MICROBIOLOGIA PRTICA 1 Frequncia

COLORAO DE GRAM.................................................................................................................................................2 OBSERVAO DA CPSULA BACTERIANA............................................................................................................3 MOBILIDADE BACTERIANA: EXAME A FRESCO E EXAME CULTURAL......................................................4 VISUALIZAO DE ESPOROS, ASCSPOROS E QUISTOS.................................................................................5 COLORAO DE ZIEHL-NEELSEN COLORAO ENERGTICA.................................................................6 COLORAO DO NUCLEIDE BACTERIANO........................................................................................................6 PREPARAO DE PROTOPLASTOS E ESFEROPLASTOS BACTERIANOS....................................................6 QUESTES 1:......................................................................................................................................................................7 PREPARAO DE MEIOS DE CULTURA...................................................................................................................8 ISOLAMENTO DE MICRORGANISMOS POR SEMENTEIRA EM AGAR........................................................10 METABOLIZAO DOS ACARES POR VIA OXIDATIVA OU FERMENTATIVA (MEIO OF-GLUCOSE)....................................................................................................................................................11 PROVA DA CATALASE E DA OXIDASE...................................................................................................................11 FERMENTAO BACTERIANA DE ACARES...................................................................................................12 UTILIZAO DE CITRATO COMO NICA FONTE DE CARBONO.................................................................15 METABOLIZAO BACTERIANA DE AMINOCIDOS.......................................................................................16 REDUO DE NITRATOS, PRODUO DE UREASE E PRODUO DE H2S...............................................18 O SISTEMA API................................................................................................................................................................19 MTODO DE CULTURA DE FUNGOS FILAMENTOSOS EM LMINA............................................................20 CURVA DE CRESCIMENTO BACTERIANO EM MEIO DE CULTURA LQUIDO NO RENOVADO (MTODO TURBIDIMTRICO). CONTAGEM DE UFC/ML (MTODO DAS DILUIES SUCESSIVAS E POR MEMBRANA FILTRANTE)..................................................................................................................................20 ISOLAMENTO DA FLORA BACTERIANA COMENSAL NO HOMEM..............................................................21 QUESTES 2:....................................................................................................................................................................22

Colorao de Gram As clulas microbianas vivas, observadas a fresco, so difceis de visualizar por falta de contraste, com o meio aquoso circundante. A colorao das clulas microbianas com corantes bsicos permite obter esse contraste e facilita o estudo morfolgico das clulas microbianas, por microscopia ptica. Os corantes usados em microbiologia no penetram as clulas vivas e somente coram clulas mortas. A partir de culturas microbianas fazem-se esfregaos em lmina de vidro e aps fixao pelo calor so coradas com corantes bsicos. Os corantes usam-se sob a forma de sais, tendo um io orgnico e um io inorgnico (ex. cloridrato de azul de metileno ou cloridrato de cristal violeta). O grupo cromforo o catio. chamado corante bsico pois reage com HCl formando um sal. Os corantes bsicos dada a carga elctrica positiva do seu grupo cromforo ligam-se superfcie celular e aos cidos nucleicos que tm carga negativa ficando deste modo fixados (corados). Os microrganismos que vivem em meios acdicos (H+) tm neutralizadas as cargas negativas de superfcie, o que no atrai a carga elctrica positiva dos corantes bsicos, corando por isso fracamente. Por esta razo usam-se solues alcalinas de corantes bsicos com KOH, como o caso do azul de metileno de Leffler. Na colorao simples usa-se um nico corante bsico (azul de metileno) e na colorao de Gram usam-se dois corantes (cristal violeta/safranina O ou fucsina bsica). A colorao de Gram cora diferencialmente as bactrias, alguns grupos bacterianos coram de roxo bactrias Gram positivo e outros coram de vermelho bactrias Gram negativo. A colorao de Gram reflecte a diferente constituio qumica da parede celular bacteriana, nas bactrias Gram positivo e Gram negativo. Estas caractersticas podem ser influenciadas por vrios factores como: a idade das culturas, a presena de inibidores (antibiticos), a provenincia de meios selectivos, etc. Composio Mucopeptdeo ou Peptidoglicano cidos teicicos Lpidos Fosfolpidos LPS Lipoprotenas cidos lipoteicicos Protenas porinas Gram positivo ++++ +++ + Gram negativo + + + + +

Parte experimental Colorao de Gram Colocar uma gota de gua no centro de uma lmina de vidro e fazer uma suspenso bacteriana a partir de uma cultura de gelose nutritiva. Fixar pelo calor; Cobrir o esfregao com cristal violeta (carga positiva de modo que cora estruturas de carga negativa) durante 30. [Remover o corante]; Cobrir com soluto de Lugol (mordente ajuda a fixar o cristal violeta) durante 60; Lavar com gua; Descorar com lcool a 95 (agente descolorante) durante 30; Lavar com gua; Cobrir com safranina ou fucsina bsica durante 30 Lavar com gua; Secar a preparao com papel de filtro; Focar com lente seca 4x ou 10x. Cobrir o esfregao com leo e observar com a lente de imerso (100x).

Observao da cpsula bacteriana Algumas espcies bacterianas produzem externamente parede celular uma estrutura predominantemente polissacrida, raramente proteica e denominada cpsula. Esta estrutura diminui a hidrofobicidade da bactria dificultando os mecanismos de defesa dos leuccitos mostrando propriedades anti-fagocticas, sendo por isso considerada uma estrutura de virulncia. Em esfregaos de produtos biolgicos corados com Gram, possvel detectar a presena da cpsula bacteriana notando-se um halo transparente volta das clulas, dado que no coram com os corantes usados em microbiologia. A visualizao da cpsula bacteriana in vitro faz-se por colorao negativa com tinta-da-china ou soluo aquosa de nigrosina. A tinta-da-china uma suspenso aquosa de partculas de carvo que no permeiam a cpsula bacteriana, notando-se um halo transparente volta das clulas bacterianas. Por sua vez a nigrosina sendo um corante acdico sofre repulso electrosttica da superfcie celular bacteriana originando igualmente um halo de transparncia. A cpsula pode ser detectada tambm imunologicamente atravs de uma reaco com anticorpos anti-capsulares que aumentam a sua refractilidade (reaco de quellung ou de tumefaco capsular).

Parte Experimental Notas Colorao negativa toda a clula corada com excepo da estrutura que se pretende visualizar No se fixa pelo calor, uma vez que este destri as cpsulas Quando houver necessidade de lavar, ter-se- que ter muito cuidado para que as bactrias, no fixadas ao calor, no sejam varridas da lmina.

Colorao de Granulaes lipdicas (Mtodo de Burdon) As granulaes lipdicas, quimicamente poli--hidroxibutiratos, funcionam com reserva de carbono e de energia em certas espcies bacterianas. Por microscopia ptica, as granulaes lipdicas das clulas bacterianas, fixadas em lmina so postas em evidncia com negro de Sudo (estruturas sudanfilas) e o restante citoplasma corado com fucsina bsica (mtodo de Burdon). Os grnulos lipdicos no tm afinidade para os corantes bsicos e, quando presentes, aparecem como espaos incolores quando a bactria corada pela tcnica de Gram ou pela tcnica de colorao simples (para os menos experientes poder confundir-se com endosporos) Nota: os poli--hidroxibutiratos no tm qualquer importncia a nvel clnico, uma vez que no revelam qualquer virulncia; estes so muitas vezes utilizados no fabrico de plsticos, como, por exemplo, as embalagens de soro fisiolgico existentes nos hospitais.

Mobilidade bacteriana: exame a fresco e exame cultural As bactrias patognicas mveis deslocam-se geralmente por flagelos, sendo as espiroquetas uma excepo pois possuem como rgo de locomoo filamentos axiais. Os flagelos so de natureza proteica, constitudos por sub-unidades de flagelina. Os flagelos podem distribuir-se volta da clula bacteriana ou ter uma disposio polar. Monotrica bactria com um flagelo terminal Lofotrica bactria com um tufo de flagelos numa extremidade Anftrica bactria com um flagelo em cada extremidade Pertrica - bactria com muitos flagelos em toda a periferia Anftrica bactria com um tufo de flagelos em cada extremidade trica bactria sem flagelos Nos flagelos esto localizados os antignios H e o seu nmero e disposio tm importncia taxonmica. A visualizao dos flagelos pode fazer-se por microscopia electrnica ou por microscopia ptica recorrendo a tcnicas de colorao de flagelos. Se as bactrias se deslocam de um ponto para outro do microscpio, diz-se que so mveis. Contudo importante no confundir mobilidade bacteriana com movimentos brownianos, pois neste caso observa-se apenas a oscilao da bactria proveniente da agitao molecular. Os flagelos no se observam nestas preparaes a no ser quando corados por processos especiais com mtodos de impregnao com sais de prata. Para avaliar a mobilidade bacteriana utilizamos a tcnica da gota pendente (cultura slida em gua) e a cultura em meio SIM. O meio SIM um meio de cultura semi-slido que permite avaliar a mobilidade por inoculao por picada central. Aps incubao a 37C/18H perceptvel a mobilidade celular ou a sua ausncia. Este meio de cultura tambm indica se a bactria produtora de gs sulfdrico (H2S). No caso de Proteus mirabilis pe-se em evidncia as suas propriedades invasivas em Gelose Sangue/Chocolate e a inibio do swarming em CLED agar. P. mirabilis um bacilo Gram negativo dotado de grande mobilidade e invade a superfcie dos meios de cultura slidos, sobretudo se existe humidade superfcie do meio. O swarming de P. mirabilis no se manifesta no meio de CLED agar, dado que este meio deficiente em electrlitos.

Visualizao de esporos, ascsporos e quistos As bactrias formadoras de esporos esto, praticamente, confinadas ao Gnero Bacillus e ao Gnero Clostridium. Os esporos so estruturas de resistncia que se formam no interior da bactria e so capazes de sobreviver nas condies ambientais mais desfavorveis e adversas e por dezenas ou milhares de anos. A formao do esporo geneticamente controlada. Estes so produzidos durante a fase estacionria de crescimento, acabando a parte vital do esporo por ser revestida pelo crtex (CX), tnica interna (IC), tnica externa (OC) e exsporo. Pensou-se que as bactrias esporulavam quando as condies ambientais lhe eram desfavorveis ao crescimento. Actualmente, sabe-se que para a ocorrncia da esporulao duma bactria so necessrias condies ptimas, semelhantes s de crescimento das clulas vegetativas. O esporo maduro com estes invlucros exibe resistncia qumica (cloro, antibiticos, detergentes, etc.) e termo-resistncia a temperatura de 121C. Os invlucros do esporo impedem a penetrao dos corantes de Gram, ficando o esporo incolor e o esporngio corado de vermelho. A observao de clulas em esporulao e dos esporos livres faz-se tambm por microscopia de contraste de fase. De acordo com a localizao no esporngio, os esporos so: Terminais; Subterminais ou Centrais. Os esporos so difceis de corar pelas tcnicas de colorao usuais, por essa razo, necessitam de um mtodo de colorao em que a aplicao do corante feita por um processo enrgico. A razo da dificuldade de colorao, pelos mtodos usuais, deve-se existncia de tnicas constitudas por protenas insolveis que dificultam a penetrao dos corantes. Pelas tcnicas usuais de colorao (tcnica de Gram, colorao com azul de metileno) o esporngio cora e o endsporo apresenta-se refringente pois o corante no penetrou atravs das tnicas do esporo e atravs do crtex. Os esporos podem ser corados com verde de malaquite a quente. O corante que entrou no esporo no removido por lavagem com gua e como contrastante usa-se safranina ou nigrosina, que cora o esporngio. A formao de esporos acontece com frequncia nos fungos. o caso de Saccharomyces cerevisi que produz ascsporos, que podem ser visualizados pela colorao com verde de malaquite a quente e a aplicao de nigrosina. A forma vegetativa (trofozoitos) dos protozorios no sobrevive no meio ambiente. Os protozorios que no seu ciclo de vida no tm uma passagem pelo meio ambiente, no apresentam a forma de quisto (Trichomonas vaginalis). Notas: Os ascsporos ficam corados de verde.

Colorao de Ziehl-Neelsen Colorao energtica Bactrias dos Gneros Mycobacterium e Nocardia tm uma parede celular especial contendo cidos miclicos. No coram pela tcnica do Gram, porque a parede impenetrvel. Estas clulas requerem colorao enrgica com Fucsina fenolada de Ziehl (+concentrada, +fenol descolora com o soluto de Ebner), a quente. A descolorao do esfregao faz-se com soluto de Ebner (lcool-cido clordrico). As clulas de Mycobacterium resistem a esta descolorao. Por isso so designadas por bacilos lcool-cido resistentes (b.a.a.r.). A flora microbiana no lcool-cido resistente cora de azul (azul de metileno). Cuidados a ter na preparao do esfregao: o esfregao da expectorao efectua-se somente em lminas novas e desengorduradas; o esfregao deve ser feito a partir das partes purulentas ou hemorrgicas da expectorao; no fazer o esfregao a partir da expectorao por esmagamento entre duas lminas pois pode ocorrer a formao de aerossis; secar o esfregao ao ar e no chama.

Colorao do nucleide bacteriano A clula bacteriana (clula procariota) apresenta um ncleo bastante simples, desprovido da membrana nuclear e constitudo por DNA (cido desoxiribonucleico) disperso no citoplasma, no ligado a protenas, que se divide por processos no mitticos. designado por nucleide. O protoplasto bacteriano tem tambm abundantes ribossomas (rRNA). Dada a afinidade dos cidos nucleicos para os corantes bsicos a clula bacteriana cora uniformemente ao contrrio do que acontece com as clulas eucariotas, no sendo possvel visualizar a regio nuclear. Para pr em evidncia o nucleide bacteriano com corantes bsicos, torna-se necessrio destruir previamente o RNA, por aco de RNAse ou por hidrlise cida com HCL 1N a 60C.

Preparao de protoplastos e esferoplastos bacterianos O mucopeptdeo ou peptidoglicano o constituinte da parede celular bacteriana que torna possvel a sobrevivncia das clulas bacterianas em meios hipotnicos. A sua digesto enzimtica com lisozima provoca a lise das clulas bacterianas. Desprovido de proteco mecnica conferida pelo mucopeptdeo, o protoplasto bacteriano entra em lise pelo facto da membrana citoplasmtica no ter resistncia para suportar as diferenas de presso a que est sujeita. Quando as bactrias Gram positivas susceptveis lisozima so tratadas com esta enzima muraltica, em meio osmoticamente adequado, ocorre a formao de clulas arredondadas protoplastos, completamente desprovidas de parede celular. O mesmo tratamento em bactrias Gram negativas, em presena de EDTA, provoca a formao de esferoplastos, isto , clulas arredondadas com restos de parede celular (membrana externa) e desprovida da camada mucopeptdica (camada rgida). Os protoplastos e esferoplastos em meios de cultura adequados e a temperatura fisiolgica so metabolicamente activas.

Questes 1: Porque razo as clulas velhas tm um diferente comportamento em relao colorao de Gram? Resposta: As clulas velhas possuem, no s uma reduo da camada de peptidoglicano, como destruio parcial da parede celular. Assim sendo, os corantes usados na colorao de Gram dificilmente coram a clula, na medida em que no ficam retidos; consequentemente torna-se difcil a distino entre Gram + e Gram -. Qual a importncia mdica da serotipagem da cpsula em S.pneumoni? Resposta: A cpsula considerada, pelo nosso sistema imunitrio, um antignio. De bactria para bactria, mesmo que da mesma espcie, a cpsula no semelhante, podendo uma qualquer bactria possuir mais de cem serotipos de cpsula o que representa mais de cem antignios. Por outro lado, ainda no est provada a serotipagem capsular como influncia na resistncia medicamentosa. De qualquer modo, num intuito de tentar ultrapassar as barreiras supracitadas criaram-se as teraputicas medicamentosas e as vacinas (note-se que falveis; ex. a bactria que provoca a meningite tem mais de noventa serotipos e a vacina apenas abrange aproximadamente dez serotipos). Outros tipos de granulaes esto presentes em certas bactrias. Qual a sua importncia clnica? Resposta: Ao se identificarem diferentes granulaes possvel a identificao de algumas bactrias, sendo apenas esta a importncia clnica das granulaes. Que propriedades adicionais possuem as bactrias produtoras de esporos? E porqu? Resposta: Certos grupos bacterianos possuem genes de esporolao, tornando possvel a modificao morfolgica de clulas vegetativas em esporos que apresentam estruturas muito complexas, e que sobrevivem dissecao e a outras situaes hostis, nomeadamente aos solventes orgnicos, radiaes, antibiticos, detergentes, cloro e ao calor. Como se distingue a colorao de Gram (Gram negativa) da colorao de Ziehl-Neelsen? Resposta: Ambas so facilmente distinguveis pelo fundo da preparao, uma vez que o das Gram negativas se apresenta cor-de-rosa pela fucsina e o das Ziehl-Neelsen azul pelo azul de metileno. A preparao de protoplastos e esferoplastos bacterianos pode acontecer in vivo? Resposta:

Preparao de meios de cultura As bactrias e os fungos so capazes de crescer in vitro em meios de cultura contendo essencialmente fontes de carbono, azoto, fsforo e gua. Os nutrientes essenciais para o crescimento variam entre os diferentes microrganismos, havendo microrganismos nutricionalmente exigentes. Existem meios de cultura complexos contendo extracto de carne ou extracto de levedura, bastante ricos nutricionalmente, mas de composio qumica indefinida. Para os microrganismos pouco exigentes nutricionalmente, como E. coli, podem usar-se meios de cultura de composio sinttica simples (meio de cultura definidos) contendo, por exemplo: glucose, sulfato de amnio e alguns sais minerais. Os meios de cultura em bacteriologia tm geralmente um pH ligeiramente alcalino, enquanto que os meios de cultura para os fungos so acdicos. essencial no s que os meios de cultura possuam um pH dentro de determinados limites, mas tambm, que o valor deste no sofra grandes variaes durante o crescimento bacteriano. Quanto finalidade o meio de cultura pode ser: 1. Meio de cultura enriquecido contm substncias nutritivas para as bactrias mais exigentes (ex.: gelose sangue e gelose chocolate) 2. Meio selectivo que contm substncias que inibem o crescimento de algumas bactrias, tornando possvel o crescimento de outros grupos bacterianos (Manitol salt agar, MacConkey agar) 3. Meio diferencial ou indicador que nos do a visualizao das actividades metablicas das bactrias (ex. as fermentadoras e as no fermentadoras da lactose no meio CLED agar) 4. Meio geral A grande maioria dos microrganismos utiliza fermentativamente os acares fazendo baixar acentuadamente o pH dos meios de cultura, o que nocivo para a viabilidade bacteriana. Assim, os meios com acares tm tampes de pH, a fim de evitar fortes variaes de pH. Existem meios de cultura lquidos (caldos) em que os nutrientes esto dissolvidos em gua destilada e meios de cultura slidos (15-20g agar/L) a fim de tornar possvel a sementeira de produtos biolgicos complexos e isolar as colnias dos microrganismos existentes. Com este isolamento torna-se possvel identificar os microrganismos de acordo com as suas caractersticas morfolgicas e bioqumicas. Meios de cultura semi-slidos (3g agar/L), como acontece no meio SIM possvel detectar a mobilidade microbiana. A gelose ou agar, extrado de algas, um complexo polisacardico composto de galactose e cido galacturnico. o agente solidificante dos meios de cultura fluidificando com a gua por fervura e formando um gel slido temperatura de 42C. No degradado pelas eubactrias, sendo por isso o agente solidificante ideal em microbiologia. Aps a dissoluo dos meios de cultura e sua distribuio em bales ou em tubos, consoante o tipo de meio de cultura, procede-se sua esterilizao por autoclavagem a 121C/15. Quando um meio de cultura contm nutrientes termo-lbeis, os meios de cultura so autoclavados sem esse nutriente. A soluo do componente termo-lbil esterilizada por filtrao com filtros de celulose com porosidade mdia de 0,42 - 0,45p. O meio de cultura, aps autoclavagem, arrefecido temperatura de 50C misturado assepticamente com a soluo termo-lbil (ex.: meio de ureia). Existem tambm meios de cultura no autoclavveis, dissolvidos e fervidos em gua durante alguns minutos meios de cultura extemporneos (ex.: SS agar e XLD agar). Aps fervura ou autoclavagem e arrefecidos a cerca de 60C, os meios de cultura slidos, para isolamento microbiano, so distribudos por placas de petri estreis e mantidos no local de trabalho at estarem solidificados. A preparao de geloses inclinadas requer a inclinao dos tubos de ensaio at solidificao (aps autoclavagem). Quando se semeiam meios de cultura com amostras polimicrobianas h vantagem em utilizar meios de cultura selectivos e/ou diferenciais.

 Por esta razo utilizam-se os seguintes meios: 1.1. Manitol Salt agar Proteose - Peptona 10g Extracto de carne 1g D-manitol 10g NaCl 75g Agar 15g H20 1L V. fenol (6,8 - 8,4) 0,025g pH = 7,4 A elevada concentrao em NaCl no permite o crescimento de bactrias Gram negativas, sendo este meio selectivo para Gram (+). O Staphylococcus aureus neste meio produz colnias amarelas, devido fermentao do manitol e presena do indicador vermelho de fenol que amarelo em meio cido. 1.2 MacConkey agar Lactose 10g Peptona 17g Proteose - peptona 3g Cristal violeta 0,001g Sais biliares 1,5g H20 destilada 1L Agar 13,5g V. neutro 0,03g NaCl 5g pH =7,1 No meio de MacConkey, o cristal violeta e os sais biliares no permitem o crescimento de bactrias Gram positivas e de fungos meio selectivo para Gram negativas. As bactrias Gram negativas so diferenciadas neste meio pela capacidade de fermentar a lactose. Os fermentadores da lactose do colnias vermelhas e os no fermentadores do colnias incolores, devido ao indicador vermelho neutro meio diferencial. 1.3. O meio de CLED agar um meio diferencial e no selectivo: CLED agar Extracto de carne 3g Lactose 10g Agar 15g A. bromotimol 0,02g Lcistena 0,128g Digesto pancretico de gelatina 4g Digesto pancretico de casena 4g H20 1L pH = 7,3 As bactrias fermentadoras da lactose do colnias amarelas (fentipo Lac) e as bactrias no fermentadoras da lactose do colnias verdes ou azuis meio diferencial. Trata-se de um meio de cultura no inibitrio do crescimento bacteriano, muito utilizado em bacteriologia para a identificao do agente tiologico da infeco urinria. Como um meio deficiente em electrlitos, impede o swarming de Proteus spp meio no selectivo. 1.4. Para o crescimento de microrganismos fastidiosos recorre-se por vezes a gelose sangue (ex: Streptococcus pyo genes) e a gelose chocolate (ex: H. influenzae). Estes meios preparam-se utilizando um meio base isento de acares (ex: Blood agar base, Columbia agar) ao qual se adiciona sangue desfibrinado (5%).

A gelose chocolate prepara-se do mesmo modo, mas, aps o aquecimento da agarose, adiciona-se sangue, que aquecido a 70C 115. Com o aquecimento so libertados para o meio nutrientes dos eritrcitos que vo servir de factores de crescimento tais como a hemina e o coenzima NAD a certas espcies bacterianas como ex: H. influenzae. A partir de 1930, a preparao dos meios de cultura foi simplificada, pois passou a utilizarse uma pesagem nica de meios desidratados, evitando-se assim o trabalho fastidioso na pesagem dos diferentes constituintes dos meios de cultura. Nota: Algumas solues como, por exemplo, com glicose so termolbeis (no vo ao autoclave, se no perdem as caractersticas). Outros meios so muito selectivos, no necessitando de ir ao autoclave.

Isolamento de microrganismos por sementeira em agar As espcies bacterianas so geneticamente diferentes e geralmente do colnias diferentes em meios de cultura slidos. Quando estamos perante uma cultura pura as colnias tm o mesmo tamanho e o mesmo aspecto. Nestas condies possvel proceder ao estudo morfolgico, bioqumico e serolgico das espcies, conducente sua identificao. No caso de termos uma mistura de espcies bacterianas no possvel proceder identificao dos microrganismos presentes, quando essa identificao feita pelas caractersticas fenotpicas das espcies. assim evidente que o isolamento das espcies microbianas, recorrendo a tcnicas por sementeira em agar, torna possvel obter colnias isoladas de cada uma das espcies. assim possvel a identificao de espcies bacterianas, previamente em mistura. Os meios de cultura selectivos so um ptimo auxiliar para a separao de espcies bacterianas. No diagnstico clnico microbiolgico recorre-se muito aos meios selectivos anteriormente descritos. No caso de pretender isolar microrganismos de crescimento fastidioso que apenas crescem em gelose sangue ou gelose chocolate recorre-se por vezes incorporao nestes meios, de solues antibiticas como agentes selectivos.

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Metabolizao dos acares por via oxidativa ou fermentativa OF-glucose)

(meio

As bactrias metabolizam os acares como substratos energticos, por via oxidativa ou por via fermentativa, at produo de piruvato. Por via fermentativa os NADH so regenerados custa de outro composto orgnico Por via oxidativa, os NADH so geralmente regenerados custa do 02. A utilizao oxidativa ou fermentativa dos acares provoca uma diminuio do pH dos meios de cultura devido produo de cidos. O meio OF-glucose (meio HughLeifson) contm glucose como nico acar, um meio de cultura semi-slido e usa o azul de bromotimol como indicador de pH. Antes de os 2 tubos serem inoculados por picada central devem ser regenerados por fervura (10), a fim de expulsar o 0 2 incorporado no meio. Um dos tubos recoberto com parafina esterilizada (tubo fechado). Se a bactria utiliza o acar por via fermentativa, sem a interveno do O2 (anaerbia facultativa e estrita) ocorre acidificao no tubo fechado e no tubo aberto. Se utiliza a glucose por via oxidativa (aerbia estrita) s ocorre a acidificao no topo superior do tubo aberto. Se no utilizar o acar, o meio de cultura mantm a cor verde original nos dois tubos.

Prova da Catalase e da Oxidase Muitas bactrias durante o seu metabolismo produzem perxido de hidrognio (H202 gua oxigenada) e radicais livres de oxignio, nocivos para a integridade celular. As bactrias aerbias estritas e as anaerbias facultativas produzem superxido dismutase e catalase que levam destruio daqueles compostos. As bactrias anaerbias estritas como no fazem eficazmente estas operaes, no sobrevivem ao ar e tm de crescer exclusivamente em anaerobiose, isto , na ausncia total de 02. A deteco da catalase faz-se mergulhando clulas bacteranas numa gota de gua oxigenada a 3% (10 volumes), ocorrendo a libertao gasosa de 02. Este teste muito importante, pois permite diferenciar rapidamente as bactrias por Gneros (ex: Staphylococcus spp. catalase positiva e Streptococcus spp. catalase negativa). A citocromo oxidase uma enzima que intervm no transporte de electres na cadeia respiratria, como acontece nas bactrias aerbias estritas, (ex: Neisseria spp, Pseudomonas spp), at ao aceitador final 02. um teste de grande importncia para a identificao bacteriana. A deteco da oxidase (citocromo c oxidase) faz-se colocando as clulas bacterianas em contacto com uma soluo de um indicador de xido reduo (tetrametil p fenildiamina). Este indicador incolor na forma reduzida e ao ser oxidado pela citocromo oxdase adquire a cor prpurea.

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Notas: Teste da catalase se ocorrer libertao de bolhas de gs aps se colocar o inoculo na gota de gua oxigenada no centro da lmina de vidro -- Catalase Positivo (estafilococos anaerbios facultativos ou aerbios estritos); na ausncia de bolha de gs -- Catalase Negativo (estreptococos, anaerbios estritos). Teste da oxidase o aparecimento de cor prpurea no papel onde foi colocada a cultura, significa que a bactria Oxidase Positiva (aerbias estritas, pseudomonas). O no aparecimento da cor prpurea significa que a bactria Oxidase Negativa (tero que se realizar outros testes).

Fermentao bacteriana de acares Os acares so o principal substrato energtico das bactrias. A glucose quebrada por enzimas bacterianas at produo de cido pirvico.

Nas Enterobacteriaceae a partir do cido pirvico so obtidos diversos compostos, que variam consoante as espcies.

evidente que a metabolizao fermentativa dos acares nos meios de cultura provoca uma descida do pH, facilmente detectado pelo uso de indicadores de pH que mudam de cor. A maioria das espcies produz tambm fermentao gasosa com a produo de CO 2 e H2, a partir do HCOOH.

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Nos caldos com acar constitudos por: Caldo Glucosado Extracto carne1g Peptona 10g Glucose 5-10g PICADA CENTRAL NaCl 5g gua 1L (+) cor amarela V.fenol 0,018g (-) cor vermelha (laranja) pH 7,6 e aps incubao a 37C/18H trs leituras so possveis: i. cido com gs (AG) em meio cido o vermelho de fenol toma a cor amarela e no tubo Durhan observa-se gs (CO2 + H2) proveniente da aco da hidrognoliase frmica bacteriana sobre o metabolito cido frmico (HCOOH); ii. cido sem gs (A) bactria fermentadora da glucose e no possuidora de hidrognoliase frmica; iii. Ausncia de cido e gs (-) bactria no fermentadora da glucose. O meio Kligler Iron agar constitudo por: Peponas 20g Lactose 10g PICADA CENTRAL + SLANT EM ESTRIA Glucose 1g NaCl 5g Citrato ferro amoniacal 0,5g Tiossulfato de sdio 0,5g Agar 15g H20 1L V.fenol 0,025g pH = 7,4 A fermentao da lactose l-se na parte inclinada (rampa) do meio de cultura e a fermentao da glucose no fundo do tubo pelo aparecimento de cor amarela (cor do v. fenol na zona cida). Esta leitura diferencial deve-se ao facto do meio de cultura conter 10x mais lactose do que glucose. O meio de cultura indica tambm se a bactria reduz S 2032- H2S (o meio pode ficar com gs acumulado no fundo do tubo, sinal que a bactria produziu gs metabolitos resultantes da reaco), que reagindo com o sal frrico provoca o enegrecimento do meio (cor preta). Nota: Indica se a bactria fermenta a glicose (fundo do meio amarelo) e a lactose (fundo do meio amarelo + rampa isto porque o meio tem muito mais lactose (glucose + galactose) do que glicose note-se que todas as bactrias que fermentam a lactose tambm fermentam a glicose). Descarboxilao de aminocidos (ocorre somente na rampa) compensao de pH (este diminui com a fermentao e volta a aumentar com a descarboxilao) rampa deixa de estar amarela regressando cor inicial vermelho. O meio Clark Lubs tambm conhecido por meio MR VP, indica-nos se a bactria produz cidos fortes a partir do piruvato, fazendo baixar fortemente o pH do meio de cultura (reaco do vermelho de metilo positiva) ou a produo de acetona, neutra do ponto de vista de pH. A deteco da acetona faz-se pela reaco de Voges Proskauer. Geralmente estas duas reaces so mutuamente exclusivas (MR (-) VP (+) ou MR (+) VP (-)). Nota: MR (-) amarelo e MR (+) vermelho agitar VP (+) vermelho e VP (-) mantm a cor esverdeada no agitar, uma vez que a revelao feita pelo anel que se forma em cima do caldo.

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Meio de MR VP (Clark Lubs) constitudo por: Meio MRVP Peptona 7g K2HP04,5g Dextrose 5g H20 1L pH 6,9 O Meio

MacConkey agar contm lactose como nica fonte de carbono, o V. neutro como indicador de pH, cristal violeta e sais biliares como agentes inibidores de bactrias Gram positivo meio selectivo para Gram (-): MacConkey agar Peptona 20g Lactose 10g Sais biliares 1,5g NaCl 5g Cristal violeta 0,001g V. neutro 0,03g Agar 15,0g H20 1L pH = 7,1 As bactrias Gram negativo fermentadoras da lactose (lac +) produzem colnias vermelhas (cor do V. neutro em zona cida) e as bactrias lac- do colnias amarelas (cor do V. neutro em zona alcalina) meio diferencial. No meio CLED agar constitudo por: Extracto de carne 3g Peptona 4g meio no selectivo e diferencial Triptona 4g Lcistena 1,2g Lactose 10g Agar 15g H20 1L Azul bromotimol (6,0 - 7,6) 0,06g pH = 7,3 As bactrias lac positivas originam colnias amarelas (cor do A. bromotimol na zona cida), enquanto que as lac negativas produzem colnias verdes ou azuis. Existem estirpes bacterianas fermentadoras da lactose que no manifestam o fentipo lac positivo por falta de uma permease, embora produzam a enzima -galactosidase. A presena de -galactosidase indica que a bactria fermentadora de lactose, utilizando-se para esse efeito o teste ONPG. Este teste requer que a bactria seja oriunda de um meio lactosado visto que esta enzima indutvel e a lactose funciona como indutor. Nota: meio incolor passa a amarelo na presena de -galactosidase.

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O meio Manitol Salt agar contm manitol como nica fonte de carbono, V fenol como indicador de pH e NaCl em elevada concentrao impedindo o crescimento de bactrias Gram negativas meio selectivo para Gram (+): Manitol Salt agar Proteose - Peptona 10g Extracto de carne 1g D-manitol 10g NaCl 75g Agar 15g H20 1L V. fenol (6,8 - 8,4) 0,025g pH = 7,4 Staphylococcus aureus cresce em presena de elevada concentrao de NaCl, e fermenta o manitol produzindo colnias de cor amarela (cor do indicador de V. fenol na zona cida). Bactrias no fermentadoras do manitol do colnias da cor do meio (vermelho). Notas: MSA se for positiva cresce; se fermentar o manitol, desce o pH, muda de cor (deixa de estar vermelho)

Utilizao de citrato como nica fonte de carbono Alguns grupos bacterianos utilizam citrato como nica fonte de carbono. Estas bactrias possuem uma permease para o citrato e tm a capacidade enzimtica (citrase redutase) para converter o citrato em cido pirvico e anidrido carbnico. Esta enzima requer caties bivalentes para a sua actividade, O meio Simmons Citrate agar utilizado para se saber se uma dada espcie bacteriana utiliza o citrato de sdio como nica fonte de carbono contendo ies Mg2+ e Azul de bromotimol como indicador de pH. Meio Simmons Citrate agar MgSO4, 7H2O 0,2g NH4H2PO4 1g K2HPO4 1g citrato (+) meio azul Citrato sdio 2g citrato (-) manuteno da cor original (verde) NaCl 5g Agar 15g A. bromotimol O,08g Agua 1L pH = 6,8 O CO2. resultante da utilizao do citrato como nica fonte de carbono, reage em meio aquoso com os ies Na produzindo carbonato de sdio, fazendo subir o pH. A cor azul (cor do indicador de pH na zona alcalina) ou simplesmente o crescimento no slant indica que a bactria utiliza o citrato como nica fonte de carbono. A manuteno da cor original do meio antes da inoculao ou a ausncia de crescimento bacteriano indica que a bactria no utiliza o citrato como nica fonte de carbono.

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Metabolizao bacteriana de aminocidos Os aminocidos so usados geralmente como fonte de N para o crescimento bacteriano. Aguns grupos bacterianos podem utilizar aminocidos como material energtico. Os aminocidos so metabolizados por desaminao ou por descarboxilao.

A remoo da funo amino (-NH2) mediada por desaminases pode ocorrer por: a. Desaminao oxidativa b. Desaminao redutora

A remoo da funo carboxilo (-COOH) mediada por descarboxilases pode ocorrer em bactrias.

Notas: a. Fenilalanina desaminase meio APP (RAMPA 2 culturas MacConkey lactose positivas E. coli) rampa muda para verde ou mantm a cor amarela se houver ou no desaminase. b. lisina descarboxilase meio LBC (meio com indicador de pH se houver descarboxilao, o pH muda para cido, e o meio toma a cor amarela. Aps a produo de produtos alcalinos ocorre o inverso mudando para a cor inicial roxo - (+)roxo, (-) amarelo importante a vigia ao longo das 18 a 24 horas para confirmar se de facto h alterao de cor, ou seja, crescimento bacteriano. c. Degradao de aminocidos aromticos

Vrios meios de cultura utilizados em microbiologia podem pr em evidncia estas caractersticas bacterianas. Notas: utilizao do triptofano com produo de indol. Meio SIM (meio semi-slido SEM RAMPA, inoculao por PICADA CENTRAL). Se a bactria for mvel espalha-se, se no for s se desenvolve junto da picada. Aps a reaco, adiciona-se o reagente Ehrlich-Kovacs para confirmar a presena de indol (+)anel vermelho; (-)anel acastanhado.

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d. Demonstrao da existncia de fenilalanina desaminase, usando o meio: Fenilalanina agar Peptona 10g K2HPO4 1g NaCl 1g Ext. levedura 3g Fenilalanina 2g Agar 12g H20 1L pH = 7,3 As bactrias possuidoras de fenilalanina desaminase produzem cido fenilpirvico a partir da fenilalanina do meio. A adio de uma soluo frrica em meio cido sobre as colnias produz uma cor verde, devido ao complexo formado entre o cido fenilpirvico e o io frrico.

e. Demonstrao da existncia de descarboxilases de aminocidos usando: Caldo Lisina descarboxilase (LDC) Caldo Ornitina descarboxilase (ODC) Extracto Levedura 1,5g Glucose 0,5g L-lisina (Cl-) ou L ornitina 2,5g Azul bromocresol indicador H20 1L pH = 6,8 As bactrias que descarboxilam o aminocido produzem subida do pH do meio, neutralizando os cidos da metabolizao da glucose. Tal facto acontece porque o meio de cultura tem maior quantidade de aminocido do que glucose A manuteno da cor prpura do meio indica que a bactria possuidora de descarboxilases. O aparecimento de cor amarelo indica apenas a presena de cidos provenientes da metabolizao da glucose, devido ausncia de descarboxilases. f. Produo de indol a partir de triptofano, mediada por triptofanases gua de peptona OU Meio SIM Peptona 10g Peptona de casena 20,0g NaCl 5g Peptona de carne 6,1g H20 1L Sulfato de amonio ferroso 0,2g pH 7,2 Tiosulfato de sdio 0,2g Agar 3,5g H20 1L pH = 7,3 As bactrias produzem indol a partir do aminocido triptofano. A deteco do indol faz-se com o reagente de Erlich-Kovacs sobre as culturas, formando-se um anel vermelho na zona de contacto com a cultura.

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Reduo de nitratos, Produo de Urease e Produo de H2S Certos grupos bacterianos tm a capacidade de reduzir os nitratos a nitritos ou a N2, graas presena de nitrato redutases. No meio de nitratos as bactrias reduzem o nitrato a nitrito, o que evidenciado pela adio de cido sulfanlico e N, N-dimetil-1-naftilamina, produzindo cor vermelha com o anio nitrito. Caldo de Nitratos Extracto de carne 3g Peptona 5g KNO3 1g gua destilada 1L pH = 7,2 Um resultado negativo pode dever-se ausncia do anio NO2-, pois a reduo pode ter transformado os N03- N2. A fim de evitar os resultados falsos negativos, adiciona-se ao meio zinco em p como redutor. O aparecimento de cor vermelho indica que o nitrato do meio estava intacto (Zn + N03- N02- + Zn2+). Se no houver cor vermelho, a bactria reduziu os NO3- N2, portanto possu nitrato redutases. A reduo dos nitratos a azoto tambm pode ser avaliado usando tubos Durhan nos caldos de nitrato, notando-se a presena de gs no interior destes tubos. A produo de urease, enzima que hidrolisa a ureia em amonaco e CO2 (aumento do pH), importante para a classificao de Proteus spp, Kiebsiella pneumoniae e Helicobacterpylon. Composio do meio de cultura: Meio de ureia agar Extracto de levedura 0,1g KH2PO4 9,1g Na2HPO4 9,5g urease(+) cor salmo Urela 20g urease(-) cor rosa choque (meio alcalino) Agar 15g V. fenol 0,01g H20 1L pH =7.2 A hidrlise da ureia e a libertao de amonaco faz subir o pH do meio, tomando a cor rosa devido ao V. de fenol. Algumas bactrias so capazes de produzir gs sulfidrico a partir do aminocido custa da enzima cistena desulfurase. Os meios de cultura SIM agar e Kligler contm na sua constituio tiosulfato, a partir bactrias podem produzir H2S. O gs produzido pelas bactrias reage com o io meio produzindo-se um precipitado negro. cistena, iron agar do qual as sulfdrico frrico do

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O sistema API O sistema API 20 E uma verso em miniatura dos testes bioqumicos convencionais, indicados nos exerccios anteriores. Os diferentes meios de cultura esto introduzidos em diversas cpulas de uma galeria plstica, no estado desidratado. preparada uma suspenso bacteriana que vai ser dispensada em cada poo da galeria. As galerias API ficam a incubar em estufa a 37Cl24horas. Vai ocorrer metabolizao dos substratos que se tornam evidentes por reaces colorimtricas ou por turvao, consoante o tipo de galerias. As leituras so feitas manualmente ou automaticamente. E o perfil numrico dos resultados obtidos reconhecido em computador com software adequado, tornando possvel a identificao de enterobactrias. Existem outros tipos de galerias para bactrias Gram positivo e Gram negativo e tambm para leveduras. Este sistema tem a vantagem de utilizar um elevado n de substratos e facilitar a identificao semi-automtica de estirpes, tornando possvel a identificao de espcies difceis de identificar por mtodos tradicionais. Resultados do API 20 E: ONPG Hidrlise da ortonitrofenol--D-galactose ADH Transfor. da arginina em ornitina, amonaco e CO2 LDC Formao de cadaverina por descarboxilao da usina ODC Formao de putrescina por remoo do CO2 da ornitina CITRATO Utilizao do citrato como nica fonte de carbono H2S Reduo do enxofre das peptonas e tiosulfato de sdio UREIA Degradao da ureia em amonaco TODA Formao do cido indolpirvico a partir do triptofano INDOL Formao de indol a partir do triptofano VP Produo de acetona GELATINASE Liquefaco da gelatina GLU Fermentao da glucose MAN Fermentao do manitol INO Fermentao do inositol SOR Fermentao do sorbitol RHA Fermentao da ramanose SAC Fermentao da sucrose MEL Fermentao da melibiose AMY Fermentao da amigdalina ARA Fermentao da arabinose Nota: Algumas tm que se cobrir com parafina

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Mtodo de cultura de Fungos Filamentosos em lmina Os fungos so microrganismos eucariontes e podem ser unicelulares ou filamentosos. A identificao dos fungos filamentosos depende muito do aspecto macroscpico do miclio, do aspecto microscpico das hifas e rgos reprodutores. As colnias dos fungos so formadas por hifas que formam um miclio que adere ao agar (miclio vegetativo) e pelo miclio areo, onde se encontram as hifas especializadas para a reproduo. Os fungos filamentosos isolados em cultura podem ser observados ao microscpio usando tcnicas prprias como o mtodo de cultura em lmina. Este mtodo permite a obteno de duas preparaes definitivas para observao ao microscpio (uma a partir da lmina e outra a partir da lamela) conservando as estruturas intactas. Nota: Parte experimental na cmara de fluxo laminar tudo estril para que os esporos no invadam o ar para o cuidado da nossa sade.

Curva de crescimento bacteriano em meio de cultura lquido no renovado (Mtodo Turbidimtrico). Contagem de UFC/ml (Mtodo das diluies sucessivas e por membrana filtrante) As clulas bacterianas dividem-se por ciso binria, aps a replicao semi-conservativa do DNA. Em condies fisiolgicas adequadas, certas espcies bacterianas crescem muito rapidamente em caldos nutritivos, passando por uma fase de adaptao, por uma fase de crescimento exponencial at ao esgotamento dos nutrientes no meio, entrando na fase estacionria do crescimento. A avaliao do crescimento bacteriano pode fazer-se por mtodo turbidimtrico (A620nm) ou pelo mtodo das diluies sucessivas em gelose nutritiva (UFC/ml), ao longo do tempo de crescimento. O n de UFC/ml, numa dada amostra, pode tambm ser determinado pelo mtodo da membrana filtrante.

Notas: colnia conjunto de bactrias provenientes da mesma clula me pelo que a contagem de colnias equivale ao nmero de bactrias inicialmente numa cultura.

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Exemplo de clculos: 9colnias-----------100l (10-5) Xcolnias-----------1000l (1mL) X = 90, logo: Resultado final: 90 x 105 UFC/mL UFC = unidade formadora de colnias Sementeira por encorporao (bactrias anaerbias) ou por ESPALHAMENTO (pipeta estril dobrada em tringulo)

Isolamento da Flora Bacteriana Comensal no Homem A boca, a nasofaringe e as mos de um indivduo saudvel contm uma flora bacteriana residente sem causar doena ao hospedeiro. No entanto, podem em situaes clnicas particulares tornarem-se patognicos oportunistas ou serem patognicos para terceiros. importante conhecer a flora autctone da pele e das superfcies mucosas, pois desempenha um papel importante na defesa inespecfica do organismo contra a invaso de microrganismos patognicos e o seu conhecimento facilita o diagnstico microbiolgico das doenas infecciosas. O transporte de uma amostra biolgica para o laboratrio de microbiologia faz-se sempre em meio de cultura de transporte que impede o crescimento normal da flora de cada regio, o que facilita o isolamento dos microrganismos patognicos. Este exerccio tem como finalidade o isolamento de microrganismos colhidos com zaragatoas a partir das fossas nasais, orofaringe e mos. Notas: utilizao de zaragatoas (cotonetes gigantes) com soro fisiolgico para melhorar a adeso das bactrias. Nasofaringe gelose de sangue (meio enriquecido) e gelose de chocolate (para H. influenzae) Orofaringe placa de gelose de sangue Mos (unhas e entre os dedos) Bactrias fastidiosas difceis de serem cultivadas, necessitando de outros nutrientes inexistentes no agar nutritivo comum. Identificao das diferentes colnias: -hemolticas = hemlise total = alo branco volta das colnias corresponde eliminao das hemcias; -hemolticas = hemlise parcial = colnias verdes devido as bilirrubinas e biliverdinas; -hemolticas = sem hemlise = colnias semelhantes s colnias cultivadas em agar nutritivo comum.

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Questes 2: Justifique o crescimento mais lento das bactrias em anaerobiose. Resposta: Indique a importncia deste meio na identificao bacteriana, por mtodos fenotpicos. Resposta: Qual a importncia fenotpica dos testes de catalase e oxidase? Exemplifique. Resposta: O citrato intervm no ciclo de Krebs. Esta via metablica acontece no meio Simmons? Resposta: Como que as bactrias assacarolticas produzem energia custa de aminocidos? Resposta:

Qual o papel da urease em H. pylori? Resposta:

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