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Método de Bradford (1976)

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Método de Bradford (1976

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Quantificação de proteínas totais

Prof. Luiz Edson Mota de Oliveira
Fernanda Nery; Fernanda Soares; Francyane Braga; Samantha Dignart

Setembro - 2004

Introdução
As proteínas são os maiores constituintes de toda célula viva, e cada uma delas, de acordo com sua estrutura molecular, tem uma função biológica associada às atividades vitais.

Práticas de laboratório para purificação de proteínas requerem um método rápido e sensível para a quantificação destas.

Métodos mais utilizados  Reação de Biureto  Método de Lowry  Método de Bradford  Método micro-Kjeldahl .

A intensidade da cor formada é proporcional à quantidade de proteína. baseado na observação de que substâncias que contêm duas ou mais ligações peptídicas formam um complexo de cor roxa com sais de cobre em soluções alcalinas.Reação de Biureto O método por biureto foi proposto por Riegler em 1914. e a medida é feita num colorímetro. Interferências: • Tris • Amônia • Glicerol .

O C NH RC H Cu2+ HN C H CR C HN H CR O O C NH RCH O .

íon magnésio. . Reagentes de Thiol. Reactivo Folin oxid. Complejo Proteína-Cu 2+ AA red. Tris. Carboidratos. EDTA. AZUL Interferências: íon potássio. AMARILLO Reactivo Folin red.Procedimento de Lowry (1951) Aumenta a sensibilidade da reação de Biureto: composto de proteína-Cu2+ reage com Folin-Ciocalteus = coloração azul (650 nm). Complejo Proteína-Cu 2+ AA oxid.

.  Lowry indicou menos proteínas do que os resultados obtidos com o de Bradford. os métodos colorimétricos são efetivos e justificam sua utilização (Passos. tampões e mudanças no pH ou na temperatura.  Clorofila e outros pigmentos podem afetar os valores de absorbância.  Métodos colorimétricos: são sensíveis a íons.Método de Bradford  O corante que se liga à proteína é o Comassie Blue G–250. 1996). Apesar dessas limitações. 1982).  É considerado mais simples e sensível do que o método de Lowry. mas estas diferenças não foram significativas (Pinto.

Comassie Blue G-250 azul vermelho Ligação com proteína .

Materiais e Métodos Reagentes: Coomassie Brilliant Blue G-250 2-Mercaptoethanol Triton X-100 Dodecil Sulfato de Sódio outros .

15 M NaCl  Albumina de soro Bovino (2x cristalizada)  Quimiotripsinogênio A  Citocromo C (Coração de cavalo) Espectrofotômetro 200 uv  Albumina de Soro Humano Hemoglobina Método Gravimétrico .Preparação da solução de proteína 0.

8.7% de etanol. . as concentrações finais serão: 0.01% de Comassie.Preparação do reagente Comassie-blue G-250 Dissolver 100 mg de Comassie blue em 50 mL de etanol 95%. Dessa forma. Adicionar 100 mL de H3PO4 85% e completar para 1 L.5% de ácido fosfórico e 4.

1 mL com solução tampão  Adicionou 5 mL do reagente protéico e agitou em vórtex  Leitura de absorbância: 595 nm (depois de 2 minutos e antes de 1 hora)  Obtenção da Curva Padrão: Concentração vs Absorbância .Ensaio Protéico  10 a 100 µg de proteína  Pipetou em tubos volumes que foram ajustado para 0.

Resultados Reprodutibilidade. sensibilidade e linearidade  BSA = alta reprodutibilidade  Sensibilidade de 5 µg de proteína/mL no volume final  Linearidade = Lei Lambert-Beer .

Precisão do método Bradford Lowry .

Interferências de Componentes Não Protéicos .

Marcha analítica seguida no Laboratório 1) Reagentes  Comassie Blue G-250. H3PO4 e etanol  Soro Albumina Bovina (BSA) (1 mg/mL ou 10 µg/0.1 mL) .

7% de etanol Obs.5% de ácido fosfórico e 4.2) Metodologia Preparação do reagente Comassie-blue G-250 Dissolver 100 mg de Comassie blue em 50 mL de etanol 95% Adicionar 100 mL de H3PO4 85% Completar para 1 L Deixar overnight com agitação constante e filtrar Concentrações finais: 0.: Ácido fosfórico deve ser adicionado ao Comassie dissolvido em etanol e nunca o contrário. 8.01% de Comassie. .

10 0.00 0.1 mL .0 µg Protéina 0 20 1 2 3 4 5 6 0.0 5.02 0.00 5.0 40 60 80 100 *Volume reacional = 5.04 0.0 5.08 0.04 0.06 0.02 Água (mL) 0.08 Comassie Blue G250 (mL) 5.06 0. Procedimento para obtenção da curva padrão de proteínas utilizando-se como padrão BSA (1 mg/mL).Procedimento para obtenção da curva padrão Tabela 1.0 5. Tubos BSA (1 mg/mL) (mL) 0.10 0.0 5.

Tabela 2.1 de H2O 0.0 60 80 100 *Volume reacional = 5.0 5.0 µg Proteína 1 2 3 0 20 40 4 5 6 0. Procedimento para obtenção da curva padrão de proteínas utilizando-se como padrão soluções diluídas de BSA.1 mL) (mL) 0.1 mL .0 5.1 0.0 5. Tubos BSA (X µg / 0. a curva seguirá o padrão mostrado na Tabela 2.1 mL retiradas de soluções de 20.1 mL. Se assim for. 40.1 Comassie Blue G-250 (mL) 5.1 5. 80 e 100 µg de BSA / 0.Erros de pipetagem podem ser minimizados utilizando-se alíquotas de 0.1 0. 60.0 5.1 0.

agitar os tubos em vortex Leitura no espectrofotômetro U. . = 595 nm.Após.V.

.

4 0.2 0 0 Abs 595 nm y = 0.0.6 0.0043 R2 = 0.9888 20 40 60 80 100 Concentração (ug/mL) .8 0.Curva Padrão Método de Bradford 1 0.0076x .

OBRIGADO!! .

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