdo penetra ms lentamente que el formaldehdo y es ms recomendable en microscopa electrnica y en histoqumica enzimtica. Pequeos bloques de tejido 1 - 2 mm en tamao, se fijan bien a temperatura bajas, 1 a 4 C, y muestras de tejidos fijados pueden almacenarse en una solucin estabilizadora por muchos meses. La penetracin lenta, la baja temperatura requerida y la necesidad de un medio de almacenamiento impiden el uso de este fijador en la histotecnologa diagnstica de rutina. El cido actico nunca se usa solo, sino en combinacin con otros fijadores que causen contraccin tisular. En cido actico penetra rpida y completamente pero lisa los eritrocitos. La acetona fra se prefiere en estudios histoqumicos para enzimas, especialmente lipasas y fosfatasas. La acetona no se usa como un fijador de rutina por causar distorsin nuclear y compresin del citoplasma; adems no preserva el glucgeno.
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Cuando se usan fijadores de Zenker o Bouin, una vez que han permanecido los tejidos 24 hrs. para su fijacin, deben permanecer en alcohol por 3 hrs. en cada uno de los alcoholes al 50, 60 y 70%, para retirar la coloracin amarilla, se prefiere agitar para favorecer esto, lavarse con agua y luego colocarse en alcohol al 80 %. No se debe utilizar cido fnico, antispticos o soluciones alcohlicas de uso quirrgico como preservantes. MANEJO DEL TEJIDO NERVIOSO Para el diagnstico de rabia se requiere el encfalo y en determinadas circunstancias las glndulas salivales, la obtencin de la muestra la debe realizar personal especializado cuyos ttulos de anticuerpos antirrbicos garanticen que no existe riesgo de adquirir la enfermedad bajo la exposicin. En caso contrario se debe enviar el cadver dentro de un costal de plstico y cubierto con hielo, si esto no es posible se decapita el animal y la cabeza se envuelve en hojas de peridico para ser depositado en una bolsa doble de plstico y esta a su vez en un recipiente hermtico que contenga hielo suficiente. El envo de las muestras debe ser lo ms rpido posible en condiciones de refrigeracin, congelacin o conservadas en una solucin de glicerina al 50% en solucin salina fisiolgica. Cuando se envan las muestras, en la parte externa del paquete se coloca una etiqueta con el SIMBOLO DE RIESGO BIOLOGICO y se anota una leyenda que diga MATERIAL BIOLGICO DE FCIL DESCOMPOSICIN, MUESTRA SOSPECHOSA A RABIA y entrega inmediata al laboratorio para su procesamiento. Es importante anexar los datos completos y exactos del propietario, nombre completo, direccin con algn punto de referencia (evitar el domicilio conocido), su telfono, cdigo postal, personas agredidas, personas en contacto. Datos del animal; sintomatologa, si fue vacunado, cuando, tipo de vacuna, si existen ms casos en la regin, etc. Para enfermedades en programas de campaas nacionales como: la fiebre porcina clsica las muestras de histopatologa slo podrn utilizarse como apoyo y no como prueba definitiva para emitir un diagnstico final. Las muestras recomendadas son: mitad de encfalo, tonsila, ganglios linfticos, rin, hgado y bazo (Mnimo 1 cm. de ancho por 2 cm. de largo y 1 cm. de espesor). Y parte distal del leon no ms de 4 horas postmortem refrigerada o en congelacin. En la Enfermedad de Aujeszky se enviarn muestras de tonsila, encfalo, pulmn, bazo y ganglio de Gaser (ubicacin). Para el programa de vigilancia de Neuropatas en bovinos en Mxico en el que se efecta el diagnostico diferencial entre los diferentes padecimientos neurolgicos en la especie animal y dentro de ellos el de la Encefalopata Espongiforme Bovina considerada como extica en nuestro pas. Para ello se recomiendan pednculos cerebrales, puente y mdula oblonga. As mismo estas porciones de tejido nervioso son remitidas para efectuar el diagnostico de Listeriosis y Scrapie en los ovinos. En el caso de un diagnstico presuntivo de Distemper canino, se enva el cerebro completo.
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BIBLIOGRAFA Comit de Enfermedades Exticas de la Asociacin de Sanidad Animal de los Estados Unidos (1986). Enfermedades Exticas de los animales, su prevencin, diagnstico y control. Mxico. De Aluja, S.A.; Casas, F.C. (2002): Tcnicas de necropsias en animales domsticos. El Manual Moderno, Mxico. Doxey, D.L. (1987): Patologa Clnica y Procedimientos de Diagnstico en Veterinaria. El Manual Moderno, Mxico. Flores, T.R.; Hoffmann, E.O.; Velasquez, R.M. (1993): Manual de Histotecnologa. junio 28-julio 2, 1993. Gzquez, O.A. (1988): La Necropsia en los Mamferos Domsticos. Interamericana Mc Graw-Hill. Madrid, Espaa. Goldschmidt, M. H.; Shofer, F. S. (1992): Skin tumors of the dog and cat. Pergamon press, USA. Gonzlez, S.D.; Valero, E. G.; Cmara, M.A. (1994): Toma y envo de muestras para el diagnstico de rabia. Desplegable Tcnico No. 18, Instituto Nacional de Investigaciones Forestales y Agropecuarias, Mxico. Gross, T. L.; Ihrke, P. J.; Walder, E. J. (1992): Veterinary dermatopathology. Mosby Year book, USA. Kummel, B. A. (1992): Small animal dermathology. Mosby Wolfe, Mxico. Paredes, H. E., Cubillos, G. V. (1995): Muestras para examen Histopatolgico. Manual de Necropsia en animales domsticos y envo de muestras a laboratorio. Instituto de Patologa Animal, Facultad de Ciencias Veterinarias de la Universidad Austral de Chile., 47-48. Prophet, E. B.; Mills, B.; Arrington, J.B.; Sobin, L.H. (1995): Mtodos Histotecnolgicos. Instituto de Patologa de las Fuerzas Armadas de los Estados Unidos de Amrica (AFIP). Washington, D.C. Secretara de Agricultura y Recursos Hidrulicos. (s/f): Recoleccin, Manejo, Identificacin y Envos de Muestras. RENALDI, Mxico. Secretara de Agricultura y Recursos Hidrulicos. (1994): NORMA Oficial Mexicana NOM-007-ZOO-1994, Campaa Nacional Contra la Enfermedad de Aujeszky. Diario Oficial de la Federacin, 19 de septiembre de 1994. Secretara de Agricultura y Recursos Hidrulicos. (1995): NORMA Oficial Mexicana de emergencia NOM-EM012-ZOO-1994, Campaa Nacional contra Fiebre Porcina Clsica. Diario Oficial de la Federacin, 25 de enero de 1995. Secretara de Agricultura Ganadera y Desarrollo Rural. (1995): Manual de Actualizacin Tcnica para la Aprobacin de Mdicos Veterinarios en el Control y Erradicacin de la Fiebre Porcina Clsica. Colegio Nacional de Mdicos Veterinarios Zootecnistas de Mxico. Williams, J. B. (1986): Histologa Veterinaria Aplicada. El Manual Moderno, Mxico. William, J. B.; Linda, M. W. (1991): Atlas Color de Histologa Veterinaria. Intermdica. Buenos Aires, Argentina.
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CONSERVACIN Y ENVI DE MUESTRAS PARA PRUEBAS MOLECULARES

Dr. Simn Martnez Castaeda.
INTRODUCCIN La finalidad de este trabajo es presentar que los cidos nucleicos (DNA y RNA) pueden ser usados para el diagnstico en diversas reas como la Virologa bacteriologa micologa, gentica, oncologa medicina forense entre otras. Y que el xito de la utilizacin de estas molculas en el diagnstico depende en gran medida de la forma en la que se puede obtener y preservar muestras de DNA o RNA. El DNA es usado ms comnmente para propsitos de diagnstico que el RNA, debido a que la primera es una molcula ms estable. El diagnstico basado en DNA toma ventaja de que dicha molcula es especfica de cada organismo y microorganismo, de esta manera por ejemplo en el campo de la microbiologa nosotros podemos identificar si la infeccin en un animal ha sido producida por un virus o por una bacteria e incluso se puede establecer la cepa o especie que ha producido dicha infeccin. En gentica se pueden establecer registros genealgicos de individuos ya que el genoma de cada uno es similar a una huella dactilar, esto quiere decir que el DNA es especifico para cada persona y en medicina genmica donde las enfermedades son producidas principalmente por mutaciones en los genes que codifican para una protena con una funcin especfica, se puede identificar aquellos genes que poseen las mutaciones y diferenciarlos de los genes normales. Otra ventaja de la utilizacin del DNA en el diagnstico de enfermedades es el hecho de que los distintos mtodos y tecnologas para el anlisis de esta molcula es prcticamente el mismo para cualquier especie de donde se haya obtenido el DNA.
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Tipos de DNA: Para nuestros propsitos aqu, hay dos tipos de ADN por el que estar preocupado. El primero es el DNA nuclear de las clulas. El segundo tipo de DNA es el DNA mitocondrial (mtDNA) que est en las mitocondrias de las clulas. La prueba de mtDNA sigue a la lnea maternal debido a que este tipo de DNA solo puede ser heredado por las madres. Sin embargo, usted tambin debe saber que los vstagos machos y de sexo femenino reciben su mtDNA de su madre. Eso quiere decir que mujeres tambin como los machos pueden tener su mtDNA y se pueden hacer pruebas para seguir los antepasados de su madre, la madre de su madre. Mtodos de coleccin Desde un punto de vista cientfico, el orden de preferencia por probar las muestras de ADN sera 1) sangre, 2) el raspado bucal, 3) el pelo y 4) fluidos corporales. Hablar un poco sobre cada tipo de muestra en los prrafos siguientes. Sangre: La sangre proporciona DNA en alta concentracin y alta calidad. Distintas pruebas de laboratorio pueden realizarse a partir de una solo muestra, por ejemplo una muestra de sangre que es tomada en un animal que es sospechoso de estar infectado con el virus del distemper canino, mientras en el laboratorio clnico se realiza un hemograma para identificar si el animal presenta leucopenia, con parte de la misma muestra en el laboratorio de biologa molecular se puede buscar la presencia de partculas virales mediante la tcnica de RT-PCR. Sin embargo la obtencin de sangre es un mtodo invasivo y muchos clientes prefieren otros mtodos como el raspado de la mejilla o la obtencin de pelo, pero en estos casos difcilmente se pueden realizar pruebas para enfermedades infecciosas siendo estas ms preferidas para anlisis genticos. Raspados bucales (mejilla): Estn usndose raspados bucales cada vez ms en identificacin y en pruebas de paternidad. Las clulas obtenidas de estas muestras proporcionan DNA en suficiente cantidad y calidad. Su coleccin es un procedimiento menos invasivo que los que se utilizan para obtener sangre. Las personas podran tomar la muestra en sus casas y enviar las muestras al laboratorio.
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Pelo: El pelo puede utilizarse para analizar DNA nuclear y mtDNA. Para el anlisis del mtDNA, puede usar simplemente el propio pelo. Sin embargo, para DNA nuclear debe conseguir la "raz" o "bombilla" del pelo. La raz contiene el ADN nuclear que incluye. Obtener DNA del pelo es difcil y consume tiempo, por lo que esto podra aumentar los costos de cualquier prueba. Conservacin del DNA: Primero se debe saber para quiere guardar DNA. Para anlisis de relaciones genealgica? Para el diagnstico o estudio de enfermedades mdicas genticas?, para el diagnstico de agentes infecciosos? Comercialmente se puede utilizar el qumico de FTA que fija el DNA para su almacenamiento este qumico se invent en 1988 por Profesor Leigh Burgoyne Asociado de la Universidad de Flinders en Australia (Tecnologas de Flinders PTY S.A.). Los Flinders lo lleva a otro sitio: (Whatman BioScience-quienes distribuyen los productos de FTA). Whatman tiene una licencia para distribuir los productos con el preservativo de FTA (desarrollado en Universidad de Flinders). Nota: Con respecto al qumico FTA se ha comprobado que puede preservar el DNA durante 11 aos en excelentes condiciones. En el laboratorio DNA puede ser preservado en congelacin a -20C suspendido en etanol, isopropanol o acetona; incluso se ha reportado que la utilizacin de acetona podra conservar el DNA por varios aos a temperatura ambiente. Tambin se ha estudiado el uso de DMSO (dimethyl sulfoxide)- para la preservacin del DNA; esta sal provee la mejor proteccin para evitar la degradacin de DNA.
BIBLIOGRAFA: 1. Takema Fukatsu (1999) Acetone preservation: a practical technique for molecular analysis Molecular Ecology. Volumen 8; Nmero 11 Page 1935 2. Kilpatrick CW. (2002) Noncryogenic preservation of mammalian tissues for DNA extraction: an assessment of storage methods. Biochem Genet. Volumen 40; nmeros 1-2; pginas 53-62.
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ONCOLOGA
Fajardo Muoz Ral Introduccin Las neoplasias son causadas por una proliferacin continua no controlada de las clulas, debido a que stas no son capaces de responder apropiadamente a las seales que rigen el comportamiento normal celular, crecen y se dividen de manera incontrolada, invadiendo los tejidos y rganos sanos, y finalmente se diseminan por todo el cuerpo. Uno de los puntos ms importantes en la patologa del cncer es distinguir los elementos histolgicos que caracterizan a los tumores malignos, as como su comportamiento, ya que estos tumores son capaces de invadir el tejido normal adyacente y de propagarse por el cuerpo mediante los sistemas circulatorio o linftico (produccin de metstasis). Existen diversos factores a los que estamos expuestos da con da que favorecen y predisponen el desarrollo de procesos neoplsicos, entre los cuales se pueden mencionar la edad, la raza, factores genticos y ambientales. En la clnica veterinaria ya no es raro encontrar procesos neoplsicos en caninos, inclusive se han encontrado en pacientes de corta edad. Estas neoplasias rara vez son remitidas a laboratorios especializados para realizar el estudio histopatolgico, y esto representa una gran barrera para conocer y establecer un diagnostico preciso. Una de las dificultades con las que nos enfrentamos la mayora de las veces es el no conocer como se deben tomar y enviar las muestras neoplsicas, adems es indispensable actualizarnos, ya que se implementan nuevas tcnicas diagnsticas que brindan la posibilidad de un diagnostico confiable y que den informacin pronstica. Puesto que las neoplasias se originan por disturbios del comportamiento y crecimiento celular y subcelular, su etiologa debe diagnosticarse a nivel celular y subcelular, pero los estudios en epidemiologa oncolgica nos pueden brindar varias pistas sobre la causa de su aparicin, a establecer prevalencias e incidencias, en gran medida a establecer la terapia adecuada para cada tipo de tumor y adems de poder realizar estudios epidemiolgicos comparativos con los estudios que se han realizado en humanos, ya que los perros podran servir como centinelas de algunos factores ambientales predisponentes para los seres humanos. Actualmente el Centro de Investigacin y Estudios Avanzados en Salud Animal de la FMVZ-UAEM, con cooperacin del Hospital Veterinario de Pequeas Especies de la FMVZ- UAEM, Clnicas privadas y de estudiantes de licenciatura y de postgrado, est realizando investigacin oncolgica, con la finalidad de brindar estudios sobre el comportamiento epidemiolgico, patolgico, patologa molecular y epidemiologa molecular de las neoplasias en caninos de la ciudad de Toluca, ya que en esta ciudad se carece de esta informacin y a nivel nacional es muy escasa. Adems se pretende establecer un banco de tejidos neoplsicos congelados para la extraccin de ADN y ARN para contar con una base de datos que permita continuar con estudios posteriores en patologa y epidemiologa oncolgica moleculares en veterinaria. Por tanto aprovechamos este curso para informarles sobre la toma y envi de las muestras para oncologa y para invitarlos a participar en este proyecto.
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Objetivos Presentar la toma y envo de la muestra oncolgica. Realizar un estudio descriptivo de los tumores en pequeas especies. Crear un banco de tejidos. Estudiar algunas mutaciones en el ADN o en el ARN de los tumores. Material y Mtodos Generacin de un banco de tejidos Coleccin de tejidos formolados (0.5-10 cm3). Colectar los bordes laterales e inferiores de la neoplasia (Fig.1). En Masas tumorales voluminosas colectar varias biopsias de la misma masa (Fig. 2). Coleccin de tejidos tumorales congelados (1-2 cm3). Coleccin de 2x2mm de tejidos en 500l de trizol. Coleccin de sangre con EDTA congelada (2-5 ml). Creacin de una base informtica de datos. Los tumores sern sometidos a Histopatologa con tcnicas convencionales y especiales de oncologa. Sern clasificados de acuerdo a la Clasificacin Histolgica Internacional de la OMS y del Instituto de Patologa de las Fuerzas Armadas de los Estados Unidos de Norteamrica. Algunos tumores se podrn someter a pruebas inmunohistoqumicas para una mejor clasificacin. A la sangre y a los tejidos congelados se les har la extraccin de ADN y se comparar el ADN de sangre con el ADN del tumor, para identificar las mutaciones. A los tejidos en trizol se les extraer el ARN para identificar las mutaciones. Como empezar Debe haber una buena colaboracin entre el Clnico y el Patlogo, ya que trabajan en conjunto para resolver el problema del paciente. Papel del Mdico Veterinario Identificar que se trata de un tumor Tomar biopsia Realizar ciruga Enviar tejido al laboratorio Dar tratamiento Tratar de determinar la epidemiologa, etiologa Papel del Patlogo en la Oncologa Veterinaria Determinar la naturaleza del tipo de tumor Asegurar si la ciruga fue exitosa Indicar el pronstico Dar informacin de evolucin del tumor post tratamiento Tratar de determinar la epidemiologa, etiologa y la citomorfometra
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Figura 1. Se corta unos milmetros ms de lo que abarca la neoplasia. Se debe enviar los bordes laterales e inferiores de la masa tumoral, ya que nos ayuda a ver si la masa tumoral est infiltrando el tejido normal y para ver si la ciruga retir completamente el tejido tumoral.
Figura 2. En neoplasias voluminosas, se debe hacer un muestreo mltiple como se muestra en la figura, debido a que muchas veces el centro o los lados de la masa tumoral pueden presentar necrosis, impidiendo con el examen histopatolgico. El muestreo mltiple da ms posibilidad de llegar a un buen diagnstico.
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Bibliografa 1. Cotran, R.S., Kumar, V. & Collins, T. (2000) Neoplasias en Patologa Estructural y Funcional. By Cotran, R.S., Kumar, V. & Collins, T. McGraw-Hill-Interamericana. Mxico. 6ta Ed. pp.277-348. 2. Rangel R. I. C. (2001). Curso de Oncologa en Pequeas Especies. UNAM. Asociaciones de Mdicos Veterinarios Especialistas en Pequeas Especies y Colegios de Mdicos Veterinarios Zootecnistas del rea Metropolitana de la Cd. de Mxico. 3. Withrow S.J. (2001) Biopsy principles in Small animal clinical oncology. 3ra Ed. Saunders Company pp.63-69.
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PECES Celene Salgado-Miranda Centro de Investigacin y Estudios Avanzados en Salud Animal, Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia, Universidad Autnoma del Estado de Mxico. Campus San Cayetano. Carretera Toluca-Atlacomulco, Km. 15.5, Toluca 50200, Mxico, Mxico. Tel/Fax: (722) 2-96-55-55, 2-96-8990. Email: salgadomiranda@uaemex.mx, celene_salgado@yahoo.com INTRODUCCIN En la acuacultura al igual que en toda actividad pecuaria se debe proporcionar a los organismos las condiciones adecuadas para un crecimiento y desarrollo ptimo, as como la implementacin de medidas de bioseguridad para la prevencin y control de enfermedades. Sin embargo, esto no siempre es posible y pueden presentarse brotes de enfermedades en las poblaciones animales, siendo necesario realizar un diagnstico oportuno y correcto. Por lo anterior, es necesario conocer la forma correcta de muestreo, seleccin, conservacin y envo de la muestra clnica al laboratorio. Debemos tener en cuenta que existen dos tipos de muestreo: el muestreo al azar y el muestreo dirigido. El muestreo dirigido se realiza cuando se presenta una enfermedad en los organismos y deseamos conocer la causa de esta. El muestreo al azar se realiza para establecer el estatus sanitario de la poblacin. A continuacin se listan algunas situaciones en las que se debe realizar el muestreo: organismos importados, organismos localizados en unidades de cuarentena, organismos que sern movilizados, organismos cultivados que no dispongan de certificado de salud, organismos naturales capturados y en organismos enfermos. Independientemente del tipo de muestra que sea enviada al laboratorio, existen algunas indicaciones importantes que deben ser consideradas: Muestra recin tomada con estrictas reglas de asepsia, muestra rotulada y acompaada de la historia clnica. SELECCIN DE LA MUESTRA Para seleccionar los organismos que conformarn la muestra, debemos observar su comportamiento dentro del agua as como su aspecto externo para identificar los cambios o alteraciones conductuales y fsicas. La muestra debe integrarse a partir de organismos enfermos o moribundos y deber completarse con organismos aparentemente sanos. Los organismos muestreados no debern haber recibido tratamiento. Cuando se trate de un muestreo dirigido, la muestra debe conformarse con un mnimo de 10 organismos que presenten signos de enfermedad. En el muestreo al azar, deber de considerarse el tamao del lote, la prevalencia del patgeno, el porcentaje de sensibilidad y especificidad de la prueba diagnstica. En ambos casos la toma de los organismos debe realizarse de forma asptica con la ayuda de una red y cuchara del estanque muestreado. CONSERVACIN Y ENVO DE LA MUESTRA OBTENIDA Los organismos acuticos que conforman la muestra clnica pueden ser transportados al laboratorio de la siguiente forma: tanques abiertos o cerrados, bolsas de plstico, en hielo o congelados o con preservativos qumicos. A continuacin se mencionan algunas recomendaciones para cada uno. 84
Tanques abiertos o cerrados: Colocar agua suficiente, no sobrecargar el tanque con peces, colocar uno o varios difusores de oxgeno. Bolsas de plstico: Colocar 1/3 de agua y 2/3 de oxgeno o aire, no sobrecargar la bolsa con peces (Figura 1). Su efectividad aumenta si se coloca hielo afuera de la bolsa.
Figura 1. Transporte de pez en bolsa de plstico (de Kinkelin, 1991)
En hielo o refrigerantes: Utilizar recipientes limpios, colocar los peces en bolsas de plstico, colocando hielo sobre estas. Preservativos qumicos: En el caso de formaldehido utilizarlo a una concentracin del 10%, realizar cortes de rganos de 0.5 cm. de grosor, la proporcin muestra-formol debe ser 1:10.
TCNICA DE SACRIFICIO Y NECROPSIA EN PECES Los peces pueden sacrificarse por medio de: Corte atrs de la cabeza, corriente elctrica y anestsicos. Para realizar la necropsia de un pez, este debe colocarse en decbito lateral, con la regin ceflica a mano izquierda del operador y la regin caudal a la derecha. Antes de iniciar la necropsia, se roca la superficie del organismo con alcohol etlico al 70 %. El primer corte se realiza en el oprculo, dejando visibles las branquias las cuales se separan del arco branquial (Figura 2 y 3). El segundo corte se realiza en lnea recta, en direccin craneal introduciendo las tijeras por la abertura anal. El tercer corte se hace en forma de semicrculo partiendo del ano, pasando a travs de la superficie lateral del cuerpo llegando a la altura del oprculo, para finalmente penetrar en la cavidad (Figura 4), posteriormente el vrtice de la piel debe ser cortado (Figura 5). El cuarto corte se realiza en el crneo del pez, de adelante hacia atrs con una hoja de bistur, dejando visible el cerebro (Figura 6). El quinto corte se hace con el bistur en la musculatura. Concluida la necropsia, es necesario que los peces examinados sean incinerados y el material y equipo utilizado esterilizado.
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Figura 2. Corte del oprculo (Aluja, 1985)
Figura 3. Corte de las branquias (Aluja, 1985)
Figura 4. Segundo y tercer corte (Aluja, 1985)
Figura 5. Corte del vrtice de la piel (Aluja, 1985)
Figura 6. Cuarto corte (Aluja, 1985)
TCNICA PARA OBTENCIN DE MUESTRA DE SANGRE La toma de sangre puede realizarse por varias vas: puncin cardiaca, puncin del vaso dorsal y corte del pednculo caudal (Figura 7).
Figura 7. Puntos para la toma de sangre
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BIBLIOGRAFA CONSULTADA Amilcea, E. (1984): Manual de enfermedades de los peces. Acribia, Zaragoza, Espaa. Barnab, G. (1991): Acuicultura. Omega, Barcelona, Espaa. Bruno, D. W.; Poppe, T. T. (1996): A colour atlas of salmonid diseases. Academic Press, USA. Collins, R. (2000): Principios de diagnstico de enfermedades. Acuicultura para veterinarios. Produccin y clnica de peces. Editorial Acribia, S. A. Zaragoza Espaa. de Kinkelin, P.; Michel, C.; Ghittino, P. (1991): Tratado de las enfermedades de los peces. Acribia, Zaragoza, Espaa. Noga, J. E. (2000): Fish Disease. Diagnosis and Treatment. First Edition. Iowa State Press. Iowa. USA. OIE (Organizacin Mundial de Sanidad Animal) (2008): Manual de Pruebas de Diagnstico para los Animales Acuticos. 5 ed. Organisation Mondiale de la Sant Animale. France. OIE (Organizacin Mundial de Sanidad Animal) (2011): Cdigo Sanitario para los Animales Acuticos. 14 ed. Organisation Mondiale de la Sant Animale. France. Plumb, J. A. (1999): Health maintenance and principal microbial diseases of cultured fishes. Iowa State University Press, USA. Roberts, R. J. (1981): Patologa de los peces. Ediciones Mundi-Prensa, Espaa. Roberts, R. J.; Shepherd, C. J. (1997): Handbook of trout and salmon diseases. Third edition. Fishing News Books, U.K. Shepherd, C. J. (1999): Piscicultura intensiva. Acribia, Espaa. Zarzuela, P. E. (1981): Principales enfermedades infecciosas de los Peces. Biblioteca Tcnica AEDOS, Barcelona, Espaa.
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BACTERIOLOGA Y MICOLOGA Dra. Adriana del Carmen Gutirrez Castillo*, Dr. Martn Talavera Rojas*, M. en C. Ada Elia Daz Gonzlez Borja, M. en C. Roberto Mendoza Vilchis.
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Integrantes del Cuerpo Acadmico de Patognesis Microbiana
INTRODUCCIN La seleccin de la muestra, la conservacin y el envo en forma correcta es de primordial importancia para llegar a un diagnstico especfico. El diagnstico de enfermedades bacterianas y micticas depende del aislamiento e identificacin del agente etiolgico. En algunos casos se hace un diagnstico de presuncin por el aspecto de un sndrome clnico y de las lesiones, sin embargo es impropio y peligroso fiarse de tal informacin como nico criterio. Los aspectos ms importantes de la bacteriologa y micologa diagnsticas son la obtencin de una cantidad adecuada de la muestra precisa y la comunicacin entre el mdico de campo y el laboratorista para delinear el diagnstico clnico y sugerir cualquier microorganismo poco comn que pudiera causar la enfermedad en cuestin. Consideraciones generales respecto a la toma de la muestra: 1. Toda muestra para examen bacteriolgico o micolgico deber ser tomada en condiciones de asepsia y los recipientes para su envo debern estar estriles. Debe evitarse la contaminacin al momento de tomarla. 2. Seleccionar al animal para obtener la mejor muestra, de preferencia en una fase adelantada de su enfermedad. Si el mal representa un problema general del hato o parvada, las muestras se obtendrn de ms de un animal enfermo. De cada grupo deben enviarse muestras de uno o dos animales que hayan muerto recientemente as como muestras de animales en varias fases de desarrollo de la enfermedad. 3. Asegurarse de que las muestras preparadas para el envo sean caractersticas de la enfermedad en estudio. 4. Considerar el horario de atencin y das hbiles del laboratorio al que ser remitida la muestra, con la finalidad de optimizar el recurso. La obtencin de una muestra adecuada carece de utilidad si el tiempo que media entre la toma y el cultivo permite que muera el microorganismo patgeno, o que sea superado en nmero por la flora normal que a veces contamina la muestra. Es de suma importancia transportar rpidamente las muestras al laboratorio de diagnstico para procesarlas sin tardanza y as tener mayores probabilidades de proliferacin, aislamiento e identificacin del microorganismo patgeno.
En algunas ocasiones se recomienda inocular inmediatamente la muestra en medio de cultivo, una vez obtenida del enfermo y despus llevar el medio inoculado al laboratorio para incubarlo e identificar las bacterias. En otros casos puede protegerse el material en un caldo nutritivo o en un 88
medio amortiguado para transporte y despus llevarlo al laboratorio para que ah prolifere. En todos los casos, el procesamiento rpido de todas las muestras y piezas permite la identificacin ms rpida y fidedigna del microorganismo. Es requisito indispensable anexar a la muestra una carta que explique toda la historia del caso y de ser posible incluir el diagnstico presuntivo. CONSERVACIN DE MUESTRAS La mejor forma de preservar las muestras para bacteriologa es en refrigeracin: Hielo natural.- Este mtodo de refrigeracin slo sirve si el envase est muy bien preparado y la distancia al laboratorio no es muy grande. El hielo conservar la muestra durante 8-12 horas. Las muestras acomodadas en hielo debern colocarse en un recipiente hermtico rodeado de un bloque de hielo o dentro de un recipiente, a su vez incluido en otro mayor, entre los cuales est el hielo. Hielo seco.- Se preferir este mtodo de refrigeracin si la muestra puede congelarse sin perturbacin con los necesarios procedimientos de laboratorio. La muestra deber encerrarse en una bolsa de plstico u otro envoltorio impermeable, con el hielo seco envuelto en papel y colocado dentro de una caja. No deber colocarse el hielo seco en contacto directo con la muestra, a no ser que la congelacin no la modifique en absoluto. No debe enviarse hielo seco en un recipiente hermtico de metal o vidrio, pues el hielo, al evaporarse se acumula con presin tan alta que provoca la explosin. Otro conservador es la glicerina al 50% combinada con una solucin buffer de fosfatos, solucin salina fisiolgica, agua destilada, solucin Hank o bien agua hervida, Inhibe el crecimiento bacteriano y mantiene la forma y tonicidad de los tejidos. Cuando el material no pueda ser enviado rpidamente al laboratorio, es aconsejable tomar las muestras con un hisopo y enviarlas en medio de transporte, en lugar de enviar los rganos completos. El medio de Stuart o de transporte est compuesto de agar, preparado con agua, glicerina y azul de metileno. Es utilizado para introducir hisopados de exudados y conserva la muestra lo ms parecida a la hora en que fue tomada, impide la contaminacin y multiplicacin de las bacterias presentes. DIMENSIONES ADECUADAS En general entre 20 y 50 ml de lquido o entre 30 y 100 gr de rganos. En caso de que sea enviada una porcin de intestino se recomienda que sea ligado en ambos extremos y se indique a que porcin corresponde (duodeno, colon, etc.).
TIPO DE MUESTRA El tipo de muestra es diferente dependiendo si el animal est muerto o no. Por ejemplo en casos de rinitis, faringitis, heridas infectadas, etc. el material generalmente ser enviado en hisopos y medios de transporte; si se ha realizado la necropsia son los rganos los que sern enviados. MUESTRAS DE RGANOS Y TEJIDOS 89
Todos los rganos y tejidos destinados a exmenes bacteriolgicos, deben recolectarse en las mejores condiciones de asepsia y ms tardar una hora despus de la muerte del animal. Los rganos esenciales para dichos exmenes son: corazn, bazo, hgado, pulmn, riones y ganglios linfticos. Cuando se realiza la necropsia en campo y no se cuente con material previamente esterilizado puede hacerse uso de un mechero de alcohol para flamear el instrumental antes de tomar las muestras. As mismo se recomienda obtener las muestras antes de la extraccin de los rganos, cuando an se encuentran dentro de la cavidad para evitar la manipulacin innecesaria y posible contaminacin. Debe procurarse el empleo de instrumental (pinzas, tijeras, cuchillos, etc.) previamente esterilizados en autoclave, por ebullicin en agua durante 15 minutos o empleando antispticos como el benzal o el alcohol (70%). As mismo se usarn guantes que se lavarn en soluciones antispticas cuantas veces sea necesario en el transcurso de la necropsia. Los rganos o parte de stos se depositarn en frascos estriles de cristal o plstico de boca ancha con tapa de rosca o bien en bolsas de plstico. Cuando se carezca de los medios necesarios para la refrigeracin, los tejidos podrn recolectarse en glicerina neutra y agua a partes iguales, mezcla que evita la proliferacin bacteriana retardando la descomposicin. Cuando se trate de recolectar exudados, lquido sinovial, lquido cefalorraqudeo o material purulento, se tomarn con agujas y jeringas estriles o con hisopos de algodn, depositndose en tubos de ensaye estriles con tapn de hule. Para evitar la desecacin lenta de la muestra, los hisopos se humedecern en solucin salina estril o en medios de cultivo apropiados (caldo infusin cerebro corazn, caldo tioglicolato), con lo cual se favorecer la supervivencia de los microorganismos. Las muestras provenientes de distintos sistemas no deben colocarse en el mismo recipiente. Por ejemplo, no se debe mezclar un trozo de intestino con uno de pulmn.
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Seleccin de muestras idneas para el aislamiento bacteriano y mictico de algunos agentes especficos de importancia en medicina veterinaria. TIEMPO PROMEDIO DE AISLAMIENTO E IDENTIFICACIN EN EL LABORATORIO 2 semanas 4 das 5-7 das 4 das 5-7 das 4 das 4-7 das 5-7 das 5 das 4-7 das
AGENTE ETIOLGICO
Lysteria monocitogenes
SELECCIN Mdula oblonga y base del encfalo, sangre, lquido cerebroespinal leon, ciegos, hgado, mdula sea, heces fecales. Heces, intestino delgado y grueso (en aves adems tonsilas cecales) leon, ganglios regionales, mdula sea, heces fecales Hisopado nasal, pulmn, ganglios regionales Orina fresca, vejiga o rin. Pulmn Meninges, encfalo, lquido cefalorraqudeo Hisopado de meninges, meninges, encfalo Msculo y tejidos necrticos
Salmonella spp.
Campylobacter spp Escherichia coli
Mycoplasma spp. Corynebacterium renale Actinobacillus pleuropneumoniae

Haemophilus somnus
Streptococcus suis Clostridium chavoei, Clostridium novyi y Clostridium septicum Bacillus anthracis Haemophilus parasuis Agentes productores de mastitis: Streptococcus, Staphylococcus, E. coli, etc. Micosis cutneas: Epidermophyton floccosum, Microsporum canis, Keratinomyces ajelloi, Trichophyton equinum, etc. Micosis subcutneas: Trichosporon cutaneum Micosis sistmicas: Blastomyces dermatitidis, Coccidioides immitis
Sangre Pulmn Leche
4-7 das 4-7 das 4-7 das
Raspados de piel
1-2 semanas
Raspado profundo de piel, biopsia. Pulmn, ganglios regionales
1-2 semanas 1-2 semanas
MUESTRAS DE SANGRE Si el examen bacteriolgico se practica a partir de sangre, esta se extraer con toda asepsia, directamente del corazn o de una vena accesible antes de la muerte del animal y se depositar en tubo de ensaye estril que contenga anticoagulante (citrato de sodio, heparina, E.D.T.A.). En muchos casos de bacteremia los microorganismos se encuentran
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en nmero relativamente pequeo. La cantidad de sangre que se extrae para cultivo no debe ser escasa, por lo general no inferior a 10 ml. Es esencial la estricta asepsia en la extraccin de sangre y en el paso de esta a los tubos esterilizados que la van a contener. El lugar elegido para la puncin debe ser rasurado y lavado con jabn detergente. Despus se limpia con un algodn empapado en ter o alcohol y finalmente se aplica yodo o merthiolato. La jeringa y la aguja deben estar secas y libres de residuos qumicos. Es preferible usar una aguja desechable estril. Aunque la muestra de sangre puede recogerse en un tubo estril conteniendo anticoagulante que, que se remite al laboratorio, es mejor ponerla directamente en el recipiente que contiene un medio de cultivo. La ventaja de la inoculacin inmediata es que se evita que los pocos microorganismos presentes en la muestra de sangre mueran durante el transporte al laboratorio. La mayora de las bacterias pueden aislarse en medios que contengan como base caldo de triptosa u otra frmula de las que se usan para el cultivo de sangre. Algunas bacterias que se encuentran en la sangre requieren condiciones anaerbicas o microanaerfilas para su multiplicacin y hay que ajustar de modo conveniente las condiciones de incubacin del medio inoculado. La identificacin de patgenos especficos requiere subcultivos en otros medios y los procedimientos usuales de aislamiento y tipificacin. La presencia de bacterias en la sangre (bacteriemia) a menudo se acompaa con escalofros y fiebre, taquicardia e hipotensin. Incluso en infecciones en que dicho signo constituye el aspecto principal de la enfermedad, no siempre estn los microorganismos en la corriente sangunea en nmeros suficientes para identificarlos en una sola muestra de sangre. A veces se necesita extraer varias muestras de sangre en los animales enfermos antes de aislar el agente causal. Cuando se sospecha de bacteriemia intermitente, es costumbre obtener tres muestras de sangre de 10 ml en un lapso de 24 horas, para maximizar las posibilidades de poder aislar el microorganismo. MUESTRAS FECALES Para el examen bacteriolgico no es necesario el uso de preservativos. Un mtodo para enviar muestras de heces consiste en suspender 5 gramos de material en solucin salina fisiolgica adicionada con 30% de glicerol. Es conveniente que todas las muestras de excremento para estudios bacteriolgicos viajen refrigeradas. Los organismos patgenos pueden no hallarse en el excremento durante todo el curso clnico de la enfermedad, lo cual sucede en individuos que han recibido quimioterapia contra bacterias. El mejor tiempo para obtener muestras en estos casos es en la etapa inicial de la fase aguda. LQUIDOS CORPORALES, EXUDADOS Y HERIDAS Los lquidos cefalorraqudeo, peritoneal, articular, contenido de abscesos, etc. pueden enviarse en jeringas estriles.
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Los signos comunes de meningitis son cefalalgia, fiebre, vmito y rigidez del cuello. El lquido cefalorraqudeo se obtiene por una puncin en la regin occipital o lumbar. Es de mxima importancia descontaminar el sitio de puncin y as asegurar que no se inyecte mecnicamente en el lquido algunos microorganismos o material contaminante. La muestra debe colocarse en un tubo estril con tapa de rosca y enviarse inmediatamente al laboratorio para diagnstico. Es posible prever que el pus y el exudado de una herida infectada o un absceso abierto contengan el agente etiolgico de la infeccin. Sin embargo, en heridas abiertas casi siempre se detectan contaminantes de piel y suelo, que en circunstancias apropiadas de cultivo superan en nmero al microorganismo infectante real y con ello, se tiene un resultado errneo. En la medida de lo posible hay que utilizar una jeringa y una aguja estriles para obtener muestras de heridas y abscesos. El empleo de un hisopo no siempre es satisfactorio, por el poco material reunido con l y porque muchos de los microorganismos mueren al secarse el algodn, con lo cual es difcil o imposible aislar el o los agentes etiolgicos. Es importante recordar tambin que las heridas y los abscesos suelen estar infectados con bacterias anaerobias obligadas, que rpidamente mueren en el hisopo que queda expuesto a la atmsfera. Por las razones aducidas, todos los materiales aspirados deben transportarse al laboratorio en frascos especiales que tengan gas pero no oxgeno. Tales recipientes, que se expenden comercialmente, pueden contener unas cuantas gotas de resazurina al 0.0003%, un indicador de oxidorreduccin, que adquiere color rosa si se contamina el interior del recipiente con aire. Un mtodo sencillo consiste en sumergir la muestra en un medio semislido para favorecer la microanaerobiosis necesaria para la conservacin de las bacterias como Haemophilus, Campylobacter, Helicobacter, etc. Las quemaduras son infectadas a menudo por oportunistas, como Pseudomona aeruginosa, grmenes entricos, Staphylococcus y levaduras, y es muy difcil el aislamiento del agente definitivo. Es necesario enviar en estos casos muestras de tejido quemado y cualquier material de drenaje. MUESTRAS DE ORINA La orina utilizada para el cultivo bacteriolgico debe ser recogida en un recipiente estril, de la porcin media y de la porcin ultima de la emisin. Si esto no es factible, es adecuada la muestra obtenida por cateterizacin, sta por lo general se recomienda en las hembras. A este tipo de muestras no debe aadirse preservativos. La aspiracin de orina por paracentesis entraa el peligro de peritonitis. Proteus, organismo que por lo general se encuentra en la orina de los cnidos causa peritonitis rpida y mortal despus de la parecentesis.
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Si se sospecha de Leptospirosis se debe aadir formol al 10% como conservador en proporcin de 1:9 (formol: orina) para preservar la integridad de las Leptospiras. LECHE La muestra debe ser tomada antes del ordeo o al menos 6 horas despus. Si se lava el pezn es indispensable secar muy bien. Eliminar los primeros chorros y colocar la leche en tubos estriles. Una vez que se cuenta con la muestra y se ha hecho la evaluacin clnica de la enfermedad, es tarea del laboratorista aislar el agente etiolgico, identificarlo y dar un perfil de la susceptibilidad a los antibiticos. Sin embargo, incluso despus del aislamiento y la identificacin de microorganismos en una muestra de laboratorio, no siempre es posible definir que sean la causa de la enfermedad o sntomas, pero que bajo circunstancias especiales ocasionan infecciones graves. No siempre se sabe por qu un microorganismo causa enfermedad y en ocasiones no la causa. Los gneros Fusobacterium y Bacteroides rara vez causan enfermedad si estn en su hbitat normal en el intestino grueso, pero producen graves abscesos si se introducen en heridas. Staphylococcus aureus causa los cuadros ms graves como invasor secundario despus de una infeccin viral o cuando algn antibitico ha destruido el resto de la flora normal. El xito o el fracaso de un anlisis de muestras en laboratorio depende en gran medida de la forma en que la muestra sea recolectada, conservada y enviada, puesto que alguna incorreccin en cualquiera de ellas arruina la correcta identificacin de los agentes que causan la enfermedad o infeccin que afecta a los animales en estudio. RASPADOS CUTNEOS En caso de piodermias (bacterianas) o infecciones micticas se procede a raspar la lesin con el filo de una navaja o bistur estril de forma perpendicular, pasndola varias veces por la lesin. El primer material obtenido se desecha y se procede a realizar otro raspado que ser conservado en medio de transporte (bacteriologa) o bien en un sobre de papel (micologa). MICOSIS SUPERFICIALES Para la adecuada toma de muestra de las micosis superficiales se recomienda seguir las siguientes recomendaciones: examen con luz de Wood, limpieza del rea afectada y recogida de la muestra.
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Examen con luz de Wood. Antes de realizar la toma de muestras de una micosis superficial es aconsejable examinar las lesiones de la piel (dermatofitosis) en una habitacin completamente oscura bajo la luz de Wood (luz ultravioleta de 365 nm de longitud de onda, que pasa a travs de un filtro de cristal que contiene xido de nquel). En Tinea capitis debidas a Microsporum spp. o Trichophyton schoenleinii, las lesiones muestran una fluorescencia caracterstica. El descubrimiento de Margarot y Deveze, en 1925, de que pelos infectados por ciertos dermatofitos producan una fluorescencia caracterstica bajo la luz ultravioleta de la lmpara de Wood fue un importante avance en la Micologa. La naturaleza y fuente de las sustancias fluorescentes en los pelos infectados no son del todo conocidas y la sugerencia de que era una pteridina ha sido cuestionada. El pelo permanece fluorescente despus de que el hongo deje de ser viable, y el material fluorescente puede ser extrado del pelo en agua caliente o solucin fra de bromuro de sodio. Debido a que el crecimiento del hongo, en el medio de cultivo o de forma in vitro en el pelo, no origina fluorescencia, esta se atribuye a alguna sustancia producida por la interaccin entre el crecimiento del hongo y del pelo. Solamente algunos dermatofitos capaces de invadir el pelo producen fluorescencia: M. canis y M. audouinii, siempre producen fluorescencia verde; sin embargo, M. gypseum y M. nanum, lo hacen ocasionalmente. T. shoenleinii, causa una fluorescencia verde plida. La fuente ms comn de errores en el examen con luz de Wood es una habitacin insuficientemente oscura o la existencia de sustancias qumicas capaces de emitir fluorescencia (cosmticos, productos teraputicos, etc.). Limpieza del rea afectada. Antes de realizar la recogida de la muestra, la piel, pelos o uas afectados deben limpiarse con etanol (70%) para eliminar la flora bacteriana, exudacin o restos de excipientes de tratamientos previos que dificultan el examen directo y el cultivo. Recoleccin del material. Escamas. En las lesiones descamativas, deben recogerse las escamas de las zonas afectas con fluorescencia positiva (pitiriasis versicolor o eritrasma) o con fluorescencia negativa (candidiasis y dermatofitosis), raspando su borde activo con un bistur desechable, ya que dicho borde es el que ms probablemente contenga elementos fngicos viables. Cuando existen lesiones satlites (candidiasis), el raspado se realiza de dichas lesiones por ser las ms jvenes. El material obtenido se recoge en un sobre o placa de Petri (debidamente precintada), con el fin de mantenerlo seco y libre de contaminacin. El uso de contenedores de plstico puede tener el inconveniente de que las escamas se adhieran a sus paredes dificultando su recuperacin; mientras que el uso de portaobjetos de cristal, tiene el riesgo de prdida de material por ruptura del vidrio en el transporte. Los dermatofitos en los raspados de la piel pueden permanecer viables durante meses.
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En la pitiriasis versicolor parcialmente tratada, la descamacin es escasa, por lo que se recomienda hacer la toma con la tcnica del papel de sello, para ello se aplica la zona adherente de la cinta sobre la piel a estudiar, presionando enrgicamente, se despega y se coloca sobre un portaobjetos. En intertrigos candidisicos, las lesiones no suelen ser descamativas sino exudativas, en cuyo caso no se debe raspar porque resultara una tcnica cruenta, sino que el material se recoge con torunda estril con/sin humedad. Si el espcimen no va a ser procesado inmediatamente, se prefiere el empleo de torunda con un medio de transporte (como el de Stuart) ya que las levaduras pierden rpidamente la viabilidad en los hisopos secos. Pero hay que tener presente que el retraso en el procesamiento de estas torundas permite la multiplicacin de las bacterias en la muestra y que, adems, el medio de transporte la diluye, dificultando la observacin directa. Existe una tcnica complementaria o alternativa para la recogida de las escamas en las micosis cutneas (candidiasis y dermatofitosis): el mtodo del cuadrado de moqueta de Mariat y Adn- Campos. Consiste en frotar 5 veces con un cuadrado de alfombra de lana estril la totalidad de la superficie a examinar (piel glabra o cuero cabelludo); posteriormente, la moqueta se guarda en un sobre de papel o en una caja de Petri y se enva al laboratorio de Micologa para su procesamiento. Este procedimiento tiene varias ventajas: i) no es cruento para el paciente, ii) es til para realizar tomas de Tinea capitis con fluorescencia negativa, iii) permite estudiar a portadores asintomticos de dermatofitos o pacientes ya tratados, cuando la lesin clnica ha desaparecido, iv) facilita los estudios epidemiolgicos de tia y v) permite estudiar animales (gatos, perros, etc.) que pueden ser reservorio de dermatofitos. Sin embargo, tiene el inconveniente de que con esta tcnica no se puede realizar la observacin directa, solamente el cultivo. Pelos. Dependiendo del tipo de lesin observada, los pelos deben recogerse mediante diversas tcnicas: En la Piedra blanca o la Piedra negra, ambas confinadas a la vaina del pelo, se debe cortar la porcin supra folicular de los pelos enfermos. En las tias es importante recoger los pelos parasitados arrancndolos con la raz intacta, ya que cortar los pelos es menos eficaz. En muchas ocasiones, los pelos parasitados se reconocen porque tienen una fluorescencia positiva con luz de Wood, estn deslustrados, rotos, friables o se desprenden fcilmente con el raspado. Las tias microspricas (M. canis y M. audouinii) se reconocen por presentar una placa escamosa blanquecina con escasa o nula inflamacin, que puede alcanzar varios centmetros de dimetro, y en la cual se observan pelos rotos a 5-10 mm de la superficie cutnea, estos pelos parasitados son friables y se arrancan con facilidad al raspar con el bistur. Las tias tricofticas antropoflicas (Trichophyton tonsurans y T. violaceum), forman pequeas placas escamosas con pelos de poca longitud, en forma de W o Z, situados en el espesor de la escama o bien rotos al nivel de la superficie dando un aspecto de puntos
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negros, casi siempre en ausencia de inflamacin. Estos puntos negros son los que deben extraerse con la punta del bistur o mediante pinzas. La tia favosa (T. schoenleinii) presenta costras amarillentas, cncavas y centradas por un pelo, denominadas esctulas o cazoletas fvicas. Estn formadas por un conglomerado de hifas que originan una foliculitis y, con el tiempo, alopecia cicatricial por destruccin de la matriz. La muestra de estas lesiones debe ser tomada con asa (el pus folicular) y cucharilla (las cazoletas). Algunos autores recomiendan que en lesiones de tia tricoftica, en las cuales se encuentran mezclados pelos sanos y enfermos, es til cortar 20 a 30 pelos a una altura de 1 cm (en un rea de 4-5 cm de dimetro) y, posteriormente, depositarlos en un portaobjetos, previamente calentado o en una placa de Petri, destinando una parte del mismo al examen directo y otra al cultivo. En la Tinea capitis, adems, se pueden realizar tomas con la moqueta de Mariat y AdnCampos y con un cepillo de plstico estril de dimetro inferior a la placa de Petri donde se va a sembrar. Este mtodo de cultivo es extremadamente sensible y de gran valor para estudios epidemiolgicos de animales domsticos sospechosos. Consiste en cepillar enrgicamente 10 veces el cuero cabelludo y posteriormente implantar las pas del cepillo sobre la superficie del agar (tcnica descrita por MacKenzie y usada por Clayton y Midgley. Antes de reutilizar estos cepillos deben esterilizarse con xido de etileno. En lesiones dolorosas e inflamatorias, como el Kerion, o en individuos sensibles, puede ser difcil la toma de muestras. En estos casos, el uso de una torunda humedecida sobre la zona afectada puede ser el nico medio incruento de realizar la toma. Con esta tcnica es posible obtener cultivos positivos, pero resultados negativos no excluyen la infeccin. Uas. En las onicomicosis, la toma de muestras vara en funcin del tipo de lesin clnica: Onicomicosis distal y lateral subungueal o ua en mdula de junco: la lesin comienza en el borde libre de la ua y va extendindose hacia la matriz, la sustancia de la ua se sustituye por un material amarillento y friable, mientras que la lmina exterior puede estar infectada o destruida. Esta lesin es debida a dermatofitos, Scopulariopsis spp. o Scytalidium dimidiatum. En estos casos, se recoge el material ungular ms cercano a la cutcula, raspando con el bistur en la profundidad del surco periungueal. Con una torunda o asa estril, se obtiene el pus de la paroniquia acompaante tras incisin con lanceta o compresin de la porcin lateral del dedo. Onicomicosis distrfica total: corresponde al estadio final de cualquier onicomicosis. En estos casos, se debe raspar preferentemente el material subungueal. Transporte de la muestra superficial. Las muestras superficiales de pitiriasis versicolor y dermatofitosis deben ser transportadas en un contenedor seco; sin embargo, si se sospecha la presencia de Candida spp. y se demorase su procesamiento, se debe emplear un medio de transporte como el de Stuart, para preservar su viabilidad. Las distintas opciones de transporte, como ya se coment para bacteriologa, estn en funcin
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de la lesin clnica, agente etiolgico y posibilidades de recoleccin. El almacenaje de muestras dermatolgicas se debe realizar a temperatura ambiente. Los nuevos mtodos de deteccin e identificacin de patgenos microbianos, basados en el ADN, ofrecen ventajas tanto para los productores como para los consumidores. La seguridad microbiolgica de los alimentos contina suscitando gran preocupacin entre todos los componentes de la cadena alimenticia, del campo a la mesa. Productores, transformadores y encargados de la elaboracin de alimentos toman todas las precauciones posibles para evitar que la comida que ofrecen pueda provocar una intoxicacin. Entre los sistemas para la gestin de la seguridad alimenticia que han demostrado ya resultados satisfactorios cabe mencionar el sistema de Buenas Prcticas de Fabricacin y el denominado Anlisis de Riesgos y Control de Puntos Crticos. Un aspecto importante de estos sistemas preventivos que garantizan la seguridad, es que determinan si los patgenos en potencia se encuentran en los productos en crudo o en el entorno de la cadena alimenticia en cuestin. Las pruebas de deteccin de agentes patgenos siempre han requerido largos anlisis a cargo de personal muy calificado. En la ltima dcada, esos anlisis tradicionales se han sustituido por mtodos que se sirven del ADN, mucho ms rpidos. Un tcnico puede realizarlos en cuestin de pocas horas, mientras que las tcnicas antiguas podan llevarle varios das a un microbilogo altamente preparado. Estos nuevos mtodos, al utilizar informacin gentica para detectar las bacterias, proporcionan resultados ms precisos que los tradicionales, basados en las caractersticas bioqumicas e inmunolgicas, que estaban sujetos a las condiciones del entorno. Muchos de los nuevos mtodos dependen de la ampliacin enzimtica o reaccin en cadena de la polimerasa (Polymerase Chain Reaction, PCR), que ha evolucionado en los ltimos aos gran parte de la biologa molecular, ya que permite obtener cantidades considerables de ADN a partir de muestras nfimas. Otros se basan en una tcnica denominada hibridacin del ADN. Los primeros resultan de gran utilidad para confirmar la presencia o ausencia de agentes patgenos determinados en los alimentos. Para comprobar la existencia de un germen en particular, como la bacteria de la salmonera, se toma una muestra del alimento en cuestin y se favorece el desarrollo de cualquier bacteria en l. Se extrae luego el ADN de las bacterias y, mediante la tcnica de PCR, se amplifican las pequeas cantidades de ADN extradas hasta obtener cantidades fciles de identificar. La PCR slo amplificar el ADN del organismo elegido (en este caso, la salmonera) y, de estar presente, resultar fcil de detectar. Diversos mtodos de produccin comercial para toda serie de bacterias patgenas ya estn disponibles. Cuando se trata de identificar de forma precisa ciertos patgenos en materias primas, a lo largo de la cadena de produccin o en los productos finales, se aplican tcnicas basadas en la hibridacin del ADN, que proporcionan las huellas del ADN de los microbios. Existe una versin automatizada de este sistema, que compara la huella del ADN de cualquier muestra con otras almacenadas en una base de datos y archiva luego el prototipo, as como las referencias relativas a su origen.
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Al cotejar esas huellas caractersticas a travs de todo el proceso de produccin alimentaria, se puede establecer el origen del agente patgeno. A modo de ejemplo, una empresa del sector productor de alimentos detect recientemente Staphylococcus epidermidis en sus productos mediante los procedimientos de garanta de calidad habituales. La tecnologa reciente permiti descubrir que, de entre las diversas fuentes posibles de dicho espcimen patgeno en la planta de produccin, el origen de la contaminacin eras las manos de un empleado, con lo que pudieron tomarse medidas correctivas inmediatas y de bajo costo, en lugar de verse forzados a suspender la actividad para realizar una costossima descontaminacin general. Gracias a estos nuevos mtodos novedosos basados en el ADN, se puede identificar rpidamente el origen de patgenos y retirar de la venta los alimentos afectados. Es indudable que tanto los productores como los consumidores se benefician de estas tcnicas, que permiten llevarles la delantera a los agentes patgenos. Cundo usamos biologa molecular en bacteriologa y micologa?: En diagnsticos difciles. En susceptibilidad y resistencia antimicrobiana. En la tipificacin de cepas. Cundo usar PCR? Si el microorganismo no crece in vitro. Si el cultivo es poco sensible Si los medios de cultivo que se requieren son complejos, por ejemplo cultivo celular. Si el tiempo de incubacin es demasiado prolongado. La naturaleza de las muestras vara dependiendo del tipo de agente bacteriano o mictico. Las ms comunes son: Sangre.- Se recomienda en lo posible la extraccin de tres muestras de sangre (3 a 10 mL segn la especie animal) obtenidas en das consecutivos. La sangre se colecta en tubos que contengan polianetol sulfonato de sodio (SPS) como anticoagulante (Vacutainer, BBL, Cokeysville, Maryland, EUA), y se remite de inmediato para su procesamiento. Hisopo rectal.- La muestra se toma introduciendo la punta de un hisopo de algodn humedecido en solucin salina o medio de transporte en el recto y hacindolo rotar ligeramente. Estar bien tomada si observamos un ligero color caf en el hisopo. Una vez tomada la muestra se introduce en hisopo hasta el fondo en un tubo con medio de transporte de Cary Blair que debe ser bien tapado posterior a la toma de muestra (tapn de rosca preferentemente). Para estudios bacteriolgicos se enva inmediatamente despus de haberse tomado. Se enva a temperatura ambiente. Materia fecal.- Las muestras fecales pueden ser obtenidas en recipientes limpios de boca ancha y con tapa hermtica que permitan su fcil transporte, de preferencia que no sean de vidrio. Las heces obtenidas del suelo no son satisfactorias, debido a que pueden
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contaminarse con material ajeno. La muestra se debe enviar de inmediato al laboratorio. El transporte se realiza en fro.
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Cuadro de referencia para la seleccin de las muestras en relacin con los probables agentes bacterianos y micticos involucrados.
TIPO DE MUESTRA Torunda nasal MICROORGANISMOS PROBABLES PRESENTES Staphylococcus Streptococcus Pasteurella Haemophilus Actinomyces Mycoplasma Corynebacterium Escherichia coli Klebsiella Bordetella Pseudomona Aspergillus Cryptococcus Los mismos que el anterior ms: Mycobacterium Nocardia Coccidioides TIPO DE MUESTRA Pus y lquidos pleurales y peritoneales MICROORGANISMOS PROBABLES PRESENTES Staphylococcus Streptococcus Corynebacterium Pasteurella Actinomyces Actinobacillus Escherichia coli Haemophilus Pseudomonas Bacteroides Clostridium Nocardia Coccidioides Staphylococcus Streptococcus Corynebacterium Haemophilus Listeria Escherichia coli Cryptococcus Mycoplasma TIPO DE MUESTRA Orina MICROORGANISMOS PROBABLES PRESENTES Escherichia coli Proteus Pseudomona Staphylococcus Steptococcus Klebsiella Organismos entricos miscelneos Corynebacterium renale Leptospira
Lavado traqueal
Lquido cerebroespin al
Exudado ocular
Staphylococcus Streptococcus Pseudomona Neisseria Mycoplasma Moraxella Haemophilus Aspergillus y otros hongos Chlamydia Brucella Vibrio Streptococcus Escherichia coli Klebsiella Salmonella Chlamydia Leptospira
Torunda de odo
Staphylococcus Streptococcus Pseudomonas Proteus Klebsiella Escherichia coli Corynebacterium Aspergillus
rganos parenquimato sos
Torundas y lquido sinovial
Raspado de piel
Staphylococcus Streptococcus Escherichia coli Erysipelotrix Actinobacillus Haemophilus Mycoplasma Salmonella Chlamydia Dermatofitos: Microsporum Trichophyton
Sangre
La mayora de los rganos ya mencionados ms: Salmonella (intestino, hgado)) Mycoplasma, hongos (pulmn) Clostridium (hgado) Bacteroides, Spherophorus y Clostridium (tej. Necrtico) Haemophilus (cerebro bovino) Leptospira (rin) Streptococcus Escherichia coli Klebsiella Erysipelotrix Staphylococcus Bacillus
Fetos abortados
Leche
Streptococcus Staphylococcus Pseudomona Mycoplasma Corynebacterium Mycobacterium
Exudados de fstulas
Pstulas y costras de piel
Staphylococcus Dermatophilus Streptococcus
Material fecal
Actinomyces Staphylococcus Bacteroides Corynebacterium Coccidioides Nocardia E.coli Salmonella Klebsiella Pseudomona Proteus Enterococcus Mycobacterium
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BIBLIOGRAFA 1. De Miguel V., Nicols A. (1985). Manual de prcticas de Bacteriologa Mdica Veterinaria. Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia. Universidad Veracruzana. 1985. 2. Del Palacio-Hernanz A. Piedras. En: Micologa mdica. Torres-Rodrguez JM, Del Palacio-Hernanz A, Guarro- Artigas J, Negroni-Briz R, Pereiro-Miguens M (Eds.) Barcelona, Masson, 1993: 43-49. 3. Evans E.G.V., Richardson MD. Medical Mycology. A practical approach. Oxford, Oxford University Press, 1989. 4. Fitzgerald C., Helsel L, Nicholson M., Olsen S., Swerdolow D., Flahart T., Sexton J., Fields P (2001) Evaluation of Methos for Subtyping Campylobacter jejuni during an Outbreak Involving a Food handler. Journal of Clinical Microbiology, Vol. 39: 23862390. 5. Gottschalk, Marcelo; Higgins, Robert. (1991) Bacteriologa Veterinaria. Facultad de Medicina Veterinaria. Universidad de Montreal, Quebec, Canad. 6. Hay RJ, Moore MK. Mycology. En: Rook A, Wilkinson DS, Ebling FJG, Champion RHM, Burton JL, Burng DA (Eds.) Rook Wilkinson / Ebling. Textbook of Dermatology. 6th ed. Oxford, Blackwell Science. 1998: 1281-1376. 7. Jawetz E., Melnik J.L., Adelberg E.A. (1992). Microbiologa Mdica. Traduccin puesta al da segn la 19 edicin por QFB Mara del Rosario Carsolio Pacheco. Editorial El Manual Moderno, S.A. de C.V. 8. Merchant, I. A.; Packer, R.A. (1980). Bacteriologa y Virologa Veterinarias. 3. Edicin espaola de la 7. Edicin norteamericana. Editorial Acribia, Zaragoza Espaa. 9. Volk, Wesley A.; Benjamin, David C.; Kadner, Robert J., Parsons, Thomas J. (1988). Microbiologa Mdica. Traducido de la 3a. edicin en ingls de Essentials of Medical Microbiology. Ed. Manual de prcticas. Interamericana. Mc Graw Hill. 10. Weitzman I, Summerbell RC. The dermatophytes. Clin Microbiol Rev 1995; 8: 240259. 11. Schrank I.S., Mores M.A.Z, Costa J.L.A., Frazzon A.P.G., Soncini R., Schrank A., Vastein M.H., Silva S.C. (2001) Influence of enrichment media and applications of a PCR based method to detect Salmonella in poultry industry products and clinical samples. Veterinary Microbiology 82: 45-53.
102
12. http://www.eufic.org/sp/food/pag/food14.htm. Fecha de consulta: Abril 2003. 13. http://www.svamc.org/. Cutara Mara Soledad. Micologa. Captulo 4: Procesamiento de muestras superficiales. Revista Iberoamericana de Micologa ISBN: 84-607-3050-6. Fecha de consulta: Mayo de 2006.
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CITOPATOLOGA Dra. Adriana del Carmen Gutirrez Castillo*, Dr. en C. Valente Velzquez Ordoez** M. en C. Soledad Daz Zarco** Dr. en C. Mara Uxa Alonso Fresn**
*
Integrante del Cuerpo Acadmico de Patognesis Microbiana * Integrante del Cuerpo Acadmico de Salud Animal
INTRODUCCIN El examen citolgico es reconocido como una herramienta til para los veterinarios prcticos. En la mayora de las situaciones, las muestras citolgicas pueden ser colectadas rpido, fcilmente y de forma econmica. Generalmente las muestras pueden ser preparadas, teidas e interpretadas mientras el cliente espera. La interpretacin diagnstica con frecuencia es valiosa en el establecimiento de un diagnstico, identificacin de una enfermedad (neoplasia contra inflamacin), orientacin de terapia, formulacin de un pronstico o bien determinar que procedimiento diagnstico debe continuar despus. Como resultado de ello el paciente recibe mayor y mejor atencin y el cliente est ms satisfecho. La citologa diagnstica veterinaria es relativamente reciente pero a la vez su progresin ha sido muy rpida. La aplicabilidad de sta tcnica se adopt sobre todo en lo que se refiere a ciertas facetas de campo que la hacen de utilidad rpida. La operatividad que representa la citologa junto con otros mtodos clnicos ambulantes similares como podra ser la realizacin de hematocrito sirve al clnico para enfocar un diagnstico y un tratamiento adecuado, en un tiempo breve. Las tcnicas diagnsticas que ejecuta el clnico en su consulta las podemos extrapolar con la mayor y total inmediacin al veterinario que realiza la inspeccin de carnes y que como especialista debe desarrollar y complementar sus conocimientos en su mxima amplitud cumpliendo los preceptos normativos actuales. Por todo ello, la inspeccin sanitaria de carnes en mataderos debera conocer y utilizar este procedimiento diagnstico para los dictmenes que confieran una decisin grave. En esencia, la citologa se basa en la investigacin celular estudiando sus alteraciones de forma. Esta tcnica resulta una forma vlida y econmica, a veces de gran exactitud y otras, al menos, de valor orientativo en los procedimientos a seguir. Entre los diagnsticos de inters que la citologa puede facilitar a nivel facultativo y con repercusin en los dictmenes rpidos en la industria productora de carne, destacan las hiperplasias, las inflamaciones tanto agudas como crnicas y las tumoraciones, tanto benignas como malignas. Tambin, y sin necesidad de una gran infraestructura ni de tcnicas complejas, la citologa permite comprobar la presencia de procesos causados por agentes micticos y parasitarios. Por ltimo, la tcnica facilita la investigacin de los cambios estructurales de tejidos alterados por residuos derivados de la adicin ilegal de sustancias para engorde de animales de abasto, actual caballo de batalla en los mataderos europeos. Los procesos neoplsicos, las hiperplasias y los tumores en general son afecciones corrientes en nuestros animales de abasto. Es por ello que el diagnstico debe ser un aspecto imprescindible para ofrecer un dictamen adecuado a cada tipo de lesin. La actual normativa refleja la necesidad 104
de diferenciar entre la benignidad o malignidad de un proceso tumoral para efectuar un decomiso parcial o total de la carne del animal. La inspeccin sanitaria de carnes en mataderos comienza por la denominada inspeccin antemortem o en vivo que se efecta de manera obligatoria antes del sacrificio del animal. Esta inspeccin resulta bsica e imprescindible para completar un buen diagnstico y dictamen final sobre las carnes. En este contexto, la citologa diagnstica ofrece la posibilidad de investigar la presencia de residuos. Sustancias como los costicosteroides son diagnosticadas citolgicamente por cambios histolgicos en glndulas como el timo o las suprarrenales. La realizacin de citologas sanguneas junto con hemogramas completos, en concreto el recuento de leucocitos (linfocitos especialmente) en ganado bovino de abasto nos relaciona sus porcentajes con la administracin de corticosteroides. Las sustancias hormonales exgenas, por otra parte, pueden detectarse en la observacin de cambios celulares de la hipfisis. El clembuterol y otros anabolizantes B-agonistas se detecta en cambios del tejido que forma la trquea, aparato reproductor y en msculos especficos, as como en la observacin del lquido sinovial. El manejo de la citologa junto con los datos macroscpicos sobre el estado del animal ayuda a diferenciar y solventar muchas dudas. Una de las principales es correlacionar los cambios observados en diferentes tejidos y rganos con el uso de sustancias ilegales. Este sera el caso de otro de los anabolizantes empleados en el engorde ilegal del ganado de abasto como el Bestradiol, que provoca en el tejido seo y cartilaginoso una inmadurez que se observa mediante tcnicas citolgicas sencillas. COLECCIN Y PREPARACIN DE IMPRONTAS Las muestras citolgicas pueden ser colectadas mediante un hisopo, raspado o aspiracin de la lesin. Las tcnicas usadas para colectar muestras citolgicas y preparacin de laminillas varan, dependiendo de la localizacin anatmica, las caractersticas del tejido a muestrear y del paciente. De ser posible varias improntas deben prepararse, dejando algunas sin teir, estas ltimas estarn disponibles para tinciones especiales si es necesario. IMPRONTAS Las improntas para la evaluacin citolgicas pueden prepararse de lesiones externas en el animal vivo o de tejidos retirados durante la ciruga o la necropsia. Son fciles de obtener e implican mnima resistencia, pero se colectan menos clulas que en los raspados y contienen mayor cantidad de contaminantes (bacterianos y celulares) que las punciones con aguja delgada (PAD). Como resultado, las improntas de lesiones superficiales solo reflejan una infeccin secundaria bacteriana o una inflamacin inducida por displasia (trmino mdico que se refiere a cambios celulares atpicos, proliferativos, irregulares, reversibles en respuesta a la irritacin o inflamacin) en el tejido. Las improntas de lceras deben realizarse antes de que estas ltimas sean limpiadas. La lesin debe limpiarse entonces con una esponja quirrgica humedecida en solucin salina y realizarse otra impronta o raspado. Puede tambin realizarse una puncin con aguja delgada (PAD) del tejido debajo de la superficie de la lesin.
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En algunos casos, tales como en la infeccin por Dermatophilus congolensis (streptothricosis) e infeccin por Coccidioides immitis, las improntas de la lesin sucia contienen mucho menos organismos que las impresiones de lesiones limpias y que las muestras colectadas por PAD. Las improntas a partir de raspados en las lesiones producidas por Dermatophilus congolensis son las ms recomendadas. En otras condiciones puede obtenerse mayor informacin en las lesiones limpias que de las lesiones sin limpiar. Para colectar improntas de lesiones en piel limpias o tejidos colectados durante la ciruga o necropsia, la sangre y los tejidos fluidos deben primero retirarse de la superficie de la lesin con un material absorbente. La sangre en cantidad excesiva y los tejidos fluidos inhiben que las clulas se adhieran a la laminilla, produciendo una preparacin celular pobre. As mismo, el exceso de fluido inhibe que las clulas se distribuyan y asuman el tamao y forma que generalmente tienen en las improntas secadas al aire. La parte media de la laminilla de vidrio debe presionarse contra el tejido a muestrear. Aunque pueden realizarse mltiples impresiones, generalmente una sola impresin por laminilla es suficiente. De ser posible deben prepararse varias improntas para tenerlas disponibles para tinciones especiales si es necesario. La obtencin de improntas convencionales de cerviz se ha conservado por 5 dcadas. El muestreo inapropiado y la transferencia de la muestra son las principales causas de resultados fasos negativos. Cuando se preparan las improntas sin cuidado, no todo el material obtenido del cerviz es enviado al laboratorio en laminillas, sino que la mayora de las clulas de la muestra permanecen en los implementos con que se colectan. En contraste, los mtodos de coleccin con lquidos virtualmente obtienen todas las clulas de la muestra. RASPADOS Las improntas de raspados pueden ser preparadas a partir de tejidos colectados durante la necropsia o ciruga o de lesiones externas en el animal vivo. El raspado tiene la ventaja de colectar gran cantidad de clulas del tejido, sin embargo es desventajosa cuando la lesin es firme y se descaman pocas clulas. La mayor desventaja es que es ms difcil de colectar y solo se obtienen muestras superficiales. Como resultado, los raspados de lesiones superficiales con frecuencia solo reflejan una infeccin secundaria o bien inflamacin inducida por displasia del tejido. Esto limita su uso en el diagnstico de neoplasias. Los raspados se obtienen frotando la lesin con el filo de una navaja de bistur de forma perpendicular, pasndola varias veces por la lesin. El primer material obtenido se desecha y se procede a realizar otro raspado. El segundo raspado se deposita en una laminilla y se realiza el frotis colocando otra laminilla sobre la que contiene la muestra y se desliza cada una de ellas hacia lados opuestos, procurando mantener el material en un rea pequea del portaobjetos. El uso combinado del raspado y la tcnica de impronta es superior que el mtodo convencional de impronta nicamente, ya que se obtienen fragmentos de tejidos intactos, policromasia, detalles nucleares y citoplasmticos, las preparaciones delgadas permiten aplicar de mejor manera los criterios citolgicos y adems se obtiene un fondo libre de eritrocitos y eosina.
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HISOPOS O COTONETES Generalmente las improntas de hisopos son colectadas en caso de que las improntas, raspados o aspirados no se pueden hacer, tales como en tractos fistulosos y en colecciones vaginales. La lesin es limpiada primeramente con un hisopo estril humedecido. Para humedecer el hisopo debe utilizarse una solucin isotnica tal como el NaCl al 0.9%. Esto ayuda a minimizar el dao de las clulas durante la colecta y preparacin de las clulas. Si la lesin es muy hmeda, el hisopo no necesita humedecerse. Despus el hisopo se rueda gentilmente sobre la superficie limpia de una laminilla. No debe comprimirse el hisopo a travs de la superficie de la laminilla, porque esto causa un dao excesivo a las clulas. ASPIRACIN DE MASAS La PAD de biopsias puede ser colectada de masas (incluyendo ndulos linfticos, lesiones nodulares y rganos internos). Para lesiones cutneas, mediante la PAD se disminuye la contaminacin superficial (bacteriana y celular), pero se colectan menos clulas que en el raspado. Seleccin de la jeringa y la aguja: Las biopsias con PAD son colectadas con aguja del 21 al 25 y jeringas de 3 a 20 mL. Mientras ms suave sea el tejido a aspirar menor ser el dimetro de la aguja y la jeringa usadas. Se recomienda cuando mucho el calibre 21 para la aspiracin, aun tratndose de tejidos firmes tales como fibromas. Cuando se usa una jeringa mayor, tiende a aspirarse el centro del tejido y esto resulta en una preparacin citolgica pobre. As mismo las agujas ms grandes tienden a causar mayor contaminacin de sangre. El tamao de la jeringa usada est influenciado por la consistencia del tejido a ser aspirado. Los tejidos suaves, tales como ndulos linfticos, con frecuencia pueden ser aspirados exitosamente con jeringas de 3 mL. Los tejidos firmes, tales como fibromas y carcinomas de clulas escamosas, requieren de jeringas ms grandes para mantener una adecuada succin y que haya una suficiente coleccin de clulas del tejido. Ya que el tamao ideal de jeringa no se conoce antes de la aspiracin, la jeringa de 10 mL es de un tamao aceptable. La preparacin del sitio de aspiracin: Cuando pruebas microbiolgicas deban realizarse de la porcin colectada, o la muestra corresponde a una cavidad (peritoneal, y torcica, articulaciones, etc.), el rea de aspiracin debe prepararse de manera quirrgica. En otras situaciones, la preparacin de la piel es esencialmente la que se requiere para la vacunacin o la venopuncin. Un hisopo con alcohol puede usarse para limpiar el rea. Procedimiento de aspiracin: La masa a ser aspirada es sujetada firmemente para permitir la penetracin de la piel y la masa y controlar la direccin de la aguja. La aguja, con la jeringa integrada, es introducida en el centro de la masa y se aplica presin negativa llevando el mbolo hasta del volumen de la jeringa (Fig. 1). Varias reas de la masa pueden ser muestreadas, pero debe evitarse la aspiracin de la muestra dentro del cilindro de la jeringa para evitar la contaminacin del tejido aspirado. Para lograr esto, cuando la masa es lo suficientemente grande se permite que la aguja sea redirigida y movida hacia varias reas de la masa, manteniendo la presin negativa durante la reorientacin y movimiento de la aguja.
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Sin embargo, cuando la masa no es lo suficientemente grande para ser reorientada y movida sin daar la masa, la presin negativa es aligerada durante la reorientacin y movimiento de la aguja. En esta situacin, la presin negativa es aplicada solo cuando la aguja est esttica. Con frecuencia colectas de alta calidad en el aspirado no se observan en la jeringa y algunas veces ni en el cubo de la aguja.
Fig. 1 Cowell y Tyler, 1989 Despus de que varias reas son muestreadas, la presin negativa es retirada de la jeringa y la aguja es removida de la masa y de la piel. Enseguida, la aguja es retirada de la jeringa y se extrae la muestra cargando con aire nuevamente la jeringa y expeliendo el contenido sobre la parte media de la laminilla y se realiza la impronta rpidamente. La lesmaniasis cutnea es una enfermedad parasitaria y su diagnstico es importante para el xito de su tratamiento. La tcnica convencional de raspado es empleada para detectar al parsito y la PAD es usada rara vez. El valor de estas dos tcnicas para confirmar el diagnstico clnico fue comparado en 46 casos por Al-Jitawi y colaboradores en 1995. El estudio indic que ambos mtodos son iguales de eficientes para detectar la enfermedad, sin embargo la PAD es ms fcil, replicable y toma menos tiempo demostrar el organismo, por lo que la PAD se recomienda como mtodo de eleccin para confirmar la sospecha clnica de lesmaniasis cutnea en reas endmicas.
PREPARACIN DE IMPRONTAS DE ASPIRADOS DE MASAS SLIDAS Varios mtodos pueden usarse para preparar improntas para la evaluacin citolgica de masas slidas, incluyendo linfonodos. La experiencia de la persona preparando las improntas y caractersticas de la muestra influyen en la seleccin de la tcnica de preparacin de improntas. Se sugiere una combinacin de tcnicas.
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Tcnica combinada. Un procedimiento combinado incluye depositar el aspirado sobre la mitad de la laminilla. Colocar la laminilla con el preparado en una superficie slida y horizontal, colocar otra laminilla a un ngulo de 45 grados con la primera laminilla y ponerla en contacto con el aspirado (Fig. 2). Entonces desplazar suave y rpidamente la segunda laminilla como en las improntas de sangre. Enseguida colocar la primera laminilla horizontalmente en un frasco con alcohol de 96 grados de pureza.
Fig. 2. Cowell y Tyler 1989. Preparacin en squash. En manos expertas esta puede proporcionar improntas excelentes. Sin embargo en manos inexpertas, es frecuente que las improntas obtenidas sean ilegibles debido a que muchas clulas son rotas o la muestra no est suficientemente distribuida. Una preparacin en squash es hecha expeliendo el aspirado en la parte media de la laminilla y luego colocando una segunda laminilla sobre el aspirado de forma horizontal (Fig. 3). La segunda laminilla es entonces rpida y suavemente deslizada a travs de la primera laminilla.
Fig. 3 Cowell y Tyler 1989. Tcnica de squash modificada. Una modificacin de la tcnica de squash con menor tendencia hacia la ruptura de las clulas consiste en colocar la segunda laminilla sobre el aspirado, luego rotar la segunda laminilla 45 grados y levantar (Fig. 4).
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Fig. 4 Cowell y Tyler 1989. Otra tcnica de distribucin de la muestra consiste en depositar el aspirado perifricamente en varias direcciones con la punta de la aguja produciendo una forma de estrella de mar (Fig. 5). Esta tcnica no daa las clulas frgiles pero permite que el tejido fluido permanezca alrededor de las clulas. Algunas veces el fluido impide que las clulas se diseminen bien e interfiere con la evaluacin del detalle celular. Generalmente, sin embargo algunas reas aceptables estn presentes.
Fig. 5 Cowell y Tyler 1989. PREPARACIN DE IMPRONTAS DE FLUDOS Las improntas citolgicas deben prepararse inmediatamente despus de colectar el fluido. Cuando es posible, y sobre todo tratndose de clulas sanguneas, las muestras de fluidos para el examen citolgico deben colectarse en tubos con EDTA (cido etilendiaminotetractico), para garantizar la mejor conservacin del material obtenido. Las improntas pueden prepararse directamente de forma fresca, o bien mezclar el fluido o el sedimento de una muestra centrifugada con la tcnica de impronta de sangre (Fig. 6), en lnea (Fig. 7) o en squash (Fig. 3). La celularidad, viscosidad y homogeneidad del fluido influye en la seleccin de la tcnica de impronta.
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Fig. 6
Fig. 7 Cowell y Tyler 1989.
La tcnica de preparacin de improntas en squash en muestras viscosas y muestras con hilos de material es mejor que la tcnica de sangre. La tcnica de improntas de sangre generalmente produce improntas bien distribuidas de fluidos homogneos con suficiente celularidad, de 5000 clulas/microlitro o ms, pero con frecuencia produce improntas de insuficiente celularidad en fluidos que contienen menos de 5000 clulas /microlitro. La tcnica de impronta en lnea puede usarse en fluidos concentrados de baja celularidad, pero con frecuencia no se distribuyen suficientemente las clulas de los fluidos altamente celulares. En general, los fluidos traslcidos son de baja a moderada celularidad, mientras que los fluidos opacos son generalmente de alta celularidad. Por ellos, los fluidos traslcidos con frecuencia requieren concentracin, ya sea por centrifugacin o por la tcnica de impronta en lnea. Cuando es posible, la concentracin por centrifugacin se prefiere. Para concentrar fluidos por centrifugacin, el fluido es centrifugado 5 minutos a 165-360 G (gravedades). Esto equivale a operar una centrfuga con un brazo radial de 14.6 cm. de longitud (el ms comn en centrfugas para orina) a 1000-1500 rpm. Despus de la centrifugacin el sobrenadante es separado del sedimento y analizado para la concentracin de protena total. El sedimento es resuspendido en unas cuantas gotas del sobrenadante. Una gota del sedimento resuspendido es colocado en una laminilla y se hace una impronta mediante las tcnicas de squash o de impronta de sangre. Cuando el fluido no puede ser concentrado por centrifugacin o la muestra centrifugada es baja en celularidad, puede usarse la tcnica de impronta en lnea para concentrar las clulas en la impronta. Una gota de fluido es colocada sobre una laminilla limpia y la tcnica de impronta de sangre es usada, excepto en que la distribucin del material se hace permitiendo la formacin de una lnea conteniendo una concentracin ms alta de clulas que el resto de la laminilla. Desafortunadamente, una cantidad excesiva de fluido puede tambin permanecer en la lnea y evitar la buena distribucin de las clulas. Las improntas son fijadas en alcohol de 96 grados durante 10 minutos y pueden ser mantenidas en el alcohol o ser secadas al aire y enviadas al laboratorio para su anlisis.
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En caso de que no se tengan posibilidades de realizar las improntas los lquidos deben ser conservados con una cantidad de alcohol de 96 grados de pureza, en una proporcin 1:1 (muestra: alcohol), para posteriormente ser transportados al laboratorio para su estudio. MTODOS DE FIJACIN
La fijacin de los especimenes citolgicos depositados en una laminilla es vital para evitar cambios en la morfologa celular que indiscutiblemente van a alterar e incluso nulificar la interpretacin de los hallazgos microscpicos. Actualmente se utilizan dos mtodos de fijacin basados en el nivel de hidratacin de la clula al momento de la fijacin. Cada uno conlleva ventajas y desventajas sobre el otro; sin embargo, no se contraponen, ms an son complementarios. Aunque dependiendo la formacin del citopatlogo, este preferir alguno de los dos, ya que las tinciones y la interpretacin de los hallazgos microscpicos son un tanto diferentes entre uno y otro. 1.- Fijacin en seco: Tambin denominada fijacin al aire, o mal llamada muestras sin fijar. En esta una vez que se ha realizado el frotis se debe secar lo ms rpido que sea posible, incluso puede recurrirse a realizar movimientos en abanico. Ya que el frotis se ha secado; es decir, que las clulas presentes en ese frotis estn totalmente secas se procede a aplicar el fijador sobre la laminilla por un periodo no menor a tres minutos. El fijador de eleccin para estos casos es el metanol. Este tipo de fijacin se utiliza primordialmente para tinciones tipo Romanowsky (Wright, Giemsa, Diff-Quik, etc.). 2.- Fijacin en Hmedo: Tambin denominada por algunos autores como fijacin en alcohol. En este caso, al terminar de realizar el frotis este debe contactar con el fijador en un periodo no mayor a tres segundos, sin permitir que la laminilla se seque. Es decir la clula debe estar perfectamente hidratada al momento que se fija, de ah el nombre de fijacin en hmedo. Si se utiliza alcohol etlico 96 como fijador, la laminilla debe sumergirse en este por un periodo mnimo de quince minutos. Transcurrido este tiempo, la laminilla se saca del fijador y se seca al aire, para ser remitida al laboratorio. El uso de alcohol, es una manera sencilla y econmica para fijar los especmenes citolgicos, pero no es la nica; ya que pueden emplearse fijadores en aerosol, los cuales crean una capa protectora sobre las clulas, lo que las preserva en ptimas condiciones, sobre todo si las laminillas tardaran varios das en llegar al laboratorio, como es el caso de las muestras remitidas a travs del correo o de la mensajera. En este caso, una vez realizado el frotis y antes de que se seque el material, se debe aplicar una capa del aerosol sobre la laminilla a una distancia no menor a 20 cm y dejar secar al aire. En el mercado, existen muy diversas marcas de fijadores citolgicos en aerosol, conocidos coloquialmente como "cito-spray", los cuales tienen un costo muy accesible. Las muestras fijadas en hmedo son las ptimas para realizar la tincin de Papanicolau, que es la tincin citolgica por excelencia. Adems de Hematoxilina-Eosina y toda la gama de histoqumicas. Todo lo anterior debe dejar muy claro que es de vital importancia comunicar al laboratorio el mtodo de fijacin que se ha empleado en cada caso, para que el laboratorio seleccione el tren de tincin ms conveniente en cada caso.
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FACTORES QUE AFECTAN LA COLECCIN DE MUESTRAS Clnicos. Los clnicos deben recibir entrenamiento apropiado en la toma de muestras, en la preparacin y fijacin de los frotis. El laboratorio, por supuesto, no puede controlar la coleccin de la muestra, por lo tanto es responsabilidad de la persona que toma la muestra minimizar los artefactos que se producen como resultado de una mala recoleccin o fijacin de la misma. Instrumento para la recoleccin. Los instrumentos para la colecta de muestras juegan un rol importante en la obtencin de una muestra adecuada. La forma, superficie, textura y material del implemento puede determinar qu tanto del tejido raspado es depositado en las laminillas y est disponible para su anlisis. En el caso de muestras vaginales el uso combinado de una esptula y un cepillo endocervical permite obtener mejor material. Nmero de laminillas. Algunos estudios han demostrado que dos laminillas detectan ms anormalidades que una. El nmero de laminillas influye en la sensibilidad del estudio, esto tambin puede reflejar el uso de dos tipos de implementos en el muestreo, la cantidad de material y la mejor conservacin de la muestra. Fijacin. La fijacin inicial en una preparacin citolgica es crtica para la posterior interpretacin de la muestra. El fijador ideal es aquel que causa menor distorsin en la morfologa celular y nuclear. La mayora de los fijadores comerciales contienen alcohol (etanol) como base con propilenglicol como aditivo para preservar el material celular. Desafortunadamente no contienen aditivos para evitar la lisis de las clulas sanguneas, lquidos extracelulares y moco, por lo que esto se dispersa en toda la extensin impidiendo que las clulas sean observadas adecuadamente. Mtodos alternativos han sido desarrollados mediante el empleo de Cytorich Red System (Roche Image Analysis Systems, Inc., Eaton Collage, North Carolina, U.S.A.), el cual evita el acumulo de sangre y lquidos extracelulares en el fondo de las preparaciones, que pueden interferir en la preparacin e interpretacin de la muestra. Conservacin de la muestra posterior a su colecta. La muestra debe permanecer refrigerada todo el tiempo posterior a la toma. El tiempo entre la toma y el procesamiento no debe superar las 24 hrs. En el caso de las efusiones. Si el tiempo de envi supera las 24 hrs. La muestra debe prefijarse realizando una dilucin 1:10 con alcohol etlico 96 y mantenerse en refrigeracin.
BIBLIOGRAFA: 1. Al-Jitawi, S.A.; Farraj, S. E.; Ramahi, S.A. (1995). Conventional scraping versus fine needle aspiration cytology in the diagnosis of cutaneus Leishmaniasis. Acta Cytologica. Volume 39, Number 1, January-February. Pgs. 82-84. 2. Cowell, R. L.; Tyler, R. D., (1989). Diagnostic cytology of the dog and cat. 1st. ed., American Veterinary Publications, Inc. 3. Cowell, T. L.; Tyler, R. D. (1992). Cytology and hematology of the horse. 1st. ed., American Veterinary Publications, Inc. 4. Durall, N (1994). Citologa: Principales diagnsticos Ars Veterinaria. Barcelona Espaa. Jornadas Dermatologa.
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5. Koss, L. G.; Woyke, S.; Olszewsky, W., (1988). Biopsia por aspiracin. Interpretacin citolgica y bases histolgicas. Primera. Ed. Editorial Panamericana. 6. Mc Googan, E.; Colgan, T. J.; Ramzy, I. (1998): Cell preparation methods and criteria for simple adequacy. Acta Cytologica. Volume 42, Number 1/January-February. Pgs.: 25-32. 7. Weidman, J.; Chaubal, A.; Bibbo, M. (1997). Cellular Fixation. A study of cytorich redand cytospin collection fluid. Acta Cytologica. Volume 41, Number 1/January-February. Pgs.: 182-187. 8. Yang, G. C. H.; Hoda, S.A. (1997). Combined use of the Scratch and smear sampling technique and ultrafast Papanicolaou stain for intraoperative cytology. Acta Cytologica. Volume 41, Number 5/September.October. Pgs.: 1513-1518. 9. http://www.consumaseguridad.com/web/es/investigacion. La inspeccin sanitaria en mataderos: La citologa diagnstica se ha confirmado como una de las tcnicas de anlisis preferente por su fiabilidad, rapidez y asequibilidad. Javier de Benito Langa. 10 de junio de 2003. Academia de Ciencias Veterinarias de Catalua. Fecha de consulta 4 de mayo de 2006. 10. http://www.ammvepe.com/mascota/mascotas.html. Curso de Oncologa en Pequeas Especies. Toma de muestras cito-histopatolgicas. MVZ EDV Ignacio Carlos Rangel Rodrguez. Responsable del Laboratorio de Citopatologa, Facultad de Estudios Superiores Cuautitln, UNAM. Fecha de consulta 4 de mayo de 2006.
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INMUNOHISTOQUMICA
Dra. Mara Uxa Alonso Fresn* Dr. Valente Velzquez Ordoez* M. en C. Soledad Daz Zarco* Dra. Adriana del Carmen Gutirrez Castillo**
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Integrante del Cuerpo Acadmico en Salud Animal Integrante del Cuerpo Acadmico en Patognesis Microbiana
INTRODUCCIN La inmunohistoqumica es la tcnica que se utiliza para localizar antgenos en secciones de tejido utilizando anticuerpos marcados, a travs de interacciones antgeno-anticuerpo especficos visualizadas por un marcador conjugado como son la fluorescencia, enzimas, un elemento radioactivo u oro coloidal. Coons y colaboradores (Coons y col. 1941, 1955 de Albert H.; Los Coons y Kaplan 1950) fueron los primeros en marcar anticuerpos con fluorescencia, y lo utilizaron para identificar antgenos en secciones de tejido. Con el uso y desarrollo de la tcnica, se han utilizado marcadores enzimticos como la peroxidasa (Nakane y Pierce 1966; Avrameas y Uriel 1966) y la fosfatasa alcalina (Masn y Sammons 1978). El oro coloidal como marcador (Faulk y Taylor 1971) tambin se ha utilizado para identificar reacciones inmunohistoqumicas en microscopa de luz y electrnica. Otros marcadores incluyen elementos radioactivos, pudindose visualizar la inmunoreaccin mediante radiografas. Puesto que la tcnica implica la reaccin especfica antgeno-anticuerpo, tiene ventajas evidentes sobre las tcnicas tradicionales de coloracin especial y enzimticas que solamente identifican un nmero limitado de protenas, de enzimas y de estructuras tisulares, por lo que ha llegado a ser una tcnica importante y ampliamente utilizada en muchos laboratorios de investigacin mdica as como de diagnstico clnico. Existen numerosos mtodos inmunohistoqumicos que se pueden utilizar para localizar antgenos. La seleccin de un mtodo debe basarse en parmetros tales como el tipo de espcimen bajo investigacin y del grado de sensibilidad requerido. FACTORES QUE INFLUYEN EN LA INMUNOMARCACIN Existen dos factores que influyen sobre la calidad de la inmunorreaccin. En primer lugar se encuentran las caractersticas del tejido y su preservacin antignica. La conservacin adecuada de las caractersticas antignicas del tejido depende del tipo de fijador empleado, de una fijacin adecuada y del tiempo de fijacin. En segundo lugar se encuentran los elementos externos al tejido que pueden controlarse como: el tipo de anticuerpo utilizado, la sensibilidad y la dilucin, el sistema de deteccin, los cromgenos empleados, el mtodo de recuperacin utilizado y la interpretacin de la reaccin por el patlogo. PROCESAMIENTO DE TEJIDOS Fijacin: La preparacin del tejido es la base de la tcnica. Para asegurar la conservacin de la arquitectura del tejido y de la morfologa celular, se requiere de una fijacin rpida y adecuada. Una fijacin inadecuada o prolongada puede disminuir perceptiblemente la capacidad de unin del anticuerpo.
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No existe un fijador universal ideal para la demostracin de todos los antgenos. Sin embargo, muchos antgenos pueden demostrarse en cortes de tejidos fijados con formaldehido y embebidos en parafina. Para obtener mejores resultados, los tejidos procedentes de vertebrados (especialmente tejidos neuronales) requieren generalmente de fijacin mediante perfusin para la conservacin ptima del tejido. Las soluciones fijadoras ms comnmente utilizadas son las siguientes: a) paraformaldehido al 4% en amortiguador de fosfato 0.1 M b) paraformaldehido al 2% adicionado con 0.2% de cido pcrico en amortiguador de fosfato 0.1 M c) Fijador PLP: para formaldehido al 4%, 0.2% de peryodato y lisina al 1.2% en amortiguador de fosfato 0.1M d) paraformaldehdol 4% adicionado con 0.05% de glutaraldehdo Algunos antgenos no resisten la fijacin con aldehdos, por lo que los tejidos frescos deben congelarse rpidamente en nitrgeno lquido y cortarse utilizando un criostato. Las secciones deben mantenerse congeladas a -20 C o menos hasta su fijacin utilizando acetona o alcohol fro. Despus de la fijacin, las secciones pueden procesarse con protocolos inmunohistoqumicos estndar. Corte: Desde su introduccin, la parafina ha sido el medio de inclusin ms ampliamente utilizado para el diagnstico histopatolgico, por lo que la mayor parte del material se ha procesado utilizando como fijador el formaldehdo en cortes incluidos en parafina. Los cortes de parafina producen resultados satisfactorios para la demostracin de la mayora de antgenos mediante el uso de tcnicas de recuperacin del antgeno. Ciertos antgenos celulares se degradan al utilizar la fijacin e inclusin de rutina, por lo que el uso de cortes congelados es esencial para su demostracin. Entre las desventajas en el uso de cortes congelados estn: prdida de la morfologa, prdida de la resolucin en aumentos microscpicos mayores, se requiere de almacenaje especial, limitacin para realizar estudios retrospectivos y dificultad en el corte para algunos tejidos. Preparacin de montaje completo: Pueden procesarse pequeos bloques de tejido (de menos de 5 milmetros de grueso) como montajes enteros. La ventaja de ste tipo de preparaciones es que proporcionan informacin tridimensional sobre la localizacin de antgenos sin la necesidad de la reconstruccin de secciones. Su limitacin principal es la penetracin incompleta del anticuerpo en el tejido, dando por resultado una coloracin desigual o falsa negativa. El tratamiento con Tritn X-100 o con saponina se utiliza para ayudar con la penetracin del anticuerpo. RECUPERACIN DE ANTGENOS La demostracin de muchos antgenos puede mejorarse mediante el tratamiento previo con reactivos de recuperacin del antgeno que rompen los enlaces proteicos cruzados formados por la fijacin con formaldehido, dejando al descubierto sitios antignicos ocultos. stos implican el uso de calor en diferentes perodos de tiempo en los cortes incluidos en parafina utilizando una solucin acuosa (designada comnmente solucin de recuperacin). Esto se llama recuperacin del eptope provocada por calor (HIER). Otro mtodo utiliza digestin enzimtica y se llama recuperacin del eptope inducida por protelisis (PIER). Entre los aparatos de mayor uso para el mtodo de calentamiento se tiene al horno de microondas, la olla de presin y las vaporeras. Otros equipos utilizados incluyen a la autoclave y bao mara. El tiempo de calefaccin durante 20 minutos parece ser el ms satisfactorio y el enfriamiento tarda generalmente cerca de 20 minutos. La solucin ms comnmente usada para la recuperacin de antgenos es el amortiguador de citrato pH 6.0, adecuada para la mayor parte de los anticuerpos. El TRIS-EDTA pH 9.0 y el EDTA pH 8.0 son otras soluciones que tambin se 116
utilizan para la recuperacin. La proteinasa K es un reactivo eficaz para la digestin de antgenos de membrana tales como integrinas, CD3 vWF. El mtodo proteoltico a travs enzimas (tales como proteinasa k, tripsina, quimiotripsina, pepsina y otras proteasas) tambin se ha utilizado para restaurar la inmunoreactividad de los antgenos del tejido. Sin embargo, el uso del mtodo de digestin enzimtica puede destruir ciertos eptopes y la morfologa del tejido. Por lo tanto, debe probarse el tiempo ptimo de incubacin as como la concentracin de la enzima. La combinacin de los mtodos enzimticos y proteolticos mediante calor son procedimientos alternativos para desenmascarar antgenos si no funcionan otros mtodos. Son especialmente tiles cuando se requieren localizar dos o tres antgenos al mismo tiempo. Es importante mejorar la penetracin del anticuerpo para lograr una buena coloracin inmunohistoqumica de las secciones congeladas. El Tritn X-100 es el detergente de eleccin para mejorar la penetracin del anticuerpo. Sin embargo, no es apropiado para el uso de antgenos de membrana puesto que las destruye. Algunos investigadores prefieren el mtodo de congelado y descongelado para mejorar la penetracin del anticuerpo. El tratamiento con borohidruro de sodio (al 1% en amortiguador de fosfato) tambin se utiliza para desenmascarar antgenos, particularmente en tejido fijado con glutaraldehdo para reducir los enlaces que se pudieran formar debido al tratamiento con glutaraldehdo. MTODOS INMUNOHISTOQUMICOS Bloqueo: La coloracin de fondo puede ser especfica o inespecfica. La fijacin inadecuada o retrasada puede dar lugar a resultados falsos positivos debido a la absorcin pasiva de la protena del suero y a la difusin del antgeno. Estos falsos positivos son comunes en el centro de bloques grandes de tejido o en tejidos en los cuales la fijacin se retras. Los anticuerpos, en especial los policlonales, se contaminan a veces con otros anticuerpos debido a la impureza del antgeno utilizado para inmunizar al animal. La causa principal de coloracin de fondo inespecfica es la atraccin no-inmunolgica de sueros inmunes especficos debidas a fuerzas hidrofbicas y electrostticas en ciertos sitios dentro de secciones del tejido. Esta forma de coloracin de fondo es uniforme generalmente y puede reducirse bloqueando esos sitios con suero normal. En muchos tejidos existe actividad endgena de la peroxidasa. La solucin para eliminarla se da con un tratamiento previo del corte de tejido con perxido de hidrgeno antes de la incubacin con el anticuerpo primario. Muchos tejidos tambin contienen actividad endgena de fosfatasa alcalina (AP) y se deben bloquearse con un tratamiento previo del corte de tejido con levamisol. Algunos tejidos tales como el hgado y rin contienen biotina endgena. Para evitar la unin de la avidina con la biotina endgena debe bloquearse con avidina no conjugada que luego se satura con biotina si se va a usar el sistema de deteccin biotina-avidina. Existe tambin autofluorescencia o fluorescencia natural en algunos tejidos y puede causar problemas de coloracin de fondo cuando se utilizan conjugados fluorescentes. La prueba ms simple es observar las secciones de tejido bajo un microscopio de fluorescencia antes de cualquier incubacin con el anticuerpo marcado. Si se detecta autofluorescencia en las secciones del tejido, la mejor solucin es elegir enzimas u otros mtodos de conjugacin. Controles: Deben correrse controles especiales para probar los protocolos y para probar la especificidad del anticuerpo utilizado. El control positivo prueba un protocolo o un procedimiento usado. Deber utilizarse un tejido positivo conocido como control. Si el control de tejido positivo da una coloracin negativa, el protocolo y el procedimiento debern ajustarse hasta que se obtenga una buena coloracin positiva. 117
El control negativo prueba la especificidad del anticuerpo implicado. Primero, ninguna coloracin debe observarse omitiendo el anticuerpo primario o reemplazando el anticuerpo primario especfico por un suero normal (de la misma especie que el anticuerpo primario). Este es un control que debe utilizarse rutinariamente en la coloracin inmunohistoqumica. En segundo lugar, la coloracin debe inhibirse por adsorcin del anticuerpo primario con antgeno purificado antes de su uso, pero no por la adsorcin con otros antgenos relacionados o no relacionados. Este tipo de control negativo es ideal y necesario en la caracterizacin y evaluacin de nuevos anticuerpos pero a veces es difcil obtener el antgeno purificado, por lo tanto no se utiliza rutinariamente en la coloracin inmunohistoqumica. Mtodo directo: El mtodo directo consiste de un paso nico, e implica un anticuerpo conjugado con isotiocianato de fluorescena (FITC) que reacciona directamente con el antgeno en secciones del tejido. Esta tcnica utiliza solamente un anticuerpo y el procedimiento es corto y sencillo. Sin embargo, es poco sensible debido a la poca amplificacin de la reaccin y ya se usa poco desde la introduccin de mtodo indirecto. Mtodo indirecto: El mtodo indirecto implica un anticuerpo primario sin conjugar (primera capa) que reacciona con el antgeno del tejido, y un anticuerpo secundario marcado (segunda capa) que reacciona con el anticuerpo primario (nota: el anticuerpo secundario debe ser contra la IgG de la especie animal en la cual se ha producido el anticuerpo primario). Este mtodo es ms sensible debido a la amplificacin de la reaccin con varias reacciones secundarias del anticuerpo con diversos sitios antignicos del anticuerpo primario. Adems, es econmico puesto que una segunda capa marcada con anticuerpo conjugado puede reaccionar con muchos anticuerpos de la primera capa. El anticuerpo secundario puede conjugarse con un tinte fluorescente tal como FITC, rodamina o rojo de Texas, y a esto se le llama mtodo de la inmunofluorescencia indirecta. Tambin puede conjugarse el anticuerpo secundario con enzimas como la peroxidasa, fosfatasa alcalina o glucosa oxidasa, y a esto se le llama mtodo indirecto inmunoenzimtico. Mtodo PAP (mtodo de la peroxidasa-antiperoxidasa): El mtodo PAP es otro desarrollo de la tcnica indirecta e implica una tercera capa que se trata de un anticuerpo marcado con peroxidasa, para hacer un complejo muy estable de peroxidasaantiperoxidasa. El complejo, integrado por la gamma-globulina y la peroxidasa, acta como una tercera capa de antgeno y se une a la gamma-globulina sin conjugar desarrollada en otra especie de la segunda capa. La sensibilidad es cerca de 100 a 1000 veces ms alta puesto que la molcula de la peroxidasa qumicamente no se conjuga a la anti-IgG sino est limitada inmunolgicamente, y no pierde ninguna actividad enzimtica. Tambin permite una dilucin mucho ms alta del anticuerpo primario, as se eliminan muchos de los anticuerpos indeseados y se reduce la coloracin inespecfica de fondo. Mtodo del complejo Avidina-Biotina (ABC): El mtodo ABC es un mtodo estndar y una de las tcnicas ms ampliamente utilizadas. La avidina, una glicoprotena grande, se puede conjugar con la peroxidasa o fluorescena y tiene una afinidad muy alta por la biotina.
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La biotina, una vitamina de bajo peso molecular, se puede conjugar a una variedad de molculas biolgicas tales como anticuerpos. La tcnica implica tres capas. La primera capa es un anticuerpo primario sin conjugar. La segunda capa es un anticuerpo secundario biotinlado. La tercera capa es un complejo de peroxidasaavidina-biotina. Se desarrolla el color de la peroxidasa utilizando un sustrato adecuado para producir diversos productos finales colorimtricos. Mtodo de la biotina marcada con Estreptavidina (LSAB): La estreptavidina, derivada del Streptococcus avidinii, es una innovacin reciente en la que se substituye a la avidina. La molcula de la estreptavidina no se encuentra cargada en relacin con el tejido, a diferencia de la avidina que tiene un punto isoelctrico de 10, por lo que no existe unin electrosttica al tejido. Adems, la estreptavidina no contiene grupos carbohidrato que pudieran unirse a las lectinas del tejido, que pudieran dar como resultado una coloracin del fondo. Esta es una tcnica similar al mtodo estndar ABC. La primera capa consiste de un anticuerpo primario sin marcar. La segunda se forma con un anticuerpo secundario biotinilado. La tercera capa consiste en la estreptavidina conjugada con una enzima (HRP-Estreptavidina o APEstreptavidina) para substituir al complejo de la avidina-biotina-peroxidasa. La enzima se visualiza utilizando soluciones de cromgeno para el substrato y as producir diversos productos finales colorimtricos. La tercera capa puede ser tambin una sustancia fluorescente conjugada a la Estreptavidina por ejemplo FITC. Este mtodo es cerca de 5 a 10 veces ms sensible que mtodo estndar ABC. Mtodos polimricos: Existen diversos mtodos comerciales basados en la polimerizacin de sustancias. Entre ellos se tienen: 1) DakoCytomation EnVision Systems se basa en tecnologa del polmero dextrano. Este permite unir una gran cantidad de molculas de la enzima (peroxidasa del rbano picante o fosfatasa alcalina) a un anticuerpo secundario va la cadena principal del dextrano. Las ventajas son muchas, incluyendo sensibilidad creciente, reduccin de reacciones de fondo no especfico al mnimo y una reduccin en el nmero total de pasos del anlisis con respecto a tcnicas convencionales. El protocolo es: i) aplicacin del anticuerpo primario; ii) aplicacin del polmero marcado con la enzima; iii) aplicacin del cromgeno del substrato. Este se desarroll despus para proporcionar una mayor sensibilidad. 2) ImmPRESS de Vector es un sistema que se basa en un nuevo mtodo de polimerizar enzimas y de unir estos polmeros a los anticuerpos. Se forman as micropolmeros que evitan el uso de dextranos u otras macromolculas como base. La unin de un Atadura de un micropolmero nico con una alta densidad de una enzima muy activa a un anticuerpo secundario genera un reactivo que proporciona una mayor accesibilidad a su blanco. El resultado es una sensibilidad excepcional, as como de intensidad de la seal, baja coloracin de fondo, y unin no especfica reducida. El protocolo es: i) aplicacin del anticuerpo primario; ii) aplicacin del polmero marcado con la enzima; iii) y aplicacin del cromgeno para el substrato. Mtodos CSA de DakoCytomation: 1) Los sistemas CSA utilizan una amplificacin de seal de la tiramida. Es ideal para los utilizarlo en: i) Deteccin de pequeas cantidades de antgeno; ii) Aumento en el funcionamiento de
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anticuerpos con baja afinidad de ratn y conejo; iii) Permitir la compatibilidad de ciertos anticuerpos difciles de ratn y conejo con cortes de tejido embebidos en parafina. El protocolo sera:
1. Aplicacin del anticuerpo primario. 2. Aplicacin del anticuerpo de unin biotinlado. 3. Aplicacin del reactivo de amplificacin de la tiramida. 4. Aplicacin de la Estreptavidina-HRP. 5. Aplicacin del sustrato cromgeno. 2) CSA II - sistema de amplificacin de seal de Tiramida libre de Biotina.- es una tincin IHC altamente sensible (IHC) que incorpora un mtodo de amplificacin de seal basado en la deposicin catalizada por la peroxidasa de un compuesto fenlico marcado con fluorescena, seguido de una reaccin secundaria con un anticuerpo anti-fluorescena marcado con peroxidasa. En el procedimiento, un anticuerpo primario desarrollado en ratn se detecta con un anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa. El paso siguiente utiliza la peroxidasa unida para catalizar la oxidacin de un fenol conjugado con fluorescena (fluorescil-tiramida) que precipita sobre la muestra. El procedimiento contina con la deteccin de la fluorescena unida a travs de una antifluorescena conjugada con peroxidasa. La coloracin se completa al utilizar la diaminobencidina/perxido de hidrgeno como cromgeno/substrato, y puede observarse con un microscopio de luz comn. En comparacin con los mtodos inmunohistoqumicos estndar, los mtodos de amplificacin de la tiramida se han reportado como mucho ms sensibles. Mtodos de coloracin mltiple: A menudo es til poder teir dos o ms antgenos en una misma seccin de tejido. Esto se puede lograr a travs del mtodo de la inmunofluorescencia utilizando diversos colorantes fluorescentes. La coloracin mltiple se puede lograr tambin con anticuerpos conjugados con peroxidasa desarrollados con diversos substratos de cromgeno para producir productos finales de varios colores. La dilucin del anticuerpo es un factor importante a considerar. Finalmente, la combinacin adecuada de color es crucial tambin puesto que una combinacin incorrecta de color puede producir resultado pobre y no poder as demostrar antgenos mltiples en la misma seccin. Para un mejor resultado, se debe ser cuidadoso en el diseo y estandarizacin de protocolos de tincin mltiples. Mtodo inmunohistoqumico para microscopa electrnica Estas tcnicas se pueden dividir en dos grupos: en las que la inmunotincin se lleva a cabo antes de embeber al tejido en resina y las que la llevan a cabo despus de embeber al tejido en resina. El escoger cualquiera de las dos tcnicas depender de la distribucin y caractersticas tanto del antgeno como del anticuerpo primario. Antes de llevar a cabo el mtodo inmunohistoqumico habr que realizar pruebas de dilucin del anticuerpo primario en microscopa de luz. Varios mtodos recientemente desarrollados se basan en el etiquetado con partculas de oro coloidal. Estos mtodos fueron introducidos originalmente para microscopia electrnica (Faulk y Taylor 1971) debido a que las partculas oro son fcilmente visibles con el microscopio electrnico, y son tiles tambin tiles para la microscopia de luz. Debido a que las partculas de oro pueden fabricarse en diversos tamaos de 5 a 30 nanmetros, es posible realizar coloraciones mltiples para usarse en el microscopio electrnico, por etiquetado directo de los anticuerpos primarios con partculas de diferente tamao. Las tcnicas indirectas pueden tambin utilizarse en el etiquetado doble o triple en paralelo si los anticuerpos primarios son de varias especies, y en secuencia si los anticuerpos primarios son de la misma especie. 120
INTERPRETACIN: Debe informarse la inmunorreaccin (positiva o negativa) y la distribucin citolgica (nuclear, membranosa o citoplsmica) y las caractersticas de expresin de los antgenos empleados. REFERENCIAS: 1. Immunochemistry: An advances textbook. (1977). John Wiley & Sons. London. 2. Jorge Buys, D.L.; Lara Torres, C.O. y Ortiz Hidalgo C. (2007). Interpretacin bsica de inmunohistoqumica. Caractersticas generales de diversos anticuerpos y su localizacin celular y subcelular. Patologa Revista Latinoamericana. 45 (3): 126-140. 3. Giorno R. (1984). A comparison of two immunoperoxidase staining methods based on the avidinbiotin interaction. Diagn Immunol. 2(3):161-6. 4. Nagle RB, Clark VA, McDaniel KM, Davis JR. (1983). Immunohistochemical demonstration of keratins in human ovarian neoplasms. A comparison of methods. J Histochem Cytochem. 31(8):1010-4. 5. Oros J, Matsushita S, Rodriguez JL, Rodrguez F, Fernndez A. (1996). Demonstration of rat CAR bacillus using a labelled streptavidin biotin (LSAB) method. J Vet Med Sci. 58(12):1219-21. 6. Milde P, Merke J, Ritz E, Haussler MR and Rauterberg EW. (1989). Immunohistochemical detection of 1,25-dihydroxyvitamin D3 receptors and estrogen receptors by monoclonal antibodies: comparison of four immunoperoxidase methods. J Histochem Cytochem 37(11): 1609-1617. 7. Taylor, CR. (2000). The Total Test Approach to Standarization of Immunohistochemistry. Arch Pathol Lab Med 124:945-951. 8. Shi ZR, Itzkowitz SH, and Kim YS. (1988). A comparison of three immunoperoxidase techniques for antigen detection in colorectal carcinoma tissues. J. Histochem. Cytochem. 36: 317-322.
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CITOMETRA DE FLUJO Dra. Claudia Giovanna Peuelas Rivas
INTRODUCCIN La citometra de flujo tiene como objetivo principal el separar subpoblaciones homogneas, de poblaciones heterogneas por los principios de tamao, complejidad y fluorescencia relativa. En la medicina humana se ha convertido en una herramienta clnica indispensable en el diagnstico de enfermedades como lo es la leucemia, dando as un correcto pronstico y tratamiento de la misma. En pacientes trasplantados se puede llevar un control del sistema inmune de los pacientes. En la medicina veterinaria est empezando a ser una herramienta diagnstica importante en enfermedades como la anemia hemoltica en equinos, linfomas en perros y en general para llevar el control de los pacientes inmunosuprimidos. La citometra de flujo puede ser utilizada para identificar propiedades fsicas y fisiolgicas de las clulas de la sangre, fluidos y tejido de pacientes humanos o veterinarios. Las caractersticas de las clulas pueden ser determinadas al incidir en ellas el rayo del lser del citmetro de flujo ocasionando cambios en las propiedades de dispersin de luz. Otros componentes y funciones celulares pueden ser definidos a travs de la aplicacin de fluorocromos afines a los componentes celulares o por medio del uso de anticuerpos monoclonales (Davis et al., 2002). Aplicaciones de la citometra de Flujo en la medicina veterinaria Inmunofenotipaje El inmunofenotipaje de linfocitos perifricos y de clulas linfoides se ha convertido en una prctica rutinaria para la investigacin clnica y bsica. El inmunofenotipaje ms comn en la medicina humana es la determinacin de clulas T CD4+ (cooperadoras) y T CD8+ (citotxicas) en pacientes inmunosuprimidos. En caballos, el inmunofenotipaje ha servido para caracterizar linfocitos T y B con el sndrome de inmunodeficiencia (Leber et al., 1998; Flaminio et al., 1998). Tambin con ello se han podido definir variaciones normales que ocurren en el sistema inmune en equinos durante su crecimiento as como a la exposicin a antgenos del ambiente (Balson et al., 1997; Flaminio et al., 1998a, 1999, 2000). En perros, el inmunofenotipaje es un mtodo objetivo confiable para el pronstico de enfermedades linfoproliferativas caracterizadas por linfocitosis (Williams et al., 2008). Enfermedades inmunomediadas La citometra de flujo se ha utilizado para detectar anticuerpos unidos a la superficie de eritrocitos y plaquetas en casos de anemia hemoltica inmunomediada y trombocitopenia (Zaruby et al., 1992). Las pruebas con anticuerpos para isotipos especficos de inmunoglobulinas equinas IgM, IgG e IgA pueden determinar el tipo de anticuerpos en casos de isoeritrolisis neonatal para dar un adecuado pronstico de la enfermedad (Wilkerson et al., 2000). Los perros con enfermedades inmunomediadas tienen mayor riesgo de desarrollar anticuerpos contra eritrocitos. La citometra de flujo es la prueba ms sensible para el diagnstico de anemia hemoltica inmunomediada (Morley, et al., 2008).
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En el caso de neoplasias en mediastino, las ms comunes en perros son los linfomas o timomas. Con el uso de anticuerpos monoclonales anti CD4+ y anti CD8+, se puede dar un diagnstico preciso de uno u otro. En los timomas se observa que 10% coexpresan CD4 y CD8, mientras que en los timomas <2% son CD4+CD8+. Los linfomas adems expresan clulas B (CD19) (Lana et al., 2006). Trombocitopenia La citometra de flujo es una herramienta para el diagnstico y el monitoreo no invasivo de la respuesta de la mdula sea en pacientes trombocitopnicos. La trombopoiesis puede ser evaluada por la circulacin de las nuevas plaquetas circulantes con una tincin de cido nucleico, el cual se une a ARN en plaquetas reticulares jvenes (Rusell et al., 1997 y Sellon et al., 1996). Est prueba provee un indicador de la capacidad regenerativa de la mdula sea y permite un monitoreo de la cintica de las plaquetas en equinos. Se puede adems conocer la funcin plaquetaria y su activacin evaluando la unin de anticuerpos a glicoprotenas mayores de plaquetas (GPIIb-IIIa, GPIV, y GPIb) y de antgenos dependientes de la activacin (P-selectina y la protena lisosomal integral de la membrana (LIMP)) observando que posterior a la activacin, aumentan a ms del doble estas uniones en comparacin a los animales clnicamente sanos (Segura et al., 2004) El tromboembolismo es la mayor causa de morbilidad y mortalidad en perros que padecen anemia hemoltica inmunomediada (IMHA) gracias a la citometra de flujo se puede detectar la activacin plaquetaria para dar un mejor pronstico y un adecuado tratamiento a los pacientes (Weiss y Brazzell, 2006). Clulas fagocticas La actividad funcional de clulas fagocticas en sangre perifrica, ya sea por las clulas polimorfonucleares o por los monocitos, puede ser determinada por citometra de flujo. Los leucocitos de sangre perifrica son incubados con dihidrorodamina (DHR) (una tincin oxidasasensible) y Staphylococcus aureus marcado con yoduro de propidio (IP). La oxidacin de DHR de la rodamina fluorescente 123 provee un estimado de la actividad explosin oxidativa de los neutrfilos y la ingesta de S. aureus de la actividad fagoctica. Esta prueba se ha utilizado para diagnosticar la enfermedad granulomatosa crnica en humanos (Gallin and Malech 1990). En caballos, est prueba se ha realizado para evaluar la funcin de neutrfilos en endotoxemia y en caballos inmunocomprometidos despus de una terapia inmunomoduladora. Los efectos por el transporte y el ejercicio tambin se han evaluado por citometra de flujo. En estos estudios indican que la alta intensidad de trabajo disminuye la funcin fagoctica de las clulas al igual que la funcin de los neutrfilos. (Raidal, et al., 1995, 1997a, 1997b, 1998a, 1998b, 2000 a, 2000b). Pruebas de apoptosis La apoptosis es una forma biolgicamente importante de muerte celular por lo que su deteccin y medida es bsica y se puede realizar a travs de la citometra de flujo. Esto incluye los cambios en la membrana plasmtica, cambios en la permeabilidad de la membrana plasmtica, cambios en la permeabilidad de la membrana mitocondrial, activacin de caspasa y en el ADN. La determinacin de alguno o de la combinacin de estos cambios por citometra de flujo permite la identificacin y cuantificacin de clulas apoptticas entre una mezcla celular. Tambin puede dar informacin valiosa de los mecanismos moleculares que tienen las clulas durante su muerte celular (Macey, 2007). 123
Anlisis de ADN La citometra de flujo sirve para el anlisis de ADN ya que existen tinciones que se unen de manera proporcional. Esto permite la cuantificacin del contenido de ADN permiten la identificacin de clulas normales diploides, aquellas que estn activas sintetizando ADN y aquellas premitticas o mitticas. Gracias a esta tcnica se pueden detectar las distintas fases del ciclo celular. Sistema inmune Actualmente existen diversas tcnicas que permiten el estudio del sistema inmune como los son los anticuerpos monoclonales, tinciones para la funcin celular, tetrmeros en la citometra de flujo. La capacidad multicolor del citmetro de flujo ofrece una gran ventaja para separar grupos celulares entre varios grupos como es el caso de sangre completa o de cultivos celulares mixtos. Por anticuerpo monoclonal se puede separar una poblacin celular y a su vez analizar su viabilidad. Se pueden separar tambin clulas que no entraran en el anlisis como por ejemplo los eritrocitos, detritus celulares o clulas muertas. Se puede medir la capacidad proliferativa de las clulas utilizando tinciones como el CFSE. Las citoquinas y quimioquinas juegan un papel muy importante por lo que se han implementado tcnicas para ser detectado por medio de citometra de flujo ya que de manera tradicional se realizaba por medio de pruebas de ELISA. Pruebas de fagocitosis y endocitosis La fagocitosis se puede medir por medio de citometra de flujo utilizando bacterias marcadas fluorescentemente. El anlisis se realizar por el nmero de clulas fagocticas que tengan fluorescencia y por la intensidad de fluorescencia que presentan las mismas. La citometra de flujo permite adems el anlisis de pruebas de adhesin. Existen diferentes protocolos para la evaluacin de activacin plaquetaria. Algunos citmetros presentan adems un sorter que sirve para realizar separaciones celulares para continuar con otros experimentos en los que se requiere una poblacin celular determinada. Colecta y envo de muestra Al realizar un estudio por medio de citometra de flujo es importante elaborar un adecuado diseo del experimento, es decir, se requiere tener claro el objeto de estudio para determinar el origen de la muestra. Si se realizara una prueba de viabilidad o apoptosis, la muestra se tiene que colectar y analizar lo ms rpido posible para conservar las caractersticas deseables. Si es nicamente para determinar inmunofenotipaje, las clulas pueden ser fijadas. Para la utilizacin de anticuerpos monoclonales, es importante saber si hay disponibles para la especie que se va a utilizar. El citmetro de flujo es capaz de analizar cualquier partcula que mida de 1Colecta de muestra Las clulas pueden ser colectadas en tejidos, fluidos o cultivos celulares dependiendo el protocolo a desarrollar y deben ser procesadas en fro y protegidas de la luz para conservar las caractersticas a analizar. Las clulas deben permanecer en una suspensin con un medio isotnico de pH 7.3 en un volumen final de 0.1-1 ml. La concentracin celular ideal es de 100,0001,000,000 de clulas por tubo.
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Envo de muestra Las muestras procesadas para citometra de flujo deben permanecer en fro y protegidas de la luz. Si las clulas estn vivas, se deben de enviar lo ms pronto posible al laboratorio de citometra de flujo (3 hrs. mximo). Si las clulas estn fijadas pueden ser analizadas hasta 24 hrs. despus. Para las muestras que requieren que el laboratorio de citometra de flujo las procese, se deben de enviar en fro en un plazo no mayor a 3hrs. En el caso de que el anlisis se hiciera con sangre completa, es necesario colectar al menos 1ml de sangre con anticoagulante. Para pruebas con suero, se requiere de 1 ml de sangre sin anticoagulante. REFERENCIAS 1. Ammersbach, M.A.G., Kruth, S.A., Sears, W., Bienzle, D. 2006.The effect of glucoccorticoids on canine lymphocyte marker expression and apoptosis. Journal of Veterinary Internal Medicine, 20:5, 1166-1171. 2. Balson G.A, Smith G.D, Yager J.A., 1997. Immunophenotypic analysis of foal bronchoalveolar lavage lymphocytes. Veterinary Microbiology, 56: 237246. 3. Davis, E.G., Wilkerson, M.J., Rush, B.R., 2002. Flow Cytometry: Clinical Applications in Equine Medicine. Review. Journal of Veterinary Internal Medicine; 16: 404410. 4. Flaminio M.J.B.F., Rush B., Cox J., Moore W.E., 1998. CD41 and CD81 lymphocytopenia in a filly with Pneumocystis carinii pneumonia. Australian Veterinary Journal; 76: 399402. 5. Flaminio M.J.B.F., Rush B., Davis E.G., 2000. Characterization of peripheral blood and pulmonary leukocyte function in healthy foals. Veterinary Immunology Immunopathoogy; 73:267285. 6. Flaminio M.J.B.F., Rush B., Shuman W., 1999. Peripheral blood lymphocyte subpopulations and immunoglobulin concentrations in healthy foals and foals with Rhodococcus equi pneumonia. Journal of Veterinary Internal Medicine, 13:206212. 7. Flaminio M.J.B.F., Rush B.R., Shuman W., 1998. Immunologic function in horses after nonspecific immunostimulant administration. Veterinary Immunology Immunopathology, 63:303315. 8. Frank, J.R, Breitschwerdt, E.B., 1999. A Retrospective Study of Ehrlichiosis in 62 Dogs from North Carolina and Virginia. Journal of Veterinary Internal Medicine; 13:194201 9. Gallin J.I., Malech H.L., 1990. Update on chronic granulomatous diseases of childhood. Immunotherapy and potential for gene therapy. Journal of American Medicine Association, 263:1533. 10. Handschel, J., Dne, ., Pomjanski, N., Depprich, R., Ommerborn, M., Braunstein, S., Kbler, N., Meyer, U., Bcking, A., 2007. Additional use of DNA-image cytometry improves the assessment of resection margins. Journal of Oral Pathology Medicine (2007) 36: 4725 11. Lana, S., Plaza, S., Hampe, K., Burnett, R., Avery, A., 2006. Diagnosis of mediastinal masses in dogs by flow cytometry. Journal of Veterinary Internal Medicine 20:5, 1161-1165. 12. Leber R., Wiler R., Perryman L.E., Meek K., 1998 Equine SCID: Mechanistic analysis and comparison with murine SCID. Veterinary Immunology Immunopathology 65:19. 13. Morley, P., Mathes, M., Guth, A., Dow, S., 2008. Anti-Erythtocyte antibodies and disease associations in anemic and nonanemic dogs. Journal of Veterinary Internal Medicine, online early article. 14. Raidal S.L., Bailey G.D., Love D.N., 1997. Effect of transportation onlower respiratory tract contamination and peripheral blood neutrophils. Australian Veterinary Journal; 75:433438. 125
15. Raidal S.L., Bailey G.D., Love D.N., 1998 Flow cytometric determination of oxidative burst activity of equine peripheral blood and bronchoalveolar lavage-derived leucocytes. Veterinary Journal; 156:7980. 16. Raidal S.L., Bailey G.D., Love D.N., 1998. Flow cytometric determination of oxidative burst activity of equine peripheral blood and bronchoalveolar lavage-derived leukocytes. Veterinary Journal, 156:117126. 17. Raidal S.L., Bailey G.D., Love D.N., 1998.The flow cytometric evaluation of phagocytosis by equine peripheral blood neutrophils and pulmonary alveolar macrophages. Veterinary Journal, 156:107116. 18. Raidal S.L., Love D.N., Bailey G.D., 1995. Inflammation and increased numbers of bacteria in the lower respiratory tract of horses within 6 to 12 hours of confinement with the head elevated. Australian Veterinary Journal; 72:4550. 19. Raidal S.L., Love D.N., Bailey G.D., 1997. Effect of a single bout of high intensity exercise on lower respiratory tract contamination in the horse. Australian Veterinary Journal; 75:293 295. 20. Raidal S.L., Love D.N., Bailey G.D., Rose R.J., 2000. Effect of single bouts of moderate and high intensity exercise and training on equine peripheral blood neutrophil function. Research Veterinary Science, 68:141146. 21. Raidal S.L., Love D.N., Bailey G.D., Rose R.J., 2000. The effect of high intensity exercise on the functional capacity of equine pulmonary alveolar macrophages and BAL-derived lymphocytes. Research Veterinary Science, 68:249253. 22. Russell K.E., Perkins P.C., Grindem C.B., 1997. Flow cytometric method for detecting thiazole orange-positive (reticulated) platelets in thrombocytopenic horses. American Journal of Veterinary Research, 58:10921096. 23. Segura, D., Monreal, L., Prez-Pujol, S., Pino, M., Ordinas, A., Brugus, R., White, J., Escolar, G., 2004. Assessment of platelet function in horses: ultraestructure, flor cytometry, and perfusion techniques. Journal of Veterinary Internal Medicine, 18:5, 710-717. 24. Sellon D.C., Levine J., Millikin E., 1996. Thrombocytopenia in horses: 35 cases (1989 1994). Journal of Veterinary Internal Medicine; 10:127132. 25. Subira, D., Grgolas, M., Castan, S., Serrano, C., Roman, A., Rivas, F., Tomas, J.F., 2005. Advantages of flow cytometry immunophenotyping for the diagnosis of central nervous system non-Hodgkins lymphoma in AIDS patients. HIV Medicine 6, 2126. 26. Weiss, D.J., Brazzell, J.L., 2006.Detection of activated platelets in dogs with primary immune-mediated hemolytic anemia. Journal of Veterinary Internal Medicine, 20:3, 682-686. 27. Wilkerson M.J., Davis E.G., Shuman W., 2000. Isotype-specific antibodies in horses and dogs with immune-mediated hemolytic anemia. Journal of Veterinary Internal Medicine; 14:190196. 28. Williams, M.J., Avery, A.C., Lana, S.E., Hillers, K.R., Bachand, A.M., Avery, P.R., 2008. Canine lymphoproliferative disease characterized by lymphocytosis: Immunophenotypic markers of prognosis. Journal of Veterinary Internal Medicine, 22:3, 596-601.
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HIBRIDACIN in situ: Localizacin de un gen en un cromosoma
M. en C. Alberto Barbabosa Pliego Integrante del Cuerpo Acadmico de Biotecnologa
INTRODUCCIN El trmino en Latn in situ, significa en su lugar original; hibridacin es la formacin de una molcula dplex hbrida, por medio de la unin de de una hebra complementaria o parcialmente complementaria de ADN o ARN La hibridacin in situ es una tcnica mediante la cual se estudia la densidad de un gen o molcula de ADN o ARN en una clula o tejido, utilizando una sonda de ADN o ARN de una sola cadena. En 1969, Mary Lou Pardue y Joseph Gall desarrollaron un procedimiento en el que mediante el calentamiento del ADN, se permite que otra hebra la complemente para formar un ADN hbrido a partir de una hebra de una especie y una segunda hebra de otra. Este proceso trabaja porque el hidrgeno enlaza solamente los pares complementarios. Cuanta ms semejanza hay en el ADN del hbrido, ms enlaces del hidrgeno sern formados en la hibridacin, de esta manera se puede determinar la localizacin cromosomal en secuencias repetitivas de ADN. La hibridacin in situ implica la separacin de cromosomas mitticos; es decir que estn en divisin, en un portaobjetos, desnaturalizando el ADN en un lcali algunos minutos, se lava con un buffer para remover la solucin alcalina. Se incuba en una solucin de hibridacin que contiene copias radioactivas de la secuencia del nucletido que nos interesa, se lava la hebra radioactiva que no hibridza con la secuencia complementaria del cromosoma exponiendo la laminilla a emulsin fotogrfica que es sensible a energa radioactiva baja, develando un a auto radiografa.
Las pruebas de hibridacin in situ se hacen hoy en da ligando componentes o tintes fluorescentes, este procedimiento se llama hibridacin fluorescente In situ (FISH).
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La tcnica consiste en preparar cortas secuencias de ADN de una sola hebra, llamadas sondas, que son complementarias de las secuencias de ADN que se quieren marcar y examinar. Estas sondas se "marcan" con molculas fluorescentes como biotina o fluorescena, las cuales hibridan o unen al ADN complementario y, como estn marcadas con molculas fluorescentes, permiten localizar las secuencias en las que se encuentran. La FISH utiliza tres tipos de sonda: Sondas especficas de un locus: estas sondas se hibridan a una regin particular de un gen. Esta sonda es til cuando se ha aislado una pequea parte de un gen y se quiere averiguar en qu cromosoma se encuentra. Sondas alfoides o centromricas: son sondas que contienen secuencias complementarias de las secuencias repetidas que se encuentran en los centrmeros de los cromosomas. Como pueden utilizarse sondas de diferentes colores, cada cromosoma puede ser marcado de manera distinta, con lo que se puede averiguar si un individuo tiene el nmero correcto de cromosomas o si tiene un cromosoma extra. Sondas para cromosomas completos: son colecciones de sondas de un tamao reducido, cada una de las cuales se hibrida a una secuencia diferente a lo largo de todo un cromosoma. Utilizando estas libreras de sondas, se puede marcar todo un cromosoma generando un cariotipo espectral. De esta manera, se consiguen imgenes en color que permiten examinar los cariotipos de una forma ms exacta que los tradicionales cariotipos basados en bandas ms o menos oscuras. Esta tcnica es particularmente til para examinar anormalidades cromosmicas. EL uso de la Hibridacin in situ La hibridacin In situ, analiza la expresin de un gen. Por tanto se usa para el diagnstico de enfermedades, identificacin de especie y/ o sexo de los individuos, para determinar enfermedades antes del nacimiento. TECNICA DE HIBRIDACION IN SITU Tcnica mediante la cual estudia la distribucin y densidad de un gen o molcula de ARNm en una clula o un tejido utilizando una sonda de ADN o ARN de una sola cadena. Hibridacin :(proceso mediante el cual dos cadenas complementarias de cido nucleico forman una doble hlice durante un perodo de unin). 128
Existen variaciones en la tcnica dependiendo de los tipos de sondas que se utilicen (ADNc, oligonucletidos, ARN). Existen dos tipos de tcnicas de hibridacin dependiendo de cmo estn marcadas las sondas: Tcnica isotpica radioactiva (sondas marcadas con: 32P, 35S, 3H) y Tcnica no isotpica o no radioactiva. (sondas marcadas con: digoxigenina, peroxidasa, etc.). Protocolo estndar: 1-Fijacin del tejido o las clulas con paraformaldehido (PFA) 4% durante unas horas. 2-Crioproteccin del tejido en sacarosa al 30% en tampn fosfato (PB) 0,1M a 4C toda la noche (este paso slo se realizar en el caso de secciones de criostato). 3-Secciones de 10 a 25 micras de grosor. 4-Hibridacin -.--a)-Incubar las secciones en proteinasa K durante 15 min a 37C. -.--b)-Delipidar el tejido deshidratando en alcoholes crecientes comenzando por 2 x 5 min en H2O, en Dietil pirocarbonato (DPC) 0,02% (50ml DPC en 250ml H2O autoclavado), 50,70, 95, y 100% en etanol, y rehidratar hasta H2O DPC. -.--c)-Preincubar las secciones en solucin de prehibridacin (50% formamida desionizada, 0,1% ADN de esperma de salmn, 2 x SSC, 10X solucin Denhardts, 0,1% SDS) durante una hora a temperatura ambiente. -.--d)-Hibridacin. Aadir solucin de prehibridacin hasta conseguir una concentracin de 0,5-2,0 x 105 cpm por 50ml de solucin de hibridacin. En el caso de utilizar oligo-sondas marcadas con digoxigenina se puede utilizar unos 20ng de sonda por ml de tampn. Escurrir la solucin de prehibridacin de las secciones. Aadir la solucin de hibridacin, se utilizar un volumen de unos 50ml por seccin. -.--e)-Incubar las secciones toda la noche en cmara de humedad a unos 45C. -.--f)-Lavar las secciones con 2x SSC (NaCl-sodio citrato) cambiar la solucin cada 15 min durante 3 hr a temperatura ambiente. -.--g)-Secar las secciones al aire. -.--h)-Visualizacin de la seal: -En el caso de la tcnica radioactiva se realizar autor radiografa. Cubriendo las secciones con emulsin fotogrfica y exponerlas durante 3-7 das a 70C. -En el caso de tratarse de la tcnica no radioactiva, las secciones se incubarn con un anticuerpo secundario dirigido contra la sustancia con la que estaba marcada la sonda (ej. anticuerpo antidigoxigenina o anti-biotina) siguiendo posteriormente el protocolo segn lo expuesto en las tcnicas inmunohistoqumicas. 5-Controles -Incubar con la solucin de hibridacin sin sonda. -Incubar con ARN asa antes de la hibridacin -Incubar las secciones con solucin de hibridacin conteniendo 400 veces de de sonda no marcada o con sonda no relacionada de tamao similar. Los tiempos, temperaturas y concentraciones de las sondas varan en cada caso particular dependiendo del tipo de tejido y de la sonda. Envo de muestras Las recomendaciones para la toma y envo de muestras para laboratorio son sencillas. Sangre: tubos estriles con EDTA, se mantienen a 4 C, hasta su procesamiento, si es inmediato no necesita refrigeracin. Heces: se debe tratar de mantener la muestra lo ms limpia que esta lo permita, sin hojas, pequeas rocas, etc. S las heces estn secas as se pueden dejar, si no se deben mantener en alcohol al 70%.
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Pelo: la muestra de pelo se debe tomar desde la raz y enviarla a laboratorio en un tubo seco. Raspados: estos se deben almacenar en alcohol al 70%.
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ENFERMEDADES EXTICAS
M. en C. Jos Luis Zamora Espinosa * M. en C. Benjamn Valladares Carranza* *Integrantes del Cuerpo Acadmico de Salud Animal
INTRODUCCIN En la constante movilizacin de productos y subproductos de origen animal, y animales vivos en movilizacin de animales, la apertura comercial internacional han aumentado los riesgos de que las plagas y enfermedades que existan en otras regiones puedan introducirse y diseminarse en nuestro pas, causando prdidas a la ganadera por su rpida diseminacin y difcil control. La vigilancia epizootiolgica en el territorio nacional debe realizarse en las tres barreras sanitarias y estar enfocada a las enfermedades de la lista A del Cdigo Zoosanitario Internacional, citadas en el Acuerdo mediante el cual se enlistan las enfermedades y plagas exticas y enzoticas de notificacin obligatoria en los Estados Unidos Mexicanos, publicado el 5 de marzo de 1999 en el Diario Oficial de la Federacin. Las enfermedades exticas son de notificacin obligatoria inmediata y para ello se debe usar el formato de notificacin SIVE 01 del Sistema de Vigilancia Epizootiolgica (SIVE), publicado el 6 de diciembre de 1995 en el Diario Oficial de la Federacin o bien en el formato de reporte de la Comisin Mxico-Estados Unidos para la Prevencin de la Fiebre Aftosa y otras Enfermedades Exticas (CPA). De confirmarse la presencia de una enfermedad extica en el territorio nacional la SAGARPA activa el Sistema Nacional de Emergencias en Salud Animal (SINESA), cuya normatividad fue publicada en el Diario Oficial de la Federacin el 16 de febrero de 1988. Sin embargo, con la nueva Ley Federal de Sanidad Animal publicada el 18 de junio de 1993 en el Diario Oficial cambia a Dispositivo Nacional de Emergencias en Salud Animal (DINESA). Este Dispositivo est integrado por ocho grupos regionales de Emergencias en Salud Animal (ESA). Las actividades que se desarrollen sern normadas y dirigidas por la Direccin General de Sanidad y Proteccin Agropecuaria y Forestal, con el apoyo de la CPA y ejecutadas en cada regin bajo la supervisin de los coordinadores responsables. La SAGARPA integra, opera y expide las normas oficiales que establecern las medidas de seguridad que debern aplicarse al caso particular en el que se diagnostique la presencia de una enfermedad o plaga extica en los animales.
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Una de las funciones que marca la NORMA Oficial Mexicana NOM-018-ZOO-1994 a los MVZ aprobados como unidades de verificacin es: asistir a la autoridad en caso de emergencia zoosanitaria para la aplicacin de las medidas de prevencin, control o erradicacin de las enfermedades o plagas de los animales que determine la Secretara. La Ley Federal sobre Metrologa y Normalizacin, en materia de normalizacin, certificacin, acreditacin y verificacin, hace mencin de fomentar la transparencia y eficiencia en la elaboracin y observacin de normas oficiales mexicanas y normas mexicanas. La misma Ley en su Art. 40 en materia de norma oficial mexicana establece en su fraccin II que su finalidad es dictar las caractersticas y especificaciones que deban reunir los productos y procesos cuando estos puedan constituir un riesgo para la seguridad de las personas o daar la salud humana, animal, vegetal, el medio ambiente general y laboral, o para la preservacin de recursos naturales. Y en su fraccin III, las caractersticas y especificaciones que deben reunir los servicios cuando stos puedan constituir un riesgo para la seguridad de las personas o daar la salud humana, animal, vegetal o el medio ambiente general y laboral o cuando se trate de la prestacin de servicios de forma generalizada para el consumidor. SERVICIO DE DIAGNSTICO DE ENFERMEDADES EXTICAS Los programas de emergencia epizootiolgica tienen que constituir un sistema previamente bien organizado, para hacer frente a las diferentes situaciones de urgencias eventuales, originadas por amenaza y brotes de enfermedades contagiosas muy peligrosas, exticas o desconocidas. La desacostumbrada extensin de las medidas contraepizoticas y sus consecuencias en la vida econmica, poltica y cultural de los lugares afectados, exigen la aplicacin de una serie de medidas que influyen en casi todos los sectores. Por eso tales procedimientos por el hecho de ser complicados y exigentes, deben ser bien preparados con anterioridad y aprobados por los organismos responsables correspondientes. 132
El contenido, la forma y los componentes de estos programas tienen que ajustarse de acuerdo con el tipo y grado de peligro epizootiolgico que amenaza al pas. El objetivo de estos programas es posibilitar en caso necesario, la aplicacin lo ms pronto posible, a todos los niveles de mando, desde el local hasta el nacional, de las medidas contraepizoticas imprescindibles. La finalidad de las actividades de control y vigilancia de las enfermedades es su identificacin de forma oportuna y se debe realizar no solo con vigilancia pasiva sino que tambin con vigilancia activa. Por otro lado la capacidad de los laboratorios de alta seguridad para confirmar un diagnstico de una enfermedad extica est relacionada directamente con la calidad de la muestra y las condiciones en las que es remitida. Este organismo debe estar constituido por personal calificado en economa, estadstica, mercado agropecuario y epizootiologa, no slo resulta importante en la elaboracin de planes de vigilancia y anlisis costo-beneficio de las enfermedades e intercambio de informacin a nivel internacional, sino tambin en forma importante en la coordinacin de los diferentes servicios de salud animal y otros relacionados con la industria pecuaria, mantenindolos informados y sensibilizados de su responsabilidad para cooperar con los planes de vigilancia y de emergencia y en los que frecuentemente se necesita constituir grupos de combate que incluyan servicios para el control de las enfermedades exticas. Este servicio debe contar tambin con sistemas de rpida recuperacin y de anlisis de datos que incluyan el uso de sistemas de computacin tan complicados como sea el volumen de informacin a manejar. Al sealar este punto debemos recordar que no siempre el mejor sistema es el ms sofisticado; sin embargo el avance actual en aspectos de computacin, provee de una amplia gama de aparatos segn las necesidades de cada programa, y da a da va resultando ms necesario incorporar esta metodologa a los sistemas de vigilancia tanto nacionales como internacionales, como una opcin para manejar cantidades grandes de datos en forma rpida y eficiente. Adems este servicio cumple la importante labor de retroalimentar a sus fuentes de informacin a nivel de campo, con los anlisis de situacin obtenidos a partir de los informes operacionales. NOTA: Cuando se sospecha de la existencia de una enfermedad extica, no se debern movilizar animales o muestras de las granjas de origen, a menos que sea bajo la custodia del MVZ oficialmente designado. Este orden de movimiento o cuarentena, debe ser aplicada hasta que se determine el diagnstico de laboratorio. ACTIVIDADES A REALIZAR PARA LA TOMA, CONSERVACIN Y ENVO DE MUESTRAS DE UNA ENFERMEDAD EXTICA A LA CPA. Para el control en la prevencin y vigilancia contra cualquier enfermedad extica, deben realizarse los siguientes procedimientos. a. Reporte y atencin de brotes. 1. Cuando se reciba un reporte de sospecha de cualquier enfermedad extica, en animales, antes de atender el reporte, se comunican inmediatamente los datos del brote al Coordinador Regional de la CPA o bien a la Comisin por va telefnica y por cobrar, proporcionando los datos contenidos en la forma del reporte de CPA. En los casos en que no se pueda efectuar esta 133
comunicacin rpidamente, el mdico proceder a atender el caso, reportndolo a su regreso al laboratorio o cuando le sea posible. 2. Al llegar el veterinario al predio afectado proceder a obtener los datos epizootiolgicos.
3. El veterinario solicitar al propietario o encargado, que encierre el rebao afectado en un corral, previa inspeccin ocular de todo el rebao.
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Los animales enfermos o sospechosos de estar afectados por una enfermedad extica, deben ser sacrificados para obtener muestras para el examen de laboratorio. Por lo general, el dueo provee los animales que se necesiten, pero si no fuera este el caso, se debern hacer los arreglos necesarios para comprarlos. Debern muestrearse de tres a cuatro animales enfermos como mnimo, dos de ellos deben estar en estado febril, para intentar el aislamiento del agente etiolgico.
4. El veterinario debe colocarse overol desechable, botas y guantes, y entrar al corral con una cubeta, un sobre con desinfectante (carbonato de sodio), nariguero, tubos para toma de muestras, frascos conteniendo glicerina buferada, pinzas, tijeras y un cepillo de raz, as como bolsas para el envo de muestras. 5. Se revisarn los animales que se noten decados, o que hayan disminuido bruscamente su produccin, procurando que sean los animales ms recientemente afectados.
6. Antes de examinar a cada animal y especialmente si se van a tomar muestras, es indispensable sujetar perfectamente al animal, utilizando el mecanismo de inmovilizacin convenientemente ms prctico.
En caso de que haya muerto algn animal la necropsia se debe realizar en el terreno o en un rea biolgicamente segura, para reducir el riesgo de diseminar la enfermedad. Los animales y el material contaminado no deben sacarse del lugar. No debemos olvidar las recomendaciones de la Norma Oficial Mexicana NOM-087- ECOL-1995, en lo referente a disposicin final de residuos peligrosos biolgico infecciosos.
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7. Las muestras deben tomarse siempre que sea posible de lesiones frescas. 8. Las muestras de tejidos lesionados deben contener por lo menos 1.5 gr; si hay varios casos, se recoge una cantidad dos o tres veces mayor. Para aislamiento de virus se debern escoger los rganos que contengan altas concentraciones de virus como: bazo, hgado tonsilas, linfonodos mediastnicos, gastrohepticos y mesentricos. Las muestras de suero debern colectarse de 4 a 6 animales adicionales para la deteccin de anticuerpos. 9. Si hay una cantidad elevada de animales (ms de 50 cabezas) afectados, el nmero de animales muestreados en el rebao quedar a criterio del veterinario, considerando que una buena muestra de tejido en ocasiones es suficiente, pero no siempre es fcil su obtencin, por lo que se requiere de mayor cantidad del mismo; si el nmero de animales afectados es menor a 50, el nmero de animales muestreados ser de 5 como mnimo; en el caso de existir menos de 5 animales afectados, se muestrean en su totalidad. 10. Puede suceder que cuando la enfermedad se ha presentado siete u ocho das antes de haber recibido la notificacin, las lesiones se encuentran en vas de cicatrizacin y resulta difcil tomar la cantidad de material indicada. En tal caso, se debe tomar con cuidado la mayor cantidad posible de tejido lesionado de los lugares afectados. 11. Las muestras se colocarn de manera individual en frascos con glicerina buferada. Cada frasco se identificar con un numricamente con lpiz y escrito sobre tela adhesiva. No debe usarse bolgrafo o tinta, pues se borra con el agua. Finalmente se sellar el tapn del frasco con cinta aislante plstica (Maskin-tape). Las muestras contenidas en frascos o bolsas de plstico, as como los tubos de sangre y suero, los frascos olas bolsitas de plstico, se enviarn empacadas en hielo, por la va ms rpida. Es preferible que las muestras lleguen al laboratorio de diagnstico de la CPA dentro de las 24 horas posteriores a su colecta. Deber evitarse la diseminacin del virus en los envases de las muestras desinfectando la parte externa o colocndolos en bolsas perfectamente cerradas.
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12. Una vez concluida la inspeccin y toma de muestras se proceder a desinfectar el equipo en la puerta del potrero, en el orden siguiente: a) Vaciar el sobre de carbonato de sodio (200 gramos) en una cubeta con 5 litros de agua (para hacer una solucin aproximada al 4%). b) Enjuagar perfectamente el nariguero, las pinzas, las tijeras y el otro material utilizado. Los frascos conteniendo las muestras se sumergirn en la solucin, colocndolos posteriormente en una de las bolsas de plstico que se cerrar doblando la punta y presionando el dobles con una cinta elstica. Luego se sumergir la bolsa en la solucin.
c) Con ayuda del cepillo de raz se desinfectarn las botas especialmente la suela.
d) El mdico veterinario se despojar del overol y lo colocar dentro de una cubeta con desinfectante, dejndolo tirado y empapado a la entrada del corral. Sugerir al propietario que posteriormente lo queme o lo entierre.
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e) Finalmente desinfectar los guantes y saldr del corral con la cubeta conteniendo el desinfectante y las botas puestas. f) Junto al vehculo desinfectar de nuevo la suela de las botas y se despojar de ellas.
b. Empaque y envo de muestras. 1. Las bolsas conteniendo las muestras se colocarn dentro de otra bolsa doble que contenga a su vez hielo. Esta segunda se sellar con un doblez, presionando con una cinta elstica. 2. Ambas bolsas se colocarn dentro de la caja de cartn o poliuretano (hielo seco) para envos, cuidando de pegar en el interior de la misma, con una cinta adhesiva, la forma de atencin de reporte. El espacio sobrante se rellena con paja, peridico o aserrn. 3. Cerrar la caja sellando su tapa con cinta adhesiva y amarrarla con hilo o lazo.
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4. El envo debe rotularse "OCURRE" y con la direccin: COMISIN MXICO-ESTADOS UNIDOS PARA LA PREVENCIN DE LA FIEBRE AFTOSA Y OTRAS ENFERMEDADES EXTICAS DE LOS ANIMALES KM. 15.5 CARRETERA MXICO-TOLUCA, km 15.5 PALO ALTO, D.F., DELEGACIN CUAJIMALPA, C.P. 05110, MXICO, D.F. 5. El paquete conteniendo las muestras se enviar por la va ms rpida posible (autobs o avin) a la ciudad de Mxico, para su pronto diagnstico inmediato. 6. Despus de depositar las muestras, el veterinario llamar a la CPA por cobrar; para informar el resultado de la investigacin y dar los datos del envo como son: hora en que se deposit, lnea de autobs o area en que se envi, nmero de recibo y hora aproximada de la salida y su arribo a la ciudad de Mxico, y la informacin epizootiolgica complementaria. Los telfonos de la CPA son: (01 800) 751 2100 y 903- 8800 (01-55)5259-3035, 5259 1441, 36180823 al 33. FAX: 01 55 3618-0834 7. Los gastos ocasionados por la toma, empaque y envo de muestras sern pagados por la CPA a la presentacin de los comprobantes de compra correspondientes. c. Comunicacin de resultados. La CPA notificar a la brevedad posible los resultados de laboratorio: si el resultado es negativo a una enfermedad extica, el Coordinador Regional de la CPA o bien el veterinario asignado informar al propietario, aprovechando para darle las instrucciones de ndole sanitaria correspondientes y retirando las medidas restrictivas que se hubieran dictado. Cuando los resultados son positivos a una enfermedad extica, el rebao afectado ser visitado dentro de los 10 das posteriores a la primera visita para constatar que no se han presentado ms animales enfermos; pero si los hubiera, el Coordinador Regional de la CPA o bien el veterinario asignado proceder como si fuera un reporte original.
BIBLIOGRAFA
1. Comisin Mxico-Estados Unidos Para la prevencin de la Fiebre Aftosa y otras Enfermedades Exticas de los Animales. Manual de Trabajo. Autosim 1. Mxico. Comit de Enfermedades Exticas de la Asociacin de Sanidad Animal de los Estados Unidos. (1986): Enfermedades Exticas de los animales, su prevencin, diagnstico y control. Mxico. 2. Secretara de Agricultura y Recursos Hidrulicos. (1987): Manual para la Toma de Muestras para el Diagnstico de Enfermedades Vesiculares y otras Enfermedades de tipo Extico para los animales. Gua para Mdicos Veterinarios. 3. Secretara de Agricultura y Recursos Hidrulicos. (1988): Acuerdo por el que se instituye en la Secretaria de Agricultura y Recursos Hidrulicos, el Sistema Nacional de Emergencia en Salud 4. Animal (SINESA). Diario Oficial de la Federacin, 16 de febrero de 1988. 5. Secretara de Agricultura y Recursos Hidrulicos. (1993): Ley Federal de Sanidad Animal. 6. Diario Oficial de la Federacin, 18 de junio de 1993. 139
7. Secretaria de Agricultura y Recursos Hidrulicos. (1994): Acuerdo mediante el cual se enlistan las enfermedades y plagas exticas para los Estados Unidos Mexicanos. Diario Oficial de la Federacin, 21 de septiembre de 1994. 8. Secretara de Agricultura y Recursos Hidrulicos. (1995): Proyecto de Norma Oficial Mexicana NOM-046-ZOO-1995, Sistema de Vigilancia Epizootiolgica. Diario Oficial de la Federacin, 6 de diciembre de 1995. 9. Secretara de Agricultura y Recursos Hidrulicos. (1997): NORMA Oficial Mexicana, NOM046-ZOO-1995, Sistema Nacional de Vigilancia Epizootiolgica. Diario Oficial de la Federacin, 19 de febrero de 1997. 10. Secretara de Comercio y Fomento Industrial. (1992): Ley Federal sobre Metrologa y Normalizacin. Diario Oficial de la Federacin, 1 de julio de 1992. 11. Secretara de Medio Ambiente, Recursos Naturales y Pesca. (1995): NORMA Oficial Mexicana NOM-087-ECOL, Que establece los requisitos para la separacin, envasado, almacenamiento, recoleccin, transporte y disposicin final de los residuos peligrosos biolgico infecciosos que se generan en establecimientos que presten atencin mdica. Diario Oficial de la Federacin, 7 de noviembre de 1995. 12. Vclav, K. (1987): Epizootiologa General. Ed. Pueblo y Educacin. La Habana, Cuba. 13.Xicohtncatl Palacios R C et al (2009). Scrapie en borregos y cabras. Benemrita Autnoma de Puebla.
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INMUNOSEROLOGA
Daz Zarco Soledad* Alonso Fresn Ma. Uxa* Velzquez Ordez Valente*
*
Integrante del Cuerpo Acadmico en Salud Animal
INTRODUCCIN En el periodo de 1886 a1889, Max Gruber, Rudolh Kraus y Jules Bordet descubrieron las pruebas de aglutinacin, precipitacin y fijacin de complemento, respectivamente. La inmunoserologa iniciada por estos investigadores, puede definirse como el estudio de la interaccin de los anticuerpos con el antgeno. El diagnstico serolgico se basa en la determinacin de anticuerpos por medio de diversas tcnicas inmunolgicas contra diferentes agentes infecciosos (bacterias, hongos, parsitos y virus) de importancia mdica; el material de estudio es el suero y, el objeto de estudio es la presencia y comportamiento de la respuesta inmune humoral; de acuerdo con estas caractersticas, es importante definir conceptos tales como: Suero, es la porcin clara de un lquido orgnico, principalmente sangre, calostro, leche y linfa, despus de la coagulacin del mismo. Anticuerpos o inmunoglobulinas, son protenas producidas por los linfocitos B (clulas plasmticas) estimulados por un antgeno y tiene la propiedad de combinarse con ste. Los anticuerpos son elementos importantes en la defensa del organismo contra bacterias, hongos, parsitos y virus. Su accin es de apoyo a otros sistemas tales como el complemento o la fagocitosis, que por s solos no eliminaran a los microorganismos. Los anticuerpos de las clases IgG, IgM e IgA intervienen en esta funcin, pero cada uno de manera diferente. La IgG acta fundamentalmente estimulando a la fraccin C1, que es la que inicia la fijacin del complemento, el cual perfora la membrana citoplasmtica de bacterias y parsitos. La IgM tiene una poderosa actividad aglutinante debido a su alta valencia que favorece la fagocitosis. La IgM es ms eficiente que la IgG, tanto en los procesos de bacterilisis mediada por el complemento, como de inmovilizacin, su localizacin srica la hace valiosa en casos de bacteriemia. En cuanto a la IgA, su actividad antibacteriana previene la adhesin de bacterias a epitelios externos, tales como el traqueobronquial, intestinal y genitourinario. El antgeno es la sustancia (bacteriana, mictica parasitaria o viral) capaz de provocar una respuesta inmune detectable despus de ser introducida en un vertebrado. Sustancia reconocida por anticuerpos y linfocitos sensibilizados CONSIDERACIONES PARA EL DIAGNSTICO INMUNOSEROLGICO Es esencial conocer las distintas pruebas que se llevan a cabo en un laboratorio clnico, como ayuda para establecer el diagnstico de ciertas enfermedades infecciosas.
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Es indudable que para cada tipo de microorganismo causal de infeccin, los procedimientos o herramientas ptimas para su diagnstico diferirn con base en varios aspectos que siempre deber tener presente el clnico, por ejemplo: tipo de examen, rapidez, costo del estudio, etc. La mayora de estas reacciones inmunoserolgicas, se basan en la habilidad de los anticuerpos para reaccionar con su antgeno especfico y en el uso de un sistema indicador para poner de manifiesto tales reacciones. Las pruebas serolgicas que se emplean pueden descubrir la existencia de infecciones recientes, pasadas o inmunizaciones previas, en general, los resultados pueden ser engaosos a menos que las muestras de suero obtenidas en un intervalo de 2 a 3 semanas pongan de relieve un creciente ttulo de anticuerpos. El reconocimiento de una infeccin reciente tambin se puede establecer sobre la base de la observacin clnica junto con una elevada reaccin serolgica en una sola prueba. Ciertos tipos de pruebas inmunserolgicas son de ayuda para el establecimiento de un rpido diagnstico. Es posible identificar un microorganismo aislado de un animal enfermo si al suero se le hace reaccionar in vitro con una serie de anticuerpos previamente conocidos. De igual modo la presencia de anticuerpos especficos en un animal convaleciente o vacunado, pueden evidenciarse si el suero se hace reaccionar con una serie predeterminada de antgenos. Estas reacciones se utilizan tambin para titular o cuantificar al antgeno presente en una preparacin o cultivo de microorganismos o la cantidad de anticuerpos presentes en una muestra de suero. Los procedimientos inmunoserolgicos de que se disponen en microbiologa se denominan por lo general, de acuerdo al tipo de sistema indicador utilizado. Las pruebas ms comnmente utilizadas son la fijacin de complemento (FC), la neutralizacin de virus (NV), la hemoadsorcin (HAd), la inhibicin de la hemoadsorcin (IHAd), la hemaglutinacin (HA), la inhibicin de la hemaglutinacin (IHA), la precipitacin, la aglutinacin, la floculacin, la difusin en agar (DA), ELISA, las tcnicas de anticuerpos fluorescentes (AF) o la quimioluminiscencia. En la mayora de las pruebas inmunoserolgicas, el ttulo de anticuerpos se expresa como el recproco de la dilucin mayor que causa el efecto esperado en la prueba. Esto es particularmente vlido para las pruebas en las que se emplean antgenos no viables tales como FC, IHA y pruebas de aglutinacin, precipitacin y floculacin. En pruebas como NV, que se basa en la habilidad de los anticuerpos para inhibir la multiplicacin del agente infeccioso homlogo en cultivo de tejidos, embriones de pollo o animales, el ttulo puede expresarse como el ndice de neutralizacin (IN) o como la dilucin ms alta de suero que protege a los hospederos de los efectos especficos esperados. Esto ltimo se denomina punto final 50% seroneutralizacin o virus neutralizacin (punto final SN50 o VN50). Las tcnicas inmunoserolgicas se han clasificado como: pruebas de vigilancia epidemiolgica, pruebas suplementarias y pruebas confirmatorias; estos criterios son aplicados sobre todo para las pruebas de diagnstico inmunoserolgico utilizadas para enfermedades que se encuentran en campaa de erradicacin permanente en nuestro pas; por ejemplo la brucelosis bovina y la salmonelosis aviar. Las pruebas inmunoserolgicas estn diseadas para detectar anticuerpos especficos resultantes de una vacunacin, de una infeccin natural o bien para establecer el diagnstico de un animal crnico, esto puede determinarse gracias al grado de sensibilidad y especificidad de cada una de las pruebas y al conocimiento del comportamiento de la respuesta inmune del hospedador ante los diversos agentes patolgicos.
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En general, en la respuesta inmune desencadenada mediante vacunacin los primeros anticuerpos en aparecer son los de la clase IgM e IgG, pero estos ltimos declinan rpidamente y desaparecen antes que los IgM; mientras que en una infeccin natural los anticuerpos IgM aparecen tempranamente y durante algunos das son la nica inmunoglobulina presente en el suero, ms tarde aparecer la IgG, que permanecer hasta que la enfermedad est presente. En cuanto a las pruebas, se entiende por sensibilidad a la capacidad de la prueba para detectar animales positivos cuando stos estn verdaderamente enfermos. En cambio la especificidad es la capacidad de la prueba para dar resultados negativos cuando un animal no est verdaderamente enfermo; estas caractersticas son expresadas en porcentaje. De acuerdo a esto es deseable que las pruebas inmunoserolgicas sean altamente sensibles y especficas, lo que permitir tener la seguridad en el diagnstico, descartando los resultados falsos positivos y falsos negativos. El diagnstico inmunoserolgico es un proceso multifactorial, en el que la correcta, acertada y oportuna seleccin de la muestra influir sobre la precisin de los resultados. OBTENCIN DE LA MUESTRA DE SANGRE Para el caso de la muestra srica es necesario seguir las recomendaciones para la obtencin adecuada de sangre, considerndose que la muestra no contendr anticoagulante. La posicin adecuada y sujecin efectiva del animal son esenciales para un muestreo exitoso, mismo que deber minimizar la necesidad del manejo fsico o qumico, porque la sangre tomada del animal adrenalizado puede originar resultados equivocados, sobre todo cuando el suero se destinar para pruebas bioqumicas adems de las inmunolgicas. La sangre venosa es la ms comnmente obtenida de los animales, el sitio y el calibre de la aguja para la obtencin depender de la especie. En los bovinos la sangre se obtendr de las venas yugular, mamaria y coccgea y, de las arterias cartida, braquial y caudal. Se recomienda el uso de agujas calibre 16 18, dependiendo de la vena que se desee abordar. En ovejas la vena yugular es la ms accesible, pero la vena y arterias femorales son tambin fciles de puncionar. Se recomienda que el calibre de la aguja sea del nmero 18 20. En los caballos se utiliza la vena yugular y se recomienda que el calibre de la aguja sea 18 20. En el cerdo se usan las venas de la oreja, de la cola y la vena cava anterior. Se recomienda que el calibre de la aguja sea 20 21. En el perro y el gato las venas ceflica y safena son usadas comnmente, pero puede recurrirse a la vena yugular. Se recomienda que el calibre de la aguja sea 18, 20 22. El conejo, cobayo y otros animales de tamao similar, es preferible la puncin intracardiaca; si el muestreo se tiene que hacer repetidamente es preferible cortar la vena marginal, en el margen externo de la oreja, la eleccin del sitio depender del volumen de sangre requerido.
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En aves adultas y pavos la muestra se obtendr de la vena braquial; en aves de talla pequea es preferible la puncin intracardiaca mediante agujas de calibre 21 23. OBTENCIN DEL SUERO El suero sanguneo se obtiene despus de que se ha formado el cogulo, esto se puede acelerar incubando entre 35 7 37 C la muestra de sangre o bien inclinando el tubo para aumentar la superficie de contacto para acelerar el proceso de coagulacin y la retraccin del cogulo. Ya coagulada la muestra (no dejar ms de 2 horas a temperatura ambiente o en caso contrario mantenerla a temperatura de refrigeracin) se decanta el suero y se extrae por aspiracin con una pipeta Pasteur o jeringa. Se debe evitar el dao a los eritrocitos. En la mayora de las especies el suero se separa sin centrifugacin; aunque con la centrifugacin el volumen que se obtiene siempre ser mayor. MANEJO Y ENVO Una vez separado el suero se traslada a un frasco estril, evitndose as el riesgo de hemlisis. El envo al laboratorio deber acompaarse con la historia clnica para facilitar la correcta interpretacin de los resultados, as como la peticin concreta de los estudios solicitados. Es importante mencionar si existen antecedentes de inmunizacin. Las muestras de sangre para el diagnstico serolgico se obtienen en tubos estriles sin anticoagulante. El volumen mnimo deber ser de 2 a 5 mL para los estudios rutinarios; en tanto que para unos estudios especializados se enviar de 5 a 10 mL de suero. Si el transporte precisa de algn tiempo es recomendable la conservar a temperatura de 4 a 8 C. Entre las causas que pueden inutilizar una muestra srica para inmunoserologa se encuentran: la hemlisis, lipemia o quiluria, desnaturalizacin por agentes fsicos o qumicos, cantidad insuficiente de la muestra o muestra con anticoagulante. BIBLIOGRAFA
Aluja SA, Casas FC. (2002): Tcnicas de necropsias en animales domsticos. El Manual Moderno, Mxico. Coffin DL. (1986): Laboratorio Clnico en Medicina Veterinaria. 3ed., La Prensa Mdica Mexicana, Mxico. Salinas MJA. (1994): Las enfermedades Infecciosas del Ganado en Mxico. Enfermedades Infecciosas del Ganado y el TLC, Simposium Internacional, Monterrey, N.L. Secretara de Salud, (1994). Proyecto de Norma Oficial Mexicana NOM -109-SSA1-1994, bienes y servicios. Procedimiento para la toma, manejo y transporte de muestras de alimentos para su anlisis microbiolgico. Diario Oficial de la Federacin, 4 de noviembre, 68-72. Thrall MA. (2006): Veterinary Hematology and Clinical Chemistry. Blackwell Publishing, USA. Thrusfield, M. (1990): Veterinary Epidemiology. Butterworths, London. Tizard IR. (2000): Inmunologa Veterinaria. 6 ed., McGraw-Hill, Mxico.
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TOMA DE MUESTRAS EN ANIMALES DE ZOOLGICO * Daz Guadarrama.H.R., Guevara Garca.J.I., Friebenth Mondragn .J., *Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia de la U.A. E. M. CEPANAP
EVALUACIN DE LOS DATOS DE LABORATORIO El mdico hoy en da se enfrenta frecuentemente a dos cuestiones respecto a los resultados de laboratorio: 1.- saber si un valor dado es o no significativamente diferente del normal y por lo tanto indicador de una enfermedad. 2.- Determinar si dos valores obtenidos a un cierto intervalo de tiempo en el curso de una afeccin son significativamente diferentes entre s, y por consiguiente indicadores de mejora o empeoramiento del proceso. Cualquiera que pueda ser el caso, como respuesta a estas sencillas cuestiones no siempre son fciles, en especial si, el mdico no posee una clara comprensin de: a) La precisin y reproducibilidad del mtodo empleado. b) Un conocimiento perfecto de las variaciones observadas entre una poblacin de especmenes normales. Por lo que para realizar una evaluacin integral y adecuada de los resultados, de tales estudios en animales de zoolgico se necesita del conocimiento de los lmites normales en las diversas especies animales estudiadas. TOMA Y RECOLECCIN DE MUESTRAS La preocupacin de todo profesional es sin lugar a duda el efectuar sus actividades a un mximo nivel de calidad. Sin embargo esto solo ser posible con un conocimiento integral de todos los factores y procedimientos que conllevan al fin de tan anhelado logro. Es indudable que gran cantidad de aspectos produzcan incertidumbre, de ah que se haga necesario definir procedimientos y acciones que conduzcan a los profesionistas a llegar con xito a la meta deseada. De ah que para la toma de muestras en los animales del zoolgico, los especialistas debern considerar factores vitales tales como; temperamento del animal, especie animal, conocer las tcnicas de contencin fsica y qumicas que puedan salvaguardar la integridad fsica del animal y de las personas que trabajan con l. Sin embargo un aspecto totalmente diferente entre las especies animales domsticas y las de zoolgico es el costo de los estudios y el manejo del espcimen ya que las especies animales de zoolgico deban ser manejadas en forma distinta a las domsticas. An cuando no existan grandes diferencias entre los animales domsticos y los animales de zoolgico ya que gran parte de los procedimientos utilizados en la toma de muestras, recoleccin y en el envo son casi los mismos, vale la pena destacar algunos puntos sobre la responsabilidad y costo, puesto que estos se aumentan en los animales de zoolgico debido a que frecuentemente se trabaja con especies raras o en peligro de extincin por lo que doblemente se debe considerar su manejo, ya que no es tico y menos operativo que en muchos de los casos de manera repetida se efecte la toma de muestras con mucha frecuencia de manera innecesaria, de ah que las recomendaciones vayan orientadas a considerar aspectos tales como: 145
OPERADOR - Tener un conocimiento profundo del espcimen tanto fisiolgica como anatmicamente y etolgicamente. - Contar con todos los materiales y equipos en buen estado. PACIENTE - Este deber ser sujetado sin causar excitacin excesiva, sedado o bien estar entrenado para el procedimiento de la toma de muestras. MATERIALES Y EQUIPOS. - Los materiales utilizados deben estar limpios y secos y en su caso estriles. - Evitar el uso de frascos no apropiados para la muestra correspondiente. - Considerar la cantidad y tipo de conservador que se deba utilizar en relacin con el volumen y tipo de muestra. SELECCIN DE LOS EXMENES MS APROPIADOS Al tener un caso clnico frente a nosotros, en el cual sea sugestiva la necesidad de estudios de laboratorio, el mdico veterinario especialista, deber escoger el examen que le proporcione la mayor informacin, confiable y sobre la cual pueda apoyar el diagnstico o teraputica, considerando el tiempo ms corto. Este procedimiento de seleccin para elegir el examen ms apropiado, se apoya en la evaluacin de la historia clnica y examen fsico del animal, en donde los resultados de los estudios de procedimientos rpidos, en la mayora de las veces sugieren la necesidad de llevar a cabo exmenes adicionales. En otras ocasiones por el manejo teraputico del espcimen se hace necesario se efecten exmenes de laboratorio a intervalos especficos para lograr respuestas satisfactorias del animal a su tratamiento. Adems de considerar las indicaciones clnicas para una prueba de laboratorio el mdico especialista requiere tomar en cuenta factores tales como: - El costo del examen - La disponibilidad del equipo para efectuarlo - El grado de especificidad y precisin requerida y su significancia para el diagnstico. Es ms comn usar de manera rutinaria exmenes rpidos que indiquen la presencia o ausencia de afecciones o enfermedad, puesto que los estudios son sencillos de realizar, rpidos, de bajo costo y confiables. Aunque en otros casos los exmenes son cualitativos y no muy especficos, pero pueden dar al clnico la informacin bsica, para escoger estudios complementarios (Microhematocrito y Recuento Leucocitario). En otras ocasiones el profesional de la medicina veterinaria de animales de zoolgico requiere de solicitar un estudio que est indicado por el examen clnico y la historia clnica, pero por lo complicado se requiere de equipos especiales y su costo es elevado.
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PRECISIN NECESARIA EN EL LABORATORIO En muchos casos los estudios rpidos llamados Screening Test dan al mdico informacin con suficiente precisin como para llegar a un diagnostico tentativo y por tanto estos exmenes pueden servir como procedimientos finales (en leucemia con el paquete leucocitario). Existen diferentes variedades de estudios y estos por lo general son: - Cualitativos - Semicuantitativos - Cuantitativos Los que van asociados con un incremento en la exactitud. SELECCIN DE LA MUESTRA Esta se apoya con el examen inicial de un paciente sospechoso de acuerdo a el padecimiento, de ah que el tipo de estudio debe proporcionar un punto de partida para el proceder clnico, donde es importante para el objeto del diagnostico diferencial, determinar si el problema es crnico o agudo. RECOLECCIN DE MUESTRAS - Que el recipiente sea el adecuado para el tipo de estudio. - Que el recipiente contenga una cantidad adecuada de conservador. - Que los materiales no estn hmedos o sucios - Que las muestras no se encuentren en estado de descomposicin o contaminadas, puesto que no sern tiles para su fin. Para una adecuada recogida de material se hace necesaria una correcta obtencin de las muestras. Puesto que los laboratorios de anlisis clnicos efectan una gran variedad de estudios a lquidos biolgicos: sangre, orina, lquidos cefalorraqudeo, lquido sinovial, lquido amnitico, lquido de cavidades, semen, secreciones y otras muestras. Se requiere para cada lquido y para cada determinacin precisas condiciones en la recoleccin; por lo que se hace necesario establecer protocolos especficos para ello. Y de igual forma resulta importante cuidar el mantenimiento de la muestra desde que sta es recolectada hasta que se efectan en ella los anlisis correspondientes. OBTENCIN DE LA MUESTRA La calidad de un estudio de laboratorio depende en gran parte de la tcnica que se emplea para su obtencin. - Los recipientes para colectar las muestras de preferencia deben estar completamente limpios y secos al igual que los equipos que puedan estar en contacto con las muestras. - Evitar el manejo excesivo en animales demasiado nerviosos, para evitar el estrs o reducirlo al mnimo. MUESTRA DE SANGRE Se debe enviar solo cuando se sospecha que existe en el animal enfermedad que afecta la sangre o que se haya producido un cambio significativo en su composicin, en tal caso se recomienda proceder a su examen. 147
Los estudios que se practican ms comnmente a este tipo de muestra en lo fundamental son de tres tipos: - Hematolgicos - Bioqumicos - Serolgicos Para lo cual ser necesario determinar el carcter de la muestra y cantidad que se requiere. Para el caso de los estudios hematolgicos, la mayora de estos se llevan a cabo con muestras de sangre, sin coagular, por lo que se recomienda agregar alguna sustancia anticoagulante que no disminuya o enmascare la confiabilidad del estudio. Cuando se realicen frotis sanguneos para conseguir la diferenciacin de las clulas (recuento diferencial) o determinar anormalidades de cualquiera de las series sanguneas (hemates, leucocitos o plaquetas) o en la bsqueda de parsitos o bacterias, se recomienda en lo posible utilizar sangre fresca sin anticoagulante. Para los estudios bioqumicos existen grandes diferencias en base a el tipo de pruebas que se tengan instaladas en cada laboratorio, pero en un sentido estricto puede enviarse sangre sin anticoagulante o preferentemente el suero sanguneo, esta misma recomendacin es vlida para serologa. La sangre para anlisis puede obtenerse de las venas, las arterias o los capilares. La mayora de las muestras de sangre se obtienen por puncin venosa. La vena se detecta por palpacin y, en los casos en que no sea fcilmente localizable, se har por su disposicin anatmica de acuerdo a la especie. La zona que circunda al punto de puncin debe desinfectarse con un algodn empapado de alcohol. Las muestras de sangre venosa pueden extraerse por medio de jeringas desechables para evitar contagios o tubos de vaco. Jeringa y aguja deben alinearse con la vena, introducindose con un ngulo de unos 15. Cuando se ha salvado la resistencia inicial de la pared de la vena, la sangre fluye a la jeringa tirando suavemente del mbolo. Extrada sta, debe sujetar fuertemente un algodn sobre el lugar de puncin para impedir la salida de la sangre. Una vez realizada la toma, la sangre de la jeringa se transfiere, con una presin suave sobre el mbolo, a los tubos adecuados. Los que contengan anticoagulantes deben taparse y mezclarse por inversin. La figura muestra el sistema de recogida de muestras de sangre con tubos de vaco.
VacutainerTM Becton Dickinson and Company Este sistema permite obtener sangre en diversas condiciones de recogida, usando la misma aguja y con un mnimo de molestias. La aguja se enrosca en el dispositivo de sujecin y se inserta en la vena. Se presiona el tubo sobre el extremo de la aguja, hasta pinchar el tapn y liberar el vaco. Cuando la sangre comienza a fluir en el tubo, se suelta el torniquete y se puede insertar otro el tubo al dispositivo de sujecin. De esta manera pueden utilizarse los tubos que sean necesarios. 148
En la tabla se muestran los diferentes tubos de vaco; en ellos, el color del tapn de goma indica el tipo de anticoagulante o preservador que llevan. Los tubos de vaco estn recubiertos interiormente de silicona, para reducir la adhesin de los cogulos a las paredes y para disminuir el riesgo de hemlisis. El tamao de los tubos permite obtener sangre entre 3 y 15 mL. Los tubos de suero con separador contienen un gel inerte que, cuando se centrifuga la sangre, una vez coagulada, se interpone entre el suero y el cogulo estableciendo entre ambos una barrera. Estos tubos pueden utilizarse como tubos primarios de los que aspirar la muestra en los analizadores automticos que contienen sensores de nivel en las pipetas de aspiracin. Para la medida de pH y gases en sangre se utilizan extracciones de sangre arterial. TABLA. TUBOS DE VACI PARA EXTRACCIN DE SANGRE MUESTRA ANTICOAGULANTE O APLICACIN PRESERVADOR Suero Qumica Plasma Heparina Qumica Sangre EDTA Hematologa Plasma Citrato Coagulacin Sangre Oxalato Velocidad Plasma Fluoruro Glucosa Suero Trombina Qumica
TAPN Rojo/gris Verde Violeta Azul Negro Gris Naranja
Las extracciones de sangre arterial deben realizarse con mucho cuidado, debido a la fragilidad de las arterias y al peligro de formacin de hematomas. La extraccin de sangre arterial se lleva a cabo con una jeringa de vidrio heparinizada. No deben utilizarse jeringas de plstico normales pues el mbolo no sube slo con la presin arterial, ni tubos de vaco. La arteria se localiza por su latido, se pincha con la aguja y se deja que la sangre fluya por su propia presin arterial. Cuando se separa la aguja de la arteria, conviene doblarla, para evitar la entrada de aire, o quitar la aguja y tapar el cono de sujecin de sta. En algunas ocasiones, sobre todo en especies de animales pequeos (aves, reptiles y pequeos mamferos), se realizan extracciones de sangre capilar, dejando que fluya la sangre y cargando un capilar heparinizado. Para aumentar la circulacin de la sangre puede caldearse la zona del pinchazo con un pao seco y caliente. ANTICOAGULANTES Y PRESERVADORES Cuando se requiera sangre total o plasma, debe aadirse a la muestra un anticoagulante durante el proceso de recogida. Existen varias sustancias capaces de impedir la coagulacin de la sangre. El anticoagulante debe elegirse de acuerdo con las determinaciones que se vayan a realizar, asegurndose de que su presencia no afecte a la medida, ejemplo, si se quieren medir los iones sodio o potasio, no puede utilizarse como anticoagulante ninguna sustancia que contenga estos iones. ANTICOAGULANTES MS USADOS - EDTA (1 a 2 mg/mL) - Oxalato de Sodios compuesto (2 mg/mL) - Citrato bisdico al 3.8 % (en proporcin 1:9) - Heparina (0.1 mg/mL) - Fluoruros 149
Todos ellos tienen sus limitaciones para ser usados ninguno puede ser utilizado en todas las determinaciones. La heparina es el anticoagulante que menos interfiere en la mayora de las determinaciones de sustancias qumicas. Polisacrido presente en la mayora de los tejidos, en concentraciones menores a las necesarias, para evitar la coagulacin de la sangre. La heparina se presenta como sal sdica, potsica, de amonio o de litio, y la dosis a utilizar es de unas 20 U/m de sangre extrada, acta como anticoagulante evitando la transformacin de protrombina y, por tanto, evitando la formacin de fibrina a partir del fibringeno. El oxalato acta como anticoagulante por la formacin de complejos con el calcio, ion que es fundamental en el mecanismo de coagulacin. La sal ms utilizada es el oxalato potsico, en una concentracin de alrededor de 2 mg/mL de sangre. Las sales de oxalato se utilizan como anticoagulantes en las determinaciones hematolgicas de recuentos celulares y hematocrito. El citrato es otro anticoagulante que acta por formacin de complejos con el calcio. Alrededor de 30 mg/mL de sangre es la concentracin que suele utilizarse. El citrato sdico se emplea para las medidas de velocidad de sedimentacin y estudios de coagulacin. El EDTA (etilendiaminotetracetato) sdico o potsico se utiliza en concentraciones de 1 a 2 mg/mL de sangre para los recuentos hematolgicos. Su accin se debe tambin a la formacin de quelatos con el calcio. El fluoruro es un preservador que inhibe un gran nmero de enzimas, por lo que impide el metabolismo de diversas sustancias sanguneas, til para las determinaciones de glucosa cuando entre la toma y la centrifugacin de la sangre haya de transcurrir ms de una hora. MUESTRAS DE SANGRE PARA HEMOCULTIVOS Las extracciones de sangre para hemocultivos deben realizarse en condiciones especiales. Para ello se limpia la piel con alcohol al 70% o con una mezcla de ter-alcohol y se extraen de 5 a 10 mL de sangre con una jeringa estril. Se punciona con la aguja en el tapn de goma del recipiente que contiene el medio y se descarga la jeringa mezclando bien la sangre con el medio de transporte. La seleccin del medio para el transporte de la sangre sobre la que se va a realizar el hemocultivo depende del organismo del que se sospeche. Para la mayora de los hemocultivos, la tripsina soya es la ms recomendada.
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ESPECIES Llamas y Guanacos Carnvoros Felinos Osos Primates Herbvoros Bongos Elefantes Rinocerontes Jirafa Hipoptamo Equinos Cebras, bongos Antlopes Crvidos, venados Pecar tejn, elefante coat Aves Avestruces Tortuga MUESTRA DE ORINA
LUGAR DE PUNCIN Yugular en bifurcacin Safena, radial, vena caudal cola, femoral (interior). Femoral, safena Femoral, safena, ceflica brazo Yugular, radical, safena Auriculares en orejas Radial, ceflica Yugular Auriculares en orejas, ceflica Yugular Yugular, radial, safena Yugular, radia, safena Cava, trax, yugular Plexo braquial, ala, corazn Plexo braquial Corazn
La orina ha de recogerse inmovilizando al animal, utilizando sonda, de acuerdo con el anlisis que se va a realizar en ella. Debe sealarse que una correcta recogida de orina condicionar la adecuada interpretacin de los datos obtenidos. En el pasado, y hoy en da, se utiliza todo tipo de recipientes para su recogida, lo que origina un gran nmero de errores, debido a las interferencias producidas por contaminantes contenidos en los recipientes. Para evitar estos problemas, conviene usar recipientes limpios de plstico desechable, de un solo uso. CONSERVADORES PARA LAS RECOGIDAS DE ORINA En las recogidas de orina, de acuerdo con las determinaciones que haya que realizar, deben adicionarse a los recipientes de almacenamiento los conservadores adecuados. Estos tienen diferentes funciones; las principales son reducir la accin bacteriana y la descomposicin qumica, solubilizar los constituyentes urinarios que puedan precipitar y evitar la oxidacin de compuestos inestables. En cualquier caso, debe procurarse mantener la orina, en refrigeracin, segn se va recogiendo. Los conservadores ms empleados son el cido clorhdrico concentrado para las determinaciones de catecolaminas, calcio, y el cido actico glacial para los 17 cetosteroides, los 17 hidroxicorticoides, estrgenos y cortisol libre. La creatinina, el cido rico y el fosfato no requieren conservadores. -MUESTRAS DE ORINA PARA CULTIVOS: Las muestras para cultivos bacterianos de orina (urocultivos) deben recogerse en recipientes estriles. Para la recogida de estas orinas. A veces 151
se emplea la cateterizacin de vejiga y la aspiracin suprapbica; sin embargo, debido a sus complicaciones, es raro su uso. MUESTRAS DE HECES En el laboratorio de qumica clnica, las heces se recogen para dos tipos principales de anlisis: determinacin de sangre oculta y estudios de contenido de nitrgeno y grasas. El anlisis de sangre oculta se realiza con pequeas porciones de heces, recogidas con una esptula. Las heces se aplican directamente sobre las pelculas reactivas y se llevan al laboratorio para su anlisis. Los estudios microbiolgicos (coprocultivo) requieren la recogida de las heces en condiciones estriles. Los recipientes de recogida suelen tener unido al tapn una pequea cucharilla para extraer las heces en el laboratorio. Para los anlisis parasitolgicos deben llevarse las muestras lo ms rpidamente posible al laboratorio, pues el examen conviene efectuarlo sobre heces frescas, recin emitidas. Cuando no pueda hacerse as, de debe utilizarse un medio de conservacin que fije y conserve los protozoos. MUESTRAS DE LIQUIDO CEFALORRAQUIDEO El lquido cefalorraqudeo se obtiene normalmente por puncin lumbar, que debe ser hecha siempre por un mdico y estando el animal inmovilizado. En caso de puncin hemorrgica, la primera muestra es la ms hemtica, pero si ya existe hemorragia, las tres muestras son igualmente hemticas. El lquido cefalorraqudeo del primer recipiente o el del tercero se utiliza, en parte, para el recuento de clulas y el resto se centrifuga y se hace una extensin del sedimento, que se tie con Giemsa para determinar la frmula leucocitaria y con Gram para observar la presencia de microorganismos. El sobrenadante se emplea para las determinaciones bioqumicas. El lquido del segundo recipiente se usa para los cultivos microbiolgicos. El LCR debe cultivarse lo antes posible; cuando no pueda hacerse as, debe mantenerse a 4C en refrigerador hasta que pueda realizarse el cultivo. MUESTRAS DE EFUSIONES SEROSAS Una efusin es la acumulacin patolgica de lquido en cualquiera de los espacios del cuerpo, entre los que se incluyen el saco pericrdico, el espacio pleural, el espacio peritoneal y los espacios articulares. Los lquidos de estos espacios se denominan, respectivamente, lquido pericrdico, pleural, peritoneal (asctico) y articular (sinovial). En condiciones normales, el volumen de estos lquidos es muy escaso, pero en condiciones patolgicas puede acumularse en grandes cantidades. Los principales anlisis que se realizan en las efusiones serosas son: examen fsico, estudio bioqumico, estudio bacteriolgico y estudio citolgico. Los lquidos se obtienen en varios recipientes estriles, uno de los cuales debe llevar un anticoagulante para el recuento celular total y el diferencial de leucocitos. La tcnica de obtencin del lquido pericrdico se denomina pericardiocentesis; la del lquido pleural, toracocentesis; la del peritoneal, laparocentesis, y la del articular, artrocentesis.
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MUESTRAS DE LQUIDO AMNIOTICO El lquido amnitico se obtiene por puncin abdominal, mediante una tcnica denominada amniocentesis. -HISOPOS: Las muestras de material de superficies o exudados para los anlisis microbiolgicos se recogen con un hisopo, que es una torunda de algodn enrollado alrededor de un palito de madera o papel. Se han comercializado una gran cantidad de hisopos con medios de transporte adecuados. Los hisopos existentes en el mercado consisten en un recipiente cilndrico, cerrado y esterilizado, que contiene el medio de transporte. Una vez usado el hisopo, se introduce en la cmara que contiene el medio, quedando la muestra sumergida en ste. De esta forma puede mantenerse durante varios das, aunque lo ms adecuado es llevarlo cuanto antes al laboratorio para su anlisis. IDENTIFICACIN DE LAS MUESTRAS La identificacin de las muestras puede ser directa o indirecta. En la identificacin directa, el contenedor de la muestra lleva unas marcas que, en cualquier momento de su procesado, la asocia con el paciente, la identificacin indirecta de las muestras, que es la que an se utiliza en la mayora de los laboratorios, asocia la posicin del contenedor de la muestra a una secuencia, con una lista de colocaciones de forma manual o por medio de un ordenador. Las determinaciones que requieren extraer la muestra del tubo original, como el plasma o el suero, generan marcas secundarias, que deben llevar la misma informacin que la original. En la actualidad, para evitar confusiones, la mayora de los analizadores pueden aspirar la muestra del tubo original de extraccin, con lo que no es necesario sacar la muestra de su contenedor original y generar marcas secundarias en otros recipientes. Los sistemas de identificacin directa ms utilizados son los que se adhieren a los tubos de extraccin o a los recipientes donde se coloca la muestra. De todos ellos, el ms empleado es el sistema de cdigo de barras. En los mtodos de identificacin indirecta de las muestras, pueden diferenciarse las colocaciones seriadas y las colocaciones posicionales. En los procedimientos de colocacin seriada, las muestras son alimentadas secuencialmente, de forma que la misma muestra normalmente tiene posiciones diferentes en varias series analticas. TRANSPORTE DE LAS MUESTRAS El tiempo que transcurre entre la obtencin de las muestras y su llegada al laboratorio suele ser corto, por lo que para la mayora de las determinaciones no son necesarias condiciones especiales de transporte. Sin embargo, algunas de ellas requieren la refrigeracin de la muestra desde el momento de la extraccin. El transporte de los especmenes desde los lugares de recogida hasta el laboratorio suele hacerse en gradillas. En algunos centros, debe tenerse especial cuidado y fijar bien los tubos de extraccin dentro del contenedor, para evitar su movimiento, lo que puede producir hemlisis. - Considerar el tiempo de vida medio para cada tipo de muestra. - La mayora de muestras para que sean validas debern ser refrigeradas. - No es recomendable agregar conservadores qumicos. - Las muestras alteradas o afectadas no son tiles para efectuar estudios de laboratorio. - Los recipientes para contener las muestras debern de ser de fcil manejo y apropiados para este uso. 153
- Evitar al mximo posible que la muestra se descomponga por: desecacin, evaporacin, hemolisis o contaminacin. ENVO DE LA MUESTRA - Remitirla lo ms pronto posible al laboratorio. - Identificarla adecuadamente. - Tapar el recipiente que la contenga hermticamente o con tapn de rosca. - Considerar la cantidad de muestra la suficiente, para que se efecten los estudios solicitados. - Anexar una resea de la historia clnica con estudios que se solicitan y diagnstico presuntivo. El envo de las muestras de unos laboratorios a otros debe hacerse en condiciones adecuadas. Los recipientes donde vayan las muestras (polietileno o polipropileno). Estos se introducen en los contenedores de transporte (sobres especiales o cajas). Las muestras que necesiten congelacin deben enviarse en recipientes de poliestireno expandido con hielo seco o bolsas congeladoras. PREPARACIN DE LAS MUESTRAS Aspectos importantes del trabajo de los laboratorios es la preparacin de las muestras. La mayor parte de las determinaciones hematolgicas se realizan en sangre total anticoagulada, obtenida con EDTA, y no requieren un tratamiento previo, pueden almacenarse hasta 24 horas a 4C. Las extensiones para la frmula leucocitaria han de hacerse lo antes posible. La sangre obtenida con citrato para la medida de la velocidad de sedimentacin globular puede mantenerse de 4 a 5 horas a temperatura ambiente. Las determinaciones bioqumicas se realizan en suero o plasma sanguneo. Cuando no se ha aadido anticoagulante a la sangre extrada, debe dejarse que se complete la coagulacin y se retraiga el cogulo antes de centrifugar, ya que si no, la formacin de fibrina puede posteriormente causar problemas de obstruccin en pipetas y en las puntas de aspiracin de las muestras de los analizadores. La sangre se coagula normalmente entre 20 y 40 min. La separacin de la fraccin lquida de la sangre de los componentes celulares se realiza por centrifugacin a 1.000-1.500 x g durante 10 min. Las muestras para determinaciones de pH y gases deben colocarse en un bao de hielo y analizarse lo ms rpidamente posible. Cuando algn anlisis no pueda realizarse en el mismo da de la extraccin, para las determinaciones bioqumicas, debe taparse el tubo y guardarse en refrigerador a 4C o congelarse a -20C hasta su anlisis. Obtenida la muestra adecuada deben repartirse a las diferentes secciones de laboratorio. Esta operacin se realiza generalmente, de forma manual. Para evitar trasvases que pueden dar lugar a errores, muchos analizadores automticos pueden utilizar los mismos tubos de extraccin, tal y como se ha sealado antes. Recientemente han aparecido en el mercado sistemas para la preparacin de las gradillas para las diferentes secciones analticas de laboratorio. Los ms corrientes son dispositivos con pipetas capaces de moverse en dos direcciones. Tambin se han fabricado robots capaces de manipular los tubos con las muestras. Estos robots tienen Manos y Dedos que manejan los tubos y distribuyen las muestras en las gradillas de cada seccin analtica de laboratorio.
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INTERPRETACIN DE LOS RESULTADOS El veterinario al examinar al paciente y realizar la historia clnica completa debe escoger los procedimientos indicados de laboratorio, para interpretar con mayor facilidad los resultados, no dejando de hacer nfasis en ciertos aspectos tales como: 1.- Variaciones normales Para reconocer los valores normales, el clnico tiene que conocer los promedios y variaciones que se consideran dentro de los lmites de normalidad para cada especie, puesto que existen variaciones fisiolgicas, propias a su metabolismo y al ambiente. 2.- Especificidad de un examen No debe olvidarse que casi no hay resultado de laboratorio, que siendo este anormal sea patognomnico para una sola enfermedad. LIMITES DE UN EXAMEN En este caso el mdico se debe familiarizar con las tcnicas que se usan en el laboratorio, porque muchas veces la interpretacin se basa en la precisin inherente a la prueba (es decir se debe contar con informacin sobre la exactitud de las tcnicas de laboratorio). Por lo que el clnico especialista debe usar el laboratorio solo como un auxiliar en el diagnostico y no esperar que el laboratorio haga el diagnstico, en otras palabras lo puede usar para apoyar o eliminar diagnsticos posibles. Para terminar con la participacin en el tema se dira que en la toma de muestras para animales de zoolgico podr haber muchas diferencias en aspectos, factores, errores y variables que puedan interferir. Pero para un profesionista no deben existir tales diferencias en su trabajo cotidiano ya que cualquiera que pudiera ser su paciente requiere de todos sus sentidos y del mximo de responsabilidad para que sus habilidades y destrezas sean puestas a funcionar en el momento en que los pacientes lo requieran, ya que no deben existir clases o niveles de calidad en los servicios que se prestan, convirtindose esta tarea doblemente importante, ya que cuando se trabaja con animales en peligro de extincin, la extincin ser permanente y definitiva. BIBLIOGRAFA 1. Archer.R.K., Comparative Clinical Haematology, Ed. Blackweel Scientific, 1977. 2. Anaesthesia and Immobilization in Zoo. Mammals and Birds with Medetomidine-Ketamine Combination, and Reversal with Atipamezole, European Association of Zoo, and Wildlife Veterinarians, Rostock, Germany, May. 1996. 3. Ancher.R.K., Tcnicas de Hematologa Animal, Ed. Acribia, 1967. 4. Boquet. J.E., et. al., Mejora Continua de la Calidad, Gua para los Laboratorios Clnicos de Amrica Latina, Ed. Panamericana, 1996. 5. Daz,.G.H.R., Hernndez, V.S.; Determinacin de Cifras Hemticas en 28 equinos de Raza Mestiza Aparentemente sanos, Centro Universitario del Estado de Mxico A C, 1985. 6. Daz.G.H.R., Manual de Prcticas de Laboratorio Clnico, 3a. ed., F.M.V.Z. de la U.A.E.M., 1991. 7. Doxey.D.L., Patologa Clnica y Procedimientos de Diagnstico en Veterinaria, Ed. Manual Moderno, 1987. 155
8. Ersley.A. J., Hematologa Aspectos fisiopatolgicos, 2a ed., Interamericana, 1981. 9. Fowler.M.E., Medicine and Surgery of South American Camelids, Ames, Iowa, 1989. 10. Gonzlez de Buitrago. J.M., Tecnologa y mtodos del Laboratorio Clnico, Ed Salvat, 1990. 11. Guevara, G.J.I., El Uso de Opiecitos en Animales de Zoolgico, Reunin de Veterinarios de Animales de Zoolgico, 1990. 12. Guevara, G.J.I., Contencin Qumica de Rumiantes Salvajes, 1era. Reunin Nacional de Criaderos, C.E.M.A.R.N.A.F., Feb. 1997. 13. Haigh, J.C. Opioids in Zoological Medicine, Journal of Zoo and Wildlife Medicine, A.A.Z.V. U.S.A., 1990 14. Kaneko.J.J. Clinical Biochemistry of Domestical animal, 3a ed., Ed. Academic Press, 1980. 15. Lance. W.R., New Pharmaceutical Tools for the 1990S, Wildlife Pharmaceuticals, Inc. 1992. 16. Maxine.M.B., Manual de Patologa Clnica en Veterinaria, Ed.- Limusa, 1984. 17. Memorias del Curso de Actualizacin sobre Contencin Fsica y Qumica en Animales Silvestres y de Zoolgico, Gobierno del Estado de Mxico, C.E.P.A.N.A.F.,1991. 18. Memorias del Diplomado en Medicina y Manejo de Fauna Silvestre, modulo V, Medicina y Manejo de Herbvoros, Fac. de Med. Vet. y Zoot., U.N.A.M., 1993. 19. Medway.D.V.M., Patologa Clnica Veterinaria, Ed. UTEHA., 1980. 20. Murray.E.F. Restraint and Handling of Wild and Domestic Animals, Seventh Printing, Iowa State University Press, 1989. 21. Mussman.H.C., Rave.G.V., Patologa Clnica Veterinaria, Ed ICA, 1978. 22. Schalm.O.W., Hematologa Veterinaria, Ed. Hemisferio, 1981. 23. William.J.M., Hematologa (Tomo I y II ), Ed. Salvat, 1980. 24. Willard.M., Small Animal Clinical Diagnosis by Laboratory Methods., Ed. Saunders Company, 1989.
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CONTENCION FSICA Y QUMICA DE FAUNA SILVESTRE M. EN C. ARTURO LUNA BLASIO INTRODUCCION. La contencin de animales salvajes tanto en vida silvestre (in situ), como los que se encuentran alojados en cautiverio (ex situ), tal es el caso de las unidades de manejo para la conservacin de la vida silvestre (UMAs) y los parques zoolgicos, es de vital importancia para un sinnmero de procedimientos, entre los que destacan: El estudio cercano de las enfermedades, realizando el examen fsico del individuo o grupo de animales en cuestin. Aplicarles un sistema de identificacin (anillos, microchip, aretes, etc.) La captura para transportarlos a otros sitios, generalmente bajo un previo entrenamiento. Nos facilita la toma de muestras, ya sea en un monitoreo durante su cuarentena o para verificar su estado de salud o tambin como medio de diagnstico cuando sospechamos de un problema patolgico.
Cada mtodo tiene sus peculiaridades para ser empleado y particularmente cuando se requiere tomar una muestra para anlisis clnicos habr que analizar si el ejemplar en cuestin est recin capturado, ha recibido inmovilizaciones previas, naci en cautiverio o incluso si est influenciado bajo el tipo de aprendizaje denominado impronta o troquelado con el humano, situacin (esta ltima) que facilita el manejo. En conclusin, para poder realizar un muestreo en este tipo de animales es indispensable elegir y emplear el mtodo de inmovilizacin idneo a las circunstancias. PRECAUCIONES ANTES DE SELECCIONAR UN METODO DE INMOVILIZACION. 1. Tener seguridad para el personal mdico y de apoyo que interviene durante el proceso. 2. Que sea seguro para el animal. 3. Observar constantemente los efectos fsicos, qumicos y conductuales, particularmente cuando se empleen agentes inmovilizantes. 4. Los animales no deben ser inmovilizados en un ambiente con temperatura superior a 32 C y humedad relativa arriba del 70% MTODOS DE MANEJO FSICO. 1. Mecanismos fisiolgicos. Podemos emplear elementos como la voz y la manipulacin con las manos (seales) como parte del entrenamiento con algunos animales en donde la contencin qumica se complica, tal es el caso de animales cuyo volumen corporal es considerable (elefantes, cebras, jirafas, hipoptamos, rinocerontes y varios artiodctilos). La voz es una herramienta frecuentemente usada por los manejadores de animales por ser fcil de emplear; diversos estados emocionales son reflejados a travs de la voz y son percibidos por los animales. Otro mecanismo para restringir la actividad de un animal es mediante el movimiento de las manos, ya que con diversos ademanes el animal puede obedecer una orden o instruccin a realizar. 157
Es notable el establecimiento en animales salvajes de una dominancia entre el manejador y el animal; tanto el empleo de la voz, como el movimiento de las manos es utilizado en ejemplares con manejos previos, ejemplo de ello, son los primates que se ocupan en bioterios y laboratorios de investigacin biomdica, los animales de circo e incluso los mamferos marinos, stos ltimos entrenados para espectculos, mediante seales y sometidos al aprendizaje de diversas rutinas mediante condicionamiento operante responden a las instrucciones que reciben de sus entrenadores e incluso de esta manera, tambin obtienen las muestras para laboratorio, cuando estn enfermos o en sus chequeos clnicos peridicos. Hoy en da ha surgido el entrenamiento por contacto protegido mediante el condicionamiento operante, como una herramienta en el manejo de animales en cautiverio, ya que el animal participa de forma voluntaria para la realizacin de diversos procedimientos clnicos de manera rutinaria, como es el muestreo de sangre (fig. 1), exmenes fsicos, vacunaciones, medicacin, etc.; todo lo anterior bajo ensayo y error siempre con un refuerzo positivo (obtencin de alimento).
Fig. 1 Muestreo de sangre de un ejemplar de rinoceronte entrenado bajo condicionamiento operante.

2. Disminucin de los sentidos: a) Caperuzas en aves rapaces (animales con manejo previo). b) Cubiertas en aves corredoras u otro tipo de aves. La reduccin o eliminacin de la comunicacin o campo visual de un animal con el medio que le rodea, es una importante tcnica de restriccin fsica. El ejemplar con los ojos cubiertos puede permanecer quieto por un largo periodo de tiempo, siempre y cuando no se realicen procedimientos que le causen demasiado estrs. Este mtodo es ocupado en aves rapaces, mediante el empleo de las llamadas caperuzas, sobre todo en aquellas entrenadas para la cetrera; tambin se ocupan fundas para la cabeza en las 158
aves corredoras (avestruz, and y em). Se pueden ocupar otro tipo de objetos para impedir su visin de las aves como son los guantes, tela, etc., siempre con el debido cuidado de no obstruir su respiracin. Los sonidos excesivos de motores, vehculos o ruidos extraos pueden inquietar al animal, por lo que se recomienda realizar los manejos en silencio, e incluso algunos animales pueden reaccionar negativamente cuando son tocados por el hombre, mostrando conducta agonstica como respuesta, por lo que habr que extremar precauciones. 3. Confinamiento Cajas de transporte de madera y metal. Jaulas de compresin: a) Mvil chica. b) Mvil grande. c) Fija de concreto y metal. Un confinamiento aceptable vara considerablemente, dependiendo de la especie, edad y situacin, por ejemplo: un animal adulto que se captura en vida libre y se le confina inadecuadamente para su transportacin, es una situacin que le causa mucho estrs e incluso puede causarle la muerte. El estrs o tensin ambiental que causa el confinamiento puede ser gradualmente intensificado mediante el movimiento, a travs de un entrenamiento, de ejemplares a cajas o encierros cada vez ms pequeos, pero acordes a su talla. Existen diversos tipos de confinamiento: a) Cajas de madera o metal. Utilizadas generalmente para transportar ejemplares de un sitio a otro; deben tener una tapa deslizable en uno de los extremos que permita la salida y entrada del animal, sin poner en riesgo al operador. Deben tener un sistema que permita ventilar adecuadamente y orificios para vigilar y suministrar agua y alimento, en caso necesario. b) Fija. Es un tipo de confinamiento que incluye las llamadas jaulas de compresin, que en el caso de ser fijas se hallan dentro de los albergues, en el rea del dormitorio; se caracterizan por tener una pared que se mueve a travs de poleas y una manivela, lo que hace que al ponerlas en funcionamiento compriman contra la pared opuesta al animal y de esa manera podemos realizar diversos procedimientos clnicos e incluso cirugas menores o curaciones; stas cajas o jaulas se pueden ocupar con animales de volumen corporal considerable de hasta 150 o 200 Kg (Fig. 2). c) Mviles. Incluye las jaulas de compresin que pueden tener ruedas, permitindonos el movimiento hacia los albergues o reas en donde se requiera el confinamiento de un animal; las hay de diversos tamaos: pequeas, para algunos primates de poco peso o carnvoros, la compresin se realiza manualmente; y tambin las hay grandes para animales de mayor talla. Escoger la jaula de compresin ms adecuada, debe ser tomando en cuenta las variantes que existen entre los animales entre su conformacin anatmica y sus requerimientos fisiolgicos y as realizar el procedimiento con mayor seguridad.
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Fig. 2 Tigre de bengala en una jaula de compresin fija

4. Sujetadores o domadores. Los domadores o sujetadores son herramientas muy tiles para el manejo fsico de animales salvajes; son tubos largos (1.5 a 2 m.) y con cuerdas de nylon o cable en uno de sus extremos, permiten su colocacin en el cuello del ejemplar que se va a manejar, mientras que en el otro extremo podemos jalar y ajustar el cierre de la cuerda o cable, siempre cuidando de no ajustarlo demasiado para no producirle asfixia; se ocupan para el manejo de pequeos carnvoros (mapaches, coats, coyotes, felinos, etc.). 5. Redes. Las redes son uno de los equipos de manejo fsico de mayor importancia y uso frecuente, tanto en animales de vida libre para su captura, como para la contencin en el cautiverio, permitindonos realizar con cierta facilidad algunos procedimientos como son: la identificacin, medicacin, revisin clnica, aplicacin de inyecciones, obtencin de muestras para laboratorio, entre otros. Existe una amplia variedad de redes y tamaos para el manejo de especies, hay redes para la captura en vida libre de aves (ornitolgica) y mamferos y redes fijas a un tubo y unidas a un aro, tiles para la contencin de ejemplares en el cautiverio. Los mamferos marinos en particular, ya sean los pinnpedos o los cetceos son manejados comnmente a travs del uso de redes (fig. 3); cuando es necesario su manejo para transporte, entonces los cetceos (delfines, orcas) son colocados en unas camillas de lona o red con orificios laterales, que permiten el libre movimiento de sus aletas, mientras que los pinnpedos pueden transportarse en las propias redes.
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Fig. 3 Contencin de un delfn con red.

6. Barreras Fsicas a) Plsticos opacos. b) Lminas. c) Escudos. Las barreras fsicas pueden ser usadas para proteccin entre un manejador y el animal; entre los artefactos que se pueden ocupar tenemos los escudos, el cual consiste en una lmina de madera o de plstico o acrlico rgido equipada con un asa al reverso que permite su manipulacin. Los escudos de madera o plstico se pueden usar con reptiles no venenosos, algunos mamferos pequeos, aves, primates de talla pequea o mediana y algunos roedores, por ejemplo, para movilizarlos de su albergue hacia una jaula de transporte o de compresin o viceversa. Otras barreras empleadas son las mantas o plsticos opacos, las cuales protegen al manejador de las patadas o embestidas con los cuernos o astas; se utilizan en el caso de varias especies de artiodctilos pequeos y medianos, que permiten conducir grupos numerosos de animales de un sitio a otro o hacia una manga de manejo. 7. Fuerza Fsica: a) Guantes de cuero, carnaza. b) Manual. Muchos procedimientos que se realizan en los animales salvajes requieren el uso de las manos, sin embargo, debemos tomar una decisin acertada de cuando utilizarlo, por nuestra propia seguridad, dependiendo del tipo de animal a manejar. La cantidad de fuerza que vamos a aplicar es muy importante, ya que no ser lo mismo manejar una musaraa de 50 g. que un primate de 10 kg. Por ejemplo; algunos de los daos que podemos causar son la sofocacin e incluso asfixia por presin en el cuello o trax o bien fracturas de miembros o costillas por aplicar demasiada fuerza. Para mayor proteccin es recomendable emplear guantes, ya sea de algodn o piel, para evitar algn dao por mordidas o presin con las garras, por ejemplo cuando manejamos aves rapaces, roedores y algunos primates de talla pequea o media, aunque existe el riesgo tambin de cometer algn error porque disminuye nuestro tacto con los guantes.
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Son muy numerosas las especies en las que podemos emplear la fuerza fsica, como son la mayor parte de especies de aves, algunos reptiles, como es el caso de las tortugas, cocodrilos jvenes, la mayora de saurios, incluyendo al Heloderma o monstruo de Gila, que a pesar de ser el nico saurio venenoso, debido a sus movimientos lentos puede ser manejado por este mtodo. Las serpientes del tipo constrictor, se pueden manejar mediante la fuerza fsica, para lo cual se toma la cabeza empleando los dedos medio y pulgar y el cuerpo con la otra mano, impidiendo que el animal enrolle nuestro brazo. El grupo de mamferos que puede ser inmovilizados a travs de la fuerza fsica son: roedores, insectvoros, quirpteros (fig. 4), carnvoros, marsupiales, varias especies de primates, desdentados y lagomorfos, adems de las cras de gran volumen corporal, evitando el empleo de la inmovilizacin qumica.
Fig. 4 Contencin mediante fuerza fsica de un microquirptero.

8. Manejo de serpientes. Para el caso especfico de algunos reptiles, particularmente las serpientes venenosas, requieren de un manejo especial, este se realiza a travs de los llamados ganchos herpetolgicos, los cuales estn diseados acorde a la anatoma de los ofidios, permitindonos su manejo y con el auxilio de otras herramientas, como los limpiadores de vidrios y tubos, podemos manipular su cuerpo y utilizar las manos para diversos procedimientos clnicos e incluso extraer su veneno. Finalmente, es importante mencionar que existen otros tipos de confinamiento que se ocupan en las propias serpientes, algunos reptiles, pequeos mamferos y aves, en donde se pueden introducir dentro de tubos de plstico o acrlico transparente y nos permiten realizar estudios radiogrficos, aplicacin de inyecciones, obtencin de muestras para laboratorio o cualquier otro procedimiento menor.
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MTODOS Y EQUIPO DE MANEJO QUMICO CLASIFICACIN DE MTODOS PARA CONTENCIN QUMICA Y ADMINISTRACIN DE FRMACOS Los mtodos de contencin qumica y para la administracin de frmacos como pueden ser por ejemplo los antibiticos, desparasitantes, analgsicos, etctera, se clasifican de la siguiente manera: 1. PASIVA: A travs de la administracin de cpsulas, grageas, tabletas, soluciones. La administracin directa se puede llevar a cabo de manera manual colocando el frmaco en la boca, o bien empleando tubos o sondas, mientras que la administracin indirecta se puede realizar depositando el frmaco o la sustancia qumica ya sea en el agua de bebida o en el alimento; dicho alimento tendr que ser de gran predileccin por parte del animal, para que lo ingiera con gran voracidad y no detecte la presencia del frmaco o sustancia qumica depositada. 2. ACTIVA: La administracin activa se puede llevar a cabo de manera manual directamente, empleando jeringas hipodrmicas, a travs de bastones o tambin denominado telecisto (fig. 5) o teniendo al animal parcialmente inmovilizado en una jaula de compresin o red por ejemplo. Otro mtodo de contencin o de administracin de frmacos es de manera remota o a distancia, para ello ocupamos: a) Propulsores Potentes y medianos: rifle y pistola con cargas explosivas de largo alcance. b) Propulsores bajos: disparadores con tanques de bixido de carbono comprimido y dardos con aire a presin.
Fig. 5 Empleo del telecisto con un oso negro

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Dentro de los propulsores potentes y medianos tenemos a los rifles y pistolas que ocupan cargas explosivas, a base de bixido de carbono comprimido para impulsar los dardos que contienen las sustancias qumicas y que son ocupados principalmente para llevar a cabo captura de animales salvajes en vida libre y pueden fcilmente cubrir distancias que van desde 15 hasta 80 metros mximo, variando de acuerdo a la potencia de carga que utilicemos. Los dardos que se ocupan para estos equipos son metlicos y presentan diversas capacidades que van desde 1 hasta 15 ml., requieren agujas metlicas atornillables; estn compuestos por: una cmara de sustancias, un mbolo y cola direccional (fig. 6); ocupan tambin cargas explosivas, cuya funcin es impulsar el mbolo al momento en que el dardo impacta en el animal.
Fig. 6 Dardo con carga explosiva mostrando: a) cola direccional, b) mbolo con carga explosiva y c) aguja atornillable
c) Propulsores bajos: Rifle, sistema Teleinyect que emplean dardos (con aire a presin) Este tipo de propulsores ocupan cerbatanas conectadas a un rifle o a un disparador, que en ambos casos se integra a un compresor de aire o bien ocupan un tanque con bixido de carbono comprimido, el cual dependiendo de la distancia que se desee cubrir, proporcionar la cantidad de libras de presin que se requieren; este equipo normalmente puede cubrir distancias de hasta 30 metros en promedio. d) Propulsores Suaves o de Aliento: Cerbatanas Son denominados como propulsores bajos o de aliento, porque el envo de los dardos a travs de la cerbatana, se realiza con el aire expulsado por una persona; la potencia ir en proporcin a la capacidad torcica del operador, por lo tanto las distancias que se cubren normalmente son de hasta 5 o 10 metros. Los dardos que se ocupan tanto para los propulsores bajos en el sistema Teleinyect, o Dainyect como con los propulsores bajos o de aliento estn compuestos de las siguientes partes: capuchn de la aguja; aguja con la punta obturada y orificio de salida lateral; tapn elstico corredizo; una 164
cmara de sustancias qumicas; un mbolo; una cmara de aire comprimido con un tapn y una cola direccional (fig. 7). El equipo tambin se compone de algunos elementos anexos como son un pequeo gancho para remover el tapn de la cmara de aire comprimido y un conector para el paso de sustancias de una jeringa convencional hacia la cmara de sustancias qumicas del dardo o para aplicar aire.
Fig. 7 Dardo con aire a presin mostrando: a) cmara de aire a presin con tapn hermtico, b) mbolo y c) aguja con tapn corredizo
La capacidad de los dardos es variable, los ms comunes son de 1, 3, 5 y hasta 10 ml, por lo que ser necesario emplear frmacos o agentes inmovilizantes muy concentrados, ya que no es recomendable administrar sustancias qumicas en grandes cantidades aplicando varios dardos. La forma de preparar los dardos lleva una serie de pasos que son los siguientes: 1. El frmaco o agente inmovilizante que se va a emplear se carga en una jeringa convencional, en condiciones aspticas. 2. Se remueve el tapn de la cmara de aire comprimido del dardo, introduciendo un gancho elaborado ex profeso para ello- a travs del orificio que comunica con dicha cmara. 3. Por medio de un conector se une con firmeza la jeringa convencional (sin la aguja) y ya cargada con el frmaco a la cmara de sustancias del dardo. 4. Una vez unidas la jeringa y el dardo, se empuja el mbolo de la jeringa convencional para permitir el paso del frmaco a la cmara de sustancias del dardo, sostenindolos con firmeza para evitar un accidente. 5. Se coloca la aguja del dardo, conectndola al orificio de salida de la cmara de sustancias qumicas y el tapn corredizo se jala para cubrir el orificio de salida lateral de la aguja; se deber poner mucho cuidado en este procedimiento para evitar accidentes, como puede ser un pinchamiento con la aguja o la salida del medicamento, que en ocasiones son muy txicos o potentes, con efectos lamentables para el humano. 6. Se coloca el capuchn que protege la aguja del dardo, esto con la finalidad de evitar algn otro accidente como puede ser la expulsin prematura del medicamento, por falla del tapn 165
corredizo o la expulsin de la aguja (si no qued bien puesta), todo esto antes de introducir aire a la cmara de aire comprimido del dardo; dicha cmara se une mediante un conector a una jeringa convencional (de 10 o 20 ml.) cargada con aire. Se introduce la cantidad de aire que sea necesaria hasta que encontremos resistencia. 7. El paso final de preparacin del dardo es la colocacin de la cola direccional, ocluyendo el orificio de salida de la cmara de aire comprimido. 8. Una vez preparado el dardo retiramos el capuchn protector de la aguja, lo introducimos a la cerbatana y sta a su vez se conecta al rifle o al disparador y de acuerdo a la distancia que necesitemos cubrir aplicamos una determinada cantidad de libras de presin, de acuerdo a la tabla de especificacin del equipo Teleinyect o bien expulsamos el dardo acorde a la capacidad torcica. El principio que rige el funcionamiento de los dardos consiste en que en el momento que el dardo es expulsado a travs de la cerbatana e impacta la aguja en la masa muscular del animal el tapn corredizo se desliza y debido a una presin positiva que ejerce el aire contenido en la cmara de aire comprimido, el mbolo del dardo es empujado permitiendo la salida de la sustancia qumica, depositndola en el msculo del animal. Lo ms importante en este procedimiento es que el dardo se aloje en una masa muscular adecuada, esto variar de acuerdo a la especie animal que vaya a ser inmovilizada y su condicin corporal, pero las regiones que generalmente se consideran idneas para el impacto de los dardos son la cervical media (tabla del cuello), la braquial lateral y las femorales craneal y caudolateral (fig. 8).
Fig. 8 Impacto de un dardo en la regin braquial lateral en un venado cola blanca

Por lo tanto, se deber tener una gran prctica sobre todo cuando se realiza un disparo a gran distancia, ya que un dardo mal dirigido puede impactar en sitios que pueden poner en riesgo la 166
vida del animal como podra ser la cabeza, la regin cervical ventral y las cavidades torcica o abdominal. Finalmente, es importante advertir que durante una inmovilizacin se pueden presentar efectos adversos como pueden ser: 1. Por el equipo: jeringas inadecuadas o no esterilizadas, agujas sin filo, cargas de bixido de carbono o de los dardos metlicos insuficientes, etc. 2. Fallas del operador: inyeccin en sitios inadecuados, mal clculo de la distancia y lesiones por impacto muy fuerte en el animal. 3. Condiciones diversas: viento, calor, estrs y humedad relativa muy elevada. LITERATURA CONSULTADA 1. Cambre, R.C. (1989): Veterinary Anesthesia. Memoria Diplomado en Medicina y Manejo de Fauna Silvestre, Modulo V: Herbvoros. FMVZ de la UNAM, Mxico, pp. 100-147. 2. Comisin Estatal de Parques Naturales y de la Fauna (CEPANAF) (1992): Memorias del Curso de Actualizacin "Fisiopatologa y Manejo de Fauna Silvestre". Ed. CEPANAF y U.N.A.M., Toluca, Mx., 3. Dierauf and Gullard (2001): Handbook of marine mammals Medicine: health, disease and rehabilitation. Vol. 2. Boca Raton: CRC Press, USA. 4. Fowler, M. E. (1995): Restraint and handling of wild and domestic animals. 2nd. Iowa State University Press, USA. 5. Fowler, M.E., (1993): Zoo and Wild Animal Medicine Current Therapy. 3rd. ed, W.B. Saunders, U.S.A. 6. Haigh, J.C. (1990): Opioids in Zoological Medicine. Journal of Zoo and Wildlife Medicine 21 (4): 391-413. 7. Lance, W. R. (1991): New Pharmaceutical Tools for the 1990`s. Proceedings American Association of Zoo Veterinarians: 354-359. 8. Nielsen, L. (1999): Chemical immobilization of wild and exotic animals. Iowa State University Press, USA. 9. Redig, P.T. (1993): Medical Management of Birds of Prey. 2nd. ed., The Raptor Center, University of Minnesota, USA. 10. West G, Heard D y Caulkett N. (2007): Zoo Animal and Wildlife immobilization and Anesthesia. First edition, Blackwell Publishing, USA.
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DISPOSICIN FINAL DE RESIDUOS PELIGROSOS BIOLGICOS-INFECCIOSOS (DISPOSICIN FINAL DE CADVERES Y MUESTRAS BIOLGICAS)
Zamora Espinosa Jos Luis Valladares Carranza Benjamn* Integrantes del Cuerpo Acadmico de Salud Animal INTRODUCCIN En nuestra profesin existen actividades inherentes a la prctica profesional, consideradas de alto riesgo, en particular, nos referimos a que existe un gran problema higinico-sanitario en la disposicin final tanto de los animales procedentes de una necropsia realizada en una sala de necropsia o en campo como de muestras biolgicas que son procesadas en los laboratorios de diagnstico, considerados actualmente como residuos peligrosos biolgico infecciosos, debido a que pueden contener bacterias, virus u otros microorganismos con capacidad de causar infeccin o que pueden contener toxinas producidas por microorganismos que provocan efectos nocivos a seres vivos y al ambiente. Lo que en realidad un problema, porque de su mala disposicin derivan una serie de trastornos que afectan no slo al personal involucrado en esta tarea, sino adems representan un riesgo potencial en el medio ambiente en donde pueden estar involucrados en diversas formas la poblacin animal, la poblacin humana y el medio ambiente.
En este sentido la Secretara de Medio Ambiente, Recursos Naturales y Pesca tiene como objetivo preservar y restaurar el equilibrio ecolgico, as como la proteccin al ambiente.
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Sus disposiciones tienen por objeto propiciar y garantizar el derecho de toda persona a vivir en un ambiente adecuado para su desarrollo, salud y bienestar; as como la prevencin y el control de la contaminacin del aire, agua y suelo. La misma ley en su captulo IV en prevencin y control de la contaminacin del suelo en su Art. 134 fraccin V, menciona: En los suelos contaminados por la presencia de materiales o residuos peligrosos, debern llevarse a cabo las acciones necesarias para recuperar o restablecer sus condiciones, de tal manera que puedan ser utilizados en cualquier tipo de actividades previstas por el programa de desarrollo urbano o de ordenamiento ecolgico que resulte aplicable, para el predio o zona respectiva. No debern emitirse contaminantes o material peligroso que al incorporarse o actuar en la atmsfera, suelo, flora, fauna, o cualquier elemento natural ocasionen desequilibrios ecolgicos o daos al ambiente. La Secretara establece la clasificacin de las actividades que se consideran altamente riesgosas, en virtud de las caractersticas corrosivas, reactivas, explosivas, txicas, flamables o biolgico infecciosas para el equilibrio ecolgico o el ambiente de los materiales que se generan o manejen en los establecimientos industriales, comerciales o de servicios, considerando adems, los volmenes de manejo y la ubicacin del establecimiento. La Secretara promover programas tendientes a prevenir y reducir la generacin de residuos peligrosos, as como a estimular su reuso y reciclaje. La responsabilidad del manejo y disposicin final de los residuos peligrosos corresponde a quien los genera, excepto en aquellos casos en que se contraten empresas autorizadas por la Secretara para el manejo y disposicin final de estos residuos, tomando estas ltimas la responsabilidad para tal actividad. CLASIFICACIN DE LOS ESTABLECIMIENTOS GENERADORES DE RESIDUOS PELIGROSOS BIOLGICO INFECCIOSOS NIVEL I 1.- Clnicas de consulta externa y veterinarias de pequeas especies. 2.- Laboratorios clnicos que realicen de 1 a 20 anlisis al da. NIVEL II 1.- Hospitales que tengan de 1 a 50 camas. 2.- Laboratorios clnicos que realicen de 21 a 100 anlisis al da.
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NIVEL III 1.- Hospitales con ms de 50 camas. 2.- Laboratorios clnicos que realicen ms de 100 anlisis clnicos al da. 3.- Laboratorios para la produccin de biolgicos. 4.- Centros de enseanza e investigacin. 5.- Centros antirrbicos.
El equipo mnimo de proteccin personal para quien efecte la recoleccin, consistir en uniforme completo, guantes y mascarilla o cubreboca. Si se manejan residuos lquidos se debern usar anteojos de proteccin o careta.
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Los envases deben estar etiquetados con la leyenda que indique PELIGRO, RESIDUOS PELIGROSOS BIOLGICO INFECCIOSOS, y rotulados con el smbolo universal de RIESGO BIOLGICO.
SMBOLO UNIVERSAL DE RIESGO BIOLGICO Fuente: NORMA Oficial Mexicana NOM-087-ECOL-1995. Esto se respalda en la Ley Federal sobre Metrologa y Normalizacin en su Art. 76, que, indica las caractersticas de las marcas y contraseas oficiales que debern llevar los productos sujetos al cumplimiento de las Normas Oficiales Mexicanas. Los residuos peligrosos biolgico infecciosos envasados debern almacenarse en contenedores con tapa y rotulados, para lo cual se destinar una rea especfica cuyas caractersticas debern regirse por la Norma Oficial Mexicana NOM-087-ECOL-1995. El perodo de almacenamiento temporal a temperatura ambiente estar sujeto al tipo de establecimiento, como sigue: NIVEL I: Hasta 7 das NIVEL II: Hasta 96 horas NIVEL III: Hasta 48 horas
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Los residuos de necropsias debern conservarse a una temperatura no mayor de 4 C. Una vez terminada la necropsia, de ser posible es importante contar con un incinerador contiguo a la sala de necropsias. En el caso de que los residuos sean transportados a un predio distinto a aqul en el que se generaron, se ajustar a lo dispuesto en la normatividad aplicable al transporte terrestre de residuos peligrosos, de manera muy conservadora podemos sugerir: si los desechos tienen que ser transportados, la ruta que deba emplearse ser la que ofrezca menos riesgo de propagacin de los agentes patgenos aun sea a poca distancia, es recomendable limpiar y desinfectar despus de cada operacin con un desinfectante eficaz, debido al peligro de contaminacin evidente particularmente en casos de enfermedades infecciosas, en especial si se trata de enfermedades exticas. Los residuos peligrosos biolgico infecciosos debern ser tratados por mtodos fsicos o qumicos, los cuales sern autorizados por la Secretara del Medio Ambiente, Recursos Naturales y Pesca, a travs del Instituto Nacional de Ecologa y debern cumplir los siguientes criterios generales: Deber garantizar la eliminacin de microorganismos patgenos y debern volver irreconocibles a los residuos peligrosos biolgico infecciosos. Disposicin final. Una vez tratados e irreconocibles, los residuos peligrosos biolgicos infecciosos se eliminarn como residuos no peligrosos. En localidades con una poblacin hasta de 100,000 habitantes, se podrn disponer los residuos peligrosos biolgico infecciosos sin tratamiento en celdas especiales, conforme a lo establecido en el Anexo 2 de la Norma Oficial Mexicana NOM087-ECOL-1995. El diseo, la construccin y la operacin de las celdas especiales sern autorizadas por la Secretara de Medio Ambiente, Recursos Naturales y Pesca, a travs del Instituto Nacional de Ecologa. 172
Los cadveres de los animales muertos por enfermedad, sacrificados sanitariamente o decomisados, as como sus rganos y desechos de orina u otros exudados, representan, una fuente potencial de agentes etiolgicos y por lo tanto deben ser desactivados apropiadamente, utilizando diferentes procesos que dependen de recursos econmicos, infraestructura y caractersticas particulares. Estos procedimientos aseguran el desecho de estos residuos biolgico infecciosos potenciales que podran servir para perpetuar la enfermedad. Esta actividad de realizar una disposicin final adecuada es factible en clnicas, veterinarias, centros de control y vigilancia epidemiolgica de la rabia y centros de enseanza e investigacin. Sin embargo se dificulta en aquellos lugares muy alejados en donde el propietario o veterinario no disponen de lo mnimo para acatar esta normatividad y debe implementar otras medidas que no afecten el medio ambiente y que al mismo tiempo no pongan en riesgo la salud animal, ni existan repercusiones en la salud pblica. Debido a lo anterior se hace necesario considerar aspectos estticos, sanitarios y econmicos. Esttico. No es nada agradable el ver y oler un cadver en estado de putrefaccin. El Reglamento de la Ley General del Equilibrio Ecolgico y la proteccin al ambiente en su Art. 5 13 para la Proteccin de la Atmsfera considera los siguientes criterios: Fraccin I; la calidad del aire debe ser satisfactorio en todos los asentamientos humanos y regiones del pas; y en su Fraccin II, en las emisiones de contaminacin a la atmsfera que sean de fuentes artificiales o naturales fijas o mviles, deben ser reducidas o controladas para asegurar una calidad del aire satisfactoria para el bienestar de la poblacin y el equilibrio ecolgico.
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Sanitario. La inadecuada disposicin final de residuos peligrosos biolgicos infecciosos, puede ser la fuente de contagio de enfermedades graves, tales como el carbunco, propagado por moscas, el viento, el polvo y las corrientes de agua.
Econmico. Puede tener como consecuencia la prdida de otros animales que se contagien con los residuos contaminados. Sin embargo sabemos que la solucin del problema no es sencilla, pero se agrava ms con las prcticas inadecuadas que se realizan con los residuos peligrosos, ya sea por ignorancia o irresponsabilidad del personal tcnico. Regularmente el destino para la degradacin de los residuos peligrosos biolgicos infecciosos, principalmente animales muertos se da en los siguientes trminos: 1. Quedan abandonados en el lugar donde han muerto, a merced de perros y aves de rapia. 2. Son enterrados a poca profundidad y sin tomar precauciones, lo que permite a los perros y cerdos que al poco tiempo pongan los despojos al descubierto. 3. Intentan incinerar el cadver y realmente slo lo hacen en forma parcial y superficial. 4. Para las muestras biolgicas, tienen una disposicin final de forma rutinaria sin considerar el riesgo biolgico que esto implica como impacto ambiental. La disposicin final de residuos peligrosos biolgico infecciosos, constituye un problema serio en las explotaciones ganaderas, un animal enfermo que muere o procede de una necropsia en campo representa una fuente de infeccin, la cual puede ser propagada por otros vectores a grandes distancias; ser empleada como alimento o producir impacto ambiental en lugares como fuentes de agua, en el microclima, macroclima y suelos cultivados. Por lo anterior debemos realizar propuestas realistas para estos casos sugiriendo las estrategias siguientes: Enterramiento. Las recomendaciones siguientes se debern adecuar a la normatividad citada. Se utiliza cuando el animal haya muerto por una enfermedad no esporognica, ya que las esporas pueden sobrevivir durante varios aos en los cadveres enterrados. Se debe realizar en sitios adecuados sin desplazar el cadver largas distancias, cuyas caractersticas son: Alejados de asentamientos humanos, establos, pozos, ros, corrales; el terreno debe ser seco, alto y no inundable, ausencia superficial de mantos acuferos no laborable y no rocoso.
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Desde el punto de vista de salud pblica no debe estar cerca de suministros de aguas municipales ni producir contaminacin ambiental. Las medidas de las fosas que se recomiendan son: de 1.20 m de ancho por 1.20-1.60 m de longitud y 1-2 m de profundidad. Antes de colocar en cadver se agrega una capa de cal viva (hidrxido de calcio), se deposita el cadver y se cubre con cal viva, se tapa con tierra y se compacta, posteriormente se agrega una capa de 8 a 10 cm de espesor de cal viva, para entonces terminar adicionando tierra hasta cubrir el agujero. Ya que se tap completamente se apisona sta para compactar el terreno y evitar filtraciones pluviales y por ello el drenaje de posibles contaminaciones a otros lugares. Se queman los pastos en donde cay el animal y se desinfecta el material y equipo que haya estado en contacto con el cadver, lazos, palas etc. Aquellos animales que murieron de fiebre carbonosa, deben ser enterrados a una profundidad mnima de 2 m y cubiertos con cal viva, para finalmente cubrirlo con tierra.
Enterramiento
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Para el enterramiento en masa se calcula un espacio de un metro cuadrado de piso por un animal de unos 500 kg o por 8 cerdos adultos u 8 ovejas. Si son depositados en cementerios o para animales, estos deben ser sealados y cercados. Incineracin o cremacin. La seleccin del lugar para esta actividad debe contar con las siguientes caractersticas: accesibilidad a vehculos pesados o semipesados, fuera de la vista pblica, lejos de edificios, pueblos o ciudades, lejos de material combustible, etc. Este tipo de proceso consiste en convertir la materia orgnica a cenizas, adems de destruir todos los agentes etiolgicos biolgicos en forma directa e inmediata, es uno de los mtodos ms seguros y adecuados. En la destruccin de un gran nmero de cadveres en los focos de enfermedades infectocontagiosas peligrosas, a menudo se emplea la incineracin colectiva directamente en las fosas cuyas dimensiones son de acuerdo con el nmero y tamao de los animales que se van a incinerar.
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Estos deben quemarse dentro de una zanja construida en orientacin de preferencia con el eje mayor de la misma y en direccin de los vientos dominantes para que facilite un fuego vivo todo el tiempo que dure la operacin, colocando madera u otro material resistente que sea capaz de sostener el peso de los cadveres y la accin del fuego, estos se alinean encima de la cama, alternando la cabeza de un animal al lado de la cola del otro, cuando la incineracin es colectiva las zanjas se rellenan con llantas, paja, lea o carbn mojado con petrleo o gasolina, con el mismo material se cubren los cadveres y se enciende el combustible. El tiempo esperado de combustin total de las canales ser de 48 horas, si las condiciones climatolgicas lo permiten, 177
despus que han sido incinerados, se aplica un desinfectante y se procede al relleno de la fosa y a la limpieza del terreno. Se indicar con un ejemplo los materiales necesarios para la incineracin tomando como referencia 5 cerdos adultos: 3 pacas de paja o heno 50 kg de lea de fcil combustin 4 llantas 1135 kg de carbn 1 galn de aceite combustible. Las llantas slo se usarn cuando la Secretara de Desarrollo Urbano y Ecologa lo autorice ya que producen alta contaminacin ambiental. Nunca deben quemarse al aire libre los cadveres o tejidos de animales sospechosos de ntrax y otras enfermedades causadas por grmenes que forman esporas, ya que stas resisten altas temperaturas y pueden ser levantadas y diseminadas con el humo. Para laboratorios de diagnstico, unidades ganaderas grandes y rastros es recomendable tener un crematorio particular, ya que permite una buena disposicin final de residuos peligrosos biolgicos infecciosos, reduciendo al mnimo el riesgo a la poblacin humana, animal y contaminacin ambiental. Proceso tcnico. Este mtodo asegura la esterilizacin del material, ya que es sometido a altas temperaturas o por medio de preparados qumicos. El material se procesa en forma de harina de carne, harina de hueso. Para este proceso se deben construir plantas especializadas. Un ejemplo que ha dado buenos resultados es la esterilizacin por espacio de 30 minutos a una temperatura de 130-140oC a una presin de 3 atmsferas con la consecuente coccin del material, hasta llegar a su desintegracin. BIBLIOGRAFA 1. Comisin Mxico-Estados Unidos para la prevencin de la Fiebre Aftosa y otras Enfermedades Exticas de los animales. Manual de Trabajo. Autosim 2. (S/F) 2. Comit de Enfermedades Exticas de la Asociacin de Sanidad Animal de los Estados Unidos. (1986): Enfermedades exticas de los animales, su prevencin, diagnstico y control. 3. Secretara de Comercio y Fomento Industrial. (1992): Ley Federal sobre Metrologa y Normalizacin. Diario oficial de la Federacin, 1 de julio de 1992. 4. Secretara de Desarrollo Urbano y Ecologa. (1988): Ley General del Equilibrio Ecolgico y la Proteccin al Ambiente. Diario Oficial de la Federacin, 28 de enero de 1988. 5. Secretara de Desarrollo Urbano y Ecologa. (1988): REGLAMENTO de la Ley General del Equilibrio Ecolgico y la Proteccin al Ambiente en Materia de Prevencin y Control de la Contaminacin de la Atmsfera. Diario Oficial de la Federacin, 25 de noviembre de 1988. 6. Secretara de Desarrollo Urbano y Ecologa. (1988): REGLAMENTO de la Ley General del Equilibrio Ecolgico y la Proteccin al Ambiente en Materia de Residuos Peligrosos. Diario Oficial de la Federacin, 25 de noviembre de 1988. 7. Secretara de Medio Ambiente, Recursos Naturales y Pesca, (1995). NORMA Oficial Mexicana NOM-087-ECOL-1995, que establece los requisitos para la separacin, envasado, almacenamiento, recoleccin, transporte y disposicin final de los residuos peligrosos biolgico-infecciosos que se generan en establecimientos que presten atencin mdica. Diario Oficial de la Federacin, 7 de noviembre de 1995.
178
8. Secretara de Medio Ambiente, Recursos Naturales y Pesca. (1996): Decreto que reforma, adiciona y deroga diversas disposiciones de la Ley General del Equilibrio Ecolgico y la Proteccin al Ambiente. Diario Oficial de la Federacin, 13 de diciembre de 1996. 9. Vaclav, K., (1987). Epizootiologa General. Pueblo y Educacin. La Habana, Cuba.
179

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Memorias del Curso Importancia de la muestra clnica para el diagnstico de laboratorio Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia Comit Organizador

Integrante del Cuerpo Acadmico en Salud Animal

GRUPOS DE RIESGO CON RELACIN AL LABORATORIO

Contencin Contencin mxima

especializado. Que trabajan con patgenos peligrosos o de alta seguridad (CPA)

V. de la Fiebre de Lassa V. de la Fiebre Aftosa V. Marburg

FORMACIN DE AEROSOLES Y GOTAS

VAS DE ENTRADA DE LOS AGENTES BIOLGICOS

EVITAR EL RIESGO Exposicin

EVITAR EL RIESGO Exposicin Oral

Agente patgeno Moraxella Staphylococcus aureus Streptoccoccus pyogenes Pseudomona aeruginosa

Nivel de Riesgo I II II III

TRANSPORTE Y ENVO DE MUESTRAS

para garantizar que el producto llega a su destino oportunamente y en buenas condiciones.

NECROPSIA Y MUESTRAS PATOLGICAS

RESIDUOS PELIGROSOS BIOLGICO INFECCIOSOS (RBI)

Clasificacin de RBI y tipo de contenedor que debe usarse

Material Agujas hipdermicas, punzocortante pipetas Pasteur, porta y cubreobjetos Pesado

Mtodos de tratamiento de RBI son.

SERVICIO MDICO PREVENTIVO.

ENVO DE MUESTRAS AL LABORATORIO

HEMATOLOGA Y QUMICA SANGUNEA

Talavera Rojas, Martn.

2.- Mediante comprensin manual de la vejiga: Para inducir a la miccin

MUESTRAS PRECISAS PARA ANLISIS TOXICOLGICOS ESPECFICOS

Microminerales (Se, Zn, Cu, Fe)

Metales pesados (Cu, Pb, Cr, Ag, As). Organoclorados y Organofosforados

Bolsa de papel Frasco estril

Frasco estril Bolsa de papel Frasco estril

Fluoracetato Sodio Urea

1000 gr 1000 gr 50 mL 50 mL 20 mL 1000 gr. 1000 gr 500 gr Todo el disponible

Solucin saturada de HgCl3

MUESTREO DE ALIMENTOS PARA ANIMALES

M. en C. Susana Goi Cedeo

Defecto Granel Inspeccin

Nivel de calidad aceptable (NCA) Produccin (lote) unitaria

Tamao del lote Unidad defectiva

Fig. 1 INSTRUMENTOS UTILES PARA REALIZAR EL MUESTREO

Forrajes frescos, pastos, herbceas y arbustivos.

150-250 g en base seca 500-1000 g

Adicionar preservador. Deshidratacin en estufa de aire forzado (50C durante 24 Hs).

500-1000 g en base de humedad

Lquido ruminal (LR)

ESTUDIO PATOLOGICO: HISTOPATOLOGA

CONSERVACIN Y ENVI DE MUESTRAS PARA PRUEBAS MOLECULARES

Figura 1. Transporte de pez en bolsa de plstico (de Kinkelin, 1991)

Figura 2. Corte del oprculo (Aluja, 1985)

Figura 3. Corte de las branquias (Aluja, 1985)

Figura 4. Segundo y tercer corte (Aluja, 1985)

Figura 5. Corte del vrtice de la piel (Aluja, 1985)

Figura 6. Cuarto corte (Aluja, 1985)

Figura 7. Puntos para la toma de sangre

Integrantes del Cuerpo Acadmico de Patognesis Microbiana

Mycoplasma spp. Corynebacterium renale Actinobacillus pleuropneumoniae

Sangre Pulmn Leche

4-7 das 4-7 das 4-7 das

Raspado profundo de piel, biopsia. Pulmn, ganglios regionales

1-2 semanas 1-2 semanas

Staphylococcus Streptococcus Pseudomonas Proteus Klebsiella Escherichia coli Corynebacterium Aspergillus

rganos parenquimato sos

Torundas y lquido sinovial

Streptococcus Staphylococcus Pseudomona Mycoplasma Corynebacterium Mycobacterium

Pstulas y costras de piel