Sebenta de Biologia Celular FMUP

qwertyuiopasdfghjklzxcvbnmqwert yuiopasdfghjklzxcvbnmqwertyuiopa sdfghjklzxcvbnmqwertyuiopasdfghj klzxcvbnmqwertyuiopasdfghjklzxc BIOLOGIA CELULAR E MOLECULAR I vbnmqwertyuiopasdfghjklzxcvbnmq 2007/2008 wertyuiopasdfghjklzxcvbnmqwerty uiopasdfghjklzxcvbnmqwertyuiopas dfghjklzxcvbnmqwertyuiopasdfghjkl zxcvbnmqwertyuiopasdfghjklzxcvb nmqwertyuiopasdfghjklzxcvbnmqw ertyuiopasdfghjklzxcvbnmqwertyui
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Jorge Manuel Paulos
Biologia Celular e Molecular I - 1 Ano - FMUP
2007/2008
AULA 2 Conceito de Clula
1 Outubro 2007
A clula a entidade fundamental que funciona como unidade estrutural de todo o ser vivo. Cada clula possui uma organizao molecular que lhe permite desempenhar as funes que caracterizam a vida: Crescimento Reproduo Adaptao Microprocessador universal as clulas comunicam na mesma linguagem entre os vrios seres porque um gene retirado de um organismo e colocado noutro, vai ter a mesma mensagem traduzida no final. Mltipla funcionalidade Morfologia variada a forma como organizam vai originar diferentes observaes microscpicas de acordo com os seus tamanhos e formas. Inicialmente, foi sugerido por volta dos anos 20, que vrias molculas orgnicas simples pudessem formar e polimerizarse espontaneamente em macromolculas, sob condies semelhantes s existentes na atmosfera primitiva da Terra. Esta era descrita como sendo uma atmosfera com muito pouco ou nenhum oxignio, consistindo principalmente em CO2 e N2 em conjunto com alguns gases como H2, H2S e CO. Esta atmosfera proporciona uma reduo das condies em que as molculas orgnicas, aps receberem uma fonte de energia como a luz solar ou uma descarga elctrica, se pudessem formar espontaneamente. Esta formao espontnea de molculas orgnicas foi inicialmente demonstrada nos anos 50, quando Stanley Miller mostrou que uma descarga de fascas elctricas numa mistura de H2, CH4 e NH3, na presena de gua, conduz formao de uma variedade de molculas orgnicas, incluindo vrios aminocidos. No entanto, apesar de esta experincia no ter reproduzido precisamente as condies da Terra primitiva, demonstrou claramente a plausibilidade da sntese espontnea de molculas orgnicas, proporcionando os materiais bsicos a partir dos quais viviam os organismos primitivos.
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Das duas principais classes de macromolculas com informao gentica existentes actualmente (cidos nucleicos e protenas), apenas os cidos nucleicos so capazes de direccionar a sua auto-replicao. Os cidos nucleicos servem de moldes para a sua prpria sntese como resultado de um emparelhamento de bases entre nucletidos complementares. Um passo essencial na compreenso da evoluo molecular foi, consequentemente, atingida no incio dos anos 80 quando se descobriu que o RNA capaz de catalizar um nmero de reaces qumicas, incluindo a polimerizao de nucletidos. Estudos seguintes avanaram as actividades previamente conhecidas do RNA, incluindo a descrio de molculas de RNA que direccionam a sntese de nova cadeia de RNA a partir de um RNA molde. Desta forma, pensa-se que o RNA tenha sido o primeiro sistema gentico e um dos primeiros estados da evoluo qumica. Assim, mais tarde, concluiu-se que um conjunto de interaces ordenadas entre o RNA e vrios aminocidos envolvidos no cdigo gentico fez com que o DNA substitusse o RNA como sendo o material gentico principal.
Pensa-se que a primeira clula foi originada a partir da incluso de RNA auto-replicativo e de molculas associadas a uma membrana composta por fosfolpidos. Cada molcula fosfolipdica contm duas longas caudas hidrofbicas anexadas a uma cabea hidroflica. Assim, as caudas hidrofbicas esto introduzidas na bicamada lipdica e as cabeas hidroflicas so expostas para o lado da gua nos dois lados da membrana.
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A evoluo do metabolismo Na primeira atmosfera anaerbica da Terra, as primeiras reaces de produo de energia envolveram presumivelmente a quebra de molculas orgnicas na ausncia de oxignio. Julga-se que estas reaces foram o que agora representa o processo de gliclise (quebra da glicose em cido lctico, com o ganho energtico de duas molculas de ATP). Para alm da utilizao de ATP como a sua fonte de energia intracelular, todas as clulas existentes actualmente realizam a gliclise. A gliclise proporcionou um mecanismo pelo qual a energia presente em molculas orgnicas pr-formadas (por exemplo, a glucose) podia ser convertida em ATP, que poderia depois ser utilizado como fonte de energia para conduzir outras reaces metablicas. O desenvolvimento da fotossntese geralmente interpretado como sendo um dos grandes passos da evoluo, por ter permitido clula obter energia a partir da luz solar e por ter proporcionado a independncia da utilizao de molculas orgnicas j existentes. A libertao de O2 como consequncia da fotossntese alterou o ambiente em que as clulas evoluram e , normalmente visto como o caminho que levou ao metabolismo oxidativo. Alternativamente, este metabolismo pode ter evoludo antes da fotossntese, com o aumento de oxignio na atmosfera, que conduziu a uma vantagem dos organismos que podiam utilizar o oxignio para reaces produtoras de energia. Por outro lado, o oxignio uma molcula altamente reactiva, fazendo com que o metabolismo oxidativo, utilizando esta reactividade, conseguisse proporcionar um mecanismo de gerar energia a partir de molculas orgnicas que muito mais eficiente que a gliclise anaerbia. Clulas procariticas e clulas eucariticas A identidade celular foi conseguida a partir do momento em que a primeira clula ganha uma membrana plasmtica, com funes de proteco e regulao da entrada e sada de substncias da clula. Isto fez com que o meio intracelular fosse diferente do meio externo, do ponto de vista fisico-qumico. Porm, o grande avano adaptativo sofrido pelas clulas foi a formao de vesculas, compartimentos e retculos originados da membrana primordial. Com isto, nasce a clula eucaritica, com o seu sistema de endomembranas. Este sistema possibilitou: Maior crescimento celular; Maior especializao, diviso de tarefas entre componentes celulares e eficincia metablica; Maior proteco do material hereditrio; Maior diversidade de rotas metablicas; Facilidade no contacto e na aglomerao intermolecular.
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As clulas procariticas so muito diferentes das eucariticas. A sua principal caracterstica , ento, a ausncia de membrana celular, individualizando assim, o ncleo. Para alm disso, no tm alguns organelos, o que lhes confere um tamanho bastante reduzido. O DNA que possuem encontra-se na forma de um anel no-associado a protenas. Eubactrias verdadeiras bactrias Arqueobactrias clulas primitivas, geralmente anaerbias, que vivem nos ambientes mais inspitos. As clulas eucariticas so mais complexas que as procariticas. Possuem membrana nuclear individualizada e vrios tipos de organelos. A maioria dos animais e plantas a que estamos habituados esto dotados deste tipo de clulas. Fungos Protozorios Clulas animais Clulas vegetais Procariontes Organismos Medida Metabolismo Organelas RNA protenas Ribossomas Citoplasma Organizao Fontes Bactrias, Cianobactrias 10 m Anaerbio, Aerbio Ausentes e Ambos sintetizados no mesmo local Tipo 70S No tem citosqueleto: correntes citoplasmticas, exocitose e endocitose ausentes Principalmente unicelular Necessitam de uma fonte de C e de N Eucariontes Protistas, Fungos, Plantas, Animais 10 - 100 nm Aerbio Ncleo, Complexo de Golgi, Mitocndria, Retculo Endoplasmtico, etc. RNA sintetizado no ncleo; Protenas sintetizadas no citoplasma Tipo 80S Tem citosqueleto: correntes citoplasmticas, exocitose e endocitose presentes Principalmente multicelular Requerem uma grande quantidade de compostos e alguns ies
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A parede celular existe para alm da membrana plasmtica porque vai conferir uma maior resistncia ao meio ambiente devido ao seu carcter diferencial. Contm estruturas de patogenicidade, onde vo interagir os antibiticos que possam ser administrados para combater as bactrias.
Classificao de bactrias de acordo com a colorao de Gram As diferenas estruturais que ocorrem na parede das bactrias, e que reflectem diferenas na sua composio qumica, so consideradas responsveis pelo comportamento das bactrias relativamente colorao de Gram. Segundo a colorao de Gram, as bactrias podem ser classificadas em Gram-positivo ou Gram-negativo. O processo de colorao consiste nas seguintes fases: Fixao das clulas Corante de roxo de metilo Diferenciao lcool acetona Descolorao Tratamento com fucsina Aps este processo, as bactrias de gram positivo (ex.: Staphylococcus) permanecem sempre de cor roxa, enquanto que as bactrias de gram negativo (ex.: Escherichia coli) descoram na fase de descolorao, voltando a adquirir uma cor mais rsea aps a aco da fucsina, que tem cor vermelha. Quase todas as bactrias apresentam nas suas paredes um polmero rgido, insolvel em gua e quimicamente complexo, designado peptidoglicano. O peptidoglicano um heteropolmero constitudo por cadeias lineares de dois aminoacares, dispostos alternadamente e unidos por ligaes glicosdicas. A parede celular das bactrias de Gram-positivo, quando observada em microscopia electrnica de transmisso, homognea apresenta-se e espessa. como uma estrutura predominantemente
constituda por peptidoglicano (cerca de 40 a 80% do peso da parede seca) que nestas bactrias apresenta um elevado teor em dmeros peptdicos. Assim, nestas bactrias a membrana plasmtica apresenta uma espessura bastante reduzida. Por sua vez, sob o ponto de vista estrutural, a parede das bactrias de Gram-negativo mais diferenciada e complexa do que a das bactrias de Gram-positivo. Ao microscpio electrnico de transmisso, apresenta-se como uma estrutura no homognea, 6 AULA 2 Conceito de Clula
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mas sim estratificada. A camada mais interna uma camada rgida, geralmente constituda por peptidoglicano e que apenas corresponde a 5 10% do peso total da parede seca. A menor espessura deste componente est provavelmente relacionada com a inferior presso osmtica interna dos Gram-negativos relativamente dos Gram-positivos. A camada mais externa da parede, designada membrana exterior uma membrana com um perfil acentuadamente assimtrico.
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AULA 3 Metodologia do estudo da clula I
4 Outubro 2007
1. Limite de Resoluo Em microscopia, a resoluo a capacidade que um microscpio tem de distinguir objectos separados por pequenas distncias e surge como um dado essencial na classificao de um microscpio. O limite de resoluo de um microscpio aproximadamente 0.2 m. Dois objectos que estejam separados por uma distncia inferior a este valor so vistos como uma nica imagem, que apenas distinguida de outra imagem. Esta limitao terica da microscopia ptica determinada por dois factores: O comprimento de onda () da luz visvel; A abertura numrica (AN) da lente do microscpio.
O comprimento de onda da luz visvel entre 0.4 e 0.7 m, fazendo com que o valor normal esteja fixado em aproximadamente 0.5 m para o microscpio ptico. A abertura numrica pode ser vista como o tamanho do cone de luz que entra na lente do microscpio depois de passar atravs da amostra, e pode ser dada pela seguinte expresso: AN = . sin em que o ndice de refraco atravs do qual a luz passa pela amostra e pela lente. O valor para o ar de 1.0, mas pode ser aumentado para um mximo de aproximadamente 1.4 perante a utilizao de leo de imerso. O ngulo corresponde a metade do comprimento do cone de luz absorvida pela lente. O mximo valor para este ngulo de 90, pelo que o mximo valor de sin 1, logo o maior valor possvel para a abertura numrica 1.4. Consoante os microscpios, pode estudar-se: Processos in vitro clulas em cultura, ou seja, a morfologia de clulas isoladas ou de tecidos (identificar os determinados tipos de clulas que fazem parte do tecido); A localizao de determinadas substncias desejadas; Processos in vivo seleccionar clulas vivas e injectar-lhes determinadas substncias no seu interior observando, por exemplo, um determinado momento do ciclo celular. No caso do estudo de clulas em tecidos ou do estudo da sua morfologia, recorre-se usualmente a microscpios pticos. Por outro lado, no caso de se estudarem as clulas isoladas ou mesmo um determinado organismo, procedem-se a ensaios in vitro e in vivo.
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No microscpio ptico (ou microscpio de campo claro), a luz passa directamente atravs da clula e a capacidade de distinguir vrios componentes celulares depende do contraste resultante da absoro de luz visvel pelos componentes celulares. 2. Microscpio de contraste Nos microscpios de contraste, encontram-se includos dois tipos diferentes de microscpios: o microscpio de contraste de fase e o microscpio de contraste de interferncia diferencial. Este microscpio bastante utilizado para clulas vivas, em culturas, ou para observar movimentos celulares. Baseia-se nas diferenas entre os ndices de refraco, entre o interior da clula e o exterior da clula e zonas das clulas. Assim sendo, as diferentes espessuras e os diferentes tipos de refraco iro converter-se em zonas claras e escuras. O que este microscpio tem de especial relativamente aos outros,no que diz respeito morfologia uma placa com um anel com orifcio e um anel escuro. Isto faz com que os raios que atravessam a preparao sofra refraco e difraco, atingindo a objectiva ao atravessar o objecto. Os raios de luz no sofrem quaisquer desvios e passam pelo anel escuro ao induzir um atraso fase da onda, permitindo assim observar as zonas claras e escuras com maior nitidez. A principal desvantagem deste microscpio o facto de apenas ser possvel observar clulas isoladas ou tecidos ou cortes extremamente finos.
Figura 1
3. Microscpio electrnico Estes microscpios servem, principalmente, para estudar todas as estruturas existentes no interior da clula. Em comparao com os restantes, estes utilizam um feixe de electres (em vez de fotes), existindo uma grande diferena de potencial entre o ctodo (filamento de tungstnio) e o nodo que vai permitir a obteno de uma boa definio da imagem observada. Quanto maior a voltagem, maior a definio da imagem e maior a resoluo do microscpio. O poder da resoluo aproxima-se dos 0.1 nm, sendo muito pequeno em valor, mais muito grande na visualizao das clulas. Esta diferena de potencial provoca uma acelerao dos electres, sendo que para evitar as interferncias deste excesso de acelerao, todo o sistema est inserido num tubo constitudo apenas pelo vazio, a fim de no haver absoro de electres.
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Possui lentes electromagnticas onde se colocam as amostras, no entanto a imagem visualizada num ecr. Modo de funcionamento: 1. Quando o filamento de tungstnio aquecido no vcuo, produz electres. 2. H uma grande diferena de potencial entre o nodo e o ctodo, que leva acelerao dos electres. 3. Os electres passam no condensador e atingem o objecto a observar os electres tm fraco poder de penetrao logo os cortes devem ser extremamente finos. 4. Muitos electres so dispersos pelos constituintes da estrutura celular e contribuem para a formao de uma imagem intermdia dada pela objectiva. Aps a passagem dos electres, as estruturas celulares ficam destrudas. 5. Esta imagem depois ampliada por outra bobina projectora que equivale ocular do microscpio ptico. 6. A focagem feita pela variao da corrente electrnica que passa atravs das lentes electromagnticas. Tipos de microscpios electrnicos: Transmisso (difere do segundo devido diferena de potencial) Transmisso de alta voltagem Esquadrinhamento SEM Integrado STEM (transmisso + enquadrinhamento)
Figura 2 - Microscpio electrnico
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4. Imunocitoqumica A imunocitoqumica uma tcnica que permite localizar protenas num determinado local do interior da clula. Para isso, utilizam-se molculas especficas para as protenas os anticorpos que localizam antignios nas clulas. Por esta razo, este mtodo a base para a maioria dos processos que utilizam anticorpos no seu procedimento. A visualizao conseguida atravs de um processo de marcao do anticorpo feita com enzimas ou fluorocromos (substncias fluorescentes). Como no possvel marcar todos os anticorpos (porque existe um nmero muito elevado de protenas), inicialmente vo ser utilizados os anticorpos que no esto marcados.
Figura 3 - Processo de imunocitoqumica Os antignios primrios so produzidos directamente pelo organismo receptor do anticorpo e os antignios secundrios so originrios de um outro organismo. No entanto, estes so marcados, inseridos no interior do primeiro organismo e vo permitir o reconhecimento da regio constante dos anticorpos. Os anticorpos encontram-se normalmente conjugados com: Fluorocromos (em microscopia de fluorescncia e confocal); Enzimas: fosfatase alcalina ou peroxidase (deteco bioqumica por microscpio de luz); Esferas de ouro coloidal (microscopia electrnica).
5. Microscopia de fluorescncia Estes microscpios so usados para estudar processos biolgicos na clula e a localizao de determinadas substncias no seu interior, utilizando-se para o efeito corantes especiais, designados fluorocromos. Estes tm a capacidade de localizar os constituintes desejados no interior das clulas, existindo vrios tipos: Vermelhos rodamina Verdes fluorescena
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Consoante o fluorocromo utilizado, vai ser emitida uma luz de determinada cor (vermelho ou verde), tendo em conta aquilo que for reconhecido. Assim, quando se liga o microscpio, possvel observar um campo escuro com vrias zonas coloradas dessas duas cores. A sua utilizao baseia-se na propriedade que certas substncias tm de absorver a luz a um determinado comprimento de onda e, posteriormente, emitir luz a um comprimento de onda superior. Este mecanismo depende do fluorocromo que est a ser utilizado, dentro do espectro vsivel, no entanto existe apenas um nmero reduzido de substncias com capacidades de fluorescncia: a clorofila, a riboflavina, a vitamina A ou a porfirina. A base da tcnica para observar as clulas neste tipo de microscpio exactamente a mesma que usada no microscpio de campo claro. Porm, enquanto no primeiro os anticorpos tm que estar marcados com fluorocromo para serem vistos no microscpio, no segundo, os anticorpos tm de estar marcados com uma dada enzima para ficarem corados. por isso que a tcnica de fluorescncia vai decaindo, ou seja, ao fim de algum tempo de permanncia do fluorocromo nas clulas, o seu efeito desaparece. Desvantagens: Durante a focagem, focam-se vrios planos simultaneamente, ou seja, verifica-se uma sobreposio de imagens fluorescentes das molculas, a profundidades da clula, o que exibe uma imagem com pouca definio. Durante a fixao, pode haver destruio da antegenicidade das protenas, o que vai dificultar a sua ligao aos anticorpos, portanto a fluorescncia emitida perde eficcia. difcil utiliz-lo para seces de clulas finas. O prprio meio em que as clulas esto pode emitir fluorescncia, obscurecendo o sinal emitido pelo anticorpo (fenmeno declant).
Figura 4 - Microscpio de fluorescncia AULA 3 Metodologia do estudo da clula I 13
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6. Microscpio confocal Tal como o microscpio anteriormente referido, este tambm emite fluorescncia durante o processo de observao. No entanto, difere do microscpio de fluorescncia nos seguintes aspectos: Permite visualizar as molculas num nico plano de focagem e forma uma imagem a nvel de computador (imagem tridimensional com mais pormenores) e bastante mais definida deconvoluo. Utiliza raios laser. Tanto a fluorescncia do declant como a sobreposio de planos desaparecem. Devido ao seu elevado custo, so usados nos laboratrios, os de fluorescncia e no confocal.
Figura 5 - Microscpio confocal
7. GFP Green Fluorescence Protein Um importante avano recente na microscopia de fluorescncia a utilizao de GFP proveniente da acalefa para visualizar protenas no interior de clulas vivas. A GFP pode ser fundida com qualquer protena de interesse utilizando mtodos normais de recombinao de DNA, e seguidamente a protena com GFP pode ser expressa nas clulas e detectada por microscopia de fluorescncia, sem necessidade de fixao das clulas como seria necessrio para a deteco de protenas com anticorpos.
Figura 6 - Microscopia de fluorescncia com utilizao de GFP
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8. Autorradiografia Um dos usos importantes da radioactividade, na biologia celular, localizar um composto radioactivo em seces de clulas intactas ou em tecidos por autorradiografia. Neste procedimento, as clulas vivas so expostas brevemente a um pulso de um composto radioactivo especfico e seguidamente, so incubadas por um perodo varivel para dar tempo de incorporarem o composto antes de serem fixadas e processadas para microscopia ptica ou electrnica. Cada preparao ento coberta com uma camada fina de emulso fotogrfica e deixada no escuro durante vrios dias, durante os quais o radioistopo decai. A emulso revelada e, a posio da radioactividade em cada clula indicada pela posio dos grnulos de prata revelados. As molculas marcadas radioactivamente tambm podem ser detectadas por autorradiografia aps serem separadas de outras molculas por electroforese em gel, como a posio de protenas e cidos nucleicos.
Figura 7 - Mtodo de autorradiografia
9. Citometria de fluxo Este mtodo de estudo permite identificar clulas atravs de dois mecanismos: ou pela luz que as clulas difundem, ou pela fluorescncia emitida quando atravessam um feixe de raios laser. Aqui, a separao das clulas pode ser efectuada tendo em conta trs factores: Marcadores; Tamanho das clulas; Contedo de DNA.
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Figura 8 - Citometria de fluxo
10. Cultura de clulas As culturas de clulas iniciais estabelecidas a partir de um tecido so designadas culturas primrias. As clulas numa cultura primria, geralmente crescem at cobrirem totalmente a superfcie em que foram colocadas. Seguidamente, j podem ser removidas da placa e colocadas noutra com menor densidade para formar culturas secundrias. Este processo pode ser repetido por um nmero indefinido de vezes, mas a maior parte das clulas no pode crescer indefinidamente numa cultura.
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Figura 9 - Cultura de clulas animais
11. Linhas de clulas imortais A maioria das clulas de vertebrados pra de dividir-se aps um nmero finito de divises celulares em cultura, num processo chamado de senescncia celular. Os fibroblastos humanos normais, por exemplo, dividem-se, normalmente, apenas 25 a 40 vezes em cultura, antes de a diviso ser interrompida. Nessas clulas, a capacidade de proliferao limitada reflecte um encurtamento progressivo dos telmeros das clulas, que so as sequncias repetitivas de DNA e de protenas associadas que recobrem os finais de cada cromossoma. As clulas somticas humanas desligaram a enzima chamada telomerase, que normalmente mantm os telmeros. Por esta razo, os seus telmeros encurtam em cada diviso celular que se processa. Os fibroblastos humanos podem ser induzidos a proliferar indefinidamente, conferindo-lhes um gene que codifica para a subunidade cataltica da telomerase; eles podem ento ser propagados como uma linhagem celular imortalizada.
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Algumas clulas humanas, entretanto, no so imortalizadas por este truque. Embora os seus telmeros permaneam longos, elas iro parar de se dividir aps um nmero limitado de divises, porque as condies da cultura activam o mecanismo de checkpoint do ciclo celular, que detm o ciclo celular. Com o objectivo de imortalizar essas clulas, deve-se fazer mais do que introduzir a telomerase. Deve-se tambm activar os mecanismos de ponto de checkpoint, o que pode ser feito pela introduo de certos oncogenes promotores de cancro, derivados de vrus tumorais.
11.1.
Produo de anticorpos monoclonais
Os anticorpos monoclonais so obtidos a partir da estimulao de um nico clone de linfcitos B e, por isso, so todos iguais e especficos para um s determinante antignico. Os anticorpos monoclonais apresentam elevado grau de pureza e de especificidade. Os anticorpos monoclonais so produzidos laboratorialmente, em grande quantidade, pela tcnica ilustrada da seguinte forma:
1. Imunizao do animal inoculando o antignio o antignio chega, via sangunea
e/ou linftica, aos rgos linfides secundrios gnglios linfticos, por exemplo activando os linfcitos B especficos a produzir anticorpos para os diferentes determinantes antignicos. 2. Recolha de linfcitos B 3. Fuso de linfcitos B, in vitro, com mielomas um mieloma uma clula tumoral do sistema imunitrio que, pelas suas caractersticas diviso celular descontrolada dividem-se indefinidamente. 4. Da fuso resultam hibridomas, os quais so colocados a crescer em meios de cultura os hibridomas renem as caractersticas das clulas que lhe deram origem linfcito B e mieloma. Assim, os hibridomas formam clulas permanentes caracterstica conferida pela clula cancerosa, o mieloma e produzem anticorpos especficos para os determinantes antignicos do antignio. 5. Seleco de hibridomas isolam-se aqueles que produzem o anticorpo pretendido, mantendo-os depois de isolados, em culturas permanentes que, por clonagem, produzem anticorpos monoclonais. Os anticorpos monoclonais so altamente especficos. O quadro seguinte resume algumas das suas aplicaes biomdicas.
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APLICAES DOS ANTICORPOS MONOCLONAIS Diagnstico clnicas de doenas ou condies
EXEMPLOS Testes de gravidez. Os anticorpos monoclonais ligam-se gonadotropina corinica.
A elevada especificidade dos anticorpos monoclonais permite a identificao de Diagnstico de doenas, como a gonorreia, determinadas substncias em fluidos ou a sfilis, a hepatite e a raiva. tecidos, mesmo quando presentes em quantidades muito reduzidas. A ligao antignio-anticorpo detectada por alterao de cor ou fluorescncia. Imunizao passiva Soro antitetnico. Permite prevenir os sintomas do ttano, logo aps a infeco, em Os anticorpos monoclonais podem ser usados pessoas no vacinadas. na preparao de soros. Tratamento de cancro A herceptina um anticorpo monoclonal utilizado no tratamento do cancro da mama.
Anticorpos especficos para antignios que so marcadores tumorais podem ser Anticorpos marcados com iodo radioactivo associados a substncias txicas ou levam regresso de linfomas. radioactivas, que, assim, destroem apenas as clulas cancerosas sem causar danos s clulas.
Enxertos e transplantes Permitem verificar a compatibilidade dos tecidos. Antdotos para venenos e drogas _____________________ _____________________
11.2.
Clulas HeLa
As clulas HeLa foram as clulas da primeira linha celular a ser isolada a partir de um carcinoma de colo do tero.
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AULA 4 Metodologia do estudo da clula II
8 Outubro 2007
1. Centrifugao Diferencial Para organizar vrias questes que dizem respeito funo de organelos subcelulares, provou-se ser necessrio isolar os organelos das clulas eucariticas numa forma que pudessem ser utilizados para estudos bioqumicos. Isto tem sido conseguido atravs da centrifugao diferencial, um mtodo que permite separar os componentes celulares com base no seu tamanho e na sua densidade. O primeiro passo no fraccionamento subcelular a rotura da membrana plasmtica sob condies que no destruam os componentes internos da clula, sendo que vrios mtodos podem ser utilizados para realizar este mecanismo. Todos eles quebram a membrana plasmtica e o retculo endoplasmtico em pequenos fragmentos, permanecendo os restantes componentes celulares intactos no seu interior (como o ncleo, lisossomas, peroxissomas, mitocndrias e cloroplastos). A suspenso das clulas ou fragmentadas (lisado homogenado) , seguidamente, fraccionada nos diferentes componentes atravs de vrias sries de centrifugaes numa ultracentrfuga, que efectua rotaes a velocidades muito elevadas, para produzir foras muitas vezes superior fora da gravidade. Esta fora faz com que os AULA 4 Metodologia do estudo da clula II 21
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componentes celulares se movam em direco ao topo do tubo de centrifugao e formem uma pequena massa compacta, atravs do processo de sedimentao, segundo uma taxa que depende do seu tamanho e densidade, sempre com as estruturas mais pesadas e densas a sedimentar mais rapidamente. Geralmente, o homogenado celular inicialmente centrifugado a velocidade relativamente baixa, que apenas permite a sedimentao de clulas no fragmentadas e de estruturas celulares de maiores dimenses, como o ncleo. Consequentemente, uma fraco agora enriquecida em componentes nucleares pode ser recuperar do sedimento de baixa velocidade, enquanto os restantes componentes permanecem suspensos no sobrenadante. Este , depois, centrifugado a uma velocidade superior primeira, permitindo a sedimentao de mitocndrias, cloroplastos, lisossomas e peroxissomas. Uma terceira centrifugao, com velocidade ainda superior anterior, conduz recolha de fragmentos da membrana plasmtica e de retculo endoplasmtico e uma quarta centrifugao permite a obteno de ribossomas, deixando apenas a poro solvel de citoplasma (citosol) no sobrenadante.
2. Fraccionamento Subcelular As fraces obtidas a partir da centrifugao diferencial correspondem a preparaes enriquecidas em organelos, mas no completamente puras nos componentes que contm. Assim, a purificao pode ser aumentada atravs de uma centrifugao por gradiente de densidade, na qual os organelos so separados por sedimentao, atravs de um gradiente de uma substncia densa, como por exemplo, a sacarose. Na centrifugao de velocidade, o material inicial colocado em camadas no topo de um gradiente de sacarose. Seguidamente, partculas de diferentes dimenses sedimentam ao longo do gradiente em posies diferentes, movendo-se em bandas discretas. Aps a centrifugao, a recolha de diferentes fraces individuais do gradiente proporciona uma resoluo suficiente para separar organelos de dimenses semelhantes, como as mitocndrias, os lisossomas e os peroxissomas.
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3. Electroforese SDS-PAGE A electroforese SDS-PAGE utiliza um gel de poliacrilamida de ligaes altamente cruzadas como uma matriz inerte, atravs da qual as protenas migram. O gel preparado pela polimerizao de monmeros e o tamanho do poro do gel pode ser ajustado de forma que seja suficientemente pequeno para retardar a migrao das molculas proteicas de interesse. As prprias protenas no esto numa simples soluo aquosa, mas numa soluo que inclui um detergente forte carregado negativamente, o SDS (dodecil sulfato de sdio). Como este detergente se liga a regies hidrofbicas das molculas proteicas, causando o seu desdobramento em cadeias polipeptdicas estendidas, as molculas proteicas individuais so liberadas das suas associaes com outras protenas ou lpidos, tornando-se completamente solveis na soluo detergente. Alm disso, um agente redutor como o -mercaptoetanol normalmente adicionado para quebrar quaisquer ligaes S-S nas protenas, de forma que todos os polipptidos constituintes, presentes em mltiplas subunidades, possam ser analisados separadamente.
Cada protena vai ligar-se a um grande nmero de molculas de detergente carregado negativamente, que supera a carga intrnseca da protena e que faz com que ela migre em direco ao elctrodo positivo, quando a corrente aplicada. As protenas do mesmo tamanho tendem a AULA 4 Metodologia do estudo da clula II 23
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migrar atravs do gel com velocidades similares pois a sua estrutura nativa est completamente desdobrada pelo SDS, de maneira que as suas formas so as mesmas, e elas ligam-se a uma mesma quantidade de SDS tendo, portanto, a mesma quantidade de cargas negativas. Por sua vez, as protenas maiores, com mais carga, so submetidas a foras elctricas maiores e tambm a um retardamento maior. Como resultado, uma mistura complexa de protenas fraccionada numa srie de diferentes bandas de protenas organizadas de acordo com a sua massa molecular. As protenas maioritrias so facilmente detectadas corando-se as protenas do gel com um corante como o azul de Coomassie, e mesmo as protenas menos abundantes podem ser visualizadas com nitrato de prata ou de ouro. Como a velocidade de migrao nestas condies maior quanto menor for o polipeptdeo, ento esta tcnica pode ser utilizada para determinar a massa molecular aproximado de uma cadeia polipeptdica, assim como a composio das subunidades de uma protena. Para isso, utiliza-se um marcador de peso molecular conhecido e traa-se um grfico com as diferenas marcaes obtidas na electroforese, e por interpolao grfica retira-se o valor pretendido.
4. Focagem isoelctrica Num valor de pH baixo (correspondente a uma alta concentrao de H+), os grupos carboxlicos cidos das protenas tendem a ficar sem carga (-COOH) e os seus grupos bsicos, que contm azoto, totalmente carregados (por exemplo, -NH3+), conferindo maioria das protenas uma carga lquida positiva. Em pH elevado, os grupos carboxlicos cidos so negativamente carregados (-COO-) e os grupos bsicos tendem a ficar sem carga (por exemplo, -NH2), dando maioria das protenas uma carga lquida negativa. No seu pH isoelctrico, uma protena no tem carga lquida desde que as cargas positivas e negativas se equilibrem. Deste modo, quando um tubo contendo um gradiente fixo de pH submetido a um campo elctrico forte na direco apropriada, cada espcie de protena presente migra at formar uma banda fina no seu pH isoelctrico.
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5. Electroforese bidimensional A electroforese bidimensional, que combina dois procedimentos de separao, pode resolver at duas mil protenas, na forma de um mapa dimensional de protenas. Na primeira etapa, a focagem isoelctrica, as protenas so separadas de acordo com a sua carga intrnseca. A amostra dissolvida num volume pequeno de uma soluo contendo um detergente no inico, juntamente com -mercaptoetanol e o reagente desnaturante, ureia. Essa soluo solubiliza, desnatura e dissocia todas as cadeias polipeptdicas, mas mantm as suas cargas intrnsecas inalteradas. As cadeias so ento separadas pelo processo de focagem isoelctrica, onde cada protena tem o seu pH isoelctrico, no qual a protena no apresenta carga e assim no migra num campo elctrico. Assim, as protenas so separadas por electroforese num pequeno tubo de gel de poliacrilamida em que um gradiente de pH estabelecido por uma mistura de tampes especiais. Cada protena migra para uma posio no gradiente que corresponde ao seu ponto isoelctrico e permanece l. Na segunda etapa, o pequeno gel contendo as protenas separadas novamente submetido electroforese, mas na direco de um ngulo recto em relao direco utilizada na primeira etapa. Neste momento, o SDS adicionado e as protenas so separadas de acordo com o seu tamanho, como na SDS-PAGE. As nicas protenas que no se separam so aquelas que tm tanto tamanho como ponto isoelctrico idnticos, uma situao relativamente rara. Mesmo traos de cada cadeia polipeptdica podem ser detectados no gel por vrios procedimentos de colorao.
6. Western blotting O processo de western blotting uma variao do processo de southern blotting. Geralmente, as protenas presentes nos extractos celulares so inicialmente separadas de acordo com o tamanho atravs de uma electroforese em gel. No entanto, como as protenas apresentam diferentes formas e cargas, este processo requer uma modificao dos mtodos utilizados para uma electroforese de cidos nucleicos. Assim, as protenas so separadas de acordo com o tamanho atravs da electroforese SDS-PAGE e transferidas do gel para um filtro. Este filtro, por sua vez, incubado com um anticorpo direccionado contra a protena de interesse. O anticorpo vai ento ligar-se ao filtro e pode ser detectado atravs da reaco com vrios reagentes que identifiquem a ligao com o anticorpo, ou corado (por exemplo com Ponceau S).
7. Deteco de protenas Estudos de expresso e funo gnica requerem a deteco, no s de DNA e RNA, mas tambm de algumas protenas especficas. Para estes estudos, os anticorpos ocupam o lugar de reagente que pode selectivamente reagir com molculas proteicas nicas. Os anticorpos so protenas produzidas pelas clulas do sistema imunitrio que reagem contra molculas (antignios) que o organismo AULA 4 Metodologia do estudo da clula II 25
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hospedeiro reconhece como sendo substncias estranhas. O sistema imunitrio dos vertebrados capaz de produzir milhes de anticorpos diferentes, cada um deles capaz de reconhecer especificamente um nico antignio, que pode ser um hidrato de carbono, uma protena, etc. Aqui, a protena encontra-se ligado membrana de nitrocelulose, induzindo a ligao do anticorpo secundrio ao anticorpo primrio. Com esta ligao, provoca-se a ligao do anticorpo primrio ao antignio e, desta forma, os anticorpos secundrios associados a enzimas como a fosfatase alcalina ou a peroxidase tm a capacidade de degradar substncias cromognicas.
8. Electroforese de DNA A extenso e a pureza das molculas de DNA podem ser determinadas com acuidade pelos mesmos mtodos de electroforese de gel que provaram ser de tanta utilidade na anlise de protenas. Como cada nucletido numa molcula de DNA j possui uma carga negativa, no existe a necessidade de adicionar o detergente SDS carregado negativamente, que necessrio para fazer com que as molculas proteicas adquiram carga negativa e se movam uniformemente na direco do elctrodo positivo. No caso de fragmentos de DNA muito pequenos, os gis de poliacrilamida especiais permitem a separao de molculas que diferem apenas num nucletido da molcula. Os poros no gel de poliacrilamida, entretanto, so muito pequenos para permitirem a passagem de molculas de DNA muito grandes, para separ-las por tamanho, utilizado um gel muito mais poroso formado por uma soluo diluda de agarose. As bandas de DNA em gel de agarose ou de poliacrilamida so invisveis a menos que o DNA seja marcado ou corado de alguma forma. Um mtodo sensvel para corar o DNA exp-lo ao corante brometo de etdio, que fluoresce de cor laranja sob luz ultravioleta quando est ligado ao DNA.
9. Desnaturao e Hibridizao A chave para a deteco de sequncias especficas de cido nucleico o emparelhamento de bases entre cadeias complementares de DNA ou RNA. A temperaturas elevadas (90 a 100C), as cadeias complementares de DNA separam (desnaturao), formando molculas de cadeia simples de DNA. Se essas cadeias de DNA desnaturado forem, depois, incubadas em condies apropriadas (65C), elas vo voltar a renaturar para formar uma nova molcula de cadeia dupla atravs do emparelhamento de bases complementares hibridizao. Os hbridos de cido nucleico podem formar-se entre duas cadeias de DNA, duas cadeias de RNA ou uma cadeia de DNA e outra de RNA. A hibridizao entre os primers e o DNA molde proporciona a especificidade para a amplificao por PCR. Para alm disso, uma grande variedade de outros mtodos utiliza a hibridizao de cidos 26 AULA 4 Metodologia do estudo da clula II
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nucleicos como um meio para detectar sequncias de DNA ou de RNA que so complementares a uma molcula isolada de cido nucleico, como uma sequncia clonada de DNA.
10. Marcao de sondas Geralmente, existem trs principais formas de marcar as molculas de DNA isoladas. No primeiro mtodo, uma DNA polimerase copia o DNA na presena de nucleotdeos que so radioactivos, normalmente marcados com radioistopos. Desta forma, as sondas de DNA que contm vrios nucletidos marcados podem ser produzidas para reaces de hibridizao de cidos nucleicos. No segundo e terceiro mtodos, a marcao radioactiva substituda pela marcao com molculas que podem ser detectadas quimicamente ou por fluorescncia. Para produzir tais molculas de DNA no-radioactivas, so utilizados precursores de nucleotdeos especificamente modificados. Uma molcula de DNA produzida desta forma liga-se sua sequncia de DNA complementar por hibridizao e ento detectada com um anticorpo que reconhece especificamente a sua cadeia lateral modificada.
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11. Southern blotting A tcnica de southern blotting amplamente utilizada para a deteco de genes especficos em DNA celular. O DNA a ser analisado digerido por uma endonuclease de restrio e os fragmentos obtidos no final so separados atravs de uma electroforese em gel. O gel coberto com uma membrana de nitrocelulose ou de nylon, membrana qual os fragmentos de DNA vo aderir para criar uma rplica do gel. O filtro depois incubado com um teste de marcao, que hibridiza para os fragmentos de DNA que contm a sequncia complementar, permitindo a visualizao destes fragmentos especficos de DNA celular.
12. Northern blotting A tcnica de northern blotting uma variao da tcnica de southern blotting, que utilizada para a deteco de RNA em vez de DNA. Nesta tcnica, as molculas de RNAs so extradas e fraccionadas de acordo com o seu tamanho, numa electroforese em gel. Tal como acontece, no southern blotting, as molculas de RNA so transferidas para o filtro de nitrocelulose e detectadas por hibridizao.
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Assim, este mtodo utilizado em estudos de expresso gnica, como por exemplo para determinar se molculas especficas de RNA esto presentes nas clulas.
QUADRO-RESUMO DE BLOTTING
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13. Hibridizao in situ A hibridizao de cidos nucleicos pode ser usada para detectar sequncias homlogas de DNA e RNA, no s em extractos celulares mas tambm em cromossomas ou clulas intactas, atravs de um mtodo designado hibridizao in situ. Nesta tcnica, a hibridizao de sondas fluorescentes para clulas especficas ou estruturas subcelulares analisada atravs de exames microscpicos. Por exemplo, sondas previamente marcadas podem ser hibridizadas para cromossomas intactos com o objectivo de identificar quais as regies do cromossoma que contm o gene de interesse. Para alm disso, a hibridizao in situ tambm pode ser utilizada para detectar mRNAs especficos em diferentes tipos de clulas, no interior de um determinado tecido. 14. PCR Um mtodo alternativo para isolar grandes quantidades de DNA a polymerase chain reaction (PCR), que proporciona uma amplificao enorme de DNA atravs de reaces que ocorrem inteiramente in vitro. Essencialmente, a DNA polimerase utilizada para efectuar uma replicao repetida de um determinado segmento de DNA. O nmero de molculas de DNA cresce exponencialmente, dobrando a cada replicao que ocorre, fazendo com que se obtenham quantidades substanciais de DNA a partir de um pequeno nmero de cpias do molde inicial.
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O material inicial tanto pode ser um clone de um fragmento de DNA como uma mistura de molculas de DNA. Uma regio especfica de DNA pode, ento, ser amplificada a partir dessa mistura, possibilitando que a sequncia de nucletidos seja reconhecida, para permitir que os primers possam iniciar a sntese de DNA no ponto desejado. Esses primers so usualmente oligonucletidos sintetizados quimicamente, que possuem cerca de 15 a 20 bases de DNA. Dois primers so utilizados para iniciar a sntese de DNA em direces opostas para duas cadeias complementares de DNA. A reaco comea com um aquecimento do DNA molde a uma temperatura elevada (95C) para que as duas cadeias de DNA se separem. Seguidamente, a temperatura reduzida para permitir que os primers emparelhem com as suas sequncias complementares nas cadeias-molde. A DNA polimerase utiliza ento os primers para sintetizar uma nova molcula complementar para cada molde. Consequentemente, em cada ciclo de amplificao, duas novas molculas de DNA so sintetizadas a partir de um molde. A DNA polimerase utilizada uma enzima estvel em temperaturas elevadas, obtida a partir da bactria Thermus aquaticus, e designa-se por Taq DNA polimerase. Estas polimerases so sempre estveis nessas temperaturas, sendo usadas perfeitamente na amplificao de molculas de DNA na tcnica de PCR, de forma rpida e automtica.
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AULA 5 DNA e DNA Binding Proteins
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1. Componentes do DNA A vida depende da capacidade das clulas em armazenar, obter e traduzir as instrues genticas necessrias para manter o organismo vivo. Esta informao hereditria passada de uma clula s suas clulas-filhas, durante a diviso celular, e de uma gerao de um organismo para outro, por meio das suas clulas reprodutoras. Essas instrues so armazenadas, em todas as clulas vivas, nos genes, os elementos que contm a informao que determina as caractersticas de uma espcie como um todo, bem como as de um indivduo. A molcula de DNA consiste de duas longas cadeias polipeptdicas compostas de quatro tipos de subunidades nucleotdicas. Cada uma dessas cadeias conhecida como uma cadeia de DNA. As pontes de hidrognio entre as regies das bases azotadas mantm as duas cadeias juntas. Os nucletidos so compostos de acares com cinco carbonos, aos quais um ou mais grupos fosfato esto ligados, e de uma base contendo azoto. No caso dos nucletidos do DNA, o acar uma desoxirribose ligada a um nico grupo fosfato (por isso o nome cido desoxirribonucleico), e a base pode ser adenina (A), timina (T), guanina (G) e citosina (C). Os nucletidos esto covalentemente ligados numa cadeia atravs dos acares e dos fosfatos, os quais permitem formar a estrutura principal alternada de acar-fosfato-acar-fosfato. Cada cadeia polinucleotdica de DNA semelhante a um colar constitudo por quarto contas diferentes, correspondentes s quatro bases azotadas, pois apenas as bases diferem nos quatro tipo de subunidades. Esses mesmos smbolos so usados para representar os quatro diferentes nucletidos, que so as bases ligadas com os seus grupos fosfato e acar.
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A estrutura tridimensional do DNA a dupla hlice decorrente das caractersticas qumicas e estruturais das suas cadeias polipeptdicas. Uma vez que essas duas cadeias so mantidas juntas atravs de pontes de hidrognio entre as bases das duas cadeias complementares, todas as bases encontram-se no interior da dupla hlice, e os acares e os fosfatos encontram-se na regio externa. Em cada um dos casos, a base mais robusta, com dois anis (purina A e G), emparelha com uma base com um nico anel (pirimidina C e T). A emparelha sempre com T e G com C. Essa complementaridade de bases permite que os pares de bases sejam dispostos num arranjo energtico mais favorvel no interior da dupla hlice. Neste arranjo, cada par de bases apresenta largura similar, mantendo a estrutura de acar-fosfato equidistante ao longo da molcula de DNA. Para maximizar a eficcia do empacotamento pelo emparelhamento, as duas estruturas enrolam-se uma em torno da outra para formar a dupla hlice, com uma volta completa a cada 10 pares de bases. Os membros de cada par de bases encaixam-se na dupla hlice apenas se as duas cadeias da hlice estiverem na posio antiparalela, isto , apenas se a polaridade de uma cadeia estiver em orientao oposta da outra cadeia. A consequncia desta caracterstica que cada cadeia de uma molcula de DNA contm uma sequncia de nucletidos exactamente complementar da outra cadeia.
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Quando a base azotada est ligada a um acar, mas no contm grupo fosfato, designa-se nuclesido. A polimerizao de nucletidos para formar cidos nucleicos envolve a formao de ligaes fosfodister entre o 5-fosfato de um nucletido e o 3-hidroxilo de outro nucletido. Assim, podem formar-se os oligonucletidos, quando so constitudos por uma pequena cadeia de nucletidos ligados entre si ou polinucletidos, quando contm milhares ou milhes de nucletidos para formar grandes cadeias de cidos nucleicos, como o DNA ou o RNA. importante referir que uma cadeia polinucleotdica tem um sentido na sua orientao, com uma extremidade a terminar num grupo fosfato em 5 e a outra a terminar num grupo hidroxilo em 3. Assim, os polinucletidos so sempre sintetizados de 5 para 3, com um nucletido livre a ser adicionado extremidade 3 com o grupo hidroxilo da cadeia nascente.
Cada rotao da cadeia de DNA tem cerca de 10,1 pares de bases e mede cerca de 3,4 nm. Estes valores podem ser identificados atravs de uma cristalografia com raio-X. Para alm disso, existem sempre sulcos ao longo da cadeia, de dois tipos (maiores e menores), sendo que grande parte da especificidade da molcula de DNA advm da regio do sulco maior.
2. Desnaturao de DNA Durante a replicao e a transcrio do DNA, as cadeias de dupla hlice da molcula separam-se para permitir o emparelhamento das partes internas das bases, com as bases dos nucletidos que vo ser polimerizadas em novas cadeias polinucleotdicas.
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O desenrolamento e a separao do DNA, referido normalmente como desnaturao pode ser induzido experimentalmente atravs de um aumento da temperatura de uma soluo de DNA. medida que a energia trmica aumenta, o aumento do movimento molecular resulta numa quebra das pontes de hidrognio e de outras foras que pudessem estabilizar a dupla hlice. De seguida, as cadeias separam-se e so conduzidas individualmente atravs da repulso electrosttica do grupo fosfato que est contido nas desoxirriboses de cada cadeia. Perto da temperatura de desnaturao, um pequeno aumento da temperatura causa uma perda das fracas interaces que mantinham as cadeias juntas ao longo de todo o comprimento da molcula de DNA, conduzindo a uma mudana abrupta na absorvncia de ultravioletas. A temperatura de fuso (Tm) qual as cadeias de DNA se separam, depende de diversos factores. As molculas que contm uma maior proporo de pares G-C requerem uma temperatura superior para desnaturarem devido existncia de trs pontes de hidrognio entre as duas bases, tornandoas mais estveis que as A-T que apenas apresentam duas pontes de hidrognio nas suas ligaes. No entanto, a percentagem de bases G-C numa determinada molcula de DNA pode ser estimada atravs da temperatura de fuso da molcula, sendo que quanto maior a percentagem de pares G-C, maior a temperatura de fuso Tm.
3. Estruturas de DNA A maior parte do DNA celular encontra-se sob a forma de hlice. A anlise desta molcula atravs de raios-X informa-nos que as bases azotadas se encontram, geralmente, espaadas de 0.36 nm entre si, ao longo dos eixos da hlice da molcula de DNA. As trs principais conformaes de DNA conhecidas so: B-DNA a forma de DNA mais esperada de encontrar nas clulas. o DNA que respeita completamente as regras de complementaridade de bases azotadas e que conduz existncia de cadeias complementares e antiparalelas. Est sempre virada para o lado direito e cada volta apresenta cerca de 3,6 nm.
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A-DNA existe em condies de baixa humidade, onde a estrutura principal bastante mais compacta, exibindo grandes pores de bases que se encontram a seguir os eixos da hlice de DNA. Geralmente apresenta 11 pares de bases por cada volta e apenas pode ser conseguida in vitro. Z-DNA inclui pequenas molculas de DNA que alternam nucletidos de purinas e pirimidinas, adoptando uma estrutura mais instvel que a estrutura em hlice. As bases criam como que um zig-zag quando visualizadas de lado, sendo que quando o DNA adquire esta conformao particular voltada para o lado esquerdo, ainda apresenta funo desconhecida.
4. Cromatina As clulas eucariticas, em geral, so maiores e mais elaboradas que as clulas procariticas e, consequentemente, os seus genomas so maiores e mais elaborados tambm. Esta diferena acompanhada por diferenas radicais nas estruturas e nas funes celulares. Alm disso, muitas classes de clulas eucariticas formam organismos multicelulares que atingem um nvel de complexidade que no alcanado pelos procariotas. As informaes genticas das clulas eucariticas tm uma origem hbrida. A maior parte dessa informao armazenada no ncleo, mas uma pequena quantidade permanece dentro da mitocndria e, em clulas vegetais, dentro dos cloroplastos. O DNA mitocondrial e o DNA dos cloroplastos podem ser separados do DNA nuclear, analisados e sequenciados individualmente. Os genes encontram-se no interior dos cromossomas, que contm cromatina que est includa no ncleo celular. Basicamente, a cromatina pode incluir polmeros de DNA podendo ser eucromatina ou heterocromatina, ou ento pode incluir apenas protenas histnicas ou no histnicas. Os estudos por microscopia ptica, distinguiram dois tipos de cromatina no ncleo interfsico de muitas clulas eucariticas superiores:
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Heterocromatina forma altamente condensada, que inclui protenas adicionais e, provavelmente, um nvel mais compacto de organizao, que est apenas a comear a ser analisado actualmente. Normalmente, corresponde a 10% do genoma de uma clula e est concentrada em diversas regies como o centrmero e o telmero. A maior parte do DNA compactado em heterocromatina no contm genes, mas o que contm resistente expresso, porque a heterocromatina se encontra compactada de forma no-usual. Eucromatina restante cromatina menos condensada, composta por tipos de estruturas cromossmicas como as fibras de 30 nm. Os cromossomas de um indivduo podem ser cromatdeos irmos (ou cromtidas irms), ou seja, quando so duas cpias de um dado cromossoma, replicado durante a fase S do ciclo celular, que se separam durante a mitose. Existem tambm os cromossomas homlogos que emparelham durante a meiose ou correspondem a cromossomas de espcies diferentes que mantm o mesmo nmero de genes durante a evoluo. Durante a interfase, a maior parte das clulas (no-divisveis) contm uma cromatina que relativamente descondensada e distribuda por praticamente todo o ncleo. Durante este perodo do ciclo celular, os genes so transcritos e o DNA replicado na preparao para a diviso celular. A maior parte da eucromatina no ncleo interfsico aparenta ter a forma de uma fibra de 30 nm, ou algumas fibras ainda mais condensadas de cerca de 60 130 nm. Neste ncleo, existem dois vrios principais domnios (intercromossomal e cromossomais), envolvidos pelo envelope nuclear. medida que a clula entra na mitose, os seus cromossomas tornam-se altamente condensados, de tal forma que podem ser distribudos pelas clulas-filhas. Filamentos de cromatina de 30 nm so capazes de se tornam com o avano da mitose, nos cromossomas metafsicos. A cromatina condensada neste ponto j no pode ser utilizada na transcrio, pelo que este processo interrompido durante a mitose.
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5. Nucleossoma e histonas Tal como j foi referido, os complexos entre o DNA eucaritico e algumas protenas adquirem a designao global de cromatina, que geralmente contm o dobro das protenas do DNA. As principais protenas existentes na cromatina, designam-se histonas, que so pequenas protenas que contm uma grande proporo de aminocidos (arginina e lisina) que facilitam a ligao do DNA negativamente carregado. Existem cinco principais tipos de histonas: H1, H2A, H2B, H3 e H4, que so bastante similares dentro das diferentes espcies de eucariotas. A unidade bsica da cromatina designa-se nucleossoma, o qual foi descoberto em 1974. Quando o ncleo interfsico delicadamente rompido e o seu contedo examinado atravs de um microscpio electrnico, a maior parte da cromatina est na forma de uma fibra com 30 nm de dimetro.
A organizao estrutural dos nucleossomas foi determinada depois de estes serem isolados, da cromatina compactada pela digesto com enzimas especficas (nucleases) que quebram o DNA cortando-o entre os cernes dos nucleossomas. Aps a digesto por um curto perodo, o DNA exposto entre as partculas dos nucleossomas, o DNA de ligao degradado. Cada partcula do cerne nucleossmico individual consiste de um complexo de oito protenas histnicas, duas molculas de cada uma das histonas H2A, H2B, H3 e H4 e a dupla cadeia de DNA, que tem 146 nucletidos de comprimento. O octmero de histonas forma, ento, um cerne proteico ao redor do qual se enrola a dupla cadeia de DNA. Cada partcula do cerne do nucleossoma separada por um segmento de DNA de ligao, o qual pode variar em comprimento desde poucos, at cerca de 80 pares de nucletidos. Este octmero de histonas , finalmente, selado por uma outra protena histnica, H1.
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Digesto com a nuclease do micrococcus Os nucleossomas so as unidades bsicas de compactao do DNA, sendo que cada um deles ligado a outro atravs de molculas de DNA linker. O DNA est protegido com protenas e passa a no ser digerido pelas enzimas de restrio ou exonucleases. Quando cada nucleossoma era constitudo por 200 pares de bases e o DNA linker tem o seu tamanho, a nuclease do micrococcus corta as molculas de DNA nas zonas onde o DNA est livre, no estando associado a protenas. Quando a enzima actua durante mais tempo, digere todo o DNA que corresponde ao DNA linker (8 a 114 pares de bases). Compactao da cromatina O DNA dos eucariotas consiste em sequncias nicas e repetidas. Apenas uma percentagem inferior a 5% do DNA humano codifica protenas e RNA funcionais e as sequncias reguladoras que controlam a sua expresso. O restante maioritariamente constituinte do DNA existente entre os genes e os intres que se encontram inseridos em genes. Uma grande quantidade deste DNA (cerca de 50% nos humanos) derivado de elementos mveis de DNA que contriburam para a evoluo dos genomas contemporneos. Cada cromossoma consiste numa molcula individual e comprida de DNA com um numero de 210 Mb nos humanos, organizada em nveis sucessivamente superiores de condensao, atravs de protenas histnicas e no histnicas, com as quais se encontra altamente complexada. As molculas de DNA de dimenses inferiores encontram-se nas mitocndrias e nos cloroplastos.
Cdigo das histonas Tal como referido, as histonas so molculas proteicas muito conservadas e podem ter diferentes modificaes que determinam o grau de codificao da cromatina em que se encontram, pois h molculas proteicas capazes de ler sinais em modificaes ps-transcrio. As protenas que constituem o nucleossoma tm cadeias estendidas para fora do nucleossoma (caudas do nucleossoma), sendo que isto acontece principalmente na H3 mas tambm pode acontecer na H2A e H2B nos seus terminais COOH. As modificaes que podem ocorrer so sobretudo as seguintes:
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Acetilaes (grupos OH) Metilaes (grupos CH3) Fosforilaes (grupos de cido fosfrico) Ubiquitinaes (grupos ubiquitina) Para fora do nucleossoma, estando terminais NH2 de histonas e COOH de H2A e H2B, estes terminais esto expostos s enzimas que introduzem estas modificaes. Para as histonas de cada nucleossoma, existem modificaes na sua cauda, que vo determinar o grau de compactao da cromatina em que esto inseridas. As histonas predominantemente acetiladas encontram-se em zonas de eucromatina por serem zonas de transcrio activa. Por sua vez, as histonas metiladas encontram-se mais em heterocromatina e ligam-se protena HP1 que tem dois domnios de ligao: o primeiro para as histonas metiladas e o segundo para molculas semelhantes entre si. Desta forma, induz uma compactao sucessiva da cromatina. Quando uma histona comea a ser compactada com as prximas, desde que as seguintes estejam metiladas, so reconhecidas pelos domnios de ligao e constituem o processo.
6. Organizao do DNA nos cromossomas
Cromossoma metafsico Um cromossoma uma molcula de DNA associada a protenas histnicas e no histnicas. constitudo por dois cromatdeos ligados pelo centrmero que se caracteriza por ser uma zona altamente compacta. Para que um cromossoma seja funcional, tem de possuir: Origem de replicao local onde se inicia a replicao do DNA;
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Centrmero regio especializada e complexa dos cromossomas que apresenta poucos ou nenhuns genes. o ponto de unio dos cromatdeos irmos e contm uma estrutura (o cinetocoro) a que as fibras do fuso se ligam durante a mitose e a meiose, pelo que tem um papel importante no movimento dos cromossomas em direco aos plos; Telmero sequncias de DNA existentes nas zonas terminais dos cromossomas, que impedem um encurtamento de DNA pela aco de uma enzima especfica. O telmero pode ter o comprimento de algumas centenas de pares de bases e participa na estabilidade e na replicao do cromossoma. Um cromossoma normal possui dois telmeros. A enzima que protege os telmeros designa-se telomerase, que j no est presente na maioria das clulas adultas. Nas clulas embrionrias, existe sempre a telomerase, na medida em que esto em constante desenvolvimento.
Bandeamento dos cromossomas Os cromossomas so submetidos a um tratamento proteoltico para depois serem colocados em contacto com reagente de Giemsa, produzindo bandas distintas em locais caractersticos. Anlises microgrficas dos cromossomas 4 e 5, mostram condies em locais onde as bandas surgem em locais levemente assinalados de forma microgrfica. Geralmente, as bandas G apresentam colorao violeta, sendo que as regies assinaladas a verde no cromossoma 4 apresentam comprimento varivel e so mais comuns na regio do centrmero. Por conveno, a regio p delimita o brao curto do cromossoma e a regio q , o brao longo. Cada um deles est dividido em seces de maiores dimenses (1, 2, etc.) e subseces. Existem ainda outros tipos de bandas de cromossomas:
O bandeamento de cromossomas permite revelar a existncia de determinadas sequncias importantes, mas tambm se o cromossoma contm eucromatina ou heterocromatina em determinadas regies.
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Caritipo O caritipo o conjunto dos cromossomas duma clula eucaritica, normalmente definido em termos do seu nmero, dimenses e morfologia (forma e estrutura). caracterstico de cada espcie como, por exemplo, o caritipo humano. Este constitudo por 22 pares de cromossomas homlogos (autossomas) e um par de cromossomas sexuais (heterossomas). Bandas G possuem baixo teor em GC (guanina + citosina) e so escuras devido colorao de Giemsa. Bandas R elevado teor em GC e apresentam cor mais clara. Correspondem a zonas com maior densidade de genes, especialmente genes que so expressos em todos os tipos de clulas.
7. DNA binding proteins No ncleo celular, ocorre sempre a replicao e a transcrio do DNA. Desta forma, podem existir processos que sejam dependentes de protenas que se ligam ao DNA em vrias posies. Isto acontece, na medida em que o DNA apresenta locais na sua periferia que podem ser reconhecidos por determinadas protenas, conduzindo ao estabelecimento de ligaes com as bases expostas no sulco maior da molcula de DNA. No entanto, como a estrutura tridimensional do DNA pode variar ligeiramente conforme a sequncia de nucleotdeos, ento a ligao das protenas ao DNA tambm pode alterar a sua conformao.
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Os factores de transcrio podem conter mais do que um domnio de activao mas raramente contm mais do que um domnio de DNA-binding. O GAL4 e o GCN4 so activadores de transcrio de leveduras. O GR (receptor de glucocorticide) promove a transcrio dos genes-alvo quando certas hormonas esto ligadas do domnio de activao do terminal-C. O SP1 ligase aos elementos promotores ricos em GC numa grande parte dos genes de mamferos. Os domnios de DNA-binding dos activadores e repressores eucariotas contm uma grande variedade de aspectos estruturais que reconhecem sequncias especficas de DNA. A abilidade das DNA binding proteins para reconhecer estas seqncias resulta, geralmente, de interaces no-covalentes entre tomos de hlice no domnio DNA-binding e tomos nas bordas das bases no sulco maior do DNA. Os princpios das interaces especificas entre DNA e protenas foram descobertos durante estudos de repressores bacterianos. Grande parte deles so protenas dimricas em que na hlice , cada monmero se insere no sulco maior da hlice de DNA.
Domnios de ligao ao DNA presentes nas DNA binding proteins Homeodomain vrios factores de transcrio eucariota que actuam durante o desenvolvimento contm um conjunto de 60 resduos conservados de DNA-binding que similar ao helix-turn-helix existente nos repressores bacterianos. Designadas por protenas de homeodomain, so factores de transcrio que foram inicialmente identificados em mutantes de Drosophila em que uma parte do corpo era transformada noutra durante o desenvolvimento. A sequncia
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conservada de homeodomain foi tambm encontrada em factores de transcrio de vertebrados, incluindo aqueles que so similares s principais funes de controlo no desenvolvimento humano. Nestas protenas, podem tambm formar-se heterodmeros que at podem ser ligados por uma cadeia peptdica (ex.: protena Oct1 nos mamferos). Helix-turn-helix as protenas partilham duas hlices, sendo uma na extremidade terminal (vermelho) hlice de reconhecimento que se liga directamente ao sulco maior e uma outra hlice no terminal amino. Esto ligadas por uma sequncia pequena de aminocidos e formam um ngulo fixo. Uma das hlices interage directamente com as bases nucleotdicas do DNA e verifica-se que h vrias protenas que partilham esta estrutura (ex.: triptofano). um domino muito frequente e que apresenta homologias com o homeodomain referido anteriormente, por ser um mecanismo igual, mas aplicado nas clulas eucariticas.
Zinc-finger so protenas capazes de interagir com o DNA atravs de tomos de zinco que estabelecem ligaes com aminocidos da regio peptdica das protenas (cistena, histidina). Formam duas principais classes, mas todas elas apresentam uma hlice para ligao directa molcula de DNA. O GL1 uma protena monomrica que contm cinco zinc-fingers C2H2. As hlices so exibidas como cilindros e os ies Zn2+ como pequenas esferas. O finger 1 no interage com o DNA, ao passo que os outros 4 interagem. O finger 3 interage directamente com a molcula de DNA enquanto que o finger 2 interage primariamente com o tomo de zinco. Em (b), o receptor de glucocorticide uma protena zinc-finger homodimrica C4. As hlices so exibidas a roxo, as cadeias com setas verdes e os ies Zn2+ como esferas. Duas hlices, uma em cada monmero, interagem com o DNA. Tal como todos os homodmeros desta classe, este factor de transcrio tem uma simetria rotacional sobre dois eixos, em que o centro exibido como uma elipse amarela. Em contraste, os receptores heterodimricos nucleares no possuem qualquer simetria rotacional.
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Leucin-zipper / bHLH nas protenas de leucin-zipper, resduos bsicos numas regies de hlice estendidas com monmeros, interagem com a cadeia de DNA nos sulcos maiores adjacentes. De sete em sete aminocidos, existe um resduo de leucina. capaz de interagir com molculas semelhantes, formando uma regio de homodmero ou heterodmero consoante so iguais ou diferentes, e assumindo uma estrutura dimensional. O domnio de dimerizao estabilizado por interaces hidrofbicas entre os monmeros. Estas protenas conseguem formar diferentes dmeros consoante as diferentes especificidades de ligao ao DNA. (b) Nas protenas bHLH, as hlices de DNA-binding no topo (terminais-N dos monmeros so separadas por loops helicais que formam uma regio semelhante ao leucin-zipper contendo um domnio de dimerizao. Neste caso, havendo uma ruptura na zona helicoidal, forma-se uma ansa e forma-se o basic HLH. A hlice quebrada em dois e as protenas tm estruturalmente muitas semelhanas com o basic-zipper.
Folhas pregueadas protenas de reconhecimento de DNA com folhas pregueadas. As protenas repressoras met de transcrio na bactria, ligam-se directamente com a molcula de DNA atravs de domnios, impedindo a transcrio pelos factores de transcrio pela RNA polimerase.
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NFAT/AP1 isoladamente so muito difceis de ligar-se ao DNA porque a cintica da ligao muito baixa. No entanto, quando existem em simultneo, estabelece-se uma ligao cooperativa entre ambos e conseguem estabelecer ligao estvel com o DNA.
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AULA 6 Replicao do DNA
18 Outubro 2007
1. Conceito de replicao de DNA A descoberta do emparelhamento de bases complementares entre cadeias de DNA sugeriu, imediatamente, uma soluo molecular para a questo de como o material gentico era capaz de dirigir a sua prpria replicao. Concluiu-se ento que seria atravs dum processo que seria necessrio por cada diviso que uma determinada clula efectuasse. Foi, ento, proposto que as duas cadeias de uma molcula de DNA se pudessem separar e servir de molde para a sntese de novas cadeias complementares, a partir das sequncias onde se iria obter a especificidade derivada do emparelhamento de bases. Este processo ento designado de replicao semiconservativa do DNA, tendo esta denominao pois uma cadeia de DNA parental conservada em cada molcula de DNA da descendncia. A enzima central envolvida na replicao do DNA a DNA polimerase, que catalisa a ligao do desoxirribonuclesidos 5-trifosfato (dNTPs) para formar uma cadeia crescente de DNA. No entanto, a replicao do DNA bastante mais complexa do que uma simples reaco enzimtica. Assim, outras protenas para alm da DNA polimerase tambm esto envolvidas, tal como mecanismos de proofreading que so necessrios para assegurar que a eficcia da replicao compatvel com a pequena frequncia de erros exigida para a reproduo celular. Protenas adicionais e sequncias especficas de DNA so tambm necessrias para iniciar a replicao e para copiar as extremidades dos cromossomas eucariticas.
Figura 10
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2. Evidncia experimental da replicao semiconservativa Bactrias que cresceram num meio contendo o isotpo normal de azoto (14N) foram transferidas para um meio que continha um istopo pesado (15N), onde cresceram durante vrias geraes seguintes. Seguidamente, foram transferidas de volta para o meio onde existia 14N e cresceram por apenas mais uma gerao. Mais tarde, o DNA foi extrado do interior das bactrias e analisado por ultracentrifugao de equilbrio numa soluo de CsCl. Os sedimentos de CsCl tendem a formar um gradiente de densidade e as molculas de DNA criam uma banda numa posio em que a densidade igual da soluo de CsCl. Por sua vez, o DNA das bactrias transferidas do meio com 15N para o meio com 14N criam uma banda numa densidade intermdia entre o DNA de 15N e o DNA de 14N., indicando que representa uma molcula hbrida com uma cadeia leve (14N) e uma cadeia pesada (15N).
Figura 11 - Demonstrao experimental da replicao semiconservativa
3. Replicao de DNA em E. Coli As molculas de DNA no processo de replicao foram inicialmente analisadas por John Cairns em experincias em que E. coli cresceram na presena de timidina radioactiva, que permitiu uma visualizao subsequente de novas sequncias de DNA replicadas, atravs de autorradiografia. Em vrios casos, molculas circulares completas no processo de replicao eram passveis de ser observadas. Estas molculas de DNA apresentavam duas forquilhas de replicao, representadas por regies de sntese de DNA activa. Assim, em cada forquilha de replicao, so sintetizadas duas cadeias parentais de DNA e duas novas cadeias filhas.
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Figura 12 - Replicao do DNA de E. Coli
4. Mecanismo global de replicao de DNA A sntese de novas cadeias de DNA complementares a ambas as cadeias da molcula parental colocou um importante problema na compreenso bioqumica da replicao do DNA. Tendo em conta que uma dupla hlice de DNA contm duas cadeias que se deslocam em direces contrrias (antiparalelas), ento a sntese contnua de duas novas cadeias de DNA na forquilha de replicao requer que uma cadeia seja sintetizada na direco 5 para 3, ao mesmo tempo que a outra sintetizada na direco oposta (de 3 para 5). No entanto, a DNA polimerase, apenas cataliza a polimerizao de dNTPs na direco de 5 para 3. Esta questo foi resolvida com experincias que mostraram que apenas uma cadeia de DNA sintetizada numa forma contnua na direco da replicao geral do DNA. Assim, a outra cadeia de DNA formada por pequenos (1 3 kb) e descontnuos fragmentos de DNA que so sintetizados na direco contrria, de acordo com o deslocamento da forquilha de replicao.
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Figura 13 - Sntese das cadeias leading e lagging de DNA
Estes pequenos fragmentos de DNA recentemente sintetizado so designados por fragmentos de Okazaki e juntam-se atravs da aco da DNA ligase, que permite a formao de uma nova cadeia intacta de DNA. A cadeia continuamente sintetizada ento designada por cadeia leading (ou contnua), pois a sua elongao na direco da forquilha de replicao expe o molde utilizado para a sntese dos fragmentos de Okazaki cadeia lagging (ou descontnua). Apesar da descoberta da sntese descontnua da cadeia lagging, que proporcionou um mecanismo possvel para a elongao de ambas as cadeias de DNA na forquilha de replicao, pode ser levantada uma outra questo: tendo em conta que a DNA polimerase requer um primer e no pode iniciar a sntese desde o incio, ento para ocorrer a sntese de fragmentos de Okazaki, so necessrios primers, que vo derivar de pequenos fragmentos de RNA.
Figura 14 - Iniciao dos fragmentos de Okazaki com primers de RNA Em contraste com a sntese de DNA, a sntese de RNA pode ser iniciada de novo, pois uma enzima designada primase sintetiza pequenos fragmentos de RNA, que so complementares ao molde da cadeia lagging na forquilha de replicao. De seguida, os fragmentos de Okazaki so sintetizados atravs da extenso destes primers de RNA atravs da DNA polimerase. No entanto, 52 AULA 6 Replicao do DNA
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novos fragmentos de Okazaki contm uma ligao RNA-DNA, que permite inferir acerca do papel dos primers na replicao de DNA. Para formar uma cadeia contnua a partir da cadeia lagging de DNA, os primers de RNA tm, eventualmente, de ser removidos dos fragmentos de Okazaki e ser substitudos por sequncias de DNA. Nos procariotas, so removidos pela aco da RNA polimerase I. Para alm da sua actividade de DNA polimerase, a RNA polimerase I tambm actua com actividade de exonuclease, conseguindo hidrolisar DNA (ou RNA), seja na direco 3 para 5 como na direco 5 para 3. A aco da RNA polimerase I como exonuclease na direco 5 para 3 permite a remoo de ribonucletidos das extremidades 5 dos fragmentos de Okazaki, permitindo que eles possam ser substitudos por desoxirribonucletidos para formar fragmentos constitudos totalmente por DNA. Por sua vez, nas clulas eucariticas, os primers de RNA so removidos pela aco combinada da RNase H, uma enzima que degrada a cadeia de RNA dos hbridos RNA-DNA e as exonucleases de 5 para 3. Os espaos resultantes so preenchidos pela aco da DNA polimerase e os fragmentos de DNA so ligados pela DNA ligase, formando uma cadeia intacta de DNA.
Figura 15 - Remoo dos primers de RNA e juno dos fragmentos de Okazaki
As enzimas envolvidas na replicao de DNA actuam numa forma coordenada para sintetizar ambas as cadeias leading e lagging do DNA de forma simultnea na forquilha de replicao. Esta tarefa auxiliada pela formao de dmeros de polimerases replicativas de DNA, cada uma delas com as protenas acessrias apropriadas. Uma molcula de polimerase actua seguidamente na sntese da cadeia leading enquanto que a outra actua na sntese da cadeia lagging.
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A forquilha de replicao de E. coli inclui uma helicase, uma primase e duas molculas de DNA polimerase III que transportam e coordenam a sntese das duas cadeias de DNA, sendo o primossoma formado pelo conjunto da primase com a helicase.
Figura 16 - Modelo da forquilha de replicao de E. Coli
5. DNA Polimerases Tal como referido anteriormente, diferentes DNA polimerases desempenham diferentes papis nas forquilhas de replicao, tanto nos procariotas, como nos eucariotas. Em E. coli, a polimerase III a principal polimerase replicativa, funcionando na sntese da cadeia leading de DNA e dos fragmentos de Okazaki pela extenso dos primers de RNA. Nas clulas eucariticas, trs diferentes DNA polimerases (, e ) esto envolvidas na replicao do DNA nuclear. A polimerase encontrada num complexo com a primase, actuando conjuntamente com ela para sintetizar pequenos fragmentos de RNA-DNA durante a sntese da cadeia lagging. A polimerase capaz de sintetizar ambas as cadeias leading e lagging, actuando no sentido de aumentar os primers RNA-DNA inicialmente sintetizados pelo complexo polimerase primase. A polimerase um gene essencial das leveduras, mas no necessria para a replicao de DNA por SV40 in vitro, fazendo com que o seu papel permanea ainda em dvida. No entanto, as suas actividades parecem ser semelhantes s da polimerase , pelo que se assume que as funes tambm devem ser parecidas.
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Figura 17 - Papis desempenhados pelas DNA polimerases em E. coli e clulas de mamferos
5.1.
Protenas acessrias da DNA polimerase
Estas protenas associadas DNA polimerase foram identificadas tanto pela anlise em E. coli e em mutantes de leveduras, defeituosos no processo de replicao do DNA, como pela purificao de protenas de mamferos necessrias para a replicao in vitro do DNA SV40. Uma classe de protenas necessria para a replicao liga-se s DNA polimerases, aumentando a actividade de polimerase e provocando uma ligao permanente ao DNA molde para que continuem a sntese de uma nova cadeia de DNA. Tanto a polimerase III de E. coli como as polimerases e dos eucariotas esto associadas a dois tipos de protenas acessrias (sliding-clamp e clamp-loading proteins) que aproximam a polimerase do primer e mantm a sua associao estvel com o molde.
Figura 18 - Protenas acessrias da DNA polimerase
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As clamp-loading proteins (RFC nos eucariotas) e as sliding-clamp proteins (PCNA nos eucariotas) formam um complexo que especificamente reorganiza e liga o DNA na juno entre o primer e a cadeia molde. A clamp-loading protein liberta, de seguida, a sliding-clamp protein que vai formar um anel em torno do DNA molde. Esta protena vai, seguidamente, libertar a DNA polimerase junto do DNA na juno entre o molde e o primer. O anel formado pela sliding-clamp protein mantm a associao da polimerase com o molde medida que a replicao vai ocorrendo, permitindo uma sntese contnua de milhares de nucletidos de DNA.
5.2.
Aco da helicase e das SSBPs
Existem ainda outras protenas que tambm interagem com o DNA molde e estabilizam as regies que ainda se encontram em cadeia simples. As helicases so enzimas que catalisam o desenrolamento da cadeia de DNA parental, acompanhado da hidrlise de ATP, depois da forquilha de replicao. As single-stranded DNA proteins (RPA nos eucariotas) estabilizam, seguidamente, o DNA molde j desenrolado, mantendo-o num estado de cadeia simples para que possa ser replicado pela aco da polimerase.
Figura 19 Aco das helicases e das SSBPs
6. Topoisomerases medida que a dupla hlice de DNA vai sendo desenrolada, o DNA localizado depois da forquilha de replicao forado a executar uma rotao. Como consequncia, as molculas de DNA iriam tornar-se em molculas circulares que ficaram enroladas em torno de si mesmas e poderiam,
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eventualmente, bloquear a replicao. Este problema resolvido pelas topoisomerases, enzimas que catalizam a quebra e a nova ligao reversvel nas cadeias de DNA. Um tipo de topoisomerase, a topoisomerase I, produz uma clivagem temporria na cadeia simples de DNA; esta quebra na cadeia permite que as duas pores da hlice de DNA, formadas dos dois lados da quebra, girem livremente uma em relao outra, usando a ligao fosfodister na cadeia oposta quebra como ponto de suporte para a rotao. Qualquer tenso na hlice de DNA ir ditar a rotao na direco que alivia esta tenso. Como resultado, a replicao pode ocorrer com a rotao de pequenos segmentos da hlice, com a poro imediatamente frente da forquilha de replicao. O outro tipo de topoisomerase, a topoisomerase II, forma uma ligao covalente com ambas as cadeias da hlice de DNA, ao mesmo tempo, formando uma quebra temporria na dupla hlice. Essas enzimas so activadas por locais nos cromossomas, em que duas duplas hlices se vo entrelaar. Uma vez que a molcula de topoisomerase II se liga a um desses locais de cruzamento, a protena vai utilizar a hidrlise de ATP para executar, eficientemente, um conjunto de reaces que so essenciais para a separao dos dois crculos de DNA previamente entrelaados.
Figura 20 - Actividades da topoisomerase I (esquerda) e topoisomerase II (direita)
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7. Proofreading As DNA polimerases replicativas (polimerases e nos eucariotas e polimerase III nos procariotas) apresentam uma actividade exonuclesica que permite a hidrlise de DNA na direco 3 para 5. Esta actividade opera na direco oposta sntese de DNA e participa no processo de proofreading das novas molculas de DNA. O proofreading um processo eficaz, na medida em que a DNA polimerase requer um primer e no capaz de iniciar a sntese desde o incio. Os primers que apresentam pontes de hidrognio na ligao com o DNA molde, so geralmente removidos de 3 para 5 por actividade exonuclesica, em vez de serem utilizados para a sntese contnua. No caso da imagem representada abaixo, um resduo de G incorporado num lugar de A, como resultado de erro no emparelhamento com uma T na cadeia molde. Devido a este erro no emparelhamento, o terminal 3 G no est ligado com pontes de hidrognio ao DNA molde, sendo excisado pela exonuclease de 3 para 5 atravs desta actividade da DNA polimerase. Seguidamente, procede-se incorporao de um nucletido correcto de A atravs da sntese de DNA.
Figura 21 - Proofreading pela DNA polimerase
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Todas as DNA polimerases apresentam uma estrutura tridimensional semelhante, que se assemelha a uma mo direita semi-aberta. Os dedos ligam o segmento da cadeia simples do molde e a actividade cataltica da polimerase (Pol) actua nas junes entre os dedos e a palma (Palm). medida que os nucletidos correctos vo sendo adicionados na extremidade 3 da cadeia crescente, vai permanecer no local da polimerase. A incorporao de uma base incorrecta na extremidade 3 vai provocar a eliminao de uma nova extremidade formada do duplex. Como consequncia, a polimerase interrompe a sua actividade e a extremidade 3 da cadeia crescente transferida para o local exonuclesico de 3 para 5 (Exo) que se encontra a cerca de 3 nm de distncia, onde mais provvel que erros de emparelhamento sejam reconhecidos atravs da eliminao de bases erradas. Subsequentemente, a extremidade 3 regressa ao local da polimerase e a elongao da cadeia continua.
Figura 22 - Modelo esquemtico do proofreading da DNA polimerase
8. Origens de Replicao Tanto no DNA eucariota como no procariota, a replicao inicia-se em locais designados origens de replicao, que so utilizados como locais de ligao para protenas que tm a capacidade de iniciar o processo de replicao. A primeira origem de replicao a ser definida foi em E. coli, onde vrias anlises genticas indicaram que a replicao se inicia sempre num local especfico do cromossoma bacteriano. A origem de replicao de E. coli consiste em 245 pares de bases de DNS, elementos que servem de locais de ligao para protenas necessrias para a iniciao da replicao de DNA. O passo essencial a ligao de uma protena iniciadora da replicao a sequncias de DNA que se encontrem no interior da origem de replicao. Depois deste passo, a protena iniciadora inicia um processo de desenrolamento da cadeia dupla de DNA e recruta outras protenas envolvidas na sntese de DNA. A helicase e as SSBPs actuam, seguidamente, para continuar o desenrolamento e a exposio do DNA molde, e a primase inicia a sntese das cadeias leading. Duas forquilhas de replicao esto, ento, formadas e movem-se em direces opostas ao longo do cromossoma circular de E. coli.
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Figura 23 - Origem de replicao em E. coli
Na E. coli, a interaco da protena iniciadora com a origem de replicao cuidadosamente regulada, e o incio ocorre apenas quando h nutrientes suficientes disponveis para a bactria completar todo o processo de replicao. Desta forma, no s a actividade da protena iniciadora controlada, mas tambm a origem de replicao que foi utilizada vai passar por um perodo refractrio, induzido por um atraso na metilao dos nucletidos A recm-sintetizados. Como consequncia, um novo incio de replicao bloqueado, at que estes nucleotdeos A sejam metilados.
Figura 24 - A metilao da origem de replicao de E. coli produz um perodo inacessvel para o incio da replicao
No caso dos eucariotas, a presena de mltiplas origens de replicao foi inicialmente demonstrada pela exposio de culturas de clulas de mamferos a timidina radioactiva durante diferentes intervalos de tempo, seguida de autorradiografia para detectar DNA recentemente sintetizado. Como resultado, foi indicado que a sntese de DNA iniciada em vrias origens de replicao, a partir dos quais procede em ambas as direces ao longo do cromossoma. As origens de replicao nas clulas de mamferos encontram-se espaadas com aproximadamente 50 a 300 kb. Consequentemente, o genoma humano contm cerca de 30000 origens de replicao. Os principais complexos de origem de replicao nos eucariotas so o ORC (origin replication complex) que uma protena com 6 subunidades e a MCM (minichromosome maintenance) com actividade de helicase e protenas Cdc6.
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Figura 25 - Origens de replicao em cromossomas eucariotas
9. Telomerase Tendo em conta que as DNA polimerases prolongam os primers apenas na direco de 5 para 3, tornam-se incapazes de copiar as extremidades 5 das molculas lineares de DNA. Consequentemente, mecanismos especiais so necessrios para replicar as sequncias terminais dos cromossomas lineares das clulas eucariticas. Estas sequncias telmeros consistem em repeties da sequncias simples de DNA, que so mantidas em aco por uma enzima individual designada telomerase, que capaz de catalisar a sntese de telmeros na falta de uma cadeia molde de DNA. A telomerase uma transcriptase reversa, uma das classes de DNA polimerases, inicialmente descoberta nos retrovrus, que sintetiza DNA a partir de um molde de RNA. Torna-se importante referir que a telomerase transporta consigo o seu prprio molde de RNA, que complementar a uma sequncia repetitiva do telmero, como parte de um complexo enzimtico. A utilizao deste RNA como molde para a sntese de DNA permite que a telomerase gere mltiplas cpias de sequncias repetitivas telomricas. O DNA telomrico uma simples sequncia repetitiva com uma extremidade 3 solta na cadeia leading recentemente sintetizada. A telomerase transporta o seu prprio molde de RNA que vai ser complementar a este DNA telomrico, como parte do complexo enzimtico da telomerase. Essa extremidade 3 do DNA telomrico liga-se a RNA telomerase, que vai servir de molde para a extenso da cadeia leading atravs de uma unidade de repetio. A cadeia lagging do DNA telomrico pode, seguidamente, ser elongada atravs do convencional RNA priming e da actividade da DNA polimerase.
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Figura 26 - Aco da telomerase
Defeitos na telomerase e na manuteno normal dos telmeros esto associados com vrias doenas humanas. A actividade da telomerase regulada nas clulas divisveis para a manuteno dos telmeros no seu comprimento normal. Esta manuteno apenas conseguida nas clulas embrionrias, enquanto que a maior parte das clulas somticas no apresenta nveis suficientemente elevados de telomerase para manter o comprimento dos seus telmeros num valor relativamente estvel por um nmero indefinido de divises celulares. Consequentemente, os telmeros diminuem gradualmente medida que a clula envelhece, e este encurtamento conduz morte celular ou senescncia. Em casos mais graves, e em determinadas doenas, existem mutaes directamente nas telomerases e as clulas tornam-se cancergenas com divises completamente indefinidas.
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AULA 8 Transcrio do mRNA
25 Outubro 2007
1. Dogma central da Biologia Molecular O dogma central da Biologia Molecular foi, inicialmente, descrito em 1958 por Francis Crick na tentativa de relacionar o DNA, o RNA e as protenas. Assim, afirmou que o DNA seria capaz de se replicar e dar origem a novas molculas de DNA. Estas molculas seriam transcritas em molculas de RNA e estas, por sua vez, traduziam o cdigo gentico em protenas.
No entanto, mais tarde, em 1975, Howard Temin e David Baltimore propuseram um segundo modelo para este dogma, em que todos os processos eram semelhantes, excepto que o RNA tambm teria a capacidade de passar a DNA atravs da aco da transcriptase reversa, como por exemplo, nos retrovrus.
2. RNA e suas diferenas com DNA A transcrio comea com a abertura e despiralizao de uma pequena poro da dupla hlice de DNA, para expr as bases em cada cadeia de DNA. Uma das duas cadeias da dupla hlice de DNA age, ento, como um molde para a sntese de uma molcula de RNA. Tal como no processo de replicao do DNA, a sequncia de nucletidos da cadeia de RNA determinada pela complementaridade do emparelhamento de bases entre os nucletidos a serem incorporados e o DNA-molde. A cadeia de RNA produzida por transcrio o transcrito , portanto, aumentanda num nucletido por processo e possui uma sequncia de nucletidos exactamente complementar cadeia de DNA utilizada como molde.
2.1. Diferenas entre DNA e RNA O primeiro passo executado pela clula para ler a informao necessria das suas instrues genticas a cpia de uma parcela especfica da sequncia de nucletidos de DNA um gene sob a forma de uma sequncia de nucletidos de RNA. A informao na forma de RNA, embora copiada de uma forma quimicamente distinta, tambm escrita essencialmente na mesma linguagem do DNA, AULA 8 Transcrio do mRNA 63
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ou seja, a linguagem de uma sequncia de nucletidos, de onde deriva a designao do processo de transcrio. Tal como o DNA, o RNA um polmero linear composto por quatro tipos diferentes de subunidades nucleotdicas unidas entre si por uma ligao fosfodister. O RNA difere quimicamente do DNA em dois aspectos principais: Os nucletidos do RNA so ribonucletidos, isto , contm o acar ribose em vez de desoxirribose; Embora, assim como o DNA, o RNA contenha as bases adenina, guanina e citosina, ele contm a base uracilo (U), em vez da timina, que ocorre no DNA. Uma vez que o uracilo, tal como a timina, pode formar pares com estabelecimento de pontes de hidrognio com a adenina, as propriedades de complementaridade por emparelhamento de bases descritas para o DNA anteriormente, tambm se aplicam ao RNA. No entanto, no raro encontrar outros tipos de emparelhamento de bases no RNA, como por exemplo a guanina a emparelhar com o uracilo, ocasionalmente. Apesar destas pequenas diferenas qumicas, o DNA e o RNA diferem drasticamente nas suas estruturas como um todo. Enquanto o DNA ocorre sempre nas clulas como uma cadeia de dupla hlice, o RNA apresenta-se com uma cadeia simples. Portanto, as cadeias de RNA podem dobrar-se sob diversas formas, do mesmo modo que uma cadeia de polipptidos pode dobrar-se, resultando na conformao final de uma protena.
2.2.
Estruturas de RNA
Ao contrrio do DNA, que existe primariamente como uma hlice dupla de grandes dimenses, a maior parte dos RNAs celulares apresenta cadeias simples e uma grande variedade de conformaes. As diferenas nos tamanhos e conformaes dos vrios tipos de RNA permite-lhes ter funes especficas na clula. A estrutura secundria mais simples que uma molcula de RNA de cadeia simples pode assumir formada pelo emparelhamento de bases complementares. Os hairpins so formados por emparelhamento de bases no interior da molcula de 5 a 10 nucletidos separados entre si e os stem-loops pelo emparelhamento de bases que
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esto separadas por mais de 10 at vrias centenas de nucletidos. Estas conformaes simples podem cooperar entre si para formar estruturas tercirias mais complexas, sendo a principal designada por pseudoknot.
3. Mecanismo geral de transcrio Durante a transcrio do DNA, uma das cadeias da molcula de DNA actua como molde, determinando a ordem em que os monmeros de rNTP (ribonuclesido trifosfato) so polimerizados para formar uma cadeia complementar de RNA. As bases localizadas na cadeia molde de DNA emparelham-se com os rNTPs complementares introduzidos, para entrar numa reaco de polimerizao catalisada pela RNA polimerase, aps a adio do ribonucletido extremidade 3 da cadeia nascente de RNA. Como consequncia da catlise da reaco entre um oxignio da extremidade 3 da cadeia nascente e um fosfato de um rNTP correctamente emparelhado, forma-se uma ponte fosfodister. Assim, as cadeias de RNA so sempre sintetizadas no sentido 5 3 e so contrrias em polaridade s suas cadeias-molde de DNA. Para o processo da transcrio, a RNA polimerase actua com diversas funes. Durante a fase de iniciao, a RNA polimerase reconhece e liga-se a uma sequncia especfica o promotor que se localiza na cadeia dupla de DNA (passo 1). As RNA polimerases nucleares requerem vrios factores proteicos, designados por factores de transcrio, para ajudarem a localizar os promotores e a iniciar o mecanismo de transcrio. Aps a ligao a um promotor, a RNA polimerase quebra as cadeias de DNA com o objectivo de tornar as suas bases disponveis para o emparelhamento com as bases dos rNTPs que vo ser polimerizados. Geralmente, as RNA polimerases celulares quebram cerca de 14 emparelhamentos das bases de DNA em torno do local de iniciao da transcrio, que se encontra na cadeia molde dentro da regio promotora (passo 2). A iniciao , ento, completa quando os dois primeiros ribonucletidos de uma cadeia de RNA so ligados por uma ponte fosfodister (passo 3). Depois de vrios ribonucletidos terem sido poimerizados, a RNA polimerase dissocia-se do promotor de DNA e dos factores gerais de transcrio. Durante a fase de elongao, a RNA polimerase move-se ao longo da cadeia molde de DNA, por uma base de cada vez, abrindo a cadeia dupla de DNA na direco do seu movimento e permitindo a hibridao das cadeias atrs de si (passo AULA 8 Transcrio do mRNA 65
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4). Um ribonucletido de cada vez adicionado extremidade 3 da cadeia nascente de RNA durante a fase de elongao pela RNA polimerase. A enzima mantm a regio quebrada de aproximadamente 14 bases, designada por bolha de transcrio. Aproximadamente 8 nucletidos na extremidade 3 da cadeia nascente de RNA permanecem emparelhados cadeia molde de RNA nesta regio. O complexo de elongao, que compreende a RNA polimerase, o DNA molde e a cadeia nascente de RNA extraordinariamente estvel, permitindo um pequeno nmero de erros durante este mecanismo. Durante a terminao da transcrio, que a fase final da sntese de RNA, a molcula de RNA ou transcrito primrio libertada pela RNA polimerase que, por sua vez, tambm se dissocia do DNA molde (passo 5). As sequncias especficas no DNA molde sinalizam o local de ligao da RNA polimerase para permitir a terminao da transcrio e, uma vez libertada, a RNA polimerase tornase disponvel para transcrever o mesmo ou outro gene de DNA.
3.1.
Regio promotora
Os primeiros genes a serem sequenciados em transcries in vitro foram genes virais e genes codificantes de protenas que so activamente transcritos tanto em alturas particulares do ciclo celular como em tipos especficos de clulas diferenciadas. Em todos estes genes, uma sequncia altamente conservada designada TATA box encontrada aproximadamente 25 a 35 pares de bases acima do local de iniciao. 66 AULA 8 Transcrio do mRNA
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Para alm da TATA box existem outras regies promotoras como a CAAT box, que contm uma citosina na posio -1 e uma timina na posio +1, com duas adeninas pelo meio, e que se encontra cerca de 75 a 80 pares de bases acima do local de iniciao. Por fim, existem outros genes que no contm TATA box nem CAAT box, apresentando uma sequncia rica em C e G com aproximadamente 40 nucletidos, situada 100 pares de bases acima do local de iniciao. O dinucletido CG estatisticamente menos representativo em DNA, sendo considerado como uma regio genmica de DNA que indica que existe uma regio de iniciao da transcrio.
3.2.
Enhancers
A transcrio de vrios genes eucariotas pode ser estimulada por elementos de controlo localizados vrios milhares de pares de bases acima do local de iniciao. Os mais encontrados so designados por enhancers e raramente so encontrados fora de genomas eucariotas. Os enhancers contm um conjunto de elementos proximamente unidos entre si que condicionam a ligao de diversos factores de transcrio que estejam ligados a alguns milhares de pares de bases de distncia. Desta forma, o DNA pode sofrer um rearranjo de tal forma que os factores de transcrio na regio do promotor e do enhancer interajam para formar um complexo proteico de grandes dimenses.
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3.3.
Ribonucleoprotenas
Na primeira imagem, encontra-se um diagrama de um domnio RRM que mostra as duas hlices e as quatro cadeias que caracterizam este tipo de molcula. Na segunda, encontra-se uma representao superficial de dois domnios RRM numa protena Sxl que reconhece e activa uma sequncia num pr-mRNA transformer (verde). Os dois RRMs esto orientados da mesma forma que as duas partes de um par de castanholas aberto com a folha da RRM1 virada superiormente e a folha da RRM2 virada inferiormente. As regies carregadas positivamente na protena Sxl so mostradas de azul e as carregadas negativamente, de vermelho. O pr-mRNA reconhecido e ligado s superfcies das folhas positivamente carregadas, fazendo grande parte dos pontos de contacto com as regies da RNP1 e RNP2 de cada RRM. Assim, como o mRNA existe na clula sempre associado a protenas (RNPs), estas vo prevenir a formao da estrutura tri-dimensional e reconhecem sequncias de ribonucleotdeos.
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4. RNA polimerases As enzimas que realizam a transcrio so denominadas de RNA polimerases. Assim como a DNA polimerase catalisa a replicao do DNA, as RNA polimerases catalisam a formao de pontes fosfodister que ligam os nucletidos entre si para formar uma cadeia linear. A libertao quase imediata da cadeia de RNA do DNA, conforme a primeira est a ser sintetizada, significa que muitas cpias de RNA podem ser produzidas a partir do mesmo gene num perodo de tempo relativamente pequeno; a sntese de molculas de RNA adicionais pode ser iniciada antes que a do primeiro RNA tenha terminado. Quando vrias molculas de RNA polimerase usam a mesma regio como molde, deixando um pequeno intervalo entre si, cada uma sintetizando aproximadamente 20 nucletidos por segundo, podem ser sintetizados mais de mil transcritos numa hora, a partir de um nico gene. Apesar de a RNA poliermase catalisar essencialmente a mesma reaco qumica que a DNA polimerase, existem algumas diferenas importantes entre estas duas enzimas: A RNA polimerase catalisa a ligao de ribonucletidos e no de desoxirribonucletidos como a DNA polimerase. Ao contrrio das DNA polimerases envolvidas na replicao de DNA, as RNA polimerases podem comear a sintetizar uma cadeia de RNA sem um iniciador. Isto pode acontecer porque a transcrio no precisa de ser to precisa quanto a replicao. O RNA no mantm permanentemente a informao gentica nas clulas. As RNA polimerases realizam aproximadamente um erro em cada 104 nucletidos copiados no RNA, enquanto que a DNA polimerase comete um em cada 107 nucletidos. As consequncias de um erro na transcrio do RNA so muito menos significativas do que aquelas que ocorrem na replicao do DNA. AULA 8 Transcrio do mRNA 69
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4.1. RNA polimerase procariota Nas clulas procariotas, a transcrio dos RNA celulares, quer sejam ribossomais (rRNA), mensageiros (mRNA), de transferncia (tRNA) ou outros, processa-se sob catlise de uma nica RNA polimerase. A RNA polimerase bacteriana apresenta uma estrutura oligomrica, em que cada uma das subunidades constituintes confere propriedades bioqumicas especficas, inerentes complexidade da funo desempenhada pela enzima. A holoenzima da E. Coli formada por cinco subunidades, constitudas por entidades proteicas diferentes, designadas , , e , que na enzima activa se apresentam organizadas num complexo constitudo por duas cadeias , uma cadeia , uma cadeia e uma cadeia . A core enzyme, de estrutura 2, tem a propriedade de catalizar a elongao das cadeias de RNA, mas depende da subunidade para poder iniciar a transcrio. A iniciao da transcrio condicionada pela ligao do complexo aos stios especficos do DNA, que correspondem ao incio de cada gene, inscrito no genoma celular sem solues de continuidade fsica. Na RNA polimerase da E. Coli: A cadeia responsvel pela fixao dos nuclesidos trifosfato da ribose, precursores do RNA, propriedade experimentalmente demonstrada mediante utilizao de anlogos radioactivos destes substratos. A cadeia apresenta carcter bsico acentuado, e determina a ligaao do complexo enzimtico ao DNA molde, que como se sabe tem carcter cido. O factor determina o reconhecimento da regio promotora de cada gene, sendo portanto essencial iniciao correcta da transcrio dos genes bacterianos. A ligao do factor modifica a conformao da core enzyme, conferindo-lhe a capacidade de reconhecer o DNA quele nvel especfico. O factor da RNA polimerase DNA dependente que actua normalmente na transcrio de todos os genes bacterianos designado por 70, devido sua massa molecular de 70 kDa. A subunidade intervm tambm no reconhecimento dos promotores, como indica o facto de alteraes estruturais desta subunidade resultar na diminuio da afinidade da holoenzima para os elementos promotores do DNA.
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4.2.
RNA polimerases eucariotas
Nos ncleos das clulas eucariotas, encontram-se trs tipos de RNA polimerases DNA dependentes: RNA polimerase I responsvel pela sntese de cerca de 80% da totalidade do RNA celular, localiza-se no nuclolo, transcrevendo os genes dos RNA ribossomais, que conduzem produo dos rRNA 18S; 5.8S e 28S. Esta polimerase insensvel inibio pela -amanitina. RNA polimerase II responsvel pela sntese de cerca de 2% do RNA celular, localiza-se no nucleoplasma, e catalisa a sntese dos produtos primrios precursores dos RNA mensageiros, que do origem ao hnRNA. A RNA polimerase II inibida pela -amanitina a baixa concentrao. RNA polimerase III responsvel pela sntese de cerca de 20% dos RNA celulares, est igualmente localizada no nucleoplasma, e catalisa a sntese dos RNA de transferncia tRNA e outros pequenos RNA, que incluem o rRNA 5S, o snRNA ou small nuclear RNA e snoRNA ou small nucleolar RNA. A RNA polimerase III animal sensvel inibio pela -amanitina a concentraes relativamente elevadas, mas a RNA polimerase III de levedura e a de insecto so insensveis a este inibidor.
Todas as trs polimerases eucariotas apresentam cinco subunidades homlogas s subunidades , , e duas da RNA polimerase procariota. A maior subunidade (RPB1) da RNA polimerase II tambm contm um domnio essencial no terminal-C (CTD). As RNA polimerase I e III contm as mesmas duas subunidades tipo e as trs no geral partilham o mesmo tipo de subunidade e quatro
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outras subunidades comuns. Para alm disso, cada uma das polimerases eucariotas contm 3 a 7 subunidades nicas mais pequenas. Um extracto proteico proveniente do ncleo de clulas eucariticas de cultura passado atravs de uma coluna Sephadex e adsorvido/eludo com uma soluo de NaCl de concentraes sucessivamente maiores (curva preta). As trs fraces obtidas subsequentemente mostram as actividades das trs RNA polimerases eucariotas (curva vermelha). Numa concentrao de 1 g/mL, a -amanitina inibe a actividade da RNA polimerase II mas no afecta as RNA polimerases I e III (sombra verde). A RNA polimerase III inibida com uma concentrao de 10 g/mL de -amanitina, enquanto que a RNA polimerase I continua inafectada mesmo com uma concentrao ainda superior.
5. Actividade da RNA polimerase II O domnio do terminal carboxilo (CTD) da RNA polimerase II composto por mltiplas repeties de uma sequncia de sete resduos (heptapptido) de Tyr-Ser-Pro-Thr-Ser-Pro-Ser. Quando se encontra em todo o comprimento, o domnio CTD nas enzimas eucariotas apresenta cerca de 65 nm de comprimento, enquanto que o CTD na polimerase humana apresenta cerca do dobro do comprimento. Este comprimento assinalvel do CTD aparentemente permite que mltiplas protenas se associem simultaneamente com uma molcula individual de RNA polimerase II. Assim, esta sequncia de heptapptido repetida um grande nmero de vezes e fosforilada durante a transcrio.
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5.1.
Complexo de iniciao de transcrio da RNA polimerase II in vitro
Para iniciar a transcrio, a RNA polimerase II necessita de vrios factores gerais de transcrio (denominados TFIIA, TFIIB, e assim por diante). O promotor contm uma sequncia de DNA denominada de TATA box, a qual est localizada a 25 nucletidos do stio no qual a transcrio iniciada. A TATA box reconhecida e ligada pelo factor de transcrio TFIID, o qual permite a ligao adjacente do TFIIB. Os restantes factores gerais de transcrio, assim como a prpria RNA polimerase, associam-se junto ao promotor. Seguidamente, o TFIIH usa ATP para separar a dupla hlice de DNA, no ponto inicial de transcrio, permitindo que a transcrio se inicie. O TFIIH tambm fosforila a RNA polimerase II, modificando a sua conformao, de tal modo que libertada dos factores gerais de transcrio e pode iniciar a fase de elongao da transcrio.
As sequncias nucleotdicas localizadas acima do local de iniciao em cerca de 900 genes eucariotas codificantes de protenas esto alinhadas para maximizar a homologia da regio desde -35 at -26. Os nmeros tabelados representam a frequncia em percentagem de cada base em cada posio. A homologia mxima ocorre numa regio de 8 bases a TATA box cuja sequncia
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consensus exibida em cima. A base inicial dos mRNAs codificados por genes contendo uma TATA box frequentemente uma A.
Para alm da TATA box, existem outras sequncias consenso que podem ser encontradas na vizinhana dos pontos iniciais da RNA polimerase II eucariota. Dois nucleotdeos separados por uma barra significam uma igual probabilidade de qualquer um deles ocorrer na posio indicada. Na maioria dos pontos iniciais de transcrio da RNA polimerase II, apenas duas ou trs das quatro sequncias esto presentes. Por exemplo, a maioria dos promotores da polimerase II tem uma sequncia TATA box, e aqueles que no a possuem, tipicamente apresentam uma sequncia INR forte. Embora a maioria das sequncias de DNA que influenciam o incio da transcrio esteja localizada acima do ponto inicial de transcrio, algumas delas, como o elemento DPE, esto localizadas na regio transcrita.
Os genes de organismos multicelulares contm tanto elementos prximos dos promotores e enhancers, como elementos promotores como a TATA box ou outros. Os elementos promotores posicionam a RNA polimerase II para iniciar a transcrio a partir do local de iniciao e, consequentemente, influenciam a taxa de transcrio. Os enhancers podem encontram-se ou acima ou abaixo e no mximo a 50 kb do local de iniciao da transcrio e, em alguns casos, encontram-se
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no interior de intres. Para outros genes, os elementos prximos dos promotores tambm podem ocorrer tanto abaixo como acima do local de iniciao. No caso dos genes de S. cerevisiae, os genes apenas contm uma regio reguladora, denominada de UAS (upstream activating sequence) e uma TATA box, que se encontra 90 pares de bases acima do local de iniciao da transcrio.
5.2.
Complexo de mediao com a RNA polimerase II
Apesar do recrutamento sequencial de cinco factores de transcrio gerais e da RNA polimerase II descrito, representar o sistema minimamente requerido para a transcrio in vitro, existem factores adicionais que so necessrios para estimular a transcrio no interior da clula. Estes factores incluem um grande complexo proteico, denominado de mediador, que consiste em mais de 20 subunidades distintas. Este complexo no s estimula a transcrio de bases como tambm desempenha um papelchave na ligao dos factores gerais de transcrio aos factores especficos para genes que regulam a expresso gnica. As protenas mediadoras esto associadas ao CTD da RNA polimerase II e so libertadas da polimerase depois do reconhecimento do complexo de pr-iniciao e da fosforilao do CTD. O CTD fosforilado activa depois outras protenas que facilitam a elongao da transcrio e vrias funes do processamento de mRNA.
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A capacidade dos enhancers funcionarem, mesmo quando se encontram separados por grandes distncias dos locais de iniciao da transcrio foi inicialmente sugerida devido sua capacidade de trabalhar por mecanismos diferentes dos promotores. No entanto, isto foi rejeitado na medida em que os enhancers, tal com os promotores, funcionam por activao de factores de transcrio que podem regular a RNA polimerase. Isto possvel atravs do DNA looping, que permite que um factor de transcrio se ligue a um enhancer distante para interagir com protenas associadas com a RNA polimerase/complexo mediador junto do promotor. Consequentemente, os factores de transcrio podem funcionar com os mesmos mecanismos com que funcionam quando ligados a promotores, no havendo nenhuma diferena fundamental entre as aces dos enhancers e das sequncias reguladores adjacentes aos locais de iniciao da transcrio.
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Um aspecto importante dos enhancers que, frequentemente, eles podem conter mltiplas sequncias funcionais que activam diferentes protenas reguladoras da transcrio, que actuam juntas para regular a expresso gnica. O enhancer da imunoglobulina de cadeia pesada, por exemplo, engloba aproximadamente 200 pares de bases e contm, pelo menos, nove sequncias distintas que actuam como locais de activao de protenas. A mutao de qualquer de uma destas sequncias reduz mas no elimina a actividade do enhancer, indicando que as funes das protenas individuais que se ligam ao enhancer so, pelo menos parcialmente, redundantes.
6. Processamento de mRNA eucariota Ao contrrio dos rRNA e tRNA, o processamento do mRNA apresenta uma maior diferena entre clulas eucariticas e procariticas. Nas bactrias, os ribossomas tm imediatamente acesso ao mRNA e a traduo comea na cadeia nascente de mRNA, mesmo enquanto a transcrio ainda est a ocorrer. Nos seres eucariotas, o mRNA sintetizado no ncleo tem de ser primeiro transportado para o citoplasma antes de poder ser utilizado como molde para a sntese proteica. Para alm disso, os produtos iniciais da transcrio nas clulas eucariotas (pr-mRNAs) so extensivamente modificados antes de serem exportados do ncleo. O processamento do mRNA inclui a modificao de ambas as extremidades do transcrito inicial, bem como a remoo de intres do seu interior. Os processos principais so o capping, o splicing e a poliadenilao.
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6.1.
Capping
A transcrio inicia-se com um nuclesido trifosfato. O primeiro nucletido retm o seu grupo 5- trifosfato e estabelece a normal ligao fosfodister desde a sua posio 3 at posio 5 do nucletido seguinte. Quando o mRNA maduro tratado in vitro com enzimas que o deviam degradar para nucletidos individuais, a extremidade 5 no expe o nuclesido trifosfato. Desta forma, contm dois nucletidos ligados por uma ligao 5-5 trifosfato e tambm por grupos metilo agora adicionados. A base terminal sempre uma guanina que adicionada ao RNA original depois da transcrio. A adio do terminal G extremidade 5 catalizada por uma enzima nuclear, a guanidil transferase. Esta reaco ocorre to perto do incio da transcrio que se torna impossvel a deteco de algo mais para alm de quantidades do 5-trifosato do RNA nuclear. A reaco total pode ser representada como uma condensao entre um GTP e o terminal original 5-trifosfato do mRNA. Consequentemente, o novo resduo guanlico adicionado extremidade do RNA, apresenta orientao contrria de todos os outros nucletidos, sendo designado por cap que actua como substrato para vrios eventos de metilao.
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6.2.
Clivagem e poliadenilao
A formao de uma estrutura terminal na extremidade 3 adequada requer: Endonuclease que consiste nos componentes CFI e CFII, para cortar o RNA. Poli-A polimerase (PAP) que sintetiza a cauda poli-A. Componente de especificade (CPSF) que reconhece a sequncia AAUAAA e comanda as restantes actividades. Factor de estimulao (CstF) condiciona a ligao de que uma sequncia rica em nucletidos de G e U, que se encontra depois do local de clivagem. O factor de especificidade contm quatro subunidades, que quando se encontram juntas se ligam especificamente aoRNA que contm a sequncia AAUAAA. As subunidades individuais so protenas que apresentam vrias sequncias de ligao ao RNA, mas que no se ligam obrigatria e especificamente a essas molculas. As interaces proteicas que existem nas subunidades podem ser necessrias para gerar o local especfico de ligao da sequncia AAUAAA. O CPSF liga-se fortemente a essa sequncia, mas s quando o CstF se encontra presente para se ligar sequncia rica em G-U. O factor de especificidade requerido tanto para a reaco de clivagem como para a reaco de poliadenilao. Geralmente, existe num complexo com uma endonuclease e com uma poli-A polimerase, que comanda a clivagem seguida de poliadenilao. Os dois componentes, o CFI e o CFII (cleavage factors I e II), quando se encontram juntos com o factor de especificidade, so necessrios e suficientes para a clivagem endonucletica. A poli-A polimerase apresenta uma actividade cataltica no especfica. Quando se encontra combinada com outros componentes, a reaco de sntese torna-se especfica para o RNA que contm a sequncia AAUAAA. A reaco de poliadenilao ocorre em duas fases. Em primeiro lugar, uma sequncia oligossacardica relativamente pequena adicionada extremidade 3, numa reaco absolutamente dependente da sequncia AAUAAA, sendo que a poli-A polimerase a completa, no sentido do factor de especificidade. Na segunda fase, a cauda oligo-A aumentada em cerca de 200 resduos de comprimento. Esta reaco requer outro factor de estimulao que reconhece a cauda oligo-A e direcciona a poli-A polimerase especificamente para a extenso da extremidade 3. A poli-A polimerase adiciona resduos adenlicos individualmente extremidade 3. O modo intrnseco de actuao desta enzima distributivo, porque se dissocia aps a adio de cada nucletido. No entanto, AULA 8 Transcrio do mRNA 79
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na presena do CPSF e da PABP (poly-A binding protein), a enzima actua processivamente para prolongar uma cadeia poli-A individual. O comprimento da cauda poli-A controlado pela PABP, que em certo ponto, limita a aco da poli-A polimerase adio de 200 resduos adenlicos, sendo que este limite pode representar uma acumulao crtica de PABPs na cadeia poli-A. Desta forma, a PABP liga-se ao factor de iniciao da transcrio eIF4G, e consequentemente gera uma terminao da cadeia, onde o complexo proteico contm as duas extremidades 5 e 3 do mRNA.
6.3.
Splicing
O processamento do mRNA nos eucariotas requer a formao de uma estrutura especfica denominada spliceossoma e requer tambm o comprimento de determinadas regras que existem e que se caracterizam na sequencia do intro. Existe um intro que tem de ser removido e para que essa remoo tenha sucesso, na regio intrnica da extremidade 5 tem de existir GU e na extremidade 3 tem de existir AG. Alm disso, existe uma regio a 500 pares de bases da extremidade 3 que rica em pirimidinas e tambm um ponto de ramificao. Se houver modificaes que interferem nas duas bases que delimitam o intro, no se consegue remov-lo. Tendo por base as regras de splicing que tm de existir, o processamento no ocorre sem a presena de outros RNA, como os snRNAs sintetizados pela RNA polimerase II.
Os locais de splicing das extremidades 5 e 3 e a sequncia entre elas so reconhecidos pelos componentes do aparelho de splicing que se forma para originar um complexo de grandes dimenses. Este complexo junta os locais de splicing das duas extremidades antes da ocorrncia de qualquer reaco. O complexo rene-se sequencialmente com o pr-mRNA, e vrios intermedirios podem ser reconhecidos por complexos fraccionados de diferentes dimenses. Desta forma, o fenmeno de splicing ocorre aps todos os componentes estarem reunidos e agregados. O aparelho de splicing contm protenas e RNAs, para alm do pr-mRNA. Os RNAs adquirem a forma de pequenas molculas que existem como ribonucleoprotenas. Tanto o ncleo como o citoplasma das clulas eucariticas contm vrias espcies discretas de pequenos RNAs. Eles variam no seu tamanho, podendo apresentar entre 100 e 300 bases nos eucariotas superiores e cerca de 1000 bases nos eucariotas inferiores.
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6.3.1.
Splicing e o spliceossoma
Com apenas algumas excepes, a maior parte dos genes que codificam para as protenas nos eucariotas superiores contm sequncias no codificantes, os intres, intercalados nas sequncias codificantes, os exes. O splicing consiste, ento, na exciso/reparao das cadeias dos respectivos produtos primrios da transcrio. O conjunto dos precursores do mRNA nucleares, que incluem as formas que se encontram nas diferentes fases de maturao, constituem o RNA heterogneo nuclear (hnRNA). Este no se encontra livre no nucleoplasma, mas sim associado a protenas, sob forma de partculas ribonucleoproteicas que, no citoplasma, contm os mRNA maduros, aptos a ser traduzidos pelos ribossomas. Em unidades pequenas de transcrio, o fenmeno de splicing segue, normalmente, a poliadenilao da extremidade 3, enquanto que em maiores unidades de transcrio, contendo um grande nmero de exes, o splicing s se inicia quando a transcrio de todo o gene termina. Splicing dos precursores dos mRNA A eliminao das sequncias intrnicas presentes nos produtos primrios da transcrio dos genes mRNA d-se mediante formao de estruturas em ansa no RNA transcrito, atravs de um mecanismos de transesterificao com formao de uma ligao 2-5 fosfodister entre o resduo adenlico do stio de ligao do pr-mensageiro e o grupo fosfato do resduo guanlico da extremidade 5 do intro. Existem, no ncleo das clulas, pequenos RNA, os snRNA (small nuclear RNA), que so constitudos por menos de 300 nucletidos, em cuja composio predominam resduos urdlicos. Estes encontram-se associados a protenas, formando partculas chamadas snRNP (small nuclear ribonucleoproteins) s quais cabe um papel no processo de eliminao dos intres da cadeia de RNA do produto primrio da transcrio. Nos eucariontes, a partcula U1-snRNP fixa-se ao stio da clivagem, delimitado pela extremidade 5 do intro, devido complementar estrutural com uma sequncia do U1RNA. O complexo U2snRNP fixa-se ao stio de ligao e ao nvel da sequncia de pirimidinas que se encontram a montante do stio de clivagem, na extremidade 3 do intro, enquanto a partcula U5-snRNP reconhece o prprio stio de clivagem em 3. A ligao entre as protenas U1 e U2 leva aproximao das extremidades 5 e 3 do intro, facilitando a segunda reaco de transesterificao necessria ligao entre os dois exes. Actuam em seguida os complexos U4 e U6-snRNP associados numa partcula dotada da capacidade de formar um complexo com o precursor do mRNA, de grandes dimenses, o spliceossoma. AULA 8 Transcrio do mRNA 81
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6.3.2.
Protenas SR
O comprimento mdio de um exo no genoma humano de aproximadamente 150 bases, enquanto que o comprimento de um intro muito superior, com cerca de 3500 bases. Tendo em conta que as sequncias dos locais de splicing 5 e 3 e que os pontos de ramificao so to degenerados, ento podem ocorrer mltiplas cpias aleatoriamente em intres de grande comprimento. Consequentemente, torna-se necessria uma informao para sequncia adicional para definir os exes que devem ser colocados juntos em organismos com intres de grandes dimenses. O mecanismo mais sofisticado para o reconhecimento de exes encontra-se na famlia das RNA binding proteins, as protenas SR, que interagem com sequncias no interior dos exes denominadas de exonic splicing enhancers. As protenas SR so caracterizados por terem um ou mais domnios RRM e vrias domnios de interaco proteica ricos em resduos de serina e arginina. Quando ligados a enhancers de splicing, as protenas SR mediam a ligao cooperativa da snRNP U1 a um local verdadeiro de splicing da extremidade 5e a snRNP U a um ponto de ramificao atravs da rede de interaces proteicas que existem ao longo do exo. O complexo de protenas SR, snRNPs e outros factores de splicing que atravessam um exo, designado por cross-exon recognition complex e permite a especificao precisa dos exes em longas molculas de pr-mRNAs.
A atrofia muscular espinhal uma das causas genticas mais comuns de morte infantil. Esta doena resulta de mutaes numa regio do genoma que contm dois genes prximos relacionados entre si SMN1 e SMN2 que surgem da duplicao de genes. O SMN2 codifica uma protena idntica ao SMN1 mas expressa num nvel muito inferior devido a uma mutao silenciosa num dos exes, que interfere com a ligao de uma protena SR e conduzindo a uma passagem de um exo em grande dos mRNAs com SMN2. O gene homlogo ao SMN no ratinho, onde apenas existe uma nica cpia, essencial para a viabilidade celular. A atrofia muscular espinhal nos humanos resulta de mutaes homozigticas que inactivam o SMN1. A baixa quantidade de protena traduzida a partir de uma pequena fraco dos mRNAs com SMN2 que sofrem um splicing correcto, suficiente para manter a viabilidade celular durante a embriognese e o desenvolvimento fetal, mas no suficiente para manter a viabilidade dos neurnios motores do cordo espinhal durante a infncia, resultando na sua morte aps a doena associada.
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6.3.3.
Self-Splicing
O papel cataltico dos RNAs no splicing foi demonstrado pela descoberta de que alguns RNAs so capazes de efectuar um self-splicing, ou seja, conseguem catalisar a remoo dos seus prprios intres na falta de algumas protenas ou factores de RNA. Nos intres de grupo I, o primeiro passo a clivagem do local da extremidade 5 pela reaco com um cofactor de guanosina. Como resultado, surge um intermedirio linear com um resduo G adicionado extremidade 5 do intro. Nos intres do grupo II (tal como no splicing de pr-mRNAs), o primeiro passo a clivagem do local da extremidade 5 por uma reaco com um resduo A no interior do intro, formando um intermedirio de forma semelhante a um lao. Em ambos os casos, o segundo passo a clivagem simultnea do local da extremidade 3 e a ligao dos exes.
6.3.4.
Splicing alternativo
O gene da fibronectina que apresenta aproximadamente 75 kb contm mltiplos exes. Os exes EIIIB e EIIIA (verde) codificam domnios de ligao para protenas especficas na superfcie dos fibroblastos. O mRNA da fibronectina produzido em fibroblastos inclui os exes EIIIA e EIIIB, fazendo com que estes exes sejam cortados do mRNA da fibronectina nos hepatcitos. Neste diagrama, os intres (linhas pretas) no esto desenhados escala, pois grande parte deles so muito maiores que qualquer um dos exes.
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7. Transporte dos mRNA atravs do complexo de poro nuclear
De todo o pr-mRNA sintetizado, apenas uma pequena fraco o mRNA maduro ser utilizada posteriormente pela clula. O restante intres excisados, RNAs quebrados e formas de pr-mRNAs que sofrem splicing anorma no apenas deixam de ser utilizados como podem ser perigosos, se no forem destrudos. O transporte de mRNA do ncleo para o citoplasma, onde poder ser traduzido para uma protena, altamente selectivo e est fortemente associado ao processamento correcto de RNA. Esta associao alcanada pelo complexo de poro nuclear, que reconhece e transporta apenas mRNAs completos. Conforme uma molcula de pr-mRNA sintetizada e processada, ela liga-se a uma srie de protenas, incluindo o complexo de ligao membrana, s protenas SR e s protenas de ligao da cauda de poli-A. Para estar pronto para a exportao, um determinado mRNA, provavelmente, deve estar ligado a um grupo apropriado de protenas com a presena de determinadas protenas, tais como o complexo de ligao membrana, e a ausncia de outras protenas, como as snRNPs. As protenas adicionais, posicionadas sobre o RNA durante o splicing, parecem marcar as junes exo a exo e, desta forma, identificam os eventos completos de splicing. Os complexos de poro nuclear so canais aquosos na membrana nuclear que conectam directamente o nucleoplasma e o citosol. As pequenas molculas podem livremente difundir-se atravs deles. Entretanto, a maioria das macromolculas nas clulas, incluindo os mRNAs complexados a protenas, grande demais para passar atravs dos poros, sem a interveno de um processo especial. Um transporte activo de substncias atravs dos complexos do poro nuclear ocorre em ambas as direces e, sinais na macromolcula determinam se ela ser exportada do ncleo ou importada para este. No caso dos mRNAs, as protenas de ligao que marcam eventos completos de splicing tm uma importncia destacada, visto sabermos que elas servem directamente como factores de exportao de RNA. A exportao dos complexos de mRNA protenas a partir do ncleo pode ser observada ao microscpio electrnico para os raramente abundantes mRNAs dos genes de um insecto. Conforme 84 AULA 8 Transcrio do mRNA
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esses genes so transcritos, o RNA recm-formado pode ser observado a ser empacotado por protenas, sendo que entre elas esto as protenas SR e hnRNPs. Este complexo protena-RNA sofre uma srie de transies estruturais, provavelmente reflectindo eventos de processamento de RNA e culminando numa fibra curva.
Essa fibra curva move-se, ento, atravs do nucleoplasma, penetra no complexo de poro nuclear (sendo a extremidade 5 a primeira a entrar) e sofre outra srie de transies estruturais, enquanto se move atravs do NPC. Essas e outras observaes revelaram que o pr-mRNA-protena e os complexos mRNA-protena so estruturas dinmicas que podem adquirir e perder numerosas protenas especficas durante a sntese, o processamento, a exportao e a traduo do RNA.
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AULA 9 Transcrio do tRNA e rRNA
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1. Tipos de RNA A maioria dos genes transportados no DNA das clulas especifica a sequncia de aminocidos de protenas: RNA mensageiro (mRNA) molculas de RNA que so copiadas a partir desses genes de DNA que especificam a sequncia de aminocidos das protenas. RNA de transferncia (tRNA) formam os adaptadores que seleccionam aminocidos e os colocam no local adequado dos ribossomas para serem incorporados em protenas. RNA ribossmico (rRNA) formam o cerne dos ribossomas. RNA nuclear (snRNA) direccionam o splicing do pr-RNA para formar o mRNA. RNA nucleolar (snoRNA) utilizados para processar e modificar quimicamente os rRNAs. Outros RNA no codificantes actuam em diversos processos celulares, incluindo a sntese de telmeros, a inactivao do cromossoma X e o transporte de protenas para o retculo endoplasmtico.
2. rRNA O rRNA sintetizado pela RNA polimerase I que tem localizao nucleolar, onde existe um componente de regio mais densa e outro componente de regio mais granular, sendo que tambm dentro do nuclolo que o ribossoma adquire maior estado de maturao. O nuclolo a estrutura mais facilmente identificada no ncleo de uma clula eucaritica, quando observada em microscopia ptica. Consequentemente, foi muito analisada pelos primeiros citologistas, a ponto de uma reviso antiga listar aproximadamente 700 referncias. Actualmente, sabe-se que o nuclolo a regio onde ocorre o processamento de rRNAs e a sua organizao sob a forma de ribossomas. Diferentemente de outros organelos celulares, o nuclolo no se encontra delimitado por uma membrana, mas sim como um grande agregado de macromolculas, incluindo-se os prprios genes de rRNA, rRNAs precursores, rRNAs maduros, enzimas processadoras de rRNAs, snoRNPs, subunidades proteicas ribossomais e ribossomas parcialmente formados. A ntima associao de todos esses componentes presumivelmente permite que a formao dos ribossomas ocorra rapidamente e sem erros. Os rRNAs 28S e 5.8S associados na subunidade ribossmica maior (60S) e o rRNA 18S associado na subunidade ribossmica menor (40S) so codificados por um nico tipo de unidade de transcrio de pr-rRNA. A AULA 9 Transcrio do tRNA e rRNA 87
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transcrio pela RNA polimerase I leva produo de um transcrito primrio 45S (pr-rRNA) que processado para os rRNAs 5.8S, 18S e 28S encontrados nos ribossomas citoplasmticos. A sequenciao de DNA para codificar pr-rRNA a partir de vrias espcies mostrou que o DNA partilha vrias propriedades em todos os eucariotas. Primeiro, os genes do pr-rRNA esto organizados em longos tandem arrays separados por regies no transcritas de comprimentos entre cerca de 2 Kb e 30 Kb. Para alm disso, as regies genmicas correspondentes aos trs rRNAs maduros so sempre organizadas na mesma ordem de 5 para 3: 18S, 5.8S e 28S. Por fim, em todas as clulas eucariticas (e mesmo nas bactrias), o gene do pr-rRNA codifica para, e o transcrito primrio correspondente contm, regies que so removidas durante o processamento e que so, depois, rapidamente degradadas. A estrutura geral do pr-rRNA mostrada abaixo.
3. Tandem arrays Nos vertebrados e invertebrados, os genes codificantes de rRNAs e outros RNAs no codificantes como os snRNAs envolvidos no splicing de RNAs so designados por tandem arrays. Estas so distintas dos genes duplicados, em que os genes repetidos codificam protenas idnticas ou proximamente idnticas ou RNAs funcionais. Grande parte das cpias de uma sequncia aparece imediatamente depois de uma sequncia j formada atravs de uma ligao cabea-cauda, ao longo de um grande fragmento de DNA. No interior dos genes dos tandem arrays, cada cpia exactamente, ou quase exactamente, igual s restantes. Assim, apesar de as pores transcritas dos genes de rRNA serem as mesmas num dado indivduo, as regies no transcritas que possam existir l intercaladas, podem variar. Os genes dos tandem arrays so necessrios para encontrar as necessidades dos transcritos. Considerando que um nmero fixo e mximo de cpias de RNA pode ser produzido a partir de um nico gene durante uma gerao celular, quando o gene se encontra completamente cheio de molculas de RNA polimerase, ento se necessrio mais RNA do que o que seria transcrito a partir de um gene, vrias cpias daquele gene tambm vo ser necessrias. Por exemplo, durante o desenvolvimento embrionrio inicial dos seres humanos, vrias clulas embrionrias apresentam um perodo de duplicao de cerca de 24 horas e contm cerca de 5 a 10 milhes de ribossomas. Para produzir rRNA suficiente para formar esta quantidade de ribossomas, uma clula embrionria humana precisa, no mnimo, de 100 cpias dos genes das subunidades maior e menor do RNA, e grande parte delas tem de estar perto de uma actividade mxima para a clula se dividir correctamente em cada 24 horas.
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4. Complexo de iniciao da transcrio com RNA polimerase I A RNA polimerase I actua apenas na transcrio de genes ribossomais, que so presentes nos tandem arrays. A transcrio destes genes d origem a um grande pr-rRNA 45S, que depois processado para formar os rRNAs 28S, 5.8S e 18S. Os promotores dos genes do RNA ribossomal encontram-se apenas cerca de 150 pares de bases acima dos locais de iniciao da transcrio. Estas sequncias promotoras so reconhecidas por dois factores de transcrio, UBF (upstream binding factor) e SL1 (selectivity factor 1), que se ligam cooperativamente ao promotor para depois recrutarem a RNA polimerase I para formar o complexo de iniciao.
O factor de transcrio SL1 composto por quatro subunidades proteicas, sendo que uma delas a TBP. Desde que os promotores dos genes do RNA ribossmico no contenham a TATA box, a TBP no se liga ao promotor especfico. Assim, em vez disso, a associao entre a TBP e os genes do RNA ribossmico mediada pela ligao de outras protenas ao complexo SL1 para o promotor, exibindo uma situao semelhante que acontecia na associao da TBP as sequncias Inr nos genes da RNA polimerase II. AULA 9 Transcrio do tRNA e rRNA 89
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A UCE o upstream control element que se encontra entre -155 e -60 e uma sequncia de nucleotdeos que se encontra nesta posio, considerando que o local +1 o primeiro nucletido a ser incorporado na molcula. Tambm existe o core element que se localiza entre -40 e +5 e que, consequentemente, coincide com o local de incio da transcrio para a RNA polimerase. Assim, vai permitir a ligao do UBF e do SL1 referidos anteriormente, para que se possa criar o complexo de transcrio e iniciar o processo.
4.1. Complexo de iniciao da transcrio com RNA polimerase I na levedura Os elementos reguladores que comandam a iniciao com a RNA polimerase I esto localizados relativamente perto do local de iniciao da transcrio. Um core element estendese sobre o local de iniciao desde -40 a +5, sendo essencial para a transcrio. Um elemento de avano na cadeia estendese tambm desde -155 a -60, estimulando a transcrio in vitro pela RNA polimerase I. A formao de um complexo de iniciao totalmente activo com a RNA polimerase I comea com a ligao de um factor multimrico de activao (UAF). Duas das seis subunidades que compem o UAF so histonas que provavelmente participam na ligao do DNA. Seguidamente, um elemento trimrico liga-se ao elemento central com a TBP, que cria contacto tanto com o UAF como com o factor central. Finalmente, um complexo pr-formado com RNA polimerase I e Rrn3p associa-se com protenas de ligao, posicionando a RNA polimerase I junto aos locais de iniciao. Em clulas humanas, o TBP estavelmente ligado a outros trs polipptidos, formando o factor de iniciao SL1 que liga o promotor central e funcionalmente equivalente ao TBP.
5. Processamento de rRNA Existem quatro tipos de rRNAs eucariticos, cada um representado no ribossoma por uma cpia. Trs destes quatro rRNAs (18S, 5.8S, 28S) so sintetizados por meio de modificaes qumicas e de clivagem de um nico grande precursor de rRNA. O quarto (5S) sintetizado a partir de um grupo separado de genes, por uma polimerase diferente, a RNA polimerase III, e no necessita de modificaes qumicas, sendo que ainda no se conhecem as razes porque isto acontece.
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Os processamentos bsicos para os rRNAs e tRNAs nas clulas eucariticas e procariticas similar, tal como se esperava tendo em conta os papis fundamentais destes RNAs na sntese proteica. Em vez de ocorrer um processo de splicing tal como acontecia no mRNA, aqui ocorrem, principalmente, mecanismos de clivagem em que as regies no codificantes so removidas por corte. Assim, s quase quando se completa a transcrio que se inicia o processamento. Tal como j foi referido anteriormente, o transcrito primrio para os genes de rRNA nos eucariotas o pr-rRNA 45S, que contm tanto os rRNAs 18S, 5.8S e 28S bem como regies intercalares previamente transcritas. Estas sequncias externas encontram-se tanto na extremidade 5 do rRNA como na extremidade 3, sendo que as internas se encontram entre as trs sequncias de rRNA. Os primeiros passos no processamento deste transcrito so clivagens na sequncia transcrita da extremidade 5 do pr-rRNA e a remoo da sequncia transcrita da extremidade 3. Clivagens adicionais resultam, depois, na formao de rRNAs maduros. O processamento segue, ento, um padro similar em todos os eucariotas, apesar de poderem existir diferenas na ordem ou no nmero de clivagens. Para alm das clivagens, o processamento do pr-mRNA tambm envolve uma quantidade substancial de modificao de bases, resultante tanto da adio de grupos metilo a bases especficos e resduos de ribose, bem como da converso de uridina em pseudo-uridina. As subunidades do ribossoma s tm amadurecimento final no citoplasma, sendo que as molculas que integram a subunidade maior tambm sofrem clivagem em vias alternativas. Todos os produtos da clivagem so sempre degradados por exossomas como Xrn e Rat1. Desta forma, depois da primeira interveno destes exossomas, forma-se um 33S que ao sofrer uma clivagem numa das sequncias intercaladas entre os rRNAs vai originar o 32S, ltima molcula, antes de haver diviso do rRNA. Daqui resulta um 20S que com exportao nuclear e clivagem citoplasmtica vai dar origem ao fragmento 18S. Simultaneamente, vo ocorrendo sucessivas clivagens e aces de exonucleases a partir da sequncia paralela 27SA2, at se formar, em 85% dos casos o 27SBS e em 15% dos casos o 27SBL. A partir deste momento, apenas um dos caminhos prossegue, mas ocorrem as mesmas modificaes em ambos os casos, havendo a aco de uma clivagem que forma o fragmento 25S e um fragmento 7S que, por sua vez, vai originar por exonucleases, o fragmento 5.8S.
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6. snoRNAs e snoRNPs Alguns snoRNAs so responsveis pelas clivagens efectuadas no prrRNA para formar fragmentos 18S, 5.8S e 28S. Por exemplo, o snoRNA mais abundante o U3, que est presente em cerca de 200.000 cpias por clula e necessrio para a clivagem do pr-rRNA nas sequncias transcritas da extremidade 5. Similiarmente, o U8 necessrio para a clivagem do pr-rRNA para formar fragmentos 5.8S e 28S e o U22 para o 18S. Grande parte dos snoRNAs, no entanto, actuam na sntese de rRNA como guia dos RNAs para direccionar as modificaes especficas de bases do pr-rRNA, incluindo a metilao de resduos especficos de ribose e a formao de pseudo-uridinas. A maior parte dos snoRNAs contm pequenas sequncias de aproximadamente 15 nucletidos que so complementares aos rRNAs 18S e 28S, sendo que estas regies de complementaridade contm locais de modificao de bases no rRNA. Atravs do emparelhamento
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de bases com regies especficas do pr-rRNA, os snoRNAs actuam como RNAs guias que atingem as enzimas responsveis pela metilao da ribose ou pela pseudouridilao para os locais correctos da molcula de prmRNA.
Ocorrem extensivas modificaes qumicas no precursor,com cerca de 13.000 nucletidos de comprimento, antes que os rRNAs sejam clivados a partir deste, e montados sob a forma de ribossoma. Essas modificaes incluem aproximadamente cem metilaes das posies 2-OH nos acares nucleotdicos e cem isomerizaes de nucleotdeos de uridina para pseudo-uridina.
As funes destas modificaes no so conhecidas em detalhe, mas provavelmente auxiliam a dobra e a unio dos rRNAs finais e podem tambm alterar sensivelmente a funo dos ribossomas. Cada modificao realizada numa posio especfica no rRNA precursor. Essas posies so determinadas por muitas centenas de RNAs guias, que se posicionam, pelo emparelhamento de bases, sobre o rRNA precursor e, assim, trazem uma enzima modificadora de RNA posio apropriada. Outros RNAs guias promovem a clivagem do precursor de rRNA em rRNAs maduros, provavelmente por causarem modificaes conformacionais no rRNA precursor. Todos esses rRNAs guias so membros de uma grande classe de RNAs denominada de snoRNAs, assim denominados porque realizam as suas funes num subcompartimento do ncleo, o nuclolo.
7. Estrutura do ribossoma Cada uma das subunidades ribossmicas contm uma molcula principal de rRNA e um variado nmero de pequenas protenas. No caso dos seres procariticas, a subunidade pequena (30S) consiste no 16S rRNA e em 21 protenas-r. A subunidade grande (50S) consiste no 23S rRNA, no 5S RNA e em 31 protenas-r. Com a excepo de uma protena presente em quatro cpias por ribossoma, todas as outras s se encontram numa nica cpia. As molculas maiores de rRNA constituem a grande parte da massa do ribossoma procariota. A sua presena extremamente importante, e propriamente a maior parte das protenas ribossmicas contactam, actualmente, com o rRNA. Desta forma, estas partculas foram o que geralmente designado por esqueleto de cada subunidade, que constitui uma linha contnua que determina a posio das protenas ribossmicas. No caso dos ribossomas eucariticas, estes apresentam maiores dimenses que os procariotas, pois o contedo total de rRNA e protenas superior, as molculas principais de rRNA so maiores e existem mais protenas-r. Desta forma, a subunidade maior (60S) contm o 28S, o 5.8S e o 5S rRNAs mais 49 protenas e a subunidade menor (40S) contm o 18S rRNA e 33 protenas. AULA 9 Transcrio do tRNA e rRNA 93
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8. Formao do ribossoma A formao dos ribossomas envolve a formao de um precursor de RNA ribossmico com as duas protenas ribossmicas e o 5S rRNA. Os genes que codificam as protenas ribossmicas so transcritos forma do nuclolo pela RNA polimerase II produzindo mRNAs que so traduzidos nos ribossomas citoplasmticos. As protenas ribossmicas so, depois, transportadas do citoplasma para o nuclolo onde so reunidas com os rRNAs para formar partculas pr-ribossmicas. Apesar de os genes para o 5S rRNA tambm serem transcritos fora do nuclelo neste caso, pela RNA polimerase III os 5S rRNAs so similarmente reunidos em partculas pr-ribossmicas no interior do nuclolo.
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A associao de protenas ribossmicas com o rRNA comea enquanto o pr-rRNA ainda est a ser sintetizado, e mais de metade das protenas ribossmicas esto complexadas com o pr-rRNA antes de ser clivado. As protenas ribossmicas restantes e o 5S rRNA so incorporados nas partculas prribossmicas medida que a clivagem do pr-rRNA decorre. Na fase inicial da formao dos ribossomas, separa-se o processamento de duas subunidades ribossmicas nascentes. O processamento da subunidade mais pequena, que contm apenas o 18S rRNA, mais simples e envolve apenas quatro clivagens endonuclesicas. Nos eucariotas, este processo completo no interior do nuclolo mas nas leveduras, a clivagem final para formar o 18S rRNA maduro ocorre depois da exportao da subunidade 40S para o citosol. Por sua vez, o processamento da subunidade maior, que contm os 28S, 5.8S e 5S rRNAs, envolve extensas clivagens nuclesicas e completa no interior do nuclolo. Consequentemente, grande parte das partculas pr-ribossmicas no nuclelo representam precursores da subunidade maior do ribossoma, 60S. As fases finais da maturao dos ribossomas seguem a exportao das partculas pr-ribossmicas para o citoplasma, formando as subunidades activas 40S e 60S dos ribossomas eucariticos.
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9. Transcrio pela RNA polimerase III Vrios estudos demonstraram que a deleco das sequncias de DNA que esto a montante do local de incio da transcrio pela RNA polimerase III no afectam a sua actividade. A RNA polimerase III ligava-se sempre com o DNA independentemente de estar ou no presente a regio que precede o local de ligao da enzima. Como h sequncias consenso que inactivadas levam ao reconhecimento dos principais transcritos de rRNA, ento se houver RNA polimerase III, existem promotores que no esto a montante mas sim dentro da regio da molcula.
9.1. Complexo de iniciao da transcrio pela RNA polimerase III Ao contrrio dos genes codificantes de protenas e genes de pr-mRNA, as regies promotoras do tRNA e do 5S-RNA contradizem inteiramente a sequncia transcrita. Dois elementos promotores internos, designados por A-box e B-box, esto presentes em todos os genes do tRNA. Estas sequncias altamente conservadas no s funcionam como promotores como tambm codificam duas pores invariantes de tRNA eucariota que so necessrias para a sntese proteica. Nos genes do 5S-RNA, apenas existe uma sequncia promotora interna, a C-box. Existem trs factores de transcrio que so necessrios para a RNA polimerase III iniciar a transcrio do tRNA e do 5S-RNA in vitro. Dois factores multimricos, TFIIIC e TFIIIB participam na iniciao do promotor do tRNA e do 5S-RNA; um terceiro factor, o TFIIIA necessrio para a iniciao dos promotores do 5S-RNA exclusivamente. Tal como acontecia nos complexos de iniciao da RNA polimerase I e II, os factores de transcrio da RNA polimerase III ligam-se ao promotor do DNA em sequncias especficas. A metade terminal-N de uma subunidade do TFIIIB, denominado BRF, semelhante sequencialmente ao TFIIB (um factor de transcrio da RNA polimerase II). Esta semelhana sugere que o BRF e o TFIIB apresentem tambm funo semelhante na iniciao, nomeadamente, para direccionar a polimerase para o local de iniciao correcto. Assim que o TFIIIB esteja ligado a um gene de tRNA ou 5SRNA, a RNA polimerase III pode ligar-se e iniciar o processo de transcrio na presena de trifosfatos ribonucleosdicos. A subunidade BRF do TFIIIB interage especificamente com uma das subunidades da polimerase, tendo em conta a iniciao para esta RNA polimerase especfica. Outra das trs subunidades que constituem o TFIIIB o TBP que surge aqui como componente principal dos factores de transcrio para as 3 RNA polimerases eucariticas.
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10. tRNA Numa molcula de mRNA, os codes no reconhecem directamente os aminocidos que determinam, por exemplo, o grupo de trs nucletidos no se liga directamente ao aminocido. Mais exactamente, a traduo do mRNA em protena depende de molculas adaptadoras que podem reconhecer e se liguem ao codo, e noutra regio da sua superfcie, ao aminocido. Estes adaptadores consistem de um conjunto de pequenas molculas de RNA conhecido como RNA de transferncia (tRNA), cada um com tamanho de aproximadamente 80 nucletidos. As molculas de RNA podem dobrar-se em estruturas tridimensionais estabelecidas com alta preciso, e as molculas de tRNA fornecem um extraordinrio exemplo disso. Quatro pequenos segmentos do tRNA dobrado formam a dupla hlice, produzindo uma molcula que se assemelha a uma folha de trevo quando desenhada esquematicamente. Por exemplo, uma sequncia 5-GCUC-3 numa regio da cadeia polinucleotdica pode formar uma associao relativmente forte com uma sequncia 5-GAGC-3 noutra regio da mesma molcula. A folha de trevo submetida ainda a outras dobras para formar uma estrutura compacta em forma de L que mantida unida por meio de pontes de hidrognio adicionais entre diferentes regies da molcula. Todas as molculas de tRNA apresentam estruturas secundrias e tercirias. A estrutura secundria pode ser expressa na forma de folha de trevo, em que as bases complementares emparelham, formando loops, designados braos do tRNA. As suas sequncias incluem bases pouco usuais que geralmente so obtidas por modificao de quatro bases normais depois da sntese da cadeia polinucleotdica. Os principais quatro braos que existem na estrutura do tRNA so: Brao aceitador consiste num conjunto de bases emparelhadas que termina numa sequncia no emparelhada, em que o 2-OH ou o 3-OH livre pode ser ligado ao aminocido.
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Braco TC designado desta forma devido presena deste tripleto em que o representa a pseudouridina base modificada. Braco anticodo contm sempre o tripleto de anticodo no centro do loop. Brao D designado desta forma porque contm a base dihidrouridina base modificada. Brao extra contm entre 3 e 21 bases e est entre os braos TC e anticodo.
10.1. Processamento do pr-Trna
Ao longo do processamento deste tipo de RNA existem trs principais etapas correspondentes a trs molculas diferentes: um transcrito primrio, um intermedirio e um maduro. O transcrito primrio, por sua vez, sofre trs modificaes sucessivas de bases, sendo duas clivagens e uma adio. Inicialmente, a RNase P remove a extremidade 5 leader da cadeia, depois a RNase D remove a extremidade 3 trailer, e por fim adicionada uma sequncia CCA na extremidade 3. A molcula obtida vai ser designada por transcrito intermedirio. Esta molcula vai ser alvo do processo de splicing, sendo que o objectivo a remoo de sequncias intrnicas que existem num dos loops. Por fim, a molcula final obtida vai ser o transcrito maduro de pr-tRNA que vai seguir o processo de processamento.
10.2. Processamento do tRNA Os produtos da clivagem do tRNA so um intro de estrutura linear e duas molculas que consistem em metade da molcula de tRNA, todas elas com extremidades caractersticas. Cada extremidade 5 termina num grupo OH e cada extremidade 3 termina num 2,3-fosfato. As duas metades de tRNA emparelham para adquirirem uma estrutura semelhante do tRNA e quando a molcula de ATP adicionada, ocorre uma segunda reaco, em que as duas extremidades caractersticas criadas pela
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endonuclease tm de ser alteradas. O grupo fosfato de estrutura cclica aberto para originar um terminal 2-fosfato, sendo que esta reaco requer a aco de uma fosfodiesterase cclica, e vai originar um grupo 2-fosfato e um grupo 3-OH. O grupo 5-OH criado pela nuclase tem de ser fosforilado para originar um 5-fosfato, conduzindo formao de uma maior proximidade entre o 3-OH e o 5-fosfato. Desta forma, pode concluir-se que os principais intervenientes neste processamento o ATP e o GTP para a juno dos exes decorrentes do processamento, a endonuclease que permite a remoo dos intres e a fosfatase ou fosfodiesterase que remove o grupo fosfato em 2.
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AULA 10 Mtodos para estudos genmicos e protemicos

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O primeiro estudo sobre a sequenciao de DNA saiu na Science, em 2001. A sequenciao de DNA de diferentes organismos pode ter interesse em vrios campos, por exemplo, na agricultura. Actualmente, um mtodo comum de sequenciao de DNA o mtodo de Sanger. Este mtodo baseia-se na terminao prematura da sntese de DNA, resultante da incluso de dideoxinucletidos, isto , nucletidos que no contm um grupo HO nos carbono 2 e 3 da deoxiribose (se bem que para o mtodo mais relevante a ausncia no carbono 3). Isto faz com que, quando includos, no seja possvel a continuao da formao da cadeia. O mtodo funciona um pouco como um PCR assimtrico. O mtodo usa o DNA molde, uma DNA polimerase, um primer, nucletidos e dideoxinucletidos. Usam-se 100 vezes mais nucletidos normais do que dideoxinucletidos. Primeiro o primer liga-se ao DNA, depois a DNA polimerase, e a replicao comea. A cada base que encontra, a DNA polimerase pode adicionar um nucletido normal ou um dideoxinucletido. Se adicionar um nucletido normal, a reaco prossegue. Caso contrrio, a reaco pra, pois no possvel fazer uma ligao entre o carbono 3 do dideoxinucletido e o nucletido seguinte. Este mtodo permite ler vrias sequncias aps electroforese, j que as cadeias, por terem comprimentos diferentes, tm pesos moleculares diferentes, e posicionamse em locais diferentes no gel. Usam-se poos diferentes, cada um com um tipo diferente de ddNTP. Caso fosse tudo feito no mesmo local, apenas se teria um conjunto de bandas que, usando este mtodo, no permitiria a sequenciao do DNA. A leitura faz-se de baixo para cima, pois a
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cadeia mais leve move-se mais no DNA. Os primers e as molculas de DNA usados so radioactivos, para que seja possvel observar as barras de DNA no gel.
Este mtodo foi no entanto automatizado. Agora tudo feito num poo, e os ddNTP marcados com fluorescncia, no se usando assim radioactividade. Cada uma das bandas ter uma fluorescncia prpria, correspondente ao deodixinucleotdeo que contm. Cada cor corresponde a um nucletido terminal diferente, e permite que o computador leia a sequncia. Note-se que em ambos os casos, a sequncia obtida sempre a complementar sequncia que queremos sequenciar. A partir das sequncias obtidas necessrio obter um significado. Assim, desenvolveram-se programas informticos que, a partir da informao do mRNA do sistema e do que j sabido, conseguem estimar o nmero de genes existentes na sequncia. A informao de que o homem tem cerca de 30.000 genes, mas apenas uma estimativa de um programa informtico. A complexidade de um ser no est correlacionada com a complexidade do seu DNA. Enquanto que o se julga que o Homo Sapiens tem 3.4x109 pares de bases no seu genoma, a Amoeba Dubia estimada ter 6.7*1011. O mesmo se aplica ao nmero de genes. O valor estimado de genes para o homem de 30.000, mas para o arroz de 50.000. Este ltimo facto levou concluso que o
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mais importante no tanto o nmero de genes existentes no genoma, mas antes aquilo que feito com cada um deles. Os dados da sequenciao do genoma tambm permitiram concluir que a maior parte dos nossos genes esto relacionados com o metabolismo e transcrio, e que apenas entre 3 a 5% do genoma codifica protenas. Dos 30.000 genes, possvel obter at 100.000 mRNAs. Isto devido ao splicing alternativo, ou seja, a restries diferentes durante o splicing. Desses mRNAs, possvel obter at 400.000 protenas, devido a fenmenos ps-traduo (ex: glicosilao, fosforilao). As 400.000 protenas podem resultar em mais de 1.000.000 interaces.
A figura representa um Interactoma de uma levedura. Cada ponto representa uma protena. Cada trao representa as interaces que se estabelecem entre as protenas.
Uma tecnologia que permite analisar um conjunto de milhar de genes denomina-se DNA chip array, ou microarray. A tecnologia permite identificar a expresso diferencial de genes durante o desenvolvimento ou induzida por situaes de stress, e permite analisar a especificidade em cada um dos tecidos, e analisar em simultneo a expresso diferencial de milhares de genes em populaes celulares diferentes. Doenas polignicas como a esquizofrenia e Alzheimer, ou casos de cancro, em que 0,2 a 10% dos mRNA so diferencialmente expressos entre tecidos normais e cancergenos so aplicaes deste tipo de tecnologia.
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No caso de um doente com Alzheimer, comea-se por retirar uma poro da rea que se sabe afectada, e homogeniza-se. feita a extraco de mRNA, e com a transcriptase reversa obtido cDNA (DNA complementar). A transcriptase reversa uma enzima que consegue, a partir de mRNA, obter DNA. Usam-se nucletidos marcados com fluorescncia, com uma cor 1 no controlo e com uma cor 2 no doente. De seguida, coloca-se o DNA num ChipDNA. Os ChipDNA contm todos os genes do genoma humano em localizaes conhecidas (poos). Caso haja DNA complementar para determinado gene no chip, ocorre hibridizao. As sequncias que hibridizarem vo emitir a fluorescncia devido aos nucletidos marcados. Atravs do controlo dos poos nos quais h ou no fluorescncia (ou seja, dos genes que existem ou no no controlo e no doente), possvel comparar quais os genes que so transcritos num caso e noutro.
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Actualmente tenta-se classificar os diferentes tipos de tumor usando este tipo de tecnologia. Caso haja um tipo de tumor no identificado, pelo tipo de genes que transcrito, possvel perceber qual a alterao gentica que ocorreu, visto que cada tumor tem uma alterao gentica nica. Alm disso, permite fazer uma terapia apontada via de sinalizao que est aumentada ou diminuda (ex: apoptose). Uma dificuldade que pode surgir neste processo a obteno de grandes quantidades de mRNA de alta qualidade, especialmente em casos de biopsia, em que a quantidade de tecido limitada. No entanto, a disseco por laser permite a captura de mRNA em boas condies. Outra limitao, comum a todos os mtodos de anlise de expresso gentica, o facto de apenas se incidir sobre o intermedirio de mRNA. Existem fenmenos ps-transcrio que no podem ser desprezados, mas que a tcnica no permite avaliar. Western blotting, electroforese em gel de policrilamida, separao cromatogrfica e especometria de massas desempenham papeis importantes no sentido de elucidar sobre nveis e funes de protenas.
Outra tcnica muito importante a tcnica de DNA recombinante. Permite a anlise bioqumica de DNA, mas tambm de protenas. Permite inibir determinados genes (com vectores vricos - terapia gnica), criar animais transgnicos, produzir uma protena ou substncias necessrias para a indstria farmacutica. A insulina, por exemplo, produzida utilizando tcnicas de DNA recombinante. Incluindo o gene numa bactria possvel obter uma colnia de bactrias que produzem continuamente insulina suficiente para satisfazer as necessidades de todos os diabticos. Tambm possvel por exemplo a produo de vacinas para a hepatite B. Nesta tcnica usa-se um vector (plasmdeo), ou seja, algo que nos permita transportar um fragmento de DNA. Ao vector incorpora-se o fragmento de DNA de interesse. Como resultado, obtm-se um plasmdeo que integra o fragmento. Ao integrar o plasmdeo numa bactria, ela passa a produzir a protena codificada pelo fragmento de DNA de interesse. O DNA complementar o DNA produzido a partir do mRNA por aco da Transcriptase Reversa. Os plasmdeos so molculas circulares de DNA extracromossomais de cadeia dupla cuja replicao independente da replicao do restante DNA. Para serem utilizados, tm que conter uma origem de replicao, um gene que confere resistncia ao antibitico, e um local rico em sequncias de restrio.
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As enzimas de restrio so endonucleases especficas, que cortam o DNA nas sequncias de restrio, que tm entre 4 a 8 nucletidos. As sequncias de restrio so sequncias que tm um eixo de simetria. Lida de 5 para 3, ou de 3 para 5 na cadeia complementar, a sequncia de restrio apresenta a mesma sequncia de nucletidos. Por cada enzima de restrio que uma bactria produza, produz tambm uma enzima modificante, que lhe altera o DNA perto da zona onde actuaria a enzima de restrio, geralmente por metilao. Assim, o DNA prprio da bactria no clivado. Caso a enzima actue como no 1 caso, formam-se extremidades abruptas, ou Blunt. No 2 e 3 caso formam-se extremidades coesivas, ou Sticky, que so as mais frequentemente usadas. Com a ajuda de DNA Ligase, o fragmento de interesse incorporado no plasmdeo na zona em que foi feita o corte. H complementaridade de bases pois o fragmento foi tratado com a mesma enzima de restrio que o plasmdeo, o que quer dizer que as sequncias onde houve o corte so iguais.
incorporao do plasmdeo na bactria d-se o nome de transformao. A transformao feita por exemplo na E. Coli. Nas bactrias Gram positivas o processo um pouco mais difcil devido camada exterior de proteoglicanos. As bactrias transformadas podem ser postas a crescer em cultura, de forma a maximizar a produo de uma dada protena (ex: insulina). As bactrias que no incorporaram o plasmdeo morrem, pois no tm nenhum gene que lhes confira resistncia ao antibitico. Assim, num meio de cultura h certezas que s existem as clulas que incorporaram o plasmdeo. Visto que plasmdeo autoreplica-se independentemente do DNA da bactria, pode acontecer que algumas bactrias tenham plasmdeos em maior quantidade do que outros.
A transformao pode ser feita pelo mtodo qumico ou por electroporao. No mtodo qumico h a seleco das clulas competentes por incubao numa soluo fria de cloreto de clcio, a que se segue um choque trmico de curta durao. Se necessrio possvel aumentar a eficincia do processo por recurso a outros ies monovalentes (K+ ou Rb+) ou divalentes (Mg2+ ou Mn 2+). A electroporao ou electrotransformao, como alternativa transformao clssica, assenta na electropermeabilizao, reversvel, das clulas bacterianas, por sujeio a um pulso elctrico de elevada intensidade e curta durao. Esta tcnica, que permite uma
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maior eficincia face transformao qumica, garante tambm a introduo de DNA recombinado (rDNA) em espcies refractrias transformao clssica, desde que as condies experimentais sejam devidamente optimizadas. A transfeco o mtodo usado para transportar fragmentos de interesse para clulas eucariticas. So usados normalmente lipossomas. possvel fazer transfeco em locais especficos dos corpos dos eucariontes. Foram feitas experincias em ratinhos, nos quais se integraram GFP (Green Fluorescent Protein) especificamente nas patas, orelhas, e cauda.
A conjugao um processo natural de transferncia de material gentico entre bactrias, que pressupe o contacto fsico entre estas. A clula dadora a clula que possui o rDNA, que queremos transferir para uma outra clula, dita receptora. Neste caso, o vector de clonagem a usar tem de poder ser mobilizvel, ou seja, apresentar parte das funes de um vector conjugativo, que autotransmissvel. Por questes de segurana em Engenharia Gentica, no permitido o uso de vectores baseados em plasmdeos conjugativos, de modo a no viabilizar a sua transferncia descontrolada para outras clulas bacterianas fora do laboratrio e do controlo do manipulador. As funes que so retiradas aos plasmdeos conjugativos para os tornar no conjugativos tero de se encontrar presentes, durante a transferncia por conjugao em laboratrio, num plasmdeo ajudante, que pela sua co-presena, permitir a associao entre a clula receptora e a clula dadora atravs do tubo de conjugao (ver figura). Este processo, envolve trs clulas (a dadora com o rDNA, a receptora e a ajudante com o plasmdeo ajudante que apresenta as funes em falta no vector com o rDNA). De salientar que a clula receptora no apresenta o rDNA mas que, no final de um processo bem sucedido, ambas as clulas de conjugao apresentam o rDNA, podendo assim a clula receptora funcionar como dadora num novo processo de conjugao. A transduo recorre tambm a um fenmeno natural: a infeco viral em bactrias. Assim, este processo utiliza um bacterifago ou fago (vrus de bactrias) que serve de veculo para a introduo do rDNA, ao infectar a clula receptora, de uma forma controlada, no laboratrio. No caso da bactria E. coli, possvel utilizar o fago (fago desta espcie) num processo engenhoso que permite introduzir plasmdeos de grandes dimenses (cerca de 50 kb ou seja 500.00 pares de bases). Para tal, estes plasmdeos tm que incluir uma regio dita cos, de reconhecimento pelo fago. Estes vectores de clonagem designam-se, por isso, cosmdeos. Vectores construdos a partir de fagos so cerca de 1.000 vezes mais eficientes do que plasmdeos.
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AULA 12 Estrutura e funcionamento do ncleo
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1. Microscopia no ncleo
1.1. Mtodo de Feulgen O mtodo de Feulgen especfico para o DNA e fornece preparaes limpas e de excelente contraste. Apesar de ser um mtodo um pouco mais trabalhoso e demorado, quando comparado com outras tcnicas de colorao convencional, os cromossomas aparecem visualmente mais delimitados, com as constries primrias e secundrias mais evidentes. Como desvantagem, podemos citar a instabilidade do corante. As lminas perdem a colorao com mais facilidade, enquanto que o Giemsa, a hematoxilina e o verde de metilo permanecem por muito mais tempo. O objectivo geral da reaco corar selectivamente o DNA, ou seja, corar o DNA sem corar o RNA. Para isso: 1 - trata-se o corte com HCl hidrolisar o RNA e bases pricas do DNA (exposio dos grupos aldedo da desoxirribose) 2 - adiciona-se reagente de Schiff o reagente de Schiff interage com os grupos aldedo expostos da desoxirribose corando a cromatina de vermelho (notar que o nuclolo no cora porque o RNA que o constitua j foi destrudo) 3 - utiliza-se um corante verde que se liga a componentes citoplasmticos corar o citoplasma de verde.
1.2. Ncleos isolados por centrifugao possvel isolar o ncleo celular por centrifugao por um processo relativamente fcil, sendo apenas quebrada a membrana citoplasmtica para se proceder centrifugao. Os organelos mais densos de maiores dimenses sedimentam logo aps o incio, principalmente o ncleo. Desta forma, AULA 12 Estrutura e funcionamento do ncleo 109
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a centrifugao das clulas depois da ruptura, resulta numa fraco impura de ncleos, bastante contaminada com outros organelos. Assim, para obter uma maior pureza, necessrio voltar a centrifugar a preparao, mas desta vez com uma ultracentrifugao contra uma soluo concentrada em sacarose, que vai funcionar como filtro e permitir sedimentar apenas os ncleos. Neste caso, necessrio utilizar uma fora de gravidade de cerca de 90000x contra uma soluo muito concentrada de sacarose de aproximadamente 2.2 M.
1.3. Ncleo celular em TEM Estas preparaes foram inicialmente observadas na dcada de 40, em que o ncleo celular separado do citoplasma por um invlucro constitudo por duas membranas biolgicas, sendo uma externa e uma interna. Entre as duas membranas um existe 1 espao cisterna perinuclear e o invlucro tambm tem uma estrutura proteica que a lmina nuclear fibrosa. Dentro do ncleo, encontra-se a cromatina condensada que se localiza quer na periferia do ncleo, quer na proximidade do nuclolo, quer em matas no interior do ncleo. V-se o nuclolo que mais se evidencia no interior do ncleo e um espao intercromatnico com pequenos grnulos entre os quais se encontra a cromatina descondensada (eucromatina) para ser transcrita a tRNA e a mRNA.
1.4. Contrastao regressiva de EDTA Na dcada de 60, desenvolveu-se o mtodo de microscopia para estudar melhor o que se encontrava no espao intercromatnico. Este mtodo utiliza o EDTA que um agente quelante e consiste numa contrastao que comea por aplicar acetato de uranilo e em seguida citrato de chumbo. No entanto, entre estes duas solues, utiliza-se EDTA, que sendo um agente quelante, retira os ies uranilo do DNA, sequestrando-os para o
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exterior da molcula. Com a aplicao do citrato de chumbo, j no existe uranilo ligado ao DNA e no ocorre a ligao. Como resultado da tcnica, vem-se as regies ocupadas por DNA no contrastadas na imagem final enquanto que as regies ricas em RNA e RNPs vo aparecer escuras. Esta tcnica foi muito importante por permitir a obteno de informao de que no espao intercromatnico que se pensava ser apenas ocupado por eucromatina, h uma riqueza muito grande em RNA associado a protenas em fibrilas pericromatnicas. Por esta tcnica, as reas ocupadas por eucromatina ou heterocromatina aparecem claras, ao contrrio das partculas riboncleoproteicas.
2. Territrios cromossmicos Os cromossomas individuais ocupam territrios distintos no interior dos ncleos das clulas. Os genes activamente transcritos esto localizados na periferia destes territrios, adjacentes a canais que separam os cromossomas. Os RNAs recentemente transcritos so libertados para o interior destes canais entre os cromossomas em que ocorre o processamento do RNA. Grande parte da heterocromatina encontra-se localizada na periferia do ncleo, na medida em que as protenas associadas a este tipo de cromatina ligam-se matriz da lmina nuclear. Tendo em conta que diferentes tipos de clulas expressam diferentes genes, ento a sua heterocromatina facultativa diferente, e as regies variveis dos cromossomas interagem com a lmina nuclear em diferentes clulas e tecidos. Algumas clulas tambm apresentam os seus centrmeros e telmeros anexados em plos opostos, enquanto que outras apresentam os seus cromossomas organizados radialmente. Assim, enquanto as localizaes nucleares dos cromossomas no so aleatrias, eles diferem ao longo de diferentes tecidos, organismos e durante a diferenciao celular.
3. Nuclolo O corpo nuclear mais proeminente o nuclolo, que definido como o local de transcrio e processamento do rRNA, bem como local de vrios acontecimentos de formao do ribossoma.
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Diferentemente de outros organelos celulares, o nuclolo no se encontra delimitado por uma membrana e, em vez disso, uma grande agregado de macromolculas, incluindo-se os prprios genes de rRNA e outros. A ntima associao de todos esses componentes presumivelmente permite que a montagem dos ribossomas ocorra rapidamente e sem erros. A organizao do nuclolo ainda no completamente conhecida, mas vrios tipos de molculas de RNA desempenham um importante papel na sua qumica e na sua estruturao, sugerindo que o nuclolo possa ter evoludo a partir de uma estrutura ancestral presente em clulas dominadas pela catlise de RNA. Como devia ser esperado, o tamanho dos nuclolos reflecte o nmero de ribossomas que a clula produz. Consequentemente, o seu tamanho varia muito entre as diferentes clulas e pode ser alterado numa nica clula, ocupando 25% do volume nuclear total em clulas que esto a produzir quantidades anormalmente grandes de protenas.
O nuclolo o compartimento que melhor se destaca no interior do ncleo e visvel em microscopia de contraste de fase, com clulas no coradas. Para alm da sntese do rRNA pela RNA polimerase I, tambm ocorre o amadurecimento e a clivagem do transcrito primrio e a ligao s protenas que formam o ribossoma atravs das subunidades ribossomais, logo o ribossoma no tem todo a mesma estrutura. H regies mais claras e homogneas rodeadas por regio fibrilar, porque essa regio quando descondensada tem fibrilas que so semelhantes a rvores de Natal aquando da transcrio da RNA Polimerase I e h regies constitudas por pequenos grnulos. As regies onde est a ocorrer transcrio dos genes que codificam para o rRNA o componente fibrilar denso e pode ver-se como uma regio mais densa do nuclolo.
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No entanto, os genes que codificam para o rRNA esto presentes em vrias cpias, as tandem arrays, sendo 200 a 250 cpias dos genes na espcie humana, mas nem todos esto activos em simultneo. Os activos esto neste componente e os inactivos esto um pouco descondensados nesta regio mais homognea que se chama centro fibrilar. Esta regio est sempre rodeada pelo componente fibrilar denso. Quando a transcrio do 45S rRNA termina e este comea a ser clivado e a associar-se a protenas passa por componente granular no interior do nuclolo onde ocorre o amadurecimento do rRNA e a formao das subunidades do ribossoma, bem como a ligao do 5S. O nuclolo mostra-nos a actividade transcritiva da RNA Polimerase I, logo se um nuclolo tiver muito componente fibrilar denso significa que a RNA Polimerase I est em grande actividade de transcrio de rRNA.
3.1. NORs Organizadores nucleares Para completar as necessidades de transcrio de um grande nmero de molculas de rRNA, todas as clulas contm mltiplas cpias dos genes de rRNA. O genoma humano, por exemplo, contm cerca de 200 cpias do gene que codifica os rRNAs 5.8S, 18S e 28S, e aproximadamente 2000 cpias do gene que codifica o 5S rRNA. Os genes para os 5.8S, 18S e 28S rRNAs so juntos nas tandem arrays em 5 diferentes cromossomas (cromossomas 13, 14, 15, 21 e 22), enquanto que os genes do 5S rRNA se encontram numa nica tandem array situada no cromossoma 1.
Depois de cada diviso celular, o nuclelo associa-se com as regies cromossmicas que contm os genes dos 5.8S, 18S e 28S rRNAs, que so designados por NORs (organizadores nucleolares). A formao do nuclolo requer a transcrio do 45S pr-rRNA, que conduz fuso de pequenos corpos pr-nucleolares que contm factores de processamento e outros componentes do nuclolo.
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3.2. Focos de replicao A replicao do genoma tambm ocorre no interior do ncleo, de modo muito organizado. Ocorre simultaneamente em vrias origens de replicao onde se concentram as molculas necessrias para a replicao, e o genoma replica-se sendo possvel observar os focos de replicao, cerca de 4000 aproximadamente no ncleo em interfase. Os focos de replicao so identificados, por exemplo, quando se utiliza um nucleotdeo que seja incorporado exclusivamente no DNA mas que no existe normalmente, a bromodesoxiuridina, que vai substituir a timina. Identificado com um anticorpo ligado a um fluorocromo, vem-se os focos de replicao, os compartimentos do ncleo onde ocorre simultaneamente a replicao. Renem todas as enzimas deste processo, como a DNA polimerase, a primase, a helicase, a DNA ligase, entre outras, que so necessrias para a replicao do DNA, tendo a topologia do ncleo para poder encontrar locais onde estes processos ocorrem.
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3.3. Topologia da maquinaria de splicing Na transcrio, o amadurecimento dos mRNA ocorre quase concomitantemente. Os mRNAs mal comeam a ser transcritos comeam logo a associar-se a protenas que depois so responsveis pelo seu amadurecimento final, sendo possvel tambm a deteco da localizao das molculas que intervm no splicing dos mRNAs: quer dos pequenos que integram o spliceossoma, quer algumas protenas como a SC35 que tem um splicing complexo, e que possvel de localizar no interior do ncleo. As estruturas vermelhas correspondem a localizao de pequenos RNAs e so designados por nuclear speckles em grupos de grnulos intercromatinicos.
3.4. Corpos nucleares Associados a patologias, existem corpos nucleares, sendo que alguns no se conhece a funo, mas durante muitos anos, houve alguns cuja funo no se conhecia. No entanto, os corpos nucleares simples so estruturas proteicas rodeados por um alto largo de maiores dimenses ou os corpos nucleares complexos, que aparecem rodeados por cpsulas e que podem ter um aspecto mais granulado ou espiralado, no tem funo conhecida, mas esto associados a algumas patologias e cancros ou clulas tumorais.
Enquanto que estes ainda no tem funo e constituio molecular bem conhecida, nos corpos de Cajal ou espiralados, encontrou-se um anticorpo que identifica uma protena que exclusiva dos corpos de Cajal a coilina. Morofolgicamente, estes copros so constitudos por pequenos bastonetes ligados entre si, e existem em todos os ncleos eucariticos e encontra-se tambm uma protena exclusiva que existe no nuclolo a fibrilharina. Sabe-se que o corpo espiralado funciona como uma reserva transitria de pequenos RNAs que intervm no amadurecimento dos RNAs transcritos por todas as RNA polimerases. Dentro do corpo de Cajal, h protenas do spliceossoma e tambm pequenos RNAs que intervm na clivagem e amadurecimento
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do rRNA e tRNA, funcionando como local de reciclagem e reencaminhamento de pequenos RNAs para os locais de transcrio no ncleo. Um ncleo vertebrado caracterstico tem vrios corpos de Cajal, que foram propostos como sendo os stios nos quais as snRNPs e os snoRNPs sofrem as suas modificaes finais. Propese que as regies de intercromatina granular sejam regies de armazenamento de snRNPs totalmente maduros. Um tpico ncleo vertebrado tem entre 20 a 50 regies de intercromatina granular. Aps a sua sntese inicial, os snRNAs so exportados do ncleo, sofrendo depois o processamento das suas extremidades 5 e 3 e montagem com as sete snRNPs comuns (denominadas por protenas Sm). Estes complexos so reimportados para o ncleo e os snRNPs sofrem a sua modificao final nos corpos de Cajal. Alm disto, a snRNP U6 precisa de ser modificada quimicamente pelos snoRNAs do nuclolo. Os locais de transcrio activa e splicing (aproximadamente 2 a 3 mil locais por ncleo em vertebrados) correspondem s fibras de pericromatina vistas sob microscopia electrnica.
4. Matrizes nucleares Tcnicas resultantes de extraco prvia do ncleo com DNase, tampes de alta e baixa fora inica e detergente, permitem obter uma matriz que um esqueleto e consegue-se observar a
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lmina nuclear que se passa a observar muito bem o que normalmente no comum com cromatina, e uma rede fibrilhar que descende at lmina nuclear.
5. Invlucro nuclear O ncleo est separado do citoplasma pelo invlucro nuclear. O ncleo constitudo por duas membranas concntricas e o espao entre elas a cisterna ou espao perinuclear e junto da membrana interna est a lmina nuclear fibrosa e a fundir todos estes componentes do invlucro esto os complexos de poro nuclear. O invlucro nuclear , ento, uma estrutura complexa.
A membrana externa do ncleo est em continuidade fsica com o reticulo endoplasmtico rugoso, e junto dela podem observar-se ribossomas associados. Para alm disso, o lmen da cisterna perinuclear est em continuidade com o lmen do reticulo endoplasmtico rugoso. Como o ncleo sofre aumento do volume durante a fase S e esse aumento faz-se conta do fornecimento de membrana do retculo endoplasmtico, ento esta continuidade fsica vantajosa para o ncleo.
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Entre as duas membranas, h a cisterna e firmemente associada membrana interna est a lmina nuclear composta por protenas da famlia dos filamentos intermedirios que interagem com protenas transmembranares e cromatina. Tem como uma das suas funes, ancorar a cromatina junto do invlucro do ncleo e ajudar na sua compactao. Por isso, que vemos sempre vrios conjuntos de heterocromatina perinuclear, precisamente porque atravs das histonas a cromatina interage com as laminas junto do invlucro. A lmina nuclear fibrosa uma rede tridimensional que envolve toda a membrana interna do ncleo, sendo que por imunodeteco, possvel de ver que as protenas que constituem a lmina, A, B e C, vo, por fosforilao, despolimerizar. Isto ocorre durante o final da profase, em cada ciclo celular, e as laminas despolimerizam e organizam a lmina nuclear fibrosa. A lamina B vai polimerizar juntamente com vesculas e formar pequenos complexos, enquanto que as laminas A e C vo ficar como monmeros no citoplasma. Isto importante para que possa ocorrer a ruptura do invlucro nuclear no final da profase, e de forma inversa, na telofase as laminas vo desfosforilar para que se possa reformar o invlucro nuclear junto dos cromossomas.
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6. Complexo de poro nuclear A fundir todos os componentes do invlucro est o complexo de poro nuclear. um complexo macromolecular, que tem cerca de 120 nm de dimetro e facilmente observvel em microscopia electrnica no invlucro nuclear.
constitudo por cerca de 30 a 50 protenas diferentes, que so designadas genericamente por nucleoporinas. At agora nunca foi possvel isolar complexos de poro nuclear, sendo que eles esto sempre associados lmina nuclear fibrosa. Os complexos apresentam uma simetria octadrica e formam um canal que tem um poro funcional de cerca de 9 nm, que permite a passagem de molculas no carregadas, de ies e de protenas com cerca de 20 kB, no entanto permite tambm a passagem de maiores dimenses com outros processos. Das nucleoporinas, saem filamentos para a regio citoplasmtica e tambm para a regio da face nuclear onde se ligam formando o nuclear basket. Os complexos de poro nuclear observam-se muito bem em microscopia electrnica, observandose uma molcula electronodensa a passar o invlucro nuclear. As nucleoporinas so protenas que constituem os complexos de poro nuclear, partilham alguns domnios comuns e so vrias diferentes.
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O transporte de molculas do ncleo e do citoplasma e vice-versa ocorre, exclusivamente, atravs dos complexos de poro nuclear, sendo que o processo pode ser bidireccional. O canal aquoso que existe no meio do complexo de poro nuclear permite a sifmples difuso de molculas desde que no tenham mais de 40 kB e tenham uma estrutura globular.
7. NLS Sequncia de reconhecimento nuclear No entanto, muitas das protenas que existem no ncleo como as DNA polimerases so molculas de grandes dimenses e foram transportadas atravs do complexo de poro nuclear, sendo que umas so transportadas para o ncleo e outras no. Estudou-se a sequncia de aminocidos destas protenas e todas elas da localizao nuclear possuem uma sequncia que pode ser apenas de 7 nucleotdeos, sendo uma sequncia at mais pequena mas bipartida. Estas sequncias que permitem o transporte das protenas para o ncleo chamam-se NLS nuclear localizing sequence.
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Nesta experincia, pode ver-se o que acontece numa protena que transportada para o ncleo e a mesma protena se for truncada de modo a no ter a NLS, verifica-se que ela se vai localizar no ncleo. O DNA est marcado e a protena est marcada com fluorocromo. Se houver local de reconhecimento, a protena vai reconhecer no ncleo e caso no haja, vai localizar em grande parte, no citoplasma.
8. Importao de protenas para o ncleo A protena apresenta um sinal de localizao nuclear (NLS) que vai ser reconhecido por importinas e . A importina vai reconhecer o sinal existente de reconhecimento nuclear na protena e liga-se a ela e, por sua vez, a importina vai ligar-se importina . Quando as importinas reconhem a NLS, ligam-se protena, formam o complexo e passam pelo poro nuclear, uma vez que so reconhecidas pelas nucleoporinas, e chegam ao ncleo. Esta passagem feita por interaco da importina com resduos de aminocidos das nucleoporinas, nomeadamente repeties de fenilalaninaglicina que existem em algumas nucleoporinas que vo interagindo atravs do complexo de poro nuclear. Aqui, a Ran-GTP (obtida pela transformao da Ran-GDP atravs do RCC1) actua sobre o complexo pois reconhece a importina , e dissocia a importina e a protena, mas mantm-se ligado importina . Desta forma, num processo seguinte, as importinas passam ambas para o citosol, onde a importina sofre a aco da Ran-GAP, hidrolisando a Ran-GTP a Ran-GDP e libertando finalmente a importina para o citosol. Por sua vez, a Ran-GDP passa imediatamente para o ncleo atravs do poro nuclear para ficar pronta para um novo processo. AULA 12 Estrutura e funcionamento do ncleo 121
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9. Exportao de protenas para o citoplasma A protena que vai ser transportada para o citosol tem consigo um sinal de exportao nuclear o NES (nuclear export signal). Este sinal vai ser reconhecido pela exportina existente no ncleo e que necessita de estar associada Ran-GTP para formar um complexo com a protena desejada. Assim que o complexo fica formado, reconhecido pelas nucleoporinas (NPC) presentes no envelope nuclear e passa para o citosol. Aqui, para a protena ficar livre no local desejado, tem de sofrer separao dos restantes componentes do complexo. Desta forma, o GTP hidrolisado a GDP atravs da Ran-GAP e ocorre a separao dos trs componentes: Ran-GDP, exportina e protena. A protena permanece no citosol, a exportina passa novamente para o ncleo depois de ser reconhecida pelas nucleoporinas para uma nova passagem, e a Ran-GDP tambm passa novamente para o ncleo para que seja substituda em GTP atravs do GEF, na medida em que o Ran s fica activo ligado a GTP e no a GDP.
As protenas responsveis pela importao e exportao de protenas so, genericamente, designadas por carioferinas que intervm em ambos os processos, tendo capacidade de se ligar a sinais de importao e exportao de protenas relativamente ao ncleo.
10. Transporte de mRNA A exportao dos pequenos rRNAs e tRNAs faz-se sempre com participao do Ran-GTP, sendo que a nica exportao que no envolve estes participantes o transporte do mRNA, que se pode observar em microscopia electrnica. A sua exportao, que terminam depois da aco da RNA polimerase II faz-se com aco do NET e o TEP que se ligam ao mRNA e que se chamam, no seu conjunto, mRNA exporter e interagem directamente com resduos ricos em fenilalanina e glicina das nucleoporinas e permitem o transporte de mRNAs associados a protenas, atravs do complexo de poro nuclear. O primeiro reconhecimento e feito pelo Cap que existe sempre na extremidade 5 do mRNA. Estes processos de transporte so sempre feitos com ajuda da criao de um gradiente, porque as molculas do complexo transportado so rapidamente associadas de modo a diminuir a
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concentrao do complexo e, deste modo, permitir a movimentao mais fcil por gradiente das molculas pelo complexo de poro nuclear.
11. Transporte de snRNA Os pequenos RNAs so tambm transportados com exportinas e importinas e so, inicialmente, exportados para o citoplasma onde se associam s protenas que integram as partculas ribonucleoproteicas e depois so de novo transportados para o ncleo.
12. Transporte nuclear como mecanismo de controlo da expresso gentica O transporte de molculas atravs do invlucro nuclear tem um papel muito importante na regulao da expresso gentica porque a formao dos RNAs feita no ncleo, a traduo feita no citoplasma e se no ocorrer transporte, os processos cessam. Alm disso, h ainda uma interveno na regulao da expresso gentica, que o transporte de vrios factores de transcrio que existem no citoplasma, com interveno directa feita no ncleo,
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e em que a sequncia de transporte para o ncleo est, por exemplo, dependente de um mediador ou de uma fosforilao. Nestes casos, quando se desencadeia um mecanismo, a sequncia de reconhecimento fica exposta e o factor de transcrio fica exposto para o ncleo. No caso de ligao a um inibidor como o NF-kB, se ele for degradado, ficam expostas as sequncias de localizao nuclear e permite o transporte para o ncleo.
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AULA 13 Sntese e Degradao Proteica 22 Novembro 2007
1. Dogma central O dogma central da Biologia Molecular foi, inicialmente, descrito em 1958 por Francis Crick na tentativa de relacionar o DNA, o RNA e as protenas. Assim, afirmou que o DNA seria capaz de se replicar e dar origem a novas molculas de DNA. Estas molculas seriam transcritas em molculas de RNA e estas, por sua vez, traduziam o cdigo gentico em protenas.
No entanto, mais tarde, em 1975, Howard Temin e David Baltimore propuseram um segundo modelo para este dogma, em que todos os processos eram semelhantes, excepto que o RNA tambm teria a capacidade de passar a DNA atravs da aco da transcriptase reversa, como por exemplo, nos retrovrus.
2. Constituio do mRNA eucariota O mRNA muito mais do que a sequncia ORF (open reading frame) que a regio que contm toda a informao necessria para a codificao da protena. Tem, no seu interior, o codo de iniciao AUG e termina num codo stop no final da sequncia que vai ser traduzida, logo corresponde apenas a uma pequena poro do mRNA. esquerda do local de incio da traduo, existe a sequncia 5 UTR (5 untranslated region) e do outro lado, a jusante, tem uma regio 3 UTR. Geralmente, a regio 5 UTR mais pequena, contendo centenas de pares de bases, enquanto que a regio 3 UTR extremamente grande e maior do que o resto da molcula do mRNA. Esta sequncia termina numa cauda poli-A tpica dos eucariotas, e o mRNA comea por um Cap, que uma guanina metilada, e caracterstica do RNA mensageiro.
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3. Formao do aminoacil-tRNA Esta fase o primeiro passo da sntese proteica e s ocorre na presena da aminoacil tRNA sintetase, sendo que cada aminocido tem a sua. Os aminocidos de grandes dimenses penetram nas bolsas enquanto que os mais pequenos so inicialmente activados pelas AMP (adenina monofosfato). A cada codo do mRNA correspnde um anticodo dum tRNA que transporta um aminocido. As molculas de tRNA podem servir de transportadores de aminocidos, estabelecendo uma ligao covalente entre o grupo hidroxilo da ribose ligada adenina no extremidade 3 e o grupo carboxilo do aminocido a ser transportado. A reaco catalisada pelas enzimas sintetase de aminoacil-tRNA utiliza ATP e permite a esterificao dos grupos OH em posio 3 ou 2. A reaco ocorre em duas etapas: primeiro a formao dum aminoacil-adenilato com libertao de pirofosfato e depois a reaco com o tRNA para a formao do aminoacil-tRNA:
O aminocido activado devido ligao do AMP ao seu grupo carboxlico formando-se um aminocido adenilado. Este AMP proveniente da hidrlise do ATP j referido. O aminocido adenilado transferido para uma molcula de tRNA havendo uma ligao do grupo carboxlico do aminocido e do grupo hidroxilo do acar 3 do tRNA, sendo que com esta ligao ster, fica formado o aminoacil tRNA.
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4. Cdigo gentico Degenerado O cdigo altamente degenerado na medida em que mais do que um codo pode especificar o mesmo aminocido (excepo feita metionina e ao triptofano, que so ambos especificados por um nico codo). Os diferentes codes que especificam o mesmo aminocido so designados por sinnimos. Devido degenerescncia do cdigo, podem ocorrer vrias alteraes num gene (mutaes) que no tero qualquer efeito na composio do produto gnico (mutaes silenciosas ou mutaes com o mesmo sentido). Universal O cdigo gentico parecia inicialmente aplicar-se a todos os genes, quer em procariotas, quer em eucariotas. Foi, portanto, considerado um cdigo universal. Contudo, mais tarde, foram encontradas algumas excepes no DNA mitocondrial de alguns organismos, que sero desenvolvidas em 2.4. No tem vrgulas O cdigo gentico lido seguido, na totalidade, desde o codo de iniciao at um dos codes de terminao. Codo especfico de iniciao A iniciao da traduo d-se sempre com o codo AUG e com um tRNA iniciador que transporta o aminocido metionina (logo, todas as protenas vo ter a metionina como primeiro aminocido). Codes especficos de terminao Existem trs codes que no so reconhecidos por nenhum tRNA: UAA (ochre), UAG (amber) e UGA (opal). So designados por codes sem significado, codes de terminao ou codes de paragem, porque actuam como o ponto final no fim duma frase, isto , constituem parte do sinal de que a sntese da protena dever parar nesse ponto. 64 codes 61 deles codificantes, 3 deles codes de terminao
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20 aminocidos e 4 nucletidos so necessrios trs grupos de quatro bases diferentes para se constiturem os 20 aminocidos existentes.
5. Ribossomas Os ribossomas tm aco cataltica e so constitudas por uma parte proteica e uma parte de rRNA. Os ribossomas dos eucariotas e dos procariotas so muito parecidos, mas distinguem-se pelo tamanho das subunidades que os constituem. Assim, nos eucariotas, a subunidade pequena 40S, a subunidade maior a 60S e o ribossoma total tem o tamanho de 80S, sendo uma estrutura de grandes dimenses. Nos eucariotas, a subunidade pequena (40S) constituda por 33 protenas e pelo rRNA 18S enquanto que a grande (60S) constituda, em mdia, por 49 protenas e pelos rRNAs 5S, 28S e 5.8S. Nos procariotas, a estrutura semelhante mas tem tamanhos diferentes e as protenas tambm, sendo 50S a subunidade maior e 30S a subunidade menor. Em termos de contedo na massa total, cerca de dois teros da massa total dos ribossomas corresponde ao rRNA, havendo muito mais do que protenas. A cinzento est o rRNA e a cores as vrias protenas que compem os ribossomas.
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6. Mecanismo geral de traduo Basicamente, a traduo o processo em que se realiza a produo de uma protena a partir do mRNA. O rRNA inicialmente armazenado nos nuclolos, passa para o citoplasma e associando-se s protenas, forma os ribossomas (organelos nos quais ocorre a sntese proteica). O mRNA move-se para o citoplasma e liga-se aos ribossomas. Ele formado por uma sequncia de trades de nucleotdeos (trs nucleotdeos), e cada trade corresponde a um aminocido. As trades so denominadas codes e a combinao dos diferentes codes determina o tipo, o nmero e a posio dos aminocidos na cadeia polipeptdica. O tRNA desloca-se para o citoplasma, onde se liga ao aminocido do anticodo correspondente, levando-o at o ribossoma. Os tRNA transportam aminocidos especficos, salvo raras excepes. O desenho abaixo esquematiza como ocorre a sntese proteica nos ribossomas.
A traduo envolve 3 fases. So elas:
A iniciao envolve as reaes que precedem a formao da ligao do peptdeo entre os primeiros dois a.a. da protena. Requer a ligao do ribossoma ao mRNA, dando forma a um
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complexo da iniciao que contenha o primeiro aminoacil-tRNA. Esta uma etapa relativamente lenta na sntese da protena, e determina geralmente a taxa em que um mRNA traduzido.
A elongao inclui todas as reaes da sntese da primeira ligao do peptdeo adio do a.a.. Os a.a. so adicionados cadeia, umde cada vez; a adio de um a.a. a etapa mais rpida na sntese da protena.
A terminao abrange as etapas que so precisas para libertar a corrente terminada do polipeptdeo; ao mesmo tempo, o ribossoma dissocia-se do mRNA. Relativamente a energia, o processo de traduo exige muito gasto de energia para a clula, sendo que o passo de controlo essencial para que se evite que a clula perca tempo a produzir uma protena se o mRNA est errado. Nos procariotas, gastam 90% da energia na traduo.
7. Iniciao
7.1. Iniciao da cadeia polipeptdica
A sntese de qualquer protena comea com o mesmo aminocido, a metionina. O sinal para iniciar a sntese de um polipptido um codo especial de iniciao que marca o incio da sequncia de leitura. Geralmente, o codo de iniciao o tripleto AUG, mas nas bactrias os codes GUG ou UUG tambm podem ser utilizados. O codo AUG representa a metionina, e dois tipos de tRNA podem transportar este aminocido consigo. Um deles usado para a iniciao enquanto que o outro tem a capacidade de reconhecer os codes AUG durante a elongao. Nas bactrias e nas organelas eucariticas, o tRNA iniciador transporta um resduo de metionina que tinha sido formilado no seu grupo amino, formando uma molcula de N-formilmetionil-tRNA, tambm conhecido por tRNAfMet. O nome do aminoacil-tRNA usualmente abreviado para fMet-tRNAf. O tRNA iniciador adquire o seu aminocido modificado num processo de duas fases. Em primeiro lugar, ele colocado em reaco com o aminocido para gerar o Met-tRNAf e de seguida, ocorre a reaco de formilao representada na figura ao lado, que bloqueia o grupo NH2 livre at ao momento. No entanto, ainda que este grupo esteja bloqueado e pudesse prevenir um determinado iniciador de participar na elongao da cadeia, ele no interfere com a capacidade de iniciar uma outra protena.
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Este RNA , ento, usado apenas para a iniciao. Isto acontece porque ele reconhece os codes AUG ou GUG (ou, por vezes, UUG). Os codes no so reconhecidos de forma igual, porque a extenso da fase de iniciao rejeita cerca de metade dos codes quando o codo AUG substitudo pelo codo GUG e rejeita cerca de outra metade quando o UUG utilizado. As espcies responsveis pelo reconhecimento dos codes AUG em localizaes internas so os tRNAmMet. Este tRNA responde unicamente aos codes internos AUG, logo a sua metionina no pode ser formilada. Existe um conjunto de diferenas entre o fMet-tRNAf iniciador e o Met-tRNAm elongador, sendo que algumas delas so necessrias para impedir que o iniciador seja utilizado como elongador e outras so necessrias para intervir no processo de iniciao: A formilao no estritamente necessria pois o Met-tRNAf no formilado pode funcionar como iniciador, mas aumenta a eficincia com a qual o Met-tRNAf utilizado, na medida em que uma das funes reconhecidas pelo factor IF-2 que se liga ao tRNA iniciador. As bases que se encontram frente a frente na ltima posio da cadeia, s quais o aminocido se liga, esto emparelhadas em todos os tRNAs excepto no tRNAfMet. Algumas mutaes podem criar um emparelhamento de bases nesta posio do tRNAfMet e permitem que ele actue como elongador. A falta deste par , no entanto, importante para impedir que o tRNAfMet seja utilizado na elongao e para o desenrolar da reaco de formilao. Um conjunto de trs pares G-C, no final da cadeia, que precede o anel contendo o anticodo nico para o tRNAfMet. Estes pares de bases so necessrios para permitir que o fMet-tRNAf seja inserido directamente no local P do ribossoma.
7.2. Utilizao do fMet-tRNAf pelo IF-2 O significado dos codes AUG e GUG depende do seu contexto na molcula. Quando o codo AUG utilizado na iniciao, ele lido
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como uma formil-metionina, mas quando usado na regio de codificao j representa a metionina. Por sua vez, o significado do codo GUG ainda mais dependente da sua localizao. Quando se encontra no primeiro codo, lido atravs da reaco de iniciao como uma formilmetionina, mas quando se encontra presente no interior de um gene ligado como um Val-tRNA, um dos membros regulares do conjunto de tRNA, apresentando a valina como necessria para o cdigo gentico. Num complexo de iniciao, uma pequena subunidade individual est ligada ao mRNA. O codo de iniciao permanece no interior da parte do local P transportando por essa subunidade. O nico aminoacil-tRNA que se pode tornar elemento do complexo de iniciao o iniciador que apresenta a propriedade particular de ser capaz de entrar directamente para o local P para reconhecer o seu codo. Quando a subunidade maior entra para o complexo, os locais parciais de ligao do tRNA so convertidos para os locais P e A intactos. O fMet-tRNAf iniciador ocupa ento o local P e o local A permanece disponvel para a entrar de um aminoacil-tRNA complementar para o segundo codo do gene. Assim, a primeira ligao peptdica forma-se entre o iniciador e o aminoacil-tRNA seguinte. A iniciao comea totalmente quando um codo AUG (ou GUG) se encontra num local de ligao ribossmico, pois apenas o tRNA iniciador pode entrar para o local P criado quando a subunidade 30S se liga novamente ao mRNA. A leitura interna inicia-se subsequentemente quando os codes so enfrentados por um ribossoma que se encontra a traduzir continuamente o mRNA, por apenas os aminoacil-tRNAs regulares poderem estar no local A (completo).
7.3. Controlo do local de iniciao da traduo Nos procariotas, encontra-se presente uma sequncia muito importante que permite realizar o controlo do local de iniciao da traduo, para que se siga a reading frame correcta. Esta sequncia designa-se por sequncia de Shine-Dalgarno e uma sequncia complementar de uma sequncia altamente conservada da extremidade 3 do 16S rRNA. A sequncia existente na extremidade 3 do rRNA conservada entre os procariotas e os eucariotas excepto que nos eucariotas existe a eliminao da sequncia de cinco bases CCUCC que o principal complemento da sequncia de Shine-Dalgarno. Neste local, no ocorre emparelhamento de bases entre o mRNA eucariota e o 18S rRNA, que actua como uma grande diferena no mecanismo de iniciao. Nos procariotas, a subunidade 30S liga-se directamente ao local de ligao do ribossoma. Como consequncia, o complexo de iniciao forma uma sequncia em torno do codo de iniciao AUG. Quando o mRNA policistrnico, cada uma das regies codificantes inicia com um local de ligao ribossmico.
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Por sua vez, nos eucariotas existe um processo mais complexo porque nestes organismos a subunidade pequena dos ribossomas no encaixa em qq lado do mRNA, mas sim sempre na extremidade 5. Quando isto acontece, faz um scan a percorrer a molcula de mRNA, onde encontra o AUG iniciador, conhecendo uma determinada sequncia sequncia Kozak que no mais do que uma sequncia com um contexto especfico volta do AUG, interrompe a pesquisa e a subunidade grande encaixa no mRNA.
7.4. Iniciao nos procariotas Nos procariotas verifica-se que o primeiro aminocido a ser incorporado a forma formilada da metionina (f-metionina) que transportada por um tRNA diferente do tRNA que transportada por um tRNA diferente do tRNA que transporta, posteriormente, os resduos de metionina. A seleco do cdigo AUG que inicia a traduo feita pela presena de caractersticas adicionais na regio 5 do mRNA. Na E. Coli, Shine e Dalgarno mostraram, em 1974, que os mRNA apresentavam uma regio rica em bases pricas constituda por 3 a 10 nucletidos com uma sequncia presente no rRNA 16S. Esta sequncia especfica ficava localizada a montante do codo de iniciao. O emparelhamento de bases entre estas sequncias do mRNA e do rRNA 16S permite ao ribossoma encontrar o codo AUG responsvel pelo incio da traduo. Desta forma, nos procariotas ocorre a iniciao da traduo na presena de vrios factores de iniciao (IFs). Inicialmente, ocorre a ligao do IF1 e do IF3
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subunidade maior livre 70S do ribossoma que se vai dissociar nas duas subunidades 30S e 50S. De seguida, a regio 5 do mRNA liga-se subunidade ribossomal 30S livre, permitindo a libertao do IF3. Com isto, o iniciador fMet-tRNAfMet transportado pelo IF2-GTP liga-se ao local P da mesma subunidade ribossmica 30S. Por fim, a ligao da subunidade ribossmica 50S ocorre e os factores IF1 e IF2-GDP libertamse, juntamente com um Pi.
7.5.
Iniciao nos eucariotas
A traduo inicia-se quando h um aminoacil-tRNA que se liga ao local P da subunidade pequena do ribossoma, em vez de se ligar ao local A. Assim, com esta ligao, este aminoacil-tRNA tem um codo complementar de iniciao AUG. A ligao do aminoacil-tRNA ao local P, bem como a ligao da subunidade pequena ao mRNA, deve-se participao de factores proteicos ou factores de iniciao eIFs (eIF1, eIF2 e eIF3). O eIF2 vai, ento, ligar-se molcula de tRNA, fazendo com que esta molcula se possa ligar ao local P do ribossoma. No entanto, esta molcula pode sofrer alteraes e deixa de se poder ligar ao tRNA, sendo necessrios novos mecanismos de regulao. O eIF2 na forma inactiva tem ligado a si GDP e na forma activa, troca para GTP. Para isso, necessrio que o eIF2 sofra fosforilao atravs de cinases. As duas subunidades do ribossoma esto separadas no citosol. A pequena est ligada ao eIF3 e a grande est ligada ao eIF6, sendo que quando se encontram nesta forma, perdem a capacidade de se unir e impedem o decorrer da traduo. Por sua vez, o eIF2 que permanece ligado ao GTP, pode associar-se ao aminoacil-tRNA e para se conseguir ligar ao local P do ribossoma, tem de estar aqui associada a subunidade menor, ligando-se ao eIF1A, e formando um complexo de pr-iniciao (tem esta designao porque ainda no comeou a sntese). Aqui, ocorre a etapa limitante, em que se removem as estruturas secundrias de RNA, para que haja um controlo de qualidade da traduo. Assim, se no houver um cap na extremidade 5 ou se a cauda poli-A for demasiado curta na extremidade 3, ento o RNA existente degradado. Depois de a molcula ter o eIF4, o complexo de iniciao liga-se, iniciando a sntese da molcula de RNA. No entanto, se o tRNA est ligado a outras molculas, caso haja um novo aminoacil-tRNA, ele no vai ter capacidade de se ligar. Por isso, o eIF4 efectua um scanning atravs da sequncia Kozak, para identificar onde se encontra o AUG correcto. Quando se forma o complexo de iniciao, liga-se molcula de RNA na extremidade 5 e segue at encontrar o codo AUG. Quando o encontra, d-se o estabelecimento de pontes de hidrognio entre o codo e o anticodo presente a nvel do RNA. Quando h pontes de hidrognio, a subunidade maior pode ento ligar-se, mas inicialmente o GTP hidrolisa-se e o eIF2 deixa de ter capacidade de ligao e todos os factores ligados at ao momento, desligam-se tambm. 134 AULA 13 Sntese e Degradao Proteica |
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A partir deste momento, a subunidade maior do ribossoma j tem a capacidade de se associar menor. No entanto, como tem ligado a si o eIF6, impede esta conexo, necessitando de um novo factor activo com uma molcula de GTP que permita a ligao do eIF6 subunidade menor, o IF5. Assim que a ligao ocorre, os factores eIF5 e eIF6 libertam-se, juntamente com a GTP, permitindo que finalmente se inicie a sntese do peptdeo.
7.6. IRES Internal Ribosome Entry Sites
A maquinaria de sntese proteica nos eucariotas inicia a transcrio em grande parte dos mRNAs celulares a cerca de 100 nucleotdeos do cap da extremidade 5, tal como descrito anteriormente. No entanto, alguns mRNAs celulares contm um internal ribosome entry site (IRES) localizado bastantes nucletidos depois da extremidade 5. Para alm disso, a traduo de alguns mRNAs virais, que no apresentam o cap da extremidade 5, iniciada nos IRESs, atravs da maquinaria da clula-alvo das clulas eucariticas infectadas.
Alguns dos factores de iniciao da traduo que auxiliam o scanning feito pelo ribossoma a partir do cap 5 so necessrios para a localizao de um codo interno de iniciao AUG, mas a forma como o IRES o reconhece no conhecida. No entanto, estudos recentes indicam que alguns IRESs se ligam a uma estrutura de RNA que reconhece se liga um terceiro local no ribossoma, o local E, atravs de um posterior posicionamento de um codo de iniciao AUG no local P.
8. Elongao
A elongao corresponde etapa da formao da cadeia peptdica, ou seja, a sntese da ligao peptdica entre aminocidos ordenados segundo a informao transmitida pelo mRNA. Este processo ocorre nos ribossomas em 3 fases de um ciclo que se repete continuamente. Este ciclo, que permite
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a ligao de cerca de 40 resduos por segundo, envolve a participao de vrios factores proteicos designados por factores de elongao (EFs). Com o terminar da etapa de iniciao, as subunidades ribossomais voltam a estar ligadas, o que permite ocorrer o emparelhamento de um outro tRNA transportando o aminocido correspondente ao segundo codo de leitura. Subsequentemente, pode-se formar a primeira ligao peptdica, ou seja, comea a elongao. Um aminoacil-tRNA endereado para o centro A num complexo que envolve uma molcula de GTP associada ao factor EF-1 (EF-Tu nas bactrias) e, subsequentemente, d-se o emparelhamento entre o anticodo do tRNA e o respectivo codo do mRNA no centro A. Este emparelhamento de bases est associado com a activao do domnio GTPase do factor de elongao e, com hidrlise do GTP, dissociado o aminoacil-tRNA do complexo que ocupa o centro A. O GDP dissociado do factor EF1A/EF-Tu substitudo posteriormente por GTP; A ligao peptdica sintetizada, na segunda fase do ciclo, por deslocamento nucleoflico do tRNA do centro P pelo grupo amino do aminoacil-tRNA do centro A. Esta fase designada por transpeptidao catalisada pela enzima peptidil-transferase que estabelece a ligao peptdica entre o grupo amino do aminocido do centro A e o grupo carboxilo do outro aminocido; Posteriormente, ocorre a transferncia do peptidil-tRNA do centro A para o centro P e a sada do tRNA do centro P. Esta deslocao concomitante com o posicionamento do tRNA que perde o aminocido para o centro E (exit). Esta etapa envolve a participao do factor de elongao EF2 (EF-G nas bactrias) que se liga ao ribossoma juntamente com GTP, dissociando-se do ribossoma com hidrlise de GTP, permitindo deste modo o reincio de um novo ciclo de elongao.
9. Terminao
A terminao requer um s factor de dissociao RF, que se liga ao ribossoma juntamente com GTP. na forma associada ao GTP que este factor reconhece o codo de terminao e induz a hidrlise da ligao aminoacil. A ligao de um factor RF ao codo de terminao induz a hidrlise da ligao do polipptido ao tRNA. Este tRNA dissocia-se do ribossoma com hidrlise de GTP e,
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subsequentemente, o mRNA juntamente com os factores RF-1 e RF-3 dissocia-se do ribossoma, resultando um ribossoma 70S inactivo e pronto a participar novamente na sntese de protenas. Na E. Coli, os codes de terminao, para os quais no existem tRNA com os correspondentes anticodes, so reconhecidos pelos factores de terminao/dissociao, designados por RF1, RF2 e RF3. O factor RF1 reconhece os codes UAA e UAG e o factor RF2 reconhece UAA e UGA. O factor RF3 liga-se ao GTP e estimula a ligao do RF1 e RF2 ao ribossoma. Por sua vez, o GTP intervm nas alteraes conformacionais e na capacidade de verificao. No entanto, no final do processo de terminao, voltam a intervir os factores eIF3 e eIF6 para permitir que as subunidades ribossmicas se mantenham separadas, para que se possa iniciar um novo ciclo de traduo.
10. Polissomas
A distribuio espacial dos ribossomas no citosol ou no RER no completamente aleatria. Muito frequentemente, a anlise por TEM revela a existcnia de agrupamentos ribossomais formando uma espcie de rosrio. Tais estruturas representam vrios ribossomas no processo de traduo de uma mesma molcula de mRNA e designam-se por poliribossomas ou polissomas. A distncia mnima que separa cada um dos ribossomas nestas estruturas cerca de 80 nucletidos. Apesar da complexidade ultrastutural e molecular do ribossoma, foi possvel constatar a presena de vrias zonas especficas de ligao para as diferentes molculas de RNA que com ele interactuam localizadas nas subunidades ribossomais a que foram dados o nome de centros. Um centro para o mRNA, centro este por onde o mRNA desliza medida que vai sendo traduzido. Dois centros recebem tRNA e localizam-se em zonas adjacentes no ribossoma. Um deles o chamado centro P ou centro peptidil que recebe a molcula do tRNA covalentemente ligada extremidade da cadeia polipeptdica em crescimento. O outro, chamado centro A ou centro aminoacil recebe a molcula de tRNA que contm o aminocido que vai ser incorporado na cadeia polipeptdica.
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Nestes casos, a velocidade e taxa de sntese aumentada por duas principais razes: pela reciclagem das subunidades ribossmicas e pela ligao de vrios ribossomas a um mRNA.
11. Chaperes
Enquanto a cadeia polipeptdica se encontra em crescimento, no pode enrolar para no adquirir configurao diferente do normal. Para que isto seja possvel, ocorre a ligao de um conjunto de protenas cadeia em crescimento - os chaperes moleculares impedindo: Que esta adquira uma m conformao; A precipitao das cadeias polipeptdicas (agregao de protenas).
Existem dois tipos de chaperes moleculares, o HSP70 e o HSP60, e foram descobertos quando as clulas estavam sujeitas a aquecimento, verificando-se que havia protenas em excesso. Quando a protena est 100% sintetizada, os chaperes libertam-se e vai dar-se o estabelecimento de ligaes favorecendo a conformao normal da protena. Estas protenas so HSPs (Heat Shock Proteins) e em situao de choque trmico, os nveis destas protenas esto aumentados como resposta ao aumenta da desnaturao das protenas devido ao calor.
12. Inibidores da sntese proteica Muitos dos mais eficientes antibiticos utilizados na Medicina moderna so compostos produzidos por fungos que inibem a sntese de protena bacteriana. Algumas dessas drogas exploram as diferenas estruturais e funcionais entre os ribossomas bacterianos e eucariticos de forma a interferir preferencialmente com o funcionamento dos ribossomas bacterianos.
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Tendo em vista que bloqueiam etapas especficas nos processos que levam do DNA protena, muitos dos compostos inibidores so utilizados para estudos de biologia celular. Entre as drogas mais comumente utilizadas em estudos experimentais esto o cloranfenicol, a cicloexamida e a puromicina, todos inibindo especificamente a sntese proteica. Inibidor Efeito especfico
Com aco apenas em bactrias Tetraciclina Estreptomicina Bloqueia a ligao do aminoacil-tRNA ao local A do ribossoma. Evita a transio do complexo de iniciao para um ribossoma capaz de extender a cadeia, podendo tambm causar erros de descodificao. Bloqueia a reaco de peptidil-transferase nos ribossomas. Bloqueia a reaco de translocao nos ribossomas. Bloqueia a iniciao das cadeias de RNA por meio da ligao RNA polimerase, evitando a sntese de RNA.
Cloranfenicol Eritromicina Rifamicina
Com aco em bactrias e em eucariotas Puromicina Causa a libertao prematura das cadeias polipeptdicas em formao por meio de sua adio extremidade da cadeia em crescimento. Liga-se ao DNA e bloqueia o movimento da RNA polimerase, evitando a sntese de RNA.
Actinomicina D
Com aco apenas em eucariotas Cicloexamida Anisomicina -Amanitina Bloqueia a reaco de translocao nos ribossomas. Bloqueia a reaco de peptidil-transferase nos ribossomas. Bloqueia a sntese de mRNA por meio da sua ligao preferencial RNA polimerase II. Enzima produzida pela bactria C. Diphteriae que utiliza cataliticamente o NAD para inactivar o eEF2.
Toxina diftrica
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13. Ubiquitinao / Proteossoma Quando as protenas so consideradas anormais, ou ficam no lmen ou passam para o complexo de Golgi, no conseguindo completar o transporte para o seu destino. Quando isto acontece, devido ao facto de as protenas provocarem destabilizao da clula, tm uma conformao imprpria e so reconhecidas por chaperes, fazendo com que as protenas passem para o citosol atravs do translocador que as reconheceu quando entraram para o lmen do retculo. Este translocador uma protena transmembranar que reconhece a protena como protena que deve ir para o lmen do retculo e permitindo-lhe a passagem para o citosol. Posteriormente, ocorre a remoo da cadeia oligossacardica atravs da glicanase, num processo designado ubiquitinao. Neste processo, as ubiquitinas que esto no citosol reconhecem a protena num determinado aminocido que tem compatibilidade com a ubiquitina. A protena que tem a cadeia de ubiquitinas vai ser reconhecida por um proteossoma que tem a capacidade de destruir as protenas e de controlar a qualidade da clula. Assim, desempenha funes muito importantes numa variedade de processos celulares fundamentais como a regulao do ciclo celular, diviso, desenvolvimento e diferenciao celular, apoptose, trfego celular em modulao das respostas imunes e inflamatrias. Assim, pode tambm ser encarado como um potencial alvo teraputico para o tratamento do cancro e doenas neurodegenerativas. O processo de ubiquitinao ocorre no citosol, mas tambm pode dar-se no ncleo. Quando isto acontece, protenas que so transportadas para o ncleo podem estar a adquirir uma conformao errada. Assim, tanto podem sofrer uma desfosforilao ou uma fosforilao como podem ser sintetizadas em determinadas alturas por diferentes processos, sendo no final eliminadas.
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O genoma de uma clula contm na sua sequncia de DNA, a informao para fazer milhares de diferentes molculas proteicas e de RNA. Uma clula expressa, tipicamente, apenas uma fraco dos seus genes, e surgem diferentes tipos de clulas nos organismos multicelulares, porque diferentes conjuntos de genes so expressos. Para alm disso, as clulas podem alterar o padro de genes que expressam, em resposta a mudanas no seu ambiente, tais como sinais de outras clulas. Embora todas as etapas envolvidas na expresso de um gene possam, em princpio, ser reguladas, para a maioria dos genes, o incio da transcrio do RNA o ponto de controlo mais importante. Desta forma, a regulao da expresso gentica sempre fundamental em qualquer organismo, fazendo que quando alterada traga repercusses vrias para o funcionamento da clula, como nas propriedades celulares (desenvolvimento de cancros) ou durante o desenvolvimento (fenda do palatino, tetrologia de Fallot ou aniridia). Em suma, a regulao da expresso gentica tem um papel vital na sobrevivncia das bactrias e outros microrganismos unicelulares, ajustando a maquinaria enzimtica s necessidades impostas pelo meio ambiente (por exemplo, opero Lac).
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A)
Controlo transcripcional da expresso gentica
As protenas activadoras reconhecem e ligam-se aos elementos controlo do DNA na cromatina e interagem com maquinarias multiproteicas que funcionam como co-activadoras, tal como os mediadores, com o objectivo de descondensar a cromatina e ligar a RNA polimerase e os factores gerais de transcrio aos promotores. Os genes inactivos so transportados para regies de cromatina condensada que inibem a RNA polimerase e os seus factores gerais de transcrio que a ela esto associados (GTFs) de interagirem com os promotores. Alternativamente, as protenas repressores reconhecem e ligam-se a outros elementos controlo para inibir a iniciao pela RNA polimerase e interagir com complexos multiproteicos co-repressores para condensar a cromatina.
A.1) Regulao em procariotas
1. Opero Lac A regio controlo de transcrio, constituda por aproximadamente 100 pares de bases, inclui 3 regies para ligaes de protenas: o local CAP, que reconhece a protena activadora; o promotor lac que reconhece a complexo 70 da RNA polimerase e o operador lac que reconhece o repressor lac. O gene lacZ, o primeiro dos trs genes estruturais deste opero, encontra-se direita. Na situao (a), em que estamos perante a falta de lactose, produzida uma pequena quantidade de mRNA lac, na medida em que o repressor se
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encontra ligado ao operador, inibindo a iniciao da transcrio pela RNA polimerase 70. Na situao (b), em que existe glicose e lactose no meio, o repressor reconhece a lactose e dissocia-se do operador, permitindo que a RNA polimerase 70 inicie a transcrio dos genes estruturais numa taxa reduzida. Na situao (c), verifica-se uma transcrio mxima do opero lac na medida em que se encontra perante uma presena de lactose e ausncia simultnea de glicose. Nesta situao, o cAMP aumenta em resposta s baixas concentraes de glicose e forma o complexo CAP-cAMP, que se liga ao local CAP, onde interage com a RNA polimerase para estimular a taxa de iniciao da transcrio.
2. Regulao da ligao 54-RNA polimerase pela NtrC O 54-activador melhor caracterizado conhecido a protena NtrC (nitrogen regulatory protein C) que estimula a transcrio a partir do promotor do gene glnA. Este gene codifica a enzima sintetase da glutamina que, por sua vez, sintetiza o aminocido glutamina a partir do cido glutmico e da amnia. A 54-RNA polimerase reconhece e liga-se ao promotor glnA mas no quebra as cadeias de DNA nem inicia a transcrio at que seja activada pela NtrC, que uma protena dimrica. Por sua vez, a NtrC regulada por uma cnase designada NtrB. Em resposta a nveis baixos de glutamina, a NtrB fosforila a NtrC dimrica, que depois reconhece e se liga a um enhancer localizado acima do promotor glnA. O enhancer ao qual est ligado a NtrC fosforilada estimula, seguidamente, a 54-RNA polimerase para se ligar ao promotor e separar as cadeias de DNA para iniciar a transcrio. Vrios estudos de microscopia mostraram que a NtrC fosforilada e ligada aos enhancers interage com a 54-RNA polimerase ligada ao promotor, para formar um loop no DNA entre os locais de ligao.
A NtrC apresenta actividade ATPsica, e a hidrlise de ATP , ento, necessria para a activao da -RNA polimerase pela NtrC fosforilada. Isto confirmado, na medida em que, mutantes com NtrC defeituosa na hidrlise de ATP so invariavelmente defeituosos na estimulao da 54-RNA polimerase para quebrar as cadeias de DNA no local de iniciao da transcrio.
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3. Pontos-chave no controlo transcripcional em expresso gentica de bactrias
As protenas repressoras ligam-se de modo a sobreporem-se ao local do promotor, evitando a iniciao da transcrio. A ligao dos repressores ao DNA modulada por ligandos, permitindo a regulao da expresso gentica de acordo com as necessidades celulares e condies ambientais. As protenas activadoras tambm tm uma funo reguladora, aumentando a taxa de iniciao da transcrio pela RNA polimerase (ex.: opero lac). A transcrio pelo complexo 70-RNA polimerase regulada por repressores e activadores que se ligam prximo do promotor. A transcrio pelo complexo 54-RNA polimerase regulada por activadores que se localizam longe do promotor e que interagem com o complexo atravs de loops entre os locais de ligao.
A.2) Regulao em eucariotas
1. Nveis de controlo da expresso gentica em eucariotas Se as diferenas entre os vrios tipos celulares dependem de genes particulares que a clula expressa, ento podero existir vrios nveis onde o controlo da expresso gentica exercido. Existem muitos passos no percurso que leva do DNA protena, e todos podem, em princpio, ser regulados. Portanto, uma clula pode controlar as protenas que produz: (1) - pelo controlo de quando e como um determinado gene transcrito - controlo transcripcional; (2) - pelo controlo de como o transcrito de RNA submetido ao processo de splicing, ou processado de alguma outra forma - controlo do processamento de RNA; (3) - pela seleco de quais so os mRNAs completos no ncleo celular que so exportados para o citoplasma e determinao da sua localizao no citoplasma transporte de RNA e controlo da localizao; (4) pela seleco de quais mRNAs no citoplasma so traduzidos pelos ribossomas controlo traducional; (5) pela destabilizao selectiva de certas molculas de mRNA no citoplasma controlo da degradao do mRNA; (6) pela activao, desactivao, degradao ou compartimentalizao selectiva de molculas de protenas especficas aps a sua produo controlo da activao proteica.
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2. Controlo transcripcional do gene Pax6 Um organismo multicelular no est to dependente de determinadas condies metablicas para sobreviver. A regulao da expresso gentica particularmente importante durante o desenvolvimento embrionrio, pois h alteraes que ocorrem de tecido para tecido, que em caso de gravidade, conduzem a fortes problemas. O gene Pax6 expresso ao longo de todo o desenvolvimento em vrias localizaes tecidulares do organismo. Tem expresso diferencial ao longo do tempo, e podem identificar-se as regies que codificam determinados tecidos em determinadas alturas atravs de ratinhos transgnicos. Isto acontece na medida em que se marcam diferentes momentos do desenvolvimento nos ratinhos transgnicos e depois infere-se acerca da semelhana com o ser humano.
3. Regio reguladora dos eucariotas 3.1. Organizao geral dos elementos reguladores Os genes dos organismos multicelulares contm tanto elementos prximos do promotor e enhancers, como TATA box ou outros elementos promotores. Os elementos promotores posicionam a RNA polimerase II para iniciar a transcrio no local de iniciao e influenciam a taxa de transcrio. Os enhancers tanto podem estar acima como abaixo desse local, como podem estar a cerca de 50 kb. Em alguns casos, tambm podem encontrar-se no interior de sequncias intrnicas e para alguns AULA 14 Controlo da expresso gentica e especializao celular 145
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genes, os elementos semelhantes ao promotor tambm se podem encontrar acima ou abaixo do local de iniciao. Contrariamente, nos genes bacterianos, apenas existe uma nica regio reguladora, denominada UAS (upstream activating sequence) e a TATA box, que se encontra a cerca de 90 pares de bases acima do local de iniciao.
Uma regio do DNA eucariota (cor-de-laranja) que suporta uma grande expresso de um gene reprter (azul claro) clonado num plasmdeo tal como mostrado no diagrama. Mutaes por overlapping linker scanning so introduzidas a partir de uma extremidade da regio que est a ser analisada, para a outra. Estas mutaes resultam do doseamento da sequncia nucleotdica num curto fragmento de DNA. Depois de os plasmdeos mutantes serem transfectados separadamente para culturas de clulas, a actividade do gene reprter obtido analisada. No exemplo hipottico exibido aqui, as mutaes LS 1, 4, 6, 7 e 9 tm pequenos ou nenhuns efeitos na expresso do gene reprter, indicando que as regies alteradas nestes mutantes no contm elementos controlo. No entanto, a expresso do gene reprter significativamente reduzida nos mutantes 2, 3, 5 e 8, indicando que os elementos controlo (castanho) se encontram nos intervalos mostrados. A anlise das mutaes LS na regio de controlo da transcrio do gene tk (cnase da timidina) do vrus HSV (herpes simplex vrus) identificou a TATA box e dois elementos semelhantes a promotores (PE-1 e PE-2).
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3.2.
Protenas activadoras
Na figura (a) mostrado um diagrama de DNA contendo um gene reprter lacZ e uma TATA box ligada ao UASGAL, um elemento regulador que contm vrios locais de ligao para o GAL-4. O gene reprter e o DNA codificando GAL4 mutante ou selvagem foram simultaneamente introduzidos em clulas mutantes de levedura (gal4) e a actividade da -galactosidase expressa a partir do lacZ foi doseada. Assim, a actividade vai ser elevada se o DNA-Gal4 introduzido codificar uma protena funcional. Na figura (b) so mostrados diagramas esquemticos do GAL4 selvagem e vrias formas mutantes. Os nmeros pequenos referem-se s posies na sequncia selvagem. A deleco de 50 aminocidos da extremidade do termina-N destruiu a capacidade da GAL4 reconhecer e se ligar ao UASGAL e estimular a expresso da -galactosidase a partir do gene reprter. No entanto, as protenas com deleces extensas a partir do seu C-terminal continuam a reconhecer e permitir a ligao do UASGAL. Estes resultados permitem localizar o domnio de ligao para o N-terminal da GAL4. A capacidade de activar a expresso da -galactosidase no foi inteiramente eliminada, a menos que entre 126 e 189 ou mais aminocidos sejam eliminados do C-terminal. Consequentemente, o domnio de activao permanece na regio do C-terminal da GAL4. As protenas com deleces internas tambm so capazes de estimular a expresso da -galactosidase, indicando que a regio central da GAL4 no crucial para a sua funo neste doseamento.
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3.3.
Estrutura modular dos activadores transcripcionais
Estes factores de transcrio podem contar mais do que um domnio de activao mas raramente contm mais do que um domnio de ligao para o DNA. O GAL4 e o GCN4 so activadores da transcrio das leveduras, o GR (receptor de glicocorticides) promove a transcrio de genes-alvo quando determinadas hormonas so ligadas ao domnio de activao do C-terminal. Por fim, o SP1 reconhece e liga-se a elementos promotores ricos em sequncias GC num grande nmero de genes eucariotas.
3.4. Repressores transcripcionais Os locais de reconhecimento e ligao para a WT1, uma protena repressora eucariota, no sobrepem os locais para a activao da AP1 ou o local composto de ligao para os activadores SRF e TCF. Consequentemente, a represso atravs da WT1 no envolve uma interferncia directa com o reconhecimento e ligao de outras protenas como no caso dos repressores bacterianos.
3.5. Factores de transcrio heterodimricos Em (a), no exemplo hipottico mostrado, os factores de transcrio A, B e C podem todos interagir com outro, permitindo que os trs factores se liguem a seis diferentes sequncias de DNA (locais 1 a 6) e criem seis combinaes de domnios de activao. Cada local composto de reconhecimento e ligao dividido em dois meios-locais, e cada factor heterodimrico contm os domnios de activao dos dois monmeros constituintes. Em (b), a expresso de um factor de inibio (verde) que interage apenas com o factor A inibe o reconhecimento e sucessiva ligao. Da, a activao da transcrio nos locais 1, 4 e 5 inibida, mas a activao nos locais 2, 3 e 6 continua inafectada.
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3.6. Complexos de protenas activadoras Em alguns casos bem estudados, por exemplo, duas protenas de regulao gentica com fraca afinidade entre elas cooperam para se ligar a uma sequncia de DNA, sendo que nenhuma delas tem afinidade suficiente com o DNA para se ligar eficientemente ao local de DNA por si prpria. Uma vez ligado ao DNA, o dmero proteico cria uma superfcie distinta que reconhecida por uma terceira protena, que carrega um domnio activador que estimula a transcrio. Esse exemplo ilustra um ponto geral importante: as interaces protena-protena que so muito fracas para promover a associao das protenas em soluo podem levar as protenas a associarem-se ao DNA; dessa forma, a sequncia de DNA actua como um local de cristalizao, ou como uma semente para a montagem de um complexo proteico. Uma protena de regulao gentica individual pode, frequentemente, participar em mais de um tipo de complexo regulador. Uma protena poderia funcionar, por exemplo, numa situao como parte de um complexo que activa a transcrio e, noutra situao, como parte de um complexo que reprime a transcrio. Assim, protenas eucariticas de regulao gentica individuais no so necessariamente activadoras ou repressoras exclusivas. Pelo contrrio, elas funcionam como unidades reguladoras que so utilizadas para gerar complexos cuja funo depende da montagem final de todos os componentes individuais. Essa montagem final, por sua vez, depende do arranjo das sequncias de DNA da regio controladora e de quais protenas da regulao gentica esto presentes na clula.
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As protenas de regulao gentica que no se ligam ao DNA, mas associam-se com protenas de regulao gentica ligadas ao DNA, so frequentemente designadas por co-activadoras ou corepressoras, dependendo do seu efeito no incio da transcrio. O mesmo co-activador ou corepressor pode associar-se com diferentes protenas de ligao ao DNA. Os co-activadores ou corepressores normalmente desempenham mltiplas funes: interagem com complexos de remodelao da cromatina, enzimas modificadoras de histonas, RNA polimerase holoenzima e vrios factores gerais de transcrio.
4. Regulao da expresso gentica por repressores e activadores 4.1. Modulao da cromatina
(a) No modelo da desacetilao direccionada por repressor, o complexo SIN3-RPD3 actua como um co-repressor. Os complexos co-repressores contendo desacetilases de histonas tambm foram encontrados associados com vrios repressores das clulas eucariotas. Alguns destes complexos contm um homlogo eucariota para o SIN3 (mSin3), que interage com a protena repressora. Outra desacetilase histnica identificada em clulas eucariotas parece conter protenas adicionais ou diferentes, capazes de se ligarem aos repressores. Estas combinaes repressoras e co-repressoras variadas so imaginadas como mediadoras da desacetilao histnica em promotores especficos, atravs de um mecanismo similar ao que acontece nas leveduras. No entanto, a observao de que um nmero de protenas repressoras eucariotas inibe a transcrio in vitro na falta de histonas, indica que mecanismos repressores directos, que no envolvem a desacetilao histnica, tambm operam. Desta forma, nesta desacetilao, o DNA-binding domain (DBD) do repressor UME6 interage com um elemento controlo especfico localizado acima (URS1), que pertence aos genes que ele regula. O domnio repressor do UME6 (RD) reconhece e liga-se ao SIN3, uma subunidade do complexo multiproteico que inclui a RPD3, a desacetilase histnica. A desacetilao das caudas histnicas no N-terminal dos nucleossomas na regio do local de ligao para o UME6 inibe a ligao dos factores gerais de transcrio na TATA box, reprimindo, consequentemente, a expresso gnica. (b) Na hiperacetilao direccionada por um activador das caudas histnicas no N-terminal, o DNA-binding domain do activador GCN4 interage com sequncias activadoras especficas (UAS) dos genes que regula, localizadas acima. O domnio de activao do GCN4 (AD) interage, seguidamente, com um complexo multiproteico da acetilase histnica, que inclui a subunidade cataltica GCN5. Subsequentemente, a hiperacetilao das caudas histnicas do N-terminal dos nucleossomas na proximidade do local de ligao do GCN4, facilita o acesso dos factores gerais de transcrio requeridos para a iniciao.
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4.2.
Metilao do DNA
A metilao do DNA vertebrado restrita aos nucleotdeos de citosina (C) na sequncia CG, que faz o emparelhamento de bases com a mesma sequncia (em orientao oposta), na outra cadeia da hlice de DNA. Consequentemente, um mecanismo simples permite a existncia de um padro de metilao de DNA a ser herdado directamente pelas cadeias-filhas de DNA. Uma enzima chamada metiltransferase de manuteno actua preferencialmente naquelas sequncias CG que esto emparelhadas com uma sequncia CG que j esteja metilada. Como resultado, o padro de metilao do DNA da cadeia-filha de DNA parental serve como molde para a metilao da cadeia-filha de DNA, tornando esse padro directamente herdvel aps a replicao do DNA.
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Nos vertebrados, a metilao do DNA encontrada principalmente em regies transcripcionalmente silenciosas do genoma, tais como o cromossoma X inactivo ou os genes que so inactivados em certos tecidos, sugerindo que ela desempenha uma funo no silenciamento gnico. As clulas dos vertebrados contm uma famlia de protenas que se ligam ao DNA metilado. Essas protenas de ligao ao DNA, por sua vez, interagem com complexos de remodelao de cromatina e com desacetilases histnicas que condensam a cromatina de tal forma que ela se torna transcripcionalmente inactiva. Apesar disso, a metilao do DNA no suficiente para sinalizar a inactivao de um gene, como os exemplos a seguir demonstram. O DNA plasmdico, a codificar um gene de actina especfico do msculo pode ser preparado in vitro tanto totalmente metilado como totalmente no-metilado, usando-se protenas bacterianas que metilam e desmetilam DNA. Quando essas duas verses do plasmdeo so introduzidas em clulas musculares em cultura, o plasmdeo metilado transcrito na mesma taxa elevada da cpia nometilada. Alm disso, quando um gene silencioso metilado activado durante o curso normal do desenvolvimento, a metilao perdida apenas aps o gene ter sido transcrito por algum tempo. Finalmente, durante a inactivao do cromossoma X, a condensao e o silenciamento ocorrem antes que um aumento dos nveis de metilao do DNA possa ser detectado. Esses resultados sugerem que a metilao refora a represso transcripcional que inicialmente estabelecida por outros mecanismos. A metilao do DNA parece ser usada em vertebrados, principalmente para garantir que, uma vez que um gene seja desactivado, ele continue assim permanentemente. 152 AULA 14 Controlo da expresso gentica e especializao celular |
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4.3.
Inactivao do cromossoma X
Nos mamferos, a compensao de dose alcanada pela inactivao transcripcional de um dos dois cromossomas X nas clulas somticas das fmeas, num processo conhecido como inactivao do cromossoma X. No incio do desenvolvimento de um embrio de fmea, quando este consiste em alguns milhares de clulas, um dos dois cromossomas X em cada clula torna-se altamente condensado num tipo de heterocromatina. O cromossoma X condensado pode ser facilmente observado sob o microscpio ptico nas clulas em interfase, e foi inicialmente chamado de corpsculo de Barr e est localizado prximo da membrana nuclear. Como resultado da inactivao do cromossoma X, dois cromossomas X podem coexistir dentro do mesmo ncleo, expostos s mesmas protenas reguladoras transcripcionais, ainda que difiram inteiramente na sua expresso. A escolha inicial sobre qual cromossoma X inactivar, o herdado da me (Xm) ou o herdado do pai (Xp) feita ao acaso. Uma vez que tanto Xp ou Xm tenha sido inactivado, ele permanece silencioso em todas as divises celulares daquela clula e da sua progenitora, indicando que o estado inactivado fielmente mantido por muitos ciclos de replicao do DNA e de mitoses. Devido ao facto de a inactivao do cromossoma X ser ao acaso e ocorrer aps milhares de clulas terem j sido formadas no embrio, cada fmea um mosaico de grupos clonais de clulas, nos quais tanto Xp como Xm esto silenciosos.
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4.4. Formao do complexo mediador O mediador, complexo multiproteico, assiste mais directamente na formao dos complexos de pr-iniciao da transcrio da RNA polimerase II. Algumas das aproximadamente 20 subunidades do mediador ligam-se RNA polimerase II e outras subunidades ligam-se a domnios de activao em vrias protenas activadoras. Consequentemente, o mediador pode formar uma ponte molecular entre um activador ligado ao seu reconhecedor no DNA e a RNA polimerase II no promotor. Para alm disso, uma das subunidades do mediador contm uma funo de acetilase histnica e pode funcionar para manter a regio promotora num estado hiperacetilado.
No mediador das clulas humanas, as subunidades da mesma cor formam um determinado mdulo e as cor-de-laranja, amarelas e verdes so homlogas com as subunidades do complexo mediador das leveduras. Estudos genticos nestes organismos mostraram que mutaes numa das subunidades do mdulo inibe a associao das outras subunidades no mesmo mdulo com o resto do complexo.
Vrios resultados experimentais indicaram que as subunidades individuais do mediador se ligam a domnios activadores especficos e sugeriram que mltiplos activadores influenciam a transcrio a partir de um nico promotor atravs da interaco com o complexo mediador simultaneamente. Quando a cromatina fica descondensada e hiperacetilada, um activador (SBF) pode ligar-se a vrios locais na regio prxima do promotor. A subsequente ligao do complexo mediador pelo SBF conduz formao do complexo de pr-iniciao da transcrio contendo a RNA polmerase II e os factores gerais de transcrio.
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5. Pontos-chave do controlo transcripcional em expresso gentica de eucariotas
O principal objectivo controlar a execuo precisa de decises durante o desenvolvimento. Os elemento reguladores podem estar localizados prximos ou a vrios kb do promotor. Diferentes regies podem controlar a expresso do mesmo gene em clulas distintas. As protenas repressoras e activadores interagem com co-activadores e co-repressores e so protenas modulares constitudas por domnios funcionais distintos. Exercem a sua funo pela restruturao da cromatina (efeito indirecto) ou pela interaco com a RNA polimerase II e factores gerais de transcrio (efeito directo). A estrutura da cromatina (condensada ou descondensada) regula a transcrio gentica.
B)
Controlo ps-transcripcional da expresso gentica
1. Splicing alternativo Grande parte dos genes eucariotas contm segmentos de sequncias codificantes (exes) interrompidas por sequncias no-codificantes (intres). Tanto os exes como os intres so transcritos para formar um grande transcrito primrio de RNA. Os intres so depois removidos por splicing para formar o mRNA maduro. A maior parte dos intres no especifica a sntese de determinado produto celular, mas apesar disso alguns codificam RNAs funcionais ou protenas. No entanto, os intres desempenham papis
importantes no controlo da expresso gentica. Por exemplo, a presena de intres permite que os exes de um gene se juntem em diferentes combinaes, resultando na sntese de diferentes protenas para o mesmo gene. Este processo, designado por splicing alternativo, ocorre frequentemente em genes de eucariotas complexos e pensa-se que importante para a extenso do reportrio actual de 20 a 25000 genes do genoma humano. AULA 14 Controlo da expresso gentica e especializao celular 155
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2. Longevidade do mRNA Algumas protenas de ligao ao RNA reguladas, podem funcionar como controlo da traduo ou degradao do mRNA, de forma semelhante IRE-BP. Por exemplo, uma protena de ligao ao RNA sensvel ao grupo heme, controla a tradulo do mRNA, condificando a sntese do aminolevulinato (ALA), uma enzima-chave na sntese do grupo heme. Para alm disso, estudos in vitro mostraram que o mRNA codificante da casena, protena do leite, estabilizado pela hormona prolactina e rapidamente degradado na sua ausncia.
3. RNA editing O RNA editing um processo em que a informao muda de nvel no mRNA. encontrado em situaes em que a sequncia codificante no RNA difere da sequncia de DNA de onde foi transcrita. O RNA editing ocorre em duas situaes distintas, com causas distintas. Em clulas eucariticas, existem casos em que a substituio ocorre numa base individual do mRNA, provocando uma mudana da sequncia da protena que codificada. O genoma contm um gene individual e interrompido, cuja sequncia idntica em todos os tecidos, e que apresenta uma sequncia codificante de 4563 codes. Este gene transcrito numa molcula de mRNA que traduzida numa protena de 512 kD, representando a sequncia codificante completa, que sintetizada no fgado. Uma forma mais curta da protena, produzida no intestino, com aproximadamente 250 kD, que consiste na metade do terminal-N da protena completa. transcrita para mRNA, cuja sequncia idntica interior excepto num codo. Esta substituio ocorre pois nenhum gene ou exo alternativo est disponvel no genoma para codificar para a nova sequncia, e alm disso no h alterao no padro de splicing, permitindo concluir que a modificao foi devida a uma alterao directa na sequncia do transcrito. Este tipo de adio raro, mas a apolipoprotena-B (apo-lipo-B) no nica.
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Os eventos de RNA editing na apo-B causam a modificao da C2153 para um uracilo e nos receptores de glutamato, a adenina passa a inosina. Estes eventos so designados de desaminaes, pois o grupo amino do anel nucleotdico removido. Estas alteraes so catalisados por enzimas designadas por citidina e adenosina desaminases, respectivamente. A especificidade destas reaces de RNA editing devida, maioritariamente, s enzimas intervenientes. Desta forma, as enzimas que desaminam os nucletidos apresentam grande particularidade de actuao, como o caso da adenosina desaminase que actua em qualquer resduo de adenina, numa regio de emparelhamento de RNA. As enzimas de RNA editing esto relacionadas com as desaminases gerais, mas tambm apresentam outras subunidades que controlam a sua especificidade no interior desta classe. No caso do editing feito pela apo-B, a subunidade cataltca de um complexo de editing est relacionado com a citidina desaminase das bactrias, mas tambm apresenta uma regio adicional para a ligao do RNA que ajuda a reconhecer o local especfico para o editing. Neste caso, uma adenosina desaminase de caractersticas especiais que reconhece esses locais no receptor de glutamato do RNA. Por fim, no caso da GluR-B RNA, uma regio j com bases emparelhadas, que necessria para o reconhecimento do local alvo de ligao, formada entre a regio editada no exo e a sequncia complementar no intro correspondente. Desta forma, um padro de falta de emparelhamento criado, pois necessrio na regio entre os dois intres complementares, sendo que diferentes sistemas de RNA editing podem apresentar diferentes tipos de sequncias especficas necessrias para o seu substrato.
4. Transposes Os transposes apresentam uma regio central relativamente comprida, que corresponde a um elemento IS, que codifica uma ou duas enzimas necessrias para a transposio, est bloqueada por uma sequncia repetitiva invertida em cada extremidade. Estas sequncias so aparentemente idnticas, mas esto orientadas em direces opostas, sendo que cada uma delas caracterstica de um elemento IS em particular. As sequncias de 5 para 3 no so transpostas com o elemento de insero, sendo consideradas como sequncias que vo ser duplicadas, com uma cpia em cada extremidade, durante a insero do elemento mvel. O comprimento destas sequncias 5- 3 constante para um determinado elemento IS mas a sua sequncia depende do locl de insero e ainda varia com cada transposio do elemento IS. AULA 14 Controlo da expresso gentica e especializao celular 157
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Os transposes movimentam-se atravs de um intermedirio de DNA. O transposo geralmente codifica a protena - enzima especfica transposase, que actua sobre uma sequncia especfica do DNA presente em cada uma das extremidades do transposo inicialmente desconectando-a do DNA adjacente e depois inserindo-a num novo DNAalvo, no havendo necessidade de homologia entre as extremidades do elemento e o local de insero, contudo ele insere-se numa sequncia qual tenha maior afinidade. O elemento de transposio termina com pequenas sequncias repetidas invertidas, e so capazes de gerar pequenas sequncias directas no local de insero.
5. Regulao por hormonas esterides A descoberta de reguladores relevantes veio a partir de um ecr gentico para mutantes com segmentos embrionrios alterados. Nestes casos, vrias gap proteins reprimem a transcrio dos genes, codificando outras gap proteins. Apesar de elas no terem quaisquer ligandos extracelulares, algumas gap proteins assemelham-se a receptores nucleares, que so protenas intracelulares que se ligam a ligandos lipoflicos (por exemplo, hormonas esterides), capazes de atravessar a membrana plasmtica. A maior parte dos complexos receptores dos ligandos actuam como factores de transcrio. A similaridade entre as sequncias das gap proteins e dos receptores nucleares sugere que os gap genes podem resultar da evoluo de genes cuja transcrio foi controlada por sinais que podiam atravessar membranas, como as hormonas esterides. A utilizao desse tipo de genes controlados por sinais, em vez de cascatas de transcrio, poderia explicar a especificao celular que ocorre em estdios muito precoces em vrios animais.
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6. Mecanismos reguladores que conduzem especializao celular Os circuitos de retroalimentao positiva fornecem uma estratgia geral simples para a memria celular ou seja, para o estabelecimento e a manuteno de padres herdveis de transcrio genica. As variaes dessa estratgia simples so usadas amplamente por clulas eucariticas. Vrias protenas de regulao gentica que esto envolvidas no estabelecimento do plano corporal da Drosophila, por exemplo, estimulam a sua prpria transcrio, criando um circuito de retroalimentao positiva que promove a sua sntese continuada; ao mesmo tempo, muitas dessas protenas reprimem a transcrio de genes codificantes para outras protenas de regulao gentica importantes. Assim, um padro sofisticado de comportamento herdado pode ser conseguido com apenas poucas protenas de regulao gentica que afectam reciprocamente a sntese e as actividades umas das outras.
7. RNA interference (RNAi) O RNA interference (RNAi) foi descoberto inesperadamente durante tentativas para experimentalmente manipular a expresso de alguns genes. Os investigadores tentaram inibir a expresso de um gene em C. elegans, microinjectando uma molcula de RNA complementar e de cadeia simples, que iria hibridizar com o mRNA codificado e impedir a sua traduo, por um mtodo designado por inibio antisense. No entanto, em experincias de controlo, molculas de RNA de dupla cadeia, perfeitamente emparelhadas, com cerca de algumas centenas de pares de bases foram muito mais eficazes na inibio da expresso do gene do que a cadeia antisense sozinha.
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A degradao induzida pela cadeia dupla de RNA de todos os RNAs celulares contendo a sequncia que era exactamente a mesma que existia nas cadeias simples de RNA e, consequentemente, descobriu-se que a ribonuclease Dicer era necessria para a formao de siRNAs, sugerindo que a represso da traduo mediada pelo RNAi e pelo miRNA eram processos relacionados. Estudos mais recentes indicam que as duplas cadeias de siRNAs e miRNAs so mais processados em complexos multiproteicos contendo uma das cadeias de RNA. Este RNA-induced silencing complex (RISC) cliva, depois, os RNAs alvo que so precisamente complementares aos siRNAs de cadeia simples.
8. Regulao por represso da traduo do mRNA
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AULA 15 Membranas Biolgicas

1. Estrutura geral das membranas biolgicas A estrutura e a funcionalidade das clulas so criticamente dependentes das membranas biolgicas que as envolvem, que no s permitem separar o interior da clula do ambiente que a envolve, mas tambm permitem definir determinados compartimentos intracelulares nas clulas eucariticas, incluindo o ncleo e determinados organelos celulares. A formao das membranas biolgicas est baseada nas propriedades dos lpidos e todas as membranas celulares partilham uma organizao estrutural comum com bicamadas de fosfolpidos com protenas associadas ao longo delas. Estas protenas membranares so responsveis por vrias funes especializadas, sendo que algumas actuam como receptores que permitem que a clula responda a sinais externos, outras so responsveis pelo transporte selectivo de molculas atravs da membrana e outras participam no transporte de electres e na fosforilao oxidativa. Para alm disso, as protenas membranares tambm controlam interaces entre clulas de organismos multicelulares. A organizao estrutural comum de todas as membranas, consequentemente, vai conduzir a uma grande variedade de processos e funes especficas das membranas.
2. Estrutura bsica das membranas biolgicas As molculas lipdicas da membrana constituem cerca de 50% da maioria das membranas de clulas animais, sendo que quase todo o restante constitudo de protenas. Todas as molculas lipdicas das membranas celulares so anfipticas, tendo uma extremidade hidrofilca (ou polar) e uma extremidade hidrofbica (ou apolar).
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Os lipdeos mais abundantes da membrana biolgica so os fosfolipdeos que tm um grupo polar numa extremidade e duas caudas de hidrocarboneto de caracterstica hidrofbica. As caudas so normalmente compostas por cidos gordos, que podem apresentar diferentes comprimentos (normalmente contm 14 a 24 tomos de carbono). Uma cauda possui, geralmente, uma ou mais ligaes duplas em cis (isto , insaturado), enquanto que a outra cauda no (saturado). As diferenas no comprimento e na saturao da cauda de cidos gordos so importantes, pois influem na habilidade das molculas de fosfolipdeos se empacotarem, afectando assim, a fluidez da membrana.
3. Interaco das molculas com a gua A forma e a natureza anfiptica das molculas de lipdeos so responsveis pela formao espontnea da bicamada lipdica num ambiente aquoso. As molculas hidrofilcas dissolvem-se imediatamente em gua porque contm grupos carregados e grupos polares sem carga que podem formar interaces electrostticas favorveis, ou pontes de hidrognio, com as molculas de gua. As molculas hidrofbicas, pelo contrrio, so insolveis na gua porque todos, ou quase todos, os seus tomos so no-carregados e no-polares e, portanto, no so capazes de formar interaces energeticamente favorveis com as molculas de gua. Se dispersas em gua, elas foram as molculas de gua adjacentes a reorganizarem-se em estruturas semelhantes ao gelo, que envolvem a molcula hidrofbica. Como a acetona polar, pode formar interaces electrostticas favorveis com as molculas de gua, que tambm so polares. Ento, a acetona dissolve-se imediatamente na gua. Ao contrrio, o 2-metilpropano completamente hidrofbico. No consegue formar interaces favorveis com a gua e fora molculas adjacentes de gua a reorganizar-se em estruturas semelhantes ao gelo, que aumentam a energia livre. Este composto, portanto, verdadeiramente insolvel na gua. O smbolo - indica uma carga parcialmente negativa e + indica uma carga parcialmente positiva. Os tomos polares esto mostrados em cores, e os grupos apolares esto mostrados em cinza.
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4. Comportamento dos lpidos em gua As molculas de lipdeos agregam-se espontaneamente direccionado as suas caudas hidrofbicas para o interior e expondo as suas cabeas hidroflicas para a gua. Dependendo da sua forma, eles podem fazer isto de duas formas: podem formar micelas esfricas, com as caudas voltadas para dentro, ou podem formar lminas bimoleculares ou bicamadas, com as caudas hidrofbicas contidas entre as cabeas hidroflicas. Em (A) esto representadas micelas, com as molculas em forma de cunha, enquanto que as molculas de forma cilndrica se compem em duplas camadas. Em (B), uma micela lipdica e uma bicamada lipdica vistas numa seco transversal. As molculas formam espontaneamente uma outra dessas estruturas na gua, dependendo da sua forma.
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5. Bicamadas fosfolipdicas em gua Sendo cilndricas, as molculas de fosfolipdeos formam espontaneamente duplas camadas em ambientes aquosos. Nestes arranjos energicamente mais favorveis, as cabeas hidroflicas voltam-se para gua em cada superfcie da bicamada, e as caudas hidrofbicas esto protegidas da gua no interior. As mesmas foras que fazem com que os fosfolipdeos formem duplas camadas tambm proporcionam uma propriedade de auto-selamento. Uma pequena fenda na bicamada cria um bordo livre em contacto com a gua, sendo que esta situao energeticamente desfavorvel, por isso os lipdeos rearranjam-se espontaneamente para eliminar os ngulos livres. A proibio destes bordos tem uma consequncia importante: a nica forma de uma bicamada evitar a existncia de bordos pelo encerramento em si mesma, formando um compartimento fechado. Este compartimento excepcional, fundamental para a formao de clulas vivas, uma consequncia directa da forma e da natureza anfiptica das molculas de fosfolipdeos.
6. Fosfolipdeos da membrana Quatro principais fosfolipdeos predominam na membrana plasmtica de vrias clulas de mamferos: fosfatidilcolina, fosfatidilserina, fosfatidiletanolamina e esfingomielina. Apenas a fosfatidilserina carrega uma carga global negativa, sendo que as outras trs so electricamente neutras em pH fisiolgico, carregando uma carga positiva e uma negativa. Juntos, esses quatro fosfolipdeos constituem mais de metade da massa de lipdeos na maioria das membranas biolgicas. Outros fosfolipdeos, como o fosfatidilinositol, esto presentes em quantidades menores, mas so funcionalmente importantes. O fosfatidilinositol, por exemplo, tem um papel fundamental na sinalizao celular, sendo importante para a activao da cnase do fosfatidilinositol, enquanto que a fosfatidilserina importante para a activao da PKC e na apoptose, diminuindo a flippase e aumentando a scramblase. Se pensarmos que as membranas lipdicas constituem um solvente bidimensional para protenas na membrana, exactamente como a gua constitui um solvente tridimensional para protenas numa soluo aquosa, compreendemos a necessidade da existncia de uma grande variedade de fosfolipdeos na composio da membrana biolgica. Algumas protenas membranares podem funcionar apenas na presena de grupos especficos da cabea dos fosfolipdeos, da mesma forma que muitas enzimas em soluo aquosa necessitam de um determinado io para serem activas. Alm disso, algumas enzimas citoslicas ligam-se a grupos especficos da cabea de fosfolipdeos expostos na face citoslica da membrana e so, assim, recrutados e concentrados em locais especficos da membrana.
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7. Fluidez da membrana A fluidez de uma bicamada fosfolipdica depende tanto da sua composio quanto da sua temperatura, como imediatamente demostrado em estudos com duplas camadas sintticas. Uma bicamada sinttica feita com um nico tipo de fosfolipdeo muda de um estado lquido para um estado cristalino rgido e bidimensional num ponto de congelao caracterstico. Essa mudana de estado chamada transio de fase e a temperatura na qual ocorre mais baixa (isto , a membrana torna-se mais difcil de congelar) se as cadeias de hidrocarboneto so mais curtas ou tm ligaes duplas. Um comprimento curto da cadeia reduz a tendncia das caudas de hidrocarboneto interagirem entre si, e as ligaes duplas em cis produzem flexes nas cadeias de hidrocarboneto que tornam mais difcil agrup-las, logo a membrana vai permanecer fluida em temperaturas mais baixas.
As bactrias, as leveduras e outros organismos, cujas temperaturas flutuam de acordo com o ambiente em que se encontram, ajustam a composio de cidos gordos dos seus lipdeos membranares para manter uma fluidez relativamente constante. Quando a temperatura cai, por AULA 15 Membranas Biolgicas 165
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exemplo, so sintetizados cidos gordos com mais ligaes duplas em cis, impedindo, dessa forma, que a fluidez da bicamada seja diminuda em consequncia da queda de temperatura.
8. Colesterol A bicamada lipdica de muitas membranas celulares no , porm, composta exclusivamente de fosfolipdeos, sendo que frequentemente tambm contm colesterol e glicolipdeos. As membranas plasmticas de eucariotas contm quantidades especialmente grandes de colesterol at uma molcula para cada molcula de fosfolipdeos. As molculas de colesterol aumentam as propriedades de barreira de permeabilidade das duplas camadas lipdicas. Eles orientam-se na bicamada com os seus grupos hidroxilo prximos aos grupos das cabeas polares das molculas de fosfolipdeos. Nesta posio, o seu anel esteride rgido e em forma de placa interage e imobiliza as regies das cadeias de hidrocarboneto mais prximas aos grupos das cabeas polares. Por meio da reduo da mobilidade de alguns dos primeiros grupos CH2 das cadeias de hidrocarboneto das molculas de fosfolipdeos, o colesterol torna a bicamada lipdica menos sujeita a deformaes nesta regio e, assim, diminui a permeabilidade da bicamada a pequenas molculas hidrossolveis. Apesar de o colesterol apresentar a tendncia de tornar a bicamada lipdica menos fluida, nas altas concentraes encontradas na maioria das membranas plasmticas de eucariotas, tambm impede as cadeias de hidrocarboneto de se aproximarem e cristalizarem. Dessa forma, ele inibe possveis transies de fase.
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Em suma, o colesterol apresenta trs principais funes: Reduz a mobilidade dos fosfolipdeos; Reduz a permeabilidade; Previne a cristalizao.
9. Assimetria da membrana Tal como referido anteriormente, as membranas plasmticas das clulas animais contm quatro principais fosfolipdeos: fosfatidilcolina, fosfatidiletanolamina, fosfatidilserina e esfingomielina, que na totalidade formam mais de metade do componente lipdico das membranas. Estes fosfolipdeos esto distribudos assimetricamente entre as duas metades da bicamada que constitui a membrana. A parte externa da membrana plasmtica consiste principalmente em fosfatidilcolina e esfingomielina, enquanto que a fosfatidiletanolamina e a fosfatidilserina so os fosfolipdeos predominantes da parte interna da membrana. As cabeas da fosfatidilserina e do fosfatidilinositol so carregadas negativamente, fazendo com que a sua predominncia na parte interna da membrana resulte numa carga negativa na face citoslica da membrana plasmtica. Um quinto fosfolipdeo, o fosfatidilinositol, tambm se encontra localizado na parte interna da membrana plasmtica, mas existe como um componente muito menor da membrana, desempenhando principalmente funes na sinalizao celular.
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Para alm dos fosfolpidos, tambm existem os glicolpidos e o colesterol, sendo que os glicolpidos se encontram maioritariamente do lado externo da membrana enquanto que o colesterol se encontra em ambas as partes da membrana.
10. Glicolpidos Os glicolpidos so encontradas exclusivamente na monocamada no-citoslica da bicamada lipdica, onde se supe desempenhem um papel na separao celular, principalmente em bolsas lipdicas. Os glicolpidos tendem a associar-se, em parte por meio de pontes de hidrognio entre os seus acares e, em parte, por meio das foras de van der Waals entre as suas longas e predominantemente saturadas cadeias de hidrocarboneto. A distribuio assimtrica de glicolpidos na bicamada resulta da adio de grupos de acares s molculas de lpidos no lmen do complexo de Golgi, que topologicamente equivalente ao exterior da clula. Na membrana plasmtica, os grupos de acares se encontram expostos na superfcie celular, onde eles desempenham importantes funes na interaco das clulas com o ambiente circundante. Os mais complexos dos glicolpidos so os gangliosdeos, contendo oligossacardeos com um ou mais resduos de cido silico, o que confere aos gangliosdeos uma carga final negativa. So mais abundantes na membrana plasmtica das clulas nervosas, onde os gangliosdeos constituem cerca de 5 a 10% da massa de lipdeos total, tambm so encontrados, em quantidades muito menores, em outros tipos celulares.
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(A) O galactocerebrosdeo considerado um glicolpido neutro, porque o acar que forma o grupo da sua cabea no carregado. (B) Um gangliosdeo geralmente contm um ou mais resduos de cido silico carregados negativamente (tambm chamado de cido N-acetilneuramnico. Enquanto que em bactrias e plantas quase todos os glicolpidos so derivados do glicerol, como a maioria dos fosfolipdeos, nas clulas animais so quase sempre produzidos a partir da serina, como o caso do fosfolipdeo esfingomielina.
11. Interaco das protenas com a membrana Existem duas principais classes de protenas associadas membrana plasmtica: perifricas e integrais. As protenas perifricas foram operacionalmente definidas como protenas que se dissociam da membrana atravs de tratamentos com reagentes polares, como solues de pH extremo ou com concentraes muito elevadas de sais que no corrompem a bicamada fosfolipdica. Uma vez dissociadas da membrana, as protenas perifricas so solveis em solues aquosas. Estas protenas no esto inseridas dentro da parte hidrofbica da bicamada lipdica. Em vez disso, encontram-se indirectamente associadas s membranas atravs de interaces protena-protena. Geralmente estas interaces envolvem pontes inicas, que so depois quebradas atravs de pH extremo ou elevadas concentraes de sais. Em contraste com as protenas perifricas, as protenas integrais podem ser libertadas atravs de tratamentos que quebrem a bicamada fosfolipdica. Pores destas protenas integrais so inseridas na bicamada lipdica, para que possam ser dissociadas apenas por reagentes que quebram ligaes hidrofbicas. Os reagentes mais comuns para solubilizar protenas integrais so detergentes, que so pequenas molculas anfipticas que contm grupos tanto hidrofbicos como hidroflicos. As pores hidrofbicas dos detergentes retiram os lpidos das suas posies originais e ligam-se s pores hidrofbicas das protenas integrais. Tendo em conta que a outra extremidade do
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detergente hidroflica, ento os complexos detergente-protena tambm vo ser solveis em solues aquosas. Grande parte das protenas integrais so protenas transmembranares, que atravessam a bicamada lipdica com pores expostas dos dois lados da membrana. Estas protenas podem ser visualizadas atravs de micrografia electrnica das membranas plasmticas preparadas previamente por congelao.
12. Protenas transmembranares As diferentes protenas da membrana esto associadas s membranas de formas distintas. Muitas atravessam a bicamada lipdica, com uma parte da sua massa em cada lado e tal como os lpidos circundantes, estas protenas transmembranares so anfipticas, possuindo regies que so hidrofbicas e regies que so hidroflicas. As regies hidrofbicas atravessam a membrana e interagem com as caudas hidrofbicas das molculas lipdicas no interior da bicamada, onde se encontram isoladas da gua. As regies hidroflicas ficam expostas gua nos dois lados da membrana. A hidrofobicidade de algumas destas protenas transmembranares aumentada por 170 AULA 15 Membranas Biolgicas |
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meio da ligao covalente de uma cadeia de cido gordo que se insere na monocamada citoslica da bicamada lipdica.
Acredita-se que a maioria das protenas transmembranares atravessam a bicamada como (1) uma hlice nica, (2) como mltiplas hlices ou como folhas pregueadas (no representadas na imagem). Algumas destas protenas de passagem nica ou de mltiplas passagens atravs da membrana tm uma cadeia de cidos gordos covalentemente ligada, inserida na monocamada lipdica citoslica. Outras protenas da membrana esto expostas apenas num lado da membrana. Algumas dessas esto ancoradas superfcie citoslica por meio de uma hlice anfiptica que separa a monocamada citoslica da bicamada lipdica atravs da face hidrofbica da hlice. (3) Outras, esto ligadas bicamada apenas por meio de uma cadeia lipdica covalentemente ligada uma cadeia de cido gordo ou um grupo prenilo na monocamada citoslica ou, (4) por meio de um oligossacardeo ligante, ao fosfatidilinositol na monocamada no-citoslica. (5) e (6) representam muitas protenas que esto ligadas membrana apenas por interaces no-covalentes com outras protenas de membrana.
12.1.
Hlices
Como as protenas transmembranares so difceis de cristalizar, relativamente poucas tm sido estudadas na sua totalidade por meio de cristalografia de raios X. O pregueamento da estrutura tridimensional de quase todas as outras incerto. As tcnicas de clonagem molecular e de sequenciamento, no entanto, revelaram a sequncia de aminocidos de um grande nmero de protenas transmembranares e, frequentemente, possvel prever, a partir da anlise da sequncia proteica, quais as cadeias da molcula polipeptdica que atravessam a bicamada lipdica. Os segmentos contendo cerca de 20 a 30 aminocidos com um alto grau de hidrofobicidade so suficientemente longos para atravessar uma bicamada fosfolipdica em forma de hlice , e eles podem ser frequentemente identificados por meio de uma plotagem de hidropatia. A partir destas plotagens, possvel prever qual a proporo das protenas que um organismo fabrica de protenas transmembranares.
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A glicoforina possui uma nica hlice que atravessa a membrana e um pico correspondente na plotagem de hidropatia. A bacteriorodopsina possui sete hlices e sete picos correspondentes na plotagem de hidropatia.
12.2.
Folhas
Apesar de grande parte das protenas transmembranares ser da classe das hlices , nem todas apresentam esta conformao. Uma excepo bem caracterizada so as porinas, que constituem uma classe de protenas que formam canais na membrana externa de algumas bactrias. Vrias bactrias, como a E. coli, apresentam um sistema duplo de membranas em que a membrana plasmtica (ou interna) rodeada pela parede celular e por uma segunda membrana. Em contraste com a membrana plasmtica, a membrana externa altamente permevel a ies e pequenas molculas polares, sendo que esta permeabilidade resulta das porinas, que formam os canais aquosos atravs da bicamada lipdica.
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13. Funes da membrana plasmtica A membrana plasmtica apresenta principal funo de barreira para factores externos a ela que possam existir no ambiente externo clula. Para alm disso, todas as protenas membranares que nela existem actuam como transportadores, enzimas, transductores de sinais, receptores ou canais inicos.
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1. Permeabilidade das membranas A difuso passiva um processo no-selectivo pelo qual qualquer molcula capaz de se dissolver na bicamada fosfolipdica capaz de atravessar a membrana plasmtica e equilibrar-se entre o interior e o exterior da clula. Torna-se, ento, importante de referir que apenas molculas pequenas e relativamente hidrofbicas so capazes de se difundir atravs da bicamada fosfolipdica em taxas significativas. Consequentemente, gases (como o O2 e o CO2), molculas hidrofbicas (como o benzeno) e molculas polares, pequenas e sem carga (como a gua e o etanol) so capazes de atravessar a membrana plasmtica por difuso passiva. Outras molculas biolgicas, no entanto, so incapazes de se dissolver no interior hidrofbico da bicamada fosfolipdica. Consequentemente, molculas polares e sem carga de maiores dimenses como a glicose so incapazes de atravessar a membrana plasmtica por difuso passiva, bem como molculas com carga, qualquer que seja o seu tamanho (incluindo pequenos ies como H+, Na+, K+ e Cl-). A passagem destas molculas atravs da membrana requer a actividade de protenas canais e transportadoras especficas, que tambm permite assim controlar o trfego de grande parte das molculas biolgicas do interior para o exterior da clula e vice-versa.
2. Difuso passiva e difuso facilitada A difuso passiva o mecanismo mais simples pelo qual as molculas podem atravessar a membrana plasmtica. Durante a difuso passiva, uma molcula simplesmente dissolve-se na bicamada fosfolipdica, difunde-se atravs dela, e seguidamente dissolve-se na soluo aquosa do lado externo da membrana. Nenhumas protenas membranares esto envolvidas no processo e a direco do transporte determinada apenas pelas concentraes relativas da molcula dentro e fora da clula. O fluxo natural de molculas feito sempre de acordo com o seu gradiente de AULA 16 Transporte Transmembranar 175
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concentrao, desde o compartimento onde est em maior concentrao para o compartimento onde est em menor concentrao. A difuso facilitada, tal como a difuso passiva, envolve o movimento de molculas na direco determinada pelas suas concentraes relativas dentro e fora da clula. No h qualquer fonte externa de energia, pelo que as molculas apenas se movem na direco determinada pelos seus gradientes de concentrao e, no caso de molculas com carga, pelos potenciais elctricos atravs da membrana. No entanto, a difuso facilitada difere da difuso passiva porque as molculas transportadas no se dissolvem na bicamada fosfolipdica. Neste caso, a passagem mediada por protenas que permitem que as molculas transportadas atravessam a membrana sem uma interagirem directamente com o seu interior hidrofbico. Assim, a difuso facilitada permite que molculas polares e carregadas, como os hidratos de carbono, aminocidos, nuclesidos e ies, consigam atravessar a membrana plasmtica. As duas principais classes de protenas que mediam a difuso facilitada so as protenas transportadoras que reconhecem e se ligam a molculas especficas para as transportarem de um lado da membrana. Depois sofrem modificaes conformacionais que permitem que a molcula passe atravs da membrana e seja libertada no outro lado. Em contraste, as protenas canais formam poros abertos atravs da membrana, permitindo que haja uma difuso livre de qualquer molcula com tamanho e carga apropriados.
3. Transporte activo O transporte activo o processo pelo qual protenas de transporte bombeiam activamente certos solutos atravs da membrana, contra o seu gradiente electroqumico, sendo mediado por transportadores, que so designados por bombas. No transporte activo, a actividade bombeadora da protena transportadora direccional, porque ela fortemente acoplada a uma fonte de energia metablica, tal como a hidrlise de ATP ou um gradiente inico. Assim, o transporte atravs de protenas transportadoras pode ser activo ou passivo, enquanto que o transporte por protenas canais sempre passivo.
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3.1. Fontes de energia para o transporte activo Para ocorrer o transporte activo sempre necessria uma modificao relativamente pequena do modelo molecular em causa, para ligar a protena transportadora a uma fonte de energia para bombear um soluto contra o seu gradiente electroqumico. As clulas realizam tal transporte activo de trs formas principais: Os transportadores acoplados acoplam o transporte para cima de um soluto atravs da membrana ao transporte para baixo de outro. As bombas accionadas por ATP acoplam o transporte para cima hidrlise de ATP. As bombas accionadas por luz, que so encontradas principalmente em clulas bacterianas, acoplam o transporte para cima a um aporte de energia luminosa, como com bacteriorodopsina.
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3.2. Tipos de transporte activo Algumas protenas transportadoras simplesmente transportam um nico soluto de um lado ao outro da membrana a uma taxa de transporte, com velocidade mxima de ligao e constante de ligao, sendo denominadas de uniporte. Outras, com cintica mais complexa, actuam como transportadores acoplados, nos quais a transferncia de um soluto depende estritamente do transporte de um segundo. O transporte acoplado envolve a transferncia simultnea de um segundo soluto na mesma direco, realizado pelos simportes, ou a transferncia de um segundo soluto na direco oposta, realizado por antiportes.
3.3. Transporte no epitlio intestinal Em clulas epiteliais, como aquelas envolvidas na absoro de nutrientes do intestino, as protenas transportadoras esto distribudas de maneira no uniforme na membrana plasmtica e, portanto, contribuem para o transporte transcelular de solutos absorvidos. Os simportes Na+-ligados localizados no domnio apical (absortivo) da membrana plasmtica transportam activamente nutrientes para a clula, formando gradientes de concentrao substanciais para esses solutos atravs da membrana plasmtica. As protenas de transporte Na+-independentes no domnio basal e lateral (basolateral) permitem a sada passiva de nutrientes da clula a favor desse gradiente de concentrao. Em muitas dessas clulas epiteliais, a rea de membrana plasmtica grandemente aumentada pela formao de milhares de microvilosidades, que se estendem como finas projeces em forma de dedo a partir da superfcie apical de cada clula. Tais microvilosidades podem aumentar a rea de absoro total de uma clula em mais de 25 vezes, aumentando, portanto, a sua capacidade transportadora.
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3.3.1. Transporte de glicose mediado por gradiente de Na+ As clulas epiteliais proporcionam um dos melhores exemplos de transporte activo mediado pelo gradiente de Na+. Estas clulas utilizam o transporte activo para realizarem o mecanismo de absoro, em que se permite a absoro de glicose para o interior da corrente sangunea. Neste mecanismo, o transportador coordenadamente reconhece e transporta uma molcula de glicose e dois ies Na+ para o interior da clula. O transporte de Na+ energeticamente favorvel numa determinada direco e com isso conduz a um transporte de glicose contra o seu gradiente de concentrao.
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3.3.2. Difuso facilitada de glicose Tal como muitas protenas membranares, a estrutura tridimensional do transportador de glicose no conhecida, pelo que o mecanismo molecular do transporte de glicose permanece desconhecido. No entanto, estudos cinticos indicam que o transportador de glicose actua por alternncia entre dois estados conformacionais diferentes, consoante o local de ligao para a glicose se encontra voltado para o interior ou para o exterior da clula. No principal, a glicose liga-se a um local exposto no lado externo da membrana plasmtica. O transportador vai sofrer uma alterao conformacional, o local de ligao da glicose passa a estar voltado para o interior da clula e a glicose libertada no citosol e no final, o transportador regressa sua conformao original.
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3.3.3. Bomba sdio-potssio O fluxo inico atravs dos canais membranares dependente do estabelecimento de gradientes inicos atravs da membrana plasmtica. Todas as clulas, incluindo as clulas nervosas e musculares, contm bombas inicas que utilizam energia derivada da hidrlise de ATP para activar o transporte de ies atravs da membrana plasmtica. Como resultado, a composio inica do citoplasma substancialmente diferente da dos fluidos extracelulares. Por exemplo, o Na+ activamente bombeado para fora das clulas enquanto que o K+ bombeado para dentro. Assim, a concentrao externa de Na+ cerca de 10 vezes maior que intracelularmente, enquanto que a concentrao de K+ cerca de 20 vezes maior no citosol do que meio envolvente. As bombas inicas responsveis por manter os gradientes inicos atravs da membrana plasmtica proporcionam exemplos importantes do transporte activo dominado pela hidrlise de ATP. Tal como referido anteriormente, a concentrao de Na+ maior extracelularmente enquanto que a concentrao de K+ maior no citosol. Estes gradientes inicos so mantidos atravs da bomba de Na+/K+ que tem actividade de ATPase, utilizando energia derivada da hidrlise de ATP para transportar Na+ e K+ contra os seus gradientes electroqumicos e este processo o resultado de alteraes conformacionais derivadas do ATP na bomba. Em primeiro lugar, os ies Na+ ligam-se a locais de grande afinidade no interior da clula. Esta ligao estimula a hidrlise de ATP e a fosforilao da bomba, induzindo uma alterao conformacional que expe os locais de ligao do Na+ para o exterior da clula e reduz a afinidade deles. Consequentemente, o Na+ ligado libertado para os fluidos extracelulares. Ao mesmo tempo, so expostos na superfcie celular locais de grande afinidade para o K+, ocorrendo a sua ligao. Com este processo, estimulada a hidrlise do grupo fosfato ligado bomba, induzindo uma segunda alterao conformacional desta, que vai expor os locais de ligao do K+ para o interior da clula, diminuir a sua afinidade e libertar o K+ no citosol. A bomba apresenta 3 locais de ligao para o Na+ e 2 para o K+, pelo que ocorre essa transferncia inica por cada molcula de ATP gasta.
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3.3.4. Transporte de clcio e hidrognio mediado por gradiente de sdio O transporte coordenado de glicose e sdio um exemplo de simporte, ocorrendo o transporte de duas molculas na mesma direco. Em contraste, a difuso facilitada de glicose um exemplo de uniporte, ocorrendo o transporte de uma nica molcula. O transporte activo tambm pode ter lugar nos casos de antiporte em que duas molculas so transportadas em direces opostas. Por exemplo, o clcio exportado das clulas no s pela bomba de clcio mas tambm pelo antiporter Na+/Ca2+ que transporte Na+ para dentro da clula e Ca2+ para fora. Outro exemplo da protena de troca Na+/H+ que actua na regulao do pH intracelular. O antiporter Na+/H+ acopla o transporte de Na+ para dentro da clula com a exportao de H+, removendo um excesso possvel de H+ produzido pelas reaces metablicas e prevenindo a acidificao do citoplasma.
4. Canais inicos Existem dois principais tipos de canais inicos: os que so activados (abertos) por um determinado estmulo e os que tm um filtro selectivo para ies (Na+, Cl-, K+, Ca2+).
4.1. Canais inicos de fuga Estes canais, na sua conformao fechada, apresentam o seu fluxo inico fechado e bloqueado por uma porta. A abertura desta porta permite que os ies fluam rapidamente atravs do canal. Este canal contm um poro que restringe a passagem de ies com carga e tamanho apropriados. Estes canais, para actuarem, no tm de sofrer
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estmulo sendo a sua funo principal a gerao de um potencial de estmulo (-70 mV). O principal exemplo destes canais o canal de K+. 4.2. Canais inicos activados por voltagem Estes canais so responsveis pela gerao de potenciais de aco. Um potencial de aco desencadeado pela despolarizao da membrana plasmtica, ou seja, por uma alterao no potencial de membrana para um valor menos negativo. Em clulas nervosas e musculoesquelticas, um estmulo que cause suficiente despolarizao prontamente causa a abertura de canais de Na+ controlados por voltagem, permitindo a entrada de uma pequena quantidade de Na+ na clula a favor do seu gradiente electroqumico. O influxo de cargas positivas despolariza a membrana ainda mais, abrindo, portanto, mais canais de Na+, os quais admitem mais ies Na+, desencadeando mais despolarizao. Esse processo continua de uma maneira auto-amplificante at que, dentro da fraco de um 1ms, o potencial elctrico na regio local da membrana se tenha deslocado do seu valor de repouso de cerca de -70 mV at quase o potencial de equilbrio do Na+, em torno de +50 mV. Na maioria das clulas nervosas, os canais de K+ controlados por voltagem fornecem um segundo mecanismo para auxiliar no retorno mais rpido do potencial negativo original da membrana plasmtica activa, pronta para transmitir um segundo impulso. Estes canais abrem, de modo que o influxo transitrio de Na+ rapidamente superado por um fluxo de K+, o qual rapidamente traz a membrana de volta ao potencial de equilbrio de K+, mesmo antes e a inactivao dos canais de Na+ estar completa. Esses canais de K+ respondem a mudanas no potencial de membrana de forma muito similar aos canais de Na+, mas com uma cintica levemente menor e, por essa razo, so algumas vezes denominados de delayed-rectifier. 4.3. Canais inicos activados por transmissor extracelular Estes canais so especializados em converter rapidamente os sinais qumicos extracelulares em sinais elctricos, nas sinapses qumicas. Os canais esto concentrados na membrana plasmtica da clula ps-sinptica na regio de sinapse e abrem-se temporariamente em resposta ligao de molculas neurotransmissoras, produzindo, dessa forma, uma breve mudana de permeabilidade da membrana. Diferentemente dos canais controlados por voltagem responsveis por potenciais de aco, os canais controlados por transmissor so relativamente insensveis ao potencial de membrana e, por isso, no podem produzir uma excitao auto-amplificada. Em vez disso, eles produzem mudanas de permeabilidade local e, portanto, mudanas de potencial de membrana, que so graduadas de acordo com a quantidade de neurotransmissor libertado na sinapse e o tempo de persistncia da mesma.
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4.4. Canais inicos activados por ligando intracelular O canal de K+ activado por Ca2+ tanto estrutural quanto funcionalmente diferente de qualquer tipo de canal descrito antes. Ele abre em resposta a um aumento na concentrao de Ca2+ na face citoslica da membrana celular nervosa. Supondo que um forte estmulo despolarizante aplicado por um longo perodo, vai gerar-se uma longa srie de potenciais de aco. Cada potencial de aco permite um breve influxo de Ca2+ pelos canais de Ca2+ controlados por voltagem, de tal forma que a concentrao de Ca2+ intracelular atinge, gradualmente, um nvel alto o suficiente para abrir os canais de K+ activados por Ca2+. Devido ao restante aumento da permeabilidade da membrana ao K+ tornar a membrana mais difcil de despolarizar, ela aumenta o atraso entre um potencial de aco e o prximo. Dessa forma, um neurnio que estimulado de modo contnuo por um perodo prolongado torna-se gradualmente menos afectado pelo estmulo constante.
4.5. Canais inicos activados por estmulo mecnico Os canais activados por estmulo mecnico so activados por estmulos ou presses mecnicas, sendo principalmente canais que permite o transporte de caties. Assim, a sua principal funo a transferncia de estmulos mecnicos em resposta a uma comunicao elctrica.
4.6. Canais inicos de gap junction Os canais activados de gap junction so construdos por protenas transmembranares da famlia das conexinas, que consiste em pelo menos 21 protenas humanas diferentes. Seis conexinas juntamse para formar um cilindro por um poro aquoso aberto no centro. Este conexoma (conjunto de conexinas) situado na membrana plasmtica vai-se alinhar com outro conexoma da clula adjacente, formando um canal aberto entre os dois citoplasmas. As membranas plasmticas das duas clulas so separadas por um espao correspondente ao espao ocupado pelos domnios extracelulares das conexinas.
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4.7. Canal de sdio dependente de voltagem Quando o potencial de membrana despolarizado, o canal abre-se e comea a conduzir ies. Se a despolarizao for mantida, o canal aberto adopta uma conformao inactiva, na qual o poro est obliterado por uma esfera de 20 aminocidos da regio do N-terminal, ligada ao canal por um segmento de cadeia polipeptdica desenovelada que serve como cadeia. Para simplificar, apenas duas esferas so exibidas na imagem; de facto, existem quatro, uma de cada subunidade. Um mecanismo semelhante, utilizando um segmento diferente da cadeia polipeptdica, parece operar na inactivao do canal de Na+. As foras internas estabilizam cada estgio contra pequenos distrbios, mas uma coliso suficientemente violenta com outras moolculas pode causar uma troca do canal de um desses estados para outro. O estado de menor energia depende do potencial de membrana, porque as diferentes conformaes possuem distribuio diferente de cargas. Quando a membrana est em repouso (fortemente polarizada), a conformao fechada apresenta a menor energia livre e , portanto, mais estvel, quando a membrana despolarizada, a energia da conformao aberta menor e assim o canal apresenta alta probabilidade de abrir. Mas a energia livre da conformao inactiva menor ainda; portanto, aps um perodo aleatoriamente varivel gasto no estado aberto, o canal torna-se inactivo. Assim, a conformao aberta corresponde a um estado meta-estvel que pode existir apenas temporariamente.
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4.7.1. Filtro inico do canal de sdio Um grau relativamente grande de selectividade inica visualizado nos canais de Na+ dependentes de voltagem e nos canais de K+. Os canais de Na+ so dez vezes mais permeveis ao Na+ do que ao K+, enquanto que os canais de K+ so cerca de mil vezes mais permeveis ao K+ do que ao Na+. A selectividade dos canais de Na+ pode ser explicada, em parte, na base em que o poro dos canais actua como um filtro de acordo com o tamanho das molculas. O raio inico do Na+ mais pequeno que o do K+ e pensa-se que o canal de Na+ estreito o suficiente para interferir com a passagem dos ies K+ ou ies ainda maiores.
4.7.2. Filtro inico do canal de potssio Os canais de K+ tambm apresentam poros relativamente estreitos, que impedem a passagem de ies de maiores dimenses. No entanto, como o Na+ apresenta um menor raio inico que o K+, ento este factor no pode estar relacionado com a selectividade do canal de K+. Assim, esta selectividade baseada num mecanismo diferente dos canais de Na+, em que o poro contm uma filtro selectivo que delineado por molculas de carbonilo (C=O). Quando um io K+ atravessa o filtro de selectividade, as interaces entre os oxignios carbonlicos retira as molculas de gua do lugar original onde os ies K+ esto ligados, permitindo que ies K+ desidratados atravessem o poro. Em contraste, o Na+ desidratado demasiado pequeno para interagir com os oxignios carbonlicos do poro que se encontra sempre rigidamente aberto. Consequentemente, o Na+ permanece ligado s molculas de gua como um complexo hidratado que demasiado grande para atravessar o poro.
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