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L-3 - Tecnica Tubos Multiplos

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TÉCNICA DE ANÁLISE DA POTABILIDADE DA ÁGUA ATRAVÉS DA TÉCNICA TUBOS MÚLTIPLOS
TÉCNICA DE ANÁLISE DA POTABILIDADE DA ÁGUA ATRAVÉS DA TÉCNICA TUBOS MÚLTIPLOS

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“ ÁGUA “ FONTE DA VIDA

1.

INTRODUÇÃO

A água encontra-se disponível na natureza sob várias formas e é uma das substâncias mais comuns, cobrindo cerca de 70% da superfície do planeta. É encontrada principalmente no estado líquido, constituindo um recurso natural renovável por meio de ciclo. Cerca de 97,4% da água do planeta está presente nos oceanos e mares, 2% está armazenada nas geleiras e apenas 1% está disponível para o uso, armazenada nos lençóis subterrâneos, lagos, rios e na atmosfera. A água é essencial à vida, o que significa que todos os organismos vivos, incluindo o homem, dependem dela para sobrevivência. Mas é fundamental que os recursos hídricos apresentem condições físicas e químicas adequadas para utilização pelos organismos. Disponibilidade de água significa que ela esteja presente, não somente em quantidade adequada em uma dada região, mas também que sua qualidade seja satisfatória para suprir as necessidades de um determinado conjunto de seres vivos. Através dos séculos, a complexidade dos usos múltiplos da água pelo homem aumentou e produziu enorme conjunto de degradação e poluição. Por outro lado, os usos excessivos e as retiradas permanentes para diversas finalidades têm diminuído muito a disponibilidade de água e produzindo inúmeros problemas de escassez.

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O desenvolvimento industrial, o crescimento demográfico e a ocupação do solo de forma intensa e acelerada vêm provocando o comprometimento dos recursos hídricos disponíveis para consumo humano, recreação e outras atividades, aumentando consideravelmente o risco de doenças de transmissão hídrica. Um dos grandes problemas ambientais da atualidade é a qualidade da água, que tem sido intensamente deteriorada em países desenvolvidos e em desenvolvimento, apresentando, desta forma, um risco potencial de

comprometimento à saúde e ao bem-estar do homem. Certamente, o melhor método de assegurar água adequada para consumo consiste no desenvolvimento de políticas de proteção, evitando as contaminações que podem ocorrer e a exposição das pessoas a riscos de doenças. A qualidade de vida dos seres humanos está diretamente ligada à água, pois ela é utilizada para o funcionamento adequado de seu organismo, preparo de alimentos, higiene de pessoas e utensílios. A água usada para abastecimento doméstico deve apresentar características sanitárias e toxicológicas adequadas, deve estar isenta de organismos patogênicos e de substâncias tóxicas, para prevenir danos à saúde e favorecer o bem estar das pessoas. As doenças transmitidas pela água são responsáveis por mais da metade das internações hospitalares no Brasil e por quase a metade das mortes de crianças até um ano de idade.

2. OBJETIVO

O ensaio Presuntivo e Confirmativo realizado tem por objetivo analisar, detectar e quantificar a presença/ausência do grupo Coliforme, sejam eles Totais ou Termotolerantes (Fecais) em uma determinada amostra, utilizando-se da Técnica dos Tubos Múltiplos e quantificação pelo NMP Número Mais Provável. As águas de abastecimento apresentam o risco de serem poluídas por águas residuárias e excretas de origem humana ou animal, podendo, desta forma, conter organismos patogênicos, tornando-se assim um veículo de transmissão de doenças.
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Por isso, impõe-se a necessidade de exames rotineiros das mesmas, para determinar seu grau de segurança do ponto de vista bacteriológico. Embora já existam métodos desenvolvidos para detecção de vários organismos patogênicos de veiculação hídrica, os mesmos não são aplicados na rotina devido ao alto custo e necessidade de pessoal especializado. Além disso, uma vez que o lançamento de organismos patogênicos nos esgotos é intermitente e está na dependência das condições de saúde da população, é possível que, em determinadas ocasiões, não se detectem esses organismos na água, porém sua ausência não indica que a mesma seja segura. Para a avaliação das condições sanitárias de uma água, utilizam-se bactérias do grupo coliforme, que atuam como indicadores de poluição fecal, pois estão sempre presentes no trato intestinal humano e de outros animais de sangue quente, sendo eliminadas em grandes números pelas fezes. A presença de coliformes na água indica poluição, com o risco potencial da presença de organismos patogênicos, e sua ausência é evidência de uma água bacteriologicamente potável, uma vez que são mais resistentes na água que as bactérias patogênicas de origem intestinal. Como o grupo dos coliformes totais incluí gêneros que não são de origem exclusivamente fecal, isto limita sua aplicação como indicador específico de contaminação fecal. O reconhecimento deste fato levou ao desenvolvimento de métodos de enumeração de um subgrupo de coliformes denominados coliformes fecais (coliformes termotolerantes), os quais são diferenciados dos coliformes totais pela sua capacidade de fermentar a lactose em temperatura elevada (44,50C). Embora a utilização dos coliformes fecais, em substituição aos totais, tenha determinado uma melhoria significativa na detecção da contaminação fecal, logo se tornou evidente a existência de outros coliformes

termotolerantes além de E.coli (principalmente Klebsiella), os quais, por não serem de origem exclusivamente fecal, comprometiam a especificidade deste subgrupo para a finalidade proposta. Em decorrência disto, as tendências atuais se direcionam para a detecção específica de E. Coli, que é o único componente do grupo coliforme de origem exclusivamente fecal.

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são obtidos inóculos. oxidase-negativos. O reconhecimento deste fato levou ao desenvolvimento de métodos de enumeração de um subgrupo de coliformes denominados coliformes fecais (coliformes termotolerantes). 3.1 ORGANISMOS PATOGÊNICOS Organismos patogênicos são aqueles que transmitem doenças pela ingestão ou contato com água contaminada. usando séries de 5 tubos para cada volume a ser inoculado. através da aplicação de cálculos de probabilidade. DEFINIÇÕES 3.5°C). 3. como: bactérias. não formadores de esporos. Consiste na inoculação de volumes decrescentes da amostra em meio de cultura adequado ao crescimento dos microrganismos pesquisados. 4 . Através de sucessivas diluições da amostra. uniformemente distribuídas na amostra. parasitas e protozoários. sendo inoculados múltiplos e submúltiplos de 1 mL da amostra. Esta técnica é baseada no princípio de que as bactérias presentes em uma amostra podem ser separadas por agitação. cuja semeadura fornece resultados negativos em pelo menos um tubo da séria em que os mesmos foram inoculados e a combinação de resultados positivos e negativos permite a obtenção de uma estimativa da densidade das bactérias pesquisadas. A determinação do Número Mais Provável (NMP) de coliformes em uma amostra é efetuada a partir de aplicação da técnica de tubos múltiplos. isto limita sua aplicação como indicador específico de contaminação fecal. vírus. aeróbios ou anaeróbios facultativos.2 COLIFORMES TOTAIS Grupo de bactérias constituído por bacilos· Gram-negativos. tem sido utilizado preferencialmente a fator 10 de diluição. sendo cada volume inoculado em uma série de tubos. resultando em uma suspensão de células bacterianas.Como o grupo dos coliformes totais inclui gêneros que não são de origem exclusivamente fecal. Para análises de águas. os quais são diferenciados dos coliformes totais pela sua capacidade de fermentar a lactose em temperatura elevada (44.

5 .L. não hidrolisa a ureia e apresenta atividade das enzimas ß-galactosidase e ß-glucoronidase. 2 º C e m 2 4 h o r a s p r o d u z i n d o l a p a r t i r d o t r i p t o f a n o oxidase negativa.20C em 24 horas. 3. no qual as concentrações de lactose e peptona fornecem condições ótimas para o crescimento de bactérias do grupo coliforme.5 +. O principal componente deste grupo é Escherichia coli. 3.3 COLIFORMES FECAIS (TERMOTOLERANTES) São os coliformes capazes de se desenvolver e fermentar a lactose com produção de ácido e gás a temperatura de 44. sendo que alguns coliformes do gênero Klebsiella apresentam também essa capacidade.5 CALDO LACTOSADO(COM PÚRPURA DE BROMOCRESOL-C. O grupo inclui os seguintes gêneros: Escherichia. são considerados coliformes os organismos que fermentam a lactose com produção de gás a 35 0C. 5 ± 0 . sendo considerado o mais específico indicador de contaminação fecal recente e de eventual presença de organismos patogênicos. No caso da técnica de tubos múltiplos.capazes de crescer na presença de sais biliares ou outros com postos ativos de superfície (surfactantes).) (CONCENTRAÇÃO SIMPLES) Meio de enriquecimento. comp r o d u ç ã o d e á c i d o e g á s a 4 4 . com propriedades similares de inibição de crescimento. e que fermentam a lactose com produção de ácido e gás a 350C em 24-48 horas. Citrobacter. Enterobacter e Klebsiella.4 ESCHERICHIA COLI Bactéria do grupo coliforme que fermenta a lactose e manitol.O. 3.

FÓRMULA: INGREDIENTES PEPTONA LACTOSE BILE DE BOI DESITRADA VERDE BRILHANTE ÁGUA DESTILADA pH FINAL 7. Tamponar e esterilizar em autoclave a 121oC.0. Em tubos de ensaio de 16 mm x 150 mm. tomando cuidado para que não seja atingida a temperatura de ebulição. após esterilização. distribuir volumes adequados para que o volume final.0 5. mL PREPARO: Pesar 13. durante.0 g do meio desidratado (Caldo Lactosado e 0. ARMAZENAMENTO: O meio preparado poderá ser estocado à temperatura ambiente. no máximo.9 +. em local limpo e livre de poeira. g.0 0.0.0 1000 g.0 20.2 +.0 5. seja de 10 mL.0133 1000 g. permitindo um bom desenvolvimento de bactérias do grupo coliforme. mL .6 CALDO LACTOSADO COM VERDE BRILHANTE E BILE A 2% (CLVBB) Meio seletivo. 3. urna semana.2 a 25ºC 6 QTDE 10. até a completa dissolução do meio. durante 15 minutos.0 10.01 g de púrpura de bromocresol e acrescentar 1 000 mL de água destilada fria. aquecer. g. g. g. contendo em seu interior tubos de Durharn invertidos.FÓRMULA: INGREDIENTES EXTRADO DE CARNE PEPTONA LACTOSE ÁGUA DESTILADA pH FINAL 6. g. em que ocorre inibição de bactérias Gram-positivas e de bactérias esporuladas fermentadoras da lactose. agitando frequentemente.2 a 25oC QTDE 3.

0 1. durante 15 minutos. 3.0 1000 g. g. no máximo.0 1.2 a 25oC QTDE 20. Distribuir volumes de 10 mL em tubos de ensaio de 16 mm x 150 mm. agitando frequentemente. ARMAZENAMENTO: O meio preparado poderá ser estocado à temperatura ambiente. em que os sais biliares inibem o crescimento de formas esporuladas e de Gram-positivas e cuja incubação a 44. aquecer.0 g do meio desidratado Caldo lactosado com verde brilhante e bile a 2% e acrescentar 1000 mL de água destilada fria. g. até a completa dissolução do meio. durante. FÓRMULA: INGREDIENTES TRIPTOSE OU TRIPTICASE LACTOSE MISTURA SAIS BILIARES FOSFATO DIPOTÁSSICO ((K2HP04) p. Tamponar e esterilizar em autoclave a 121°C.0. g. g. to mando cuidado para que não seja atingida a temperatura de ebulição. mL 7 .5 ± O.PREPARO: Pesar 40.20C permite a seleção dos coliformes de origem fecal (coliformes termotolerantes).7 MEIO EC Meio seletivo para detecção de coliformes fecais.a FOSFATO MONOPOTÁSSICO CLORETO DE SODIO ÁGUA DESTILADA pH FINAL 6. em local limpo e livre de poeira.0 5. g.5 5. uma semana. contendo em seu interior tubos de Durharn invertidos.9 +.5 4.

em local cal limpo e livre de poeira. durante 15 minutos ARMAZENAMENTO: O meio preparado poderá ser estocado à temperatura ambiente. 4. no mínimo.9 NÚMERO MAIS PROVÁVEL (NMP) É a estimativa da densidade de bactérias em uma amostra. agitando frequentemente. tomando cuidado para que não seja atingida a temperatura de ebulição. aquecer. Tamponar e esterilizar em autoclave a 121oC.PREPARO: Pesar 37.1 BALANÇA Com sensibilidade de. uma semana.2 BANHO-MARIA Equipado com termostato e agitador de baixa velocidade para promover a circulação da água e manter a temperatura uniforme (44. contendo em seu interior tubos de Durham invertidos. sendo recomendada a troca semanal dessa água para evitar a proliferação de fungos e outros microrganismos. em tubos de ensaio de12 mm x 120 mm. até a completa dissolução do meio.1 g ao serem pesados 150 g.5 +0.20C) em todos os pontos. 3. 4. O nível de água no banho-maria deve ser mantido acima do nível do meio de cultura nos tubos de ensaio imersos para incubação. durante. 8 . calculada a partir da combinação de resultados positivos e negativos. Distribuir volumes de 5 rnL. EQUIPAMENTOS & VIDRARIAS 4. no máximo. 0. obtidos através da aplicação da técnica de tubos múltiplos.0 g do meio EC desidratado e acrescentar 1 000 mL de água destilada fria.

9 . 4.5 a 7. produzindo. sendo recomendável que a temperatura de esterilização seja atingida em até 30 minutos.4.393 Pa (1.60C ao nível do mar. Em seu funcionamento. cuja condutividade deve ser inferior a 2 µS/cm a 250C e o pH estar na faixa de 5.4. Nota: A densidade de bactérias heterotróficas na água recém destilada deve ser inferior a 1 000 unidades formadoras de colônias por mL UFC/mL) e a 10000 UFC/mL na água destilada armazenada. em seu interior. devendo esse controle ser efetuado com frequência mínima mensal.3 DESTILADOR DE ÁGUA OU APARELHO PARA DESIONIZAÇÃO Devem produzir água não tóxica.5.4 EQUIPAMENTOS PARA ESTERILIZAÇÃO 4.1 AUTOCLAVE É normalmente operada a uma pressão de 103. livre de substâncias que impeçam ou interfiram na multiplicação bacteriana. uma temperatura de 121.05 kgf/cm 2 ou 15 lb/pol2 ). deve-se observar a substituição por vapor de todo o ar existente na câmara e a operação total desse equipamento deve durar no máximo uma hora.

com capacidade adequada para o preparo de meios de cultura.em um local onde a temperatura permaneça na faixa de 16 a 270C. 4. 4.1 unidade de pH e sua calibração deve ser feita pelo menos duas vezes ao dia. no mínimo.5 VIDRARIAS 4. duas soluçõestampão padrões (pH = 4. pH = 6.100C) durante o período de esterilização (mínimo de 2 horas).5.3 INCUBADORA BACTERIOLÓGICA TERMOSTATIZADA Deve manter a temperatura na faixa de 35 +.2 ESTUFA DE ESTERILIZAÇÃO Deve manter a temperatura de (170 +. 4.0. com.4.1 BALÕES De borossilicato ou vidro neutro.86 ou pH = 9.4.18).0. 10 .50C e a umidade relativa entre 75 e 85% e ser colocada.4.4.4 MEDIDOR DE PH Deve fornecer exatidão mínima de 0.

4 PIPETAS Devem ser de borossilicato. ou plástico autoclavável. tipo Mohr. com capacidade mínima de 125 mL. 4.5 TUBOS DE DURHAM De borossilicato ou vidro neutro. com tampas que permitam boa vedação e sejam livres de substâncias tóxicas solúveis. e com bocal para tampão de algodão. com graduação de 1/10 e erro de calibração inferior a 2. 11 .4. borossilicato. para 5 mL e 10 mL. com diâmetro não inferior a 40% do diâmetro de tubo de ensaio em cujo interior serão utilizados.5.2 mL de água de diluição.5.3 FRASCO PARA COLETA DE AMOSTRA De vidro neutro ou plástico autoclavável atóxico. deixando um espaço suficiente para permitir uma boa homogeneização quando se fizer a agitação. 4.5. 4.2 FRASCOS PARA ÁGUA DE DILUIÇÃO De vidro neutro. devem ter volume suficiente para conter 90 +.5%. boca larga e tampa a prova de vazamento.

com capacidade adequada para conter o meio de cultura e o inóculo da amostra. com 0.1 ALÇAS DE INOCULAÇÃO Fio de níquel-cromo. 16 mm x 150 mm e de 12 mm x 120 mm. com um aro de 3 mm de diâmetro em uma das extremidades.6.Nota: Usualmente são empregados tubos de Durham de 7 mm x 4. platina-irídio ou platina. Nota: Usualmente são empregados tubos de ensaio de 18 mm x 180 mm. 4.6 TUBOS DE ENSAIO De borossilicato ou vidro neutro. 12 . 4. sendo a outra fixada a um cabo metálico (cabo de Kolle).6 OUTROS MATERIAIS 4.5 mm e de 5 mm x 4 mm.5.5 mm de diâmetro e 7-8 em de comprimento.

4. 4.5 ESTOJO PARA PIPETAS Usar. estojos de alumínio ou aço inoxidável de tamanho adequado. Opcionalmente.2 BICO DE BUNSEN Devem ter funcionamento adequado. para acondicionamento e esterilização das pipetas.4 ESTANTES De tamanho adequado para colocação dos tubos de ensaio empregados na análise. 4.4.6. as pipetas podem ser embrulhadas individualmente em papel Kraft para esterilização.3 CAIXAS OU CESTAS DE AÇO INOXIDÁVEL Para esterilização de materiais.6.6.6. de modo a produzir combustão completa. 13 .

e) Fora homogeneizado o frasco com a amostra bruta e com uma nova pipeta fora transferido 1. 14 . o número da amostra. c) d) Fora homogeneizado a amostra +. PROCEDIMENTO – TÉCNICA DE TUBOS MÚLTIPLOS Procedeu-se da seguinte maneira para a realização do Ensaio: a) Identificou-se a amostra a ser analisada e fora definido os volumes da mesma a serem inoculados. de forma suave. sendo anotado nestes. b) Procedeu-se á identificação dos tubos.5. Fora diluída a amostra até 10-2 de acordo com a metodologia para realização da diluição em série. em função da procedência. o volume de 10 mL a ser inoculado e a data = 04/09/2012.25 vezes.0 mL em cada um dos tubos de caldo lactosado (série de 5 tubos). sendo identificado os frascos de diluição com as respectivas diluições.

10-1 e 10-2).f) Fora repetido a operação para as diluições 10-1. 15 . sendo 5 para cada diluição (10°. completando portanto o total de 15 tubos. 10-2.

em banho-maria com agitação. i) As culturas com resultado presuntivo foram submetidas aos testes confirmativos.5°C. 16 . durante 24-48 h e para o meio E. Fora registrado os resultados. fora retirado um inóculo da cultura positiva em caldo CL e fora transferido esse inóculo para um tubo contendo caldo lactosado com verde brilhante e bile a 2% a 35 ± 0. realizou-se a 1a leitura. com auxílio de uma alça de inoculação devidamente flambada.C. para a determinação de coliformes totais e para a diferenciação de coliformes fecais. sendo anotado o número de tubos com resultado positivo para cada volume inoculado. durante 24 h.5 ± 0.5°C. com ou sem produção de gás. a 44.g) Após a inoculação de todos os volumes da amostra. considerando como resultado positivo à acidificação do meio. durante 24 horas. h) Decorrido este período de incubação.2°C. os tubos foram incubados a 35 ± 0.

17 .

mL VOLUME DECIMAIS ÍNOCULADOS (mL) 1 . de acordo com a Tabela 3 da CETESB. QUADRO DE RESULTADOS I .10100 .10-3 4 mL. Fora anotado os resultados para ser calculado o NMP a partir dos dados obtidos.L. sendo considerado como resultado positivo para coliformes totais a produção de gás a partir da fermentação da lactose no meio caldo lactosado com verde brilhante e bile a 2%.RESULTADO ENSAIO PRESUNTIVO A) CALDO LACTOSADO (COM PÚRPURA DE BROMOCRESOL-C.) Nº DE TUBOS COM RESULTADOS POSITIVOS EM CADA SÉRIE DE 5 TUBOS ÍNOCULADOS COM: 1 10 1 . se houver produção de gás no meio E.10-2 1 .100 a 1 .10-2 4 2 2 POSITIVARAM ' 18 .j) Após o período de 24 horas de incubação. em anexo. e para verificação de coliformes fecais se estão presentes. realizou-se as leituras.10-1 1 .100 1 .C (amarelo). mL mL mL mL mL.

resultando em uma suspensão de células bacterianas. de coliformes em uma amostra é efetuada a partir de aplicação da técnica de tubos múltiplos.P.100 1 .100 a 1 .100 1 .10-2 1 .10-2 1 .10-3 4 mL.10-2 POSITIVARAM 6.II .10-1 1 . uniformemente distribuídas na amostra.10100 .100 a 1 .M. mL 0 1 0 VOLUME DECIMAIS ÍNOCULADOS (mL) 1 . sendo cada volume inoculado em uma série de tubos.1 PRINCÍPIO DO MÉTODO A determinação do N.10-3 4 mL. mL mL mL mL mL.10100 .10-2 0 0 1 POSITIVARAM B) MEIO E. (MEIO DETECTIVO DE COLIFORMES TERMOTOLERANTES) Nº DE TUBOS COM RESULTADOS POSITIVOS EM CADA SÉRIE DE 5 TUBOS ÍNOCULADOS COM: 1 10 1 .RESULTADO ENSAIO CONFIRMATIVO A) CALDO LACTOSADO VERDE BRILHANTE E BILE A 2% (TUBOS VERDES) ( MEIO DETECTIVO DE COLIFORME TOTAIS) Nº DE TUBOS COM RESULTADOS POSITIVOS EM CADA SÉRIE DE 5 TUBOS ÍNOCULADOS COM: 1 10 1 .10-1 1 . mL mL mL mL mL. Esta técnica é baseada no principio de que as bactérias presentes em uma amostra podem ser separadas por agitação.C. MÉTODOS DE EXECUÇÃO DO TESTE TÉCNICA TUBOS MÚLTIPLOS 6. 19 . mL VOLUME DECIMAIS ÍNOCULADOS (mL) 1 . Consiste na inoculação de volumes decrescentes da amostra em meio de cultura adequado ao crescimento dos microrganismos pesquisados.

1 ENSAIO PRESUNTIVO Consiste na inoculação de volumes determinados da amostra em séries. 6. aplicação do paralelamente ao teste para confirmação de coliformes totais. 6. ocorrendo um enriquecimento de organismos fermentadores da lactose. e prova presuntiva positiva para a presença de bactérias do grupo coliforme. A densidade de coliformes fecais é obtida a partir de um exame específico.2. de tubos de Caldo lauril-triptose ou Caldo lactosado. de realização obrigatória para todos os tipos de amostras de água. tem sido utilizado preferencialmente o fator 10 de diluição. 20 . durante 24-48 horas.0. quando indicado. sendo inoculados múltiplos e submúltiplos de 1 mL da amostra. A acidificação. a partir da fermentação da lactose no meio de cultura empregado nesse ensaio. que são incubados a 35 +. com púrpura de bromocresol. com ou sem produção de gás. as quais são complementadas. são obtidos inóculos. Para análises de águas.Através de diluições sucessivas da amostra. usando-se séries de 5 tubos para cada volume a ser inoculado. por uma terceira etapa (exame completo).50C. através da aplicação de cálculos de probabilidade. cuja semeadura fornece resultados negativos em pelo menos um tubo da série em que os mesmos foram inoculados e a combinação de resultados positivos e negativos permite a obtenção de uma estimativa da densidade das bactérias pesquisadas.2 ETAPAS DO MÉTODO O exame para determinação de coliformes totais se processa através de 2 etapas (ensaios presuntivo e confirmativo).

que serão incubados durante 24 +.B.V.3 ENSAIO PARA DIFERENCIAÇÃO DE COLIFORMES FECAIS Consiste na transferência de um inóculo de cada cultura com resulta do positivo em C.B.0.0. com púrpura de bromocresol após 24 ou 48 h a 35 +.2 ENSAIO CONFIRMATIVO Consiste na transferência de cada cultura com resultado presuntivo positivo (produção de ácido com ou sem gás em C. com púrpura de bromocresol incubados durante 2448 horas a 35 +.0.50C.2 horas a 44. O resultado será positivo quando houver produção de gás a partir da fermentação da lactose contida no meio E.. DETECÇÃO COLIFORMES TOTAIS: DETECÇÃO DE COLIFORME FECAIS: 6. 21 .C.L. durante 48 horas.0.T. com agitação e temperatura constantes.5 +. ou C.6. para tubos contendo o meio E.2oC em banho-maria.L. A produção de gás a partir da fermentação da lactose neste meio é prova confirmativa positiva para a presença de bactérias do grupo coliforme.50C) para C.. Esta etapa do exame reduz a possibilidade de ocorrência de resultados falsos-positivos. decorrentes da atividade de bactérias esporuladas e de bactérias Gram-positivas fermentadoras da lactose.L. sendo a incubação efetuada também a 35 .2.L.2.50C.C.

procura-se o código formado pelo número de tubo com resultados positivos obtidos nas três series consecutivas inoculadas.1 . NMP 100 NMP /mL. o qual é obtido através de tabelas da CETESB (em anexo).10.10-2 4 2 2 422 26 260 POSITIVARAM ' 22 . verificando-se valor do NMP correspondente a ele.10-3 2 mL.) Nº DE TUBOS COM RESULTADOS POSITIVOS EM CADA SÉRIE DE 5 TUBOS ÍNOCULADOS COM: 1 1 100 10 1 . 7. RESULTADOS 7. sendo utilizados os volumes indicados na Tabela (10 mL.1 mL): Quando são inoculadas apenas três series de 5 tubos.RESULTADO ENSAIO PRESUNTIVO A) CALDO LACTOSADO (COM PÚRPURA DE BROMOCRESOL-C.100 1 . CORRESP.2 UTILIZAÇÃO DA TABELA 3 NMP DA CETESB No teste realizado foram inoculadas 3 séries de 5 tubos. mL mL mL mL VOLUME DECIMAIS ÍNOCULADOS (mL) NMP COD. sendo utilizados volumes decimais diferentes daqueles indicados na Tabela 3: Neste caso.L. AO CÓDIGO CÁLC. em que são dados os limites de confiança de 95% para cada valor de NMP determinado.7. mL.100 a 1 . O NMP/100 mL será dado através da seguinte fórmula: NMP CORRESPONDENTE AO CÓDIGO X 10 MAIOR VOLUME INOCULADO I . 1 . 1 mL e 0.10.1 CÁLCULO DO NÚMERO MAIS PROVÁVEL (NMP/100 ML) A densidade de coliformes é expressa como NMP Número Mais Provável de coliformes por 100 mL.

10-2 0 0 1 001 2 20 POSITIVARAM 23 . AO CÓDIGO CÁLC.1 . NMP 100 NMP /mL.10-3 1 mL 2 mL mL COD.10.100 a 1 . NMP CORRESP. 1 .10.100 mL 1 1 .RESULTADO ENSAIO CONFIRMATIVO A) CALDO LACTOSADO VERDE BRILHANTE E BILE A 2% (TUBOS VERDES) ( MEIO DETECTIVO DE COLIFORME TOTAIS) VOLUME DECIMAIS ÍNOCULADOS (mL) Nº DE TUBOS COM RESULTADOS POSITIVOS EM CADA SÉRIE DE 5 TUBOS ÍNOCULADOS COM: 100 10 mL.II . 1 . mL.

AO CÓDIGO CÁLC. 10-1 = 2. (MEIO DETECTIVO DE COLIFORMES TERMOTOLERANTES) Nº DE TUBOS COM RESULTADOS POSITIVOS EM CADA SÉRIE DE 5 TUBOS ÍNOCULADOS COM: 100 10 mL. 10-2 = 2.10.10-2 0 1 0 010 2 20 POSITIVARAM 8. 1 . e NMP = 260p/100 mL. considerando como resultado positivo os tubos que apresentaram acidificação do meio. 10-1 e 10-2 e decorrido o período de incubação. VOLUME DECIMAIS ÍNOCULADOS (mL) NMP CORRESP. com ou sem produção de gás. conforme demonstrado no quadro disposto no item 5 j. CONCLUSÃO Após realização da diluição da amostra em diluições 10 0.10.100 a 1 . das 3 séries de 5 tubos de Caldo Lactosado com púrpura de bromocresol. realizou-se a 1a leitura.B) MEIO E. realizou-se na sequencia o Ensaio Confirmativo. sendo considerado de baixa concentração. sendo inoculado do Caldo Lactosado (positivos) na mesma sequência de diluição (diluições 100. sendo obtido os seguintes resultados positivos do Ensaio Presuntivo: 100 = 4.1 .. NMP 100 NMP /mL. mL. 10-1 e 10-2) a mesma quantidade tubos contendo: 24 .100 mL 1 1 .C. 1 . Partindo do número de tubos com resultado positivo no Ensaio Presuntivo.10-3 1 mL 2 mL mL COD.

e através dos resultados apurados na qualidade bacteriológica da água (amostra). sendo considerado positivo a amostra que apresentou organismos que fermentaram a lactose com a produção de gás. 10-2 = 0. cujo resultado fora demonstrado no quadro disposto no Item 7. sendo considerado positivo a amostra que apresentou organismos que fermentaram a lactose com a produção de gás.2 II B. independente do NMP apurado. 10-1 = 0. sendo encontrado os seguintes resultados no Ensaio Confirmativo para Coliformes Totais: 100 = 0. devendo ser tomadas as devidas providencias para correção da condição poluidora. e NMP = 20 p/100 mL.2 II A. 10-1 = 1. sendo considerado de baixa concentração de Coliformes Fecais..A. sendo considerado de baixa concentração de Coliformes Totais. o qual foi obtidos a amostra. cujo resultado fora demonstrado no quadro disposto no Item 7. fora identificado a presença de Coliformes Totais e Fecais nas amostras e diluições. 10-2 = 1. ou seja o corpo d’água está poluído e contaminado por coliformes fecais. sendo encontrado os seguintes resultados no Ensaio Confirmativo para Coliformes Totais: 100 = 0. Em síntese conclui-se que pela aplicação da Técnica dos Tubos Múltiplos através do Ensaio Presuntivo e Ensaio Confirmativo. Caldo Lactosado com Verde Brilhante e Bile a 2% (CLVBB) (tubos com coloração verde) para detecção dos Coliformes Totais existentes na amostra e fora calculado através da NMP (Numero Médio Provável) a quantidade de estimada de Coliformes Totais. B. a água não apresenta as condições mínimas de atender ao consumo Humano e de animais. porém a partir do momento que fora identificado Coliformes Fecais na amostra. 25 . porém quanto menor for o NMP maior é a probabilidade do processo de desinfecção ser mais simples. a água do corpo d'água de onde fora retirada a amostra está inadequada para o consumo humano e animal. e NMP = 20 p/100 mL. MEIO EC (tubos com coloração amarela) contendo sais biliares para detecção dos Coliformes Fecais existentes na amostra e fora calculado através da NMP (Numero Médio Provável) a quantidade de estimada de Coliformes Totais. ficou evidenciado que o local onde encontra-se o Corpo D’água.

ESQUEMA SINTETIZADO DE ENSAIO PELA TÉCNICA DE TUBOS MULTIPLOS: 26 .9.

27 .

ESQUEMA SINTETIZADO DE ENSAIO PELA TÉCNICA DE TUBOS MULTIPLOS: 28 .9.

CETESB .NORMA TÉCNICA L5.M. TABELA 3 .P = NÚMERO MAIS PROVÁVEL E LIMITES DE CONFIANÇA = 95% PARA RESULTADOS POSITIVOS OU NEGATIVOS 29 .10.202 DE JAN/1993 ÍNDICE DE N.

LIMITE DE CONFIANÇA INFERIOR = 95% SUPERIOR <2 2 2 4 2 4 4 6 6 4 7 7 9 9 12 8 11 11 14 14 17 13 17 17 21 26 22 26 27 33 34 23 30 40 30 50 60 50 70 90 <1 <1 <1 <1 1 1 2 2 1 2 2 3 3 5 3 4 4 6 6 7 5 7 7 9 12 9 12 12 15 16 9 10 20 10 20 30 20 30 40 10 10 13 11 15 15 18 18 17 20 21 24 25 29 24 29 29 35 35 40 38 45 46 55 63 56 65 67 77 80 86 110 140 120 150 180 170 210 250 30 . 0 0 0 0 1 1 1 1 1 2 2 2 2 2 2 3 3 3 3 3 3 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 TUBOS DE 1 mL. 0 1 0 0 0 1 0 1 0 0 1 0 1 0 0 0 1 0 1 0 1 0 1 0 1 2 0 1 0 1 0 0 1 2 0 1 2 0 1 2 ÍNDICE DE NMP POR 100 mL. 0 0 1 2 0 0 1 1 2 0 0 1 1 2 3 0 0 1 1 2 2 0 0 1 1 1 2 2 3 3 4 0 0 0 1 1 1 2 2 2 5 TUBOS DE 0.1 mL.Nº DE TUBOS QUE APRESENTAM REAÇÃO POSITIVA QUANDO UTILIZADOS: 5 TUBOS DE 10 mL.

html 31 .USP http://www.cdcc. BIBLIOGRAFIA I. III.5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 3 3 3 3 4 4 4 4 4 5 5 5 5 5 5 0 1 2 3 0 1 2 3 4 0 1 2 3 4 5 80 110 140 170 130 170 220 280 350 240 300 500 900 1600 ≥1600 30 40 60 80 50 70 100 120 160 100 100 200 300 600 - 250 300 360 410 390 480 560 690 820 940 1300 2000 2900 5300 - 11.NORMA TÉCNICA L5. CETESB .202 – JAN/1993 ROTEIRO AULA PRÁTICA – FT / UNICAMP ST207 SET/2012 – COLIFORMES TOTAIS E FECAIS – DETERMINAÇÃO TÉCNICA DE TUBOS MULTIPLOS II.usp. REVISTA ELETRÔNICA Nº 32 .br/ciencia/artigos/art_32/atualidades.

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