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Slide - APLICAÇÕES DA CITOMETRIA DE FLUXO NO DIAGNÓSTICO ONCOHEMATOLÓGICO

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Aplicações da Citometria de Fluxo

no diagnóstico oncohematológico
Dra. Nydia Strachman Bacal
Hematologista e Patologista Clínica
Dra. Nydia Strachman Bacal
Hematologista e Patologista Clínica
Aplicações da Citometria de Fluxo no diagnóstico
oncohematológico
Essas partículas estão suspensas em meio líquido
CÂMERA DE FLUXO CÂMERA DE FLUXO
FOCO HIDRODINÁMICO FOCO HIDRODINÁMICO
LASER LASER
Sistema que gera um fluxo contínuo laminar de partículas,
que passam uma a uma frente a um feixe de laser
Orifício com
Diâmetro: 50 a 250 m
Orifício com
Diâmetro: 50 a 250 m
F
r
e
q
Fluorescence
FSC Sensor
Detector de Fluorescência
(FL1,FL2, FL3 e FL4)
(tubos fotomultiplicadores)
Fotomultiplicadores
Impulsos elétricos
Sinais analógicos
Sinais digitais
Distribuição por frequência
Histogramas
Lasers - Fluorocromos
Fluorocromo Laser (nm) Emissão (nm)
FITC 488 525
R-PE (PE) 488 575
Pe-Cy5 (TC1) 488 667
PerCP (BD2) 488 675
PerCP/Cy5.5 (BD) 488 695
7-AAD 488 655
Iodeto de propidium 488 570
Texas Red 595 615
APC 633, 635 660
Cy5 633, 635 667
Citometria de Fluxo
Imunofenotipagem
• Análise da expressão antigênica das células através
da ligação antígeno – anticorpo - fluorocromo
Anticorpos monoclonais
designados “CDs”
Clusters of differentiation
ligam-se as células nos
determinantes antigênicos
ou epítopos em sua
membrana,
citoplasma e
intranuclearmente.
4 4 4 3 2 1 XL
6 5 4 4 3 2 1 FC500
6 5 4 3 2 1 FACSCanto
4 3 3 3 2 1 FACSalibur
3 3 3 2 1 FACScan
9 8 7 6 5 4 4 3 2 1 CYAN
Alexa450 Alexa405 APC-Cy7 APC/Cy5 PE-Cy7 PE-Cy5.5 PE-Cy5 PE-TR PE FITC
Citometros de Fluxo - Fluorocromos
• Análise do conteúdo de DNA
• Quantificação de reticulócitos
• Análise da Subpopulação Linfocítica
• •• • Diagnóstico e acompanhamento de Leucemias e Linfomas
• Diagnóstico e acompanhamento de Mieloma Multiplo
• Mielodisplasia / Doenças Mieloproliferativas
• Diagnóstico de Hemoglobinúria Paroxística Noturna
• Detecção de Anticorpos Antiplaquetários
• Disfunção plaquetária
• Quantificação de células progenitoras (stem cell)
• Detecção de Células Neoplásicas não hematopoéticas
• •• • Monitoramento Quimioterapia / Doença Residual Mínima
• •• • Avaliação imunológico de paciente transplantado e de infusão linfocitária
Outras aplicações : Estudos da função celular, Apoptose, MDR (Múltipla
Resistência à Drogas) , Procedimentos em Hemoterapia (Detecção de Anticorpo
em Anemia Auto-imune, Detecção de hemorragia feto materna, Controle de
Qualidade de Leucodepleção, etc...) , HLA-B27, Teste de Antígeno Leucocitário
(HLA) e Cross Match.
ALGUMAS APLICAÇÕES CLÍNICAS ATUAIS
Anti-CD3 PerCP
Anti-CD8 PE
Anti-CD4FITC
Análise da Subpopulação Linfocítica
IMUNODEFICIÊNCIA ADQUIRIDA
Anti-CD3 PerCP
Anti-CD16 /CD56PE
Anti-CD19 FITC
Aplicações:
Monitorar Imunodeficiência Adquirida (AIDS)
Imunofenotipagem de Linfomas
Imunofenotipagem de Leucemias
Monitorar transplantes
Monitorar sistema imunológico
Função plaquetária
Estratégia de Gates
janelas
1. FS x SSC
tamanho x granularidade
2.CD45 x SSC
3. Gates sequenciais
•CD19
•CD3
•CD138
•CD34
EXPRESSÃO DO CD45 em Leucemia
Aguda
Diagnóstico e acompanhamento de
Leucemias, Linfomas e Mieloma
• Leucemias agudas
• Linfóides x Mielóides
• Leucemias Crônicas
• Linfocítica, Mielomonocítica
• Linfomas leucemizados
• Discrasia de Células Plasmáticas
Diferenciação Granulocítica – MO normal
Painéis de anticorpos monoclonais
CD34 CD34
CD117 CD117
HLA HLA- -DR DR
I II III IV V
MieIobIusto Pro- MieIócito Metu- NeutrófiIo
mieIócito mieIócito
ßustdo
CD117 CD117
CD1b CD1b
CD11b CD11b
CD1b CD1b
CD11b CD11b
CD1ó CD1ó
CD1b CD1b
CD11b+forte CD11b+forte
CD1ó+forte CD1ó+forte
CD34/CD117/CD4b/CD1333
CD1ó/CD13/CD4b/CD11b
CD13+forte CD13+forte
CD33+forte CD33+forte
CD13+forte CD13+forte
CD33+forte CD33+forte
CD13+fruco CD13+fruco
CD33+fruco CD33+fruco
CD13+ CD13+
CD33+fruco CD33+fruco
CD13+forte CD13+forte
CD33+fruco CD33+fruco
CD1b CD1b
Dra.Silvia Ines Pires Ferrreira – Hemosc/ Sta Luzia -SC
LMA M3
CD45xSS
HLA-DRxCD45
CD33xCD45
CD2xCD45
CD13xCD45
CD34xCD45
CD117xCD45
CD56xCD45
CD71xCD45
MPO(c)xCD45
Diferenciação Linfóide B – MO Normal
Painéis de anticorpos monoclonais
CD34 CD34
TdT TdT
CD10+forte CD10+forte
I II III IV V
CD4b+fruco CD4b+fruco
CDZ0+fruco CDZ0+fruco
Cit Cit Iq Iqµ µ
CD4b CD4b
CDZ0 CDZ0
Cit Cit Iq Iqµ µ
IqM IqM sup sup
CD4b+forte CD4b+forte
CDZ0+forte CDZ0+forte
IqM IqM sup sup
CD4b CD4b- -/+ /+
Cit Cit Iq Iqµ µ
TdT/CDZ0/CD19/CD10
CD34/CDZZ/CD19/CD4b
CD34 CD34
TdT TdT
sIqk/sIqk/CDZ0/CD10 Cit Cit Iq Iqµ µ/ Iq Iqµ µ sup sup /CDZ0/CD10
Morco Morcoç çôes AIfernofivos ôes AIfernofivos
CD19 CD19
CDZZ CDZZ CDZZ CDZZ
CD4b+fruco CD4b+fruco
( (TdT TdT) )
CD10+forte CD10+forte
CD19 CD19
CDZZ CDZZ
CD10+fruco CD10+fruco
CD19 CD19
CDZZ CDZZ
CD19 CD19
CDZZ+forte CDZZ+forte
CD19 CD19
Pró B Pré-pre-BI Pré-pre-BII Pré-pre-BIII Madura Plasmática
imatura B IV
Dra. Silvia Ines Pires Ferrreira – Hemosc/ Sta Luzia - SC
LLA B MADURA
LINFOMA DE BURKITT
CD34xCD45
CD19xCD45
HLA-DRxCD45
CD20xCD45
CD10xCD45
CD22xCD45
TdTxCD19
KAPPA(sup)xCD19
IgM (sup)xCD19
CD45xSS
P.O. 32a – LMA M0
ASF, 28a – LMA M0
LLC- B: Células linfóides B com restrição de cadeia leve monoclonal para kappa
baixa expressão e expressão antigênica de CD5+ e CD20+ baixa expressão
Leucemia de Células Cabeludas - Hairy cell
Mieloma Múltiplo
Histograma de Tamanho x Complexidade Histograma CD138 x Complexidade
Mieloma Múltiplo
Histograma de Monoclonalidade em Kappa intracitoplasmática
Mieloma Múltiplo
CD56 x CD138
CD19 (-) nas células CD138 (+)
Mieloma Múltiplo
Histograma CD45 x CD138
Histograma HLA-DR x CD138
Mieloma Múltiplo
Histograma de Conteúdo de DNA com
Hiperdiploidia
Mieloma Múltiplo
Mielodisplasia
• PAPEL DA IMUNOFENOTIPAGEM POR
CITOMETRIA DE FLUXO
• Técnica complementar / análise dentro de
um contexto
• Quantificar blastos de forma exata
• Discriminar Mieloblastos de Promielócitos e dos
Pró-monócitos
• Estudo de mudanças fenotípicas na MDS
M.O normal
MO nl
Normal: CD34:2%
SÍNDROME MIELODISPLÁSICA
FENÓTIPO ALTERADO QUALITATIVAMENTE
Expressão antigênica assincrônica
CD34/CD15/HLA-DR(-)
Expressão antigênica diminuída ou aumentada
CD45 fraca em Monócitos
CD33 intenso / HLA-DR(+) em Neutrófilos
Coexpressão aberrante
CD56 em monócitos /CD2 ou CD19 em linhagem granulocítica
FENÓTIPO COM ALTERAÇÕES NUMÉRICAS
Linhagem celular ou maturação
Aumento de células CD34(+) - mielóide, aumento de células monocíticas e
eritróides e diminuição de neutrófilos
M.C.DelCanizo et al Immunophenotypic analysis of myelodysplastic syndromes
Haematologica/Journal of hematology vol.88(04):april 2003
ßAND/
NEUTROPHIL
META-
MYELOCYTE
MYELOCYTE PROMYELOCYTE MYELOßLAST
10
3
10
2
10
1
CD34
HLA-DR
CD117
CD13
CD33
CD11b
CD15
CD64 CD65
CD54
CD10
CD16
CD35
CD13
Dr Alberto Orfao - Contribuição dos Estudos Imunofenotípicos na caracterização
das Síndromes Mielodisplásicas – Florianópolis - Setembro de 2004
ßAND/
NEUTROPHIL
META-
MYELOCYTE
MYELOCYTE PROMYELOCYTE MYELOßLAST
10
3
10
2
10
1
CD34
HLA-DR
CD117
CD13
CD33
CD11b
CD15
CD64 CD65
CD54
CD10
CD16
CD35
CD13
Dr Alberto Orfao - Contribuição dos Estudos Imunofenotípicos na caracterização
das Síndromes Mielodisplásicas – Florianópolis - Setembro de 2004
HPN - Hemácias
Ausência de expressão antigênica
do CD55 em 46,5% das células
identificadas por Glicoforina A
Ausência de expressão antigênica
do CD59 em 34,9% das células
identificadas por Glicoforina A
HPN - Neutrófilos
Controle normal: CD55(+) = 99,8% Ausência de expressão antigênica do
CD55 em 97,7% dos neutrófilos.
HPN - Neutrófilos
Controle normal: CD59 (+) =
100,0%
Ausência de expressão antigênica de
CD59 em 82,7% das células
identificadas pelo CD13.
HPN - Monócitos
Controle normal: CD14(+) = 99,8%
Ausência de expressão do CD14 em
98,3% das células CD 64 (+)
Pesquisa de Anticorpo Anti-plaquetas
Método Direto
Total de casos 115 pacientes com plaquetopenia.
Amostra: 10 ml de sangue em EDTA.
Equipamento: Citômetro de Fluxo – EPICS XL-MCL da Beckman Coulter
Material:
- Anti-Human IgG FITC conjugate SIGMA (F-1641)
- CD41 ou CD61 PE Immunotech (PN – IM1416)
- Tampão PBS-EDTA
Método:
As Plaquetas separadas do sangue total coletada em EDTA, são
lavadas e marcadas com CD41PE e IgG FITC e analisadas no Citômetro de
Fluxo.
João Carlos C. Guerra, MD, Ruth H Kanayama, PhD, Sonia S.Nozawa, PhD, Márcia R. Ioshida, PhD, Irina Y Takiri, PhD, Robson J. Lazaro, PhD, Nelson
Hamerschlak, MD, Luiz Gastão M. Rosenfeld, MD, Celso Carlos C. Guerra MD and Nydia S. Bacal, MD. Low Platelet Counts: Diagnosis Using Flow
Cytometry and Anti Platelet Antibody – Blood (ASH Annual Meeting Abstracts) 2006 108: abstract 3966.
0.114
1.47
Controle Negativo
Plaquetas – 375.000/mm³
CSM
CSM, 20 anos ,masc.
Plaquetas – 65.000/mm³
AVS, 31 anos, fem.
Plaquetas – 16.000/mm³
AVS
O antígeno está ausente ou presente em baixa expressão em pacientes com
Síndrome de Bernard-Soulier é identificado pelo anticorpo CD42b que é
específico para a glicoproteina plaquetária GPIb
Essa glicoproteina plaquetária serve como receptor para o Fator Von Willebrand
e tem alta afinidade ao receptor de trombina.
CD42a(GPIX), CD42d(GPV) raramente utilizadas.
CD41 (GPIIb) and CD61 (GPIIIa) – Trombastenia Trombastenia de de Glanzmann Glanzmann
Quantificação de células progenitoras
CD34 (+) - Citometria de Fluxo
Protocolo “ISHAGE”
Plataforma dupla
Sangue periférico
Medula Óssea
Aférese
Cordão Umbilical
Marcação fluorescente ligada ao
cálcio permite o estudo de
ativação celular
Imunofenotipagem – Paineis
Proliferativos - utilizados no HIAE
1. Leucose Aguda :
• MPO, CD79a, CD3intra e/ou
• CD45 x SS
• Primeiro passo : 2 CD por linhagem
CD2-CD7 / CD10-CD19 / CD13-CD33 /CD4-CD14(My4) e
CD34 / HLA-DR
• Conforme linhagem segue com outros Atc específicos :
– CD20, CD22, IgM intra, Kappa e Lambda intra e/ou sup.
– CD 3sup., CD38, CD5, CD8
– raramente TdT
– CD11b, CD14(MO2), CD15, CD41,CD64, CD71, Glicoforina A, CD117
Imunofenotipagem – Painéis Proliferativos
utilizados no HIAE
2. Doenças Linfoproliferativas B
CD19 (+) ou CD20(+) ou CD138 :
CD5, CD10, CD11c, CD22,CD23,CD25, FMC- 7; IgM,
Kappa e Lambda intra ou sup.,CD103, IgG,CD38,
CD56 e HLA-DR
3. Doenças Linfoproliferativas T
-CD2, CD3intra e sup., CD4, CD5, CD7, CD8,
-CD11b, CD16, CD25, CD38, CD56, CD71 e HLA-DR,
Outros CD disponíveis:
-CD30, CD1-A, CD79b, IgG, IgD e IgA, TCRαβ/TCRγλ,
Ti -gamma.
LEUCEMIA AGUDA
FITC PE PE-Cy5
MPO c CD79a c CD3 c
CD15 CD33 CD45
CD2 CD7 CD45
HLADR CD34 CD45
CD10 CD19 CD45
IgG1FITC IgG1PE CD45PE-Cy5
Painel inicial
FITC PE PE-Cy5 FITC PE PE-CY5 FITC PE PE-Cy5
CD22 CD20 CD45 CD14 CD45 CD5 CD1a CD45
kappa CD19 CD15 CD13 CD45 TCR g//d TCR al/b CD45
Lambda CD19 CD71 glicofor. CD45 CD8 CD4 CD3
IgM c CD41 CD117 CD45
CD38 CD56 CD45
CD22c ? CD64 CD11b CD45
CD4 CD45
LLA-B LMA LLA T
Doenças Linfoproliferativas Crônicas
** Para suspeita de Linfoma de Hodgkin ou Linfomas agressivos
de grandes células, marcar com CD30 e CD15.
FITC PE PE Cy-5
HLA DR CD20 CD19
CD2 CD7 CD3
IgG IgG IgG
Plasmocitária
FITC PE PE Cy-5 FITC PE PE Cy-5 FITC PE PE-Cy5
kappa CD19 CD8 CD4 CD3 CD138 CD117 CD19
Lambda CD19 CD16 CD56 CD3 CD38 CD56 CD19
CD5 CD20 CD19 CD25 CD56 CD3 CD138 CD56 CD117
CD22 CD23 CD19 CD5 HLADR CD3 CD138 CD38 CD117
FMC7 CD11c CD19
CD79b CD38 CD19
CD103* CD25* CD19* *somente p/ HCL
IgM
IgD
IgG
CD30 CD15
CD15
Painel inicial
linoproliferativa B linfoprolifertativa T
IMUNOFENOTIPAGEM PAINEL PROLIFERATIVO
NOVEMBRO/1991 A JULHO/2007
PATOLOGIAS N°DE CASOS
LEUCEMIAS AGUDAS 1954 (31,3%)
LMA 1084 (17,4%)
LLA 854 (13,7%)
L. Bifenotipica 16 (0,2%)
NEOPLASIAS DE CÉLULAS B MADURAS 1441 (23,1%)
DLPC-B/LNH-B 1238 (19,9%)
NEOPLASIAS DE CÉLULAS PLASMÁTICAS 203 (3,2%)
DLPC-T / NK 83 (1,3%)
DOENÇAS MIELOPROLIFERATIVAS CRÔNICAS 55 (0,9%)
SMD e LMMoC 79 (1,3%)
Linfoma de Hodgkin 1 (0,02%)
MO SEM DOENÇAS ONCOHEMATOLOGICAS, CONTROLES 2589 (41,5%)
PÓS TRATAMENTOS, MO NORMAL e OUTRAS PATOLOGIAS
HEMATOGONIAS 30 (0,49%)
6232 (100%)
Imunofenotipagem de Doenças
Oncohematológicas – nov/91 a julho/07
Nº total de casos analisados: 6 234
Diagnósticos acima de 60 casos entre os 623+
casos nov/91 a julho/0/
OBRIGADA PELA ATEN OBRIGADA PELA ATENÇ ÇÃO ! ÃO !
Nydia S. Bacal
nsbacal@einstein.br
Grupo de
Grupo de
Citometria
Citometria
de Fluxo do
de Fluxo do
Laborat
Laborat
ó
ó
rio Cl
rio Cl
í
í
nico HIAE
nico HIAE
-
-
2007
2007
Ana Claudia Miranda Brito
Alexandra M.P. Cavalcante
João Carlos de C. Guerra
Sonia Tsukasa Nozawa
Ruth Hissae Kanayama
Citometro de Fluxo- nova geração
FC - 500 - Beckman Coulter
1991 - 1ª geração Epics Profile II
1994 - 2ª geração Epics XL – MCL
2007 - 3ª geração FC – 500
Laboratórios
Externos: 65%
HIAE: 35%
· Imunofenofipoqem Linfociforio
· Imunofenofipoqem em doenços
oncohemofoIoqicos
· Cuonfificoçôo de ceIuIos CD34+
· Pesquiso de HPM
· AvoIioçôo de disfunçôo e ofivoçôo pIoqueforio
· AnoIise do confeúdo de DMA
Fotomultiplicadores captam a fluorescência Impulsos elétricos/
Sinais analógicos
Sinais digitais
Distribuição por frequência/
Histogramas
R1
AnormuIidudes StetIer-Stevenson et uI WeIIs et uI
Imunofenotípicus ßIood, Z001 ßIood, Z003
MieIobIustos
Múmeros onormois Z4/4Z (b37) 7Z/IIb (oZ7)
CDZ+ IZ/4b (Z77) MP
Muturuçdo de neutrófiIos:
SSC onormoI 3b/4b (847) 9/IIb (87)
CD4b8e MP 4/IIb (37)
Podrôo onormoI CDI3/CDIo ZI/Z7 (787) Z7/IIb (Z37)
PeIoçôo onormoI HLADP/CDIIb MP o/IIb (b7)
Podrôo onormoI CDIIb/CDIo I9/Z7 (707) MP
Desvio ò esquerdo ossincrônico MP Zo/IIb (Z37)
CDbo+ 7/33 (ZI7) I8/IIb (Io7)
CD33- MP o/IIb (b7)
CD34+ MP 7/IIb (o7)
Presenço de Aqs Iinfoides I7/4b (387) 4/IIb (37)
Fenotipos uIterudos Síndrome MieIodispIásicu
Dr Alberto Orfao - Contribuição dos Estudos Imunofenotípicos na caracterização
das Síndromes Mielodisplásicas – Florianópolis - Setembro de 2004
Anormalidades Stetler-Stevenson et al Wells et al
Imunofenotípicas ßIood, Z001 ßIood, Z003
CéIuIus Monocíticus
SSC onormoI MP I/IIb (I7)
CDI3- ou CDIo- MP I/IIb (I7)
PeIoçôo onormoI HLADP/CDIIb MP b/IIb (47)
CDbo+ II/33 (337) I9/IIb (I77)
CD33- or CDI4- MP 3/IIb (37)
CD34+ MP I4/IIb (IZ7)
Presença de Ags linfóides MP 38/IIb (337)
CéIuIus Eritróides
CD7I oIferodo, 0phA ou CD4b 34/44 (777) MP
CéIuIus Mequcuriocíticus
Múmero oumenfodo Zo/44 (b97) MP
Fenotipos alterados Síndrome Mielodisplásica
Dr Alberto Orfao - Contribuição dos Estudos Imunofenotípicos na caracterização
das Síndromes Mielodisplásicas - Florianópolis - Setembro de 2004

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