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Eletroforese Capilar - Resumo

Eletroforese Capilar - Resumo

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Published by: Samara Ferreira Alves on Nov 13, 2012
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ELETROFORESE CAPILAR

A eletroforese capilar (EC) é um método físico de análise baseado na migração, dentro de um capilar, de solutos dissolvidos em uma solução eletrolítica, sob influência de uma corrente elétrica. É uma técnica que permite a análise quali e quantitativa íons inorgânicos, ácidos nucléicos, proteínas, metabólitos secundários e fármacos, sendo bastante aplicável em diversas áreas do conhecimento, como química, bioquímica, ciência forense, laboratórios clínicos, indústria farmacêutica, entre outros. Trata-se de uma técnica que apresenta resultados promissores em termos de resolução, velocidade e potencial para automação, principalmente em relação à eletroforese convencional, e apresenta uma instrumentação relativamente simples, como pode ser visto a seguir:

- Uma fonte de alta voltagem, que vai produzir o campo elétrico necessário à separação eletroforética; - Dois reservatórios de eletrólitos, mantidos no mesmo nível, que vão conter as soluções anódica e catódica; - Dois eletrodos (cátodo e ânodo), imersos nos reservatórios dos eletrólitos e conectados à fonte de alta voltagem e que irão consistir nos polos positivo e negativo do sistema; - Um capilar de sílica fundida, de 10-100 µm de diâmetro e 40 a 100 cm de comprimento, feito geralmente de vidro. Os terminais do capilar são imersos nos reservatórios contendo os eletrólitos. Vai ser o caminho por onde os analitos irão migrar de acordo com sua mobilidade eletroforética; - Detector capaz de monitorar a quantidade de analitos que passam através do segmento de detecção do capilar em intervalo de tempo específico. Os detectores mais usuais em eletroforese capilar são baseados em espectrofotometria de absorção (UV-VIS) ou fluorimetria, sendo também utilizada a detecção eletroquímica ou por espectro de massas. Na eletroforese capilar, dois fatores governam o fluxo dos analitos pelo capilar: a migração eletroforética e o fluxo eletro-osmótico. A migração eletroforética é a migração de analito baseada em suas propriedades massa-carga, sendo característica de cada analito e podendo ou não se dar no sentido em direção ao detector. Trata-se, portanto, do movimento dos analitos no capilar devido ao campo elétrico (E). A velocidade eletroforética vai depender de fatores inerentes ao analito (tamanho, forma, carga elétrica) e fatores inerentes ao eletrólito (força iônica, pH, viscosidade e presença de aditivos), conforme a seguinte equação:

formando uma camada móvel de cátions em direção ao cátodo (polo negativo) formando um fluxo laminar uniforme. como pode ser visto a seguir: A velocidade do fluxo eletrosmótico (Veo) depende da mobilidade eletro-osmótica (µeo). por sua vez. maior a viscosidade do eletrólito e maior o tamanho do capilar. a viscosidade para que não haja diminuição desnecessária da velocidade eletroforética que poderia acarretar em falta de reprodutibilidade inter-corrida e diminuição de eficiência. podendo acarretar em alargamento de picos. a amostra não influencia na velocidade do fluxo . uma das consequências do efeito Joule é a alteração na viscosidade do eletrólito que pode acarreta em perda de reprodutibilidade. que permite que os analitos. independente de sua carga. isto é. Já o fluxo eletro-osmótico é o fluxo de eletrólito ao longo do capilar. quanto maior a carga e a voltagem aplicada. uniforme em todo o diâmetro do capilar.Como pode ser observado pela equação. está diretamente relacionada à densidade de carga da parede interna do capilar e às características do eletrólito. levando consigo os analitos. Se a carga líquida do analito for zero (ou seja.0) que vão interagir eletrostaticamente com íons de carga positiva presente no eletrólito. partícula neutra). devido a superfície negativamente carregada da parede interna do capilar de sílica fundida. Quanto maior o tamanho da partícula do analito. Uma das principais vantagens da eletroforese capilar em relação às demais técnicas cromatográficas é que por conta desse “bombeamento de fase móvel” provocar um fluxo laminar. maior a velocidade eletroforética. menor a velocidade eletroforética. independente de sua carga. não há mobilidade eletroforética (velocidade igual a zero). como pode ser visto na equação a seguir. que. Como será visto adiante. Como pode ser observado. sendo a força adicional que direciona todos os analitos através do capilar em direção ao detector. migrem pelo capilar podendo chegar ao detector. contrário ao que ocorre no bombeamento por pressão (CLAE e CLUE) em que o fluxo se dá de forma parabólica. Por isso é importante também observar. Esse fluxo eletro-osmótico ocorre por conta da presença de grupos silanóis ionizados (quando em pH acima de 3. no eletrólito.

de diferentes densidades de cargas. portanto. a eletroforese convencional seria muito demorada. A mobilidade eletroforética e o fluxo eletro-osmótico podem. No entanto. que vai depender principalmente das cargas da parede interna do capilar. o que pode ser controlado pelo pH do eletrólito: quanto mais básico o pH. Como pode ser observado.eletroosmótico. numa mesma corrida eletroforética. na separação de ânions. para se acelerar o processo. define-se velocidade total a soma das velocidades eletroforética e eletroosmótica. elui primeiro as moléculas com maior carga (positiva) e elui por último às que tem menor carga (negativa). dependendo da carga do soluto. consegue-se separar ânions e cátions. utiliza-se polaridade invertida e fluxo eletroosmótico invertido. ou não. o que é esquematizado a seguir: . o que pode ser conseguido pela adição de tensoativos ao eletrólito. maior a ionização dos grupos silanóis da parede interna do capilar e portanto maior a densidade de cargas negativas (potencial zeta) e maior a velocidade eletroosmótica. atuarem na mesma direção. nesses casos. Dessa forma. o que é esquematizado na figura abaixo: Como pode ser observado.

maior o tempo requerido para a corrida e quanto maior a velocidade total. quanto maior o tamanho efetivo do capilar. menor o tempo necessário para a corrida. no entanto é pouco usual. Lembrando que o comprimento efetivo do capilar é a porção do capilar que se situa entre o ponto de aplicação da amostra e o detector.A eletroforese com voltagem em gradiente é uma boa alternativa para a separação simultânea de compostos com mobilidades eletroforéticas muito diferentes em um período de tempo reduzido. aumenta-se a velocidade eletroforética e eletroosmótica). O número de pratos teóricos (N) é um indicativo de eficiência da eletroforese capilar e que implicará diretamente na sua resolução. Consistiria em começar a eletroforese com uma voltagem moderada para a separação dos analitos com mobilidade maior e em seguida aumentar essa voltagem para acelerar a velocidade dos analitos de mobilidade menor (lembrando que. Tempo (t) necessário para o soluto migrar uma distância (l) do terminal de injeção do capilar até a janela de detecção (comprimento efetivo do capilar) é definido pela equação: Ou seja. sendo definido pela seguinte equação: . segundo as equações apresentadas. aumentando-se a voltagem.

mas utiliza-se o artifício de se criar uma “janela” no capilar próximo ao detector. Embora ele tenha sido enormemente minimizado com uso de capilares. São geralmente produzids em vidro. é desejável que aplique altas voltagens para se obter separações com alta resolução.Quanto menor o diâmetro interno do capilar. uma vez que quartzo não absorve luz UV. O vidro absorve UV. quartzo ou teflon. São fundidos com sílica (dióxido de silício) na parte interna.Portanto. sendo inclusive. o número de pratos teóricos pode ser aumentado com o aumento da voltagem. N é tipicamente é 105 com as voltagens usuais aplicadas em eletroforese capilar. O quartzo seria o mais ideal. em alguns casos. diz-se que a eletroforese capilar é uma técnica de resolução bastante elevada quando comparadas às demais. CAPILARES: Tem de 10 a 100 µm de diâmetro e 40 a 100 cm de comprimento. O aquecimento produzido pode alterar a viscosidade do eletrólito o que pode alterar a velocidade de migração e comprometer a repetitibilidade das corridas. principalmente quando se pensa em detecção por UV. como se pode observar. Não deve haver interação do analito com a sílica. Assim. O tamanho do capilar influencia na corrida das seguintes formas: . menor a corrente elétrica e consequente maior tempo de migração. o número de pratos (N) não aumenta como o aumento do comprimento do capilar.Quanto maior o capilar. Por isso. o que vai expor grupos silanóis que são importantes para o fluxo eletroosmótico explicado anteriormente. que seria uma espécie de buraco que permite que a luz passe pela amostra mas não passe pelo vidro. A solução mais empregada é o uso de um sistema de controle de temperatura (capilar resfriado com líquido ou ar) e usar voltagens adequadas (não muito altas). Ao contrários das demais técnicas cromatográficas. ele ainda é um problema que pode ocorrer na eletroforese capilar e que pode influenciar enormemente na resolução e repetitibilidade das corridas. mas o aumento da voltagem pode provocar efeito Joule que pode comprometer a resolução e repetitibilidade das corridas. podendo ocasionar alargamento dos picos e piora na resolução e repetitibilidade. necessário utilizar eletrólitos aditivados com substâncias que inibam essa interação. permitindo maior elevação da voltagem e redução no tempo de análise e maior eficiência de separação (maior número de pratos teóricos) . O capilar é refrigerado externamente por ar ou líquido para evitar efeito Joule. O efeito joule consiste na conversão de energia de elétrica em energia térmica. Um dos grandes gargalos da eletroforese é o efeito Joule. mas os de vidro são os mais utilizados principalmente por conta do custo mais acessível. O teflon não é muito utilizado pois não suportas elevadas voltagens. maior a capacidade de dissipação de calor (menor efeito Joule). . decorrente da passagem da corrente elétrica pelo capilar.

existe uma dificuldade na detecção por conta do menor volume de amostra (nL) e pequeno diâmetro interno dos capilares.INJEÇÃO DE AMOSTRA: A quantidade de amostra injetada num eletroferógrafo capilar situa-se na ordem de 10 a 100 nL de amostra. sendo. A injeção eletrocinética consiste na injeção com base nas mobilidades eletroforéticas dos analitos. que é crucial em algumas áreas de aplicação (como por exemplo na área forense). isso também pode ser uma limitação quando se pensa em técnicas preparativas. viscosidade da amostra e tamanho efetivo do capilar podem influenciar. que exigem grande número de amostra. o que exige que faz com que as mesmas técnicas utilizadas em CLAE sejam menos sensíveis em EC. fatores como tempo de injeção. . Por isso. na eletroforese capilar não é possível se realizar fracionamento de amostras. No entanto. o que pode ser justificado pelas micrométricas dimensões dos capilares. portanto. A injeção da amostra no eletroferógrafo capilar pode ser feita de duas formas: por injeção hidrodinâmica ou por injeção eletrocinética. ao contrário das técnicas cromatográficas convencionais. Em ambos os tipos de injeção de amostra. A injeção eletrocinética tem a desvantagem de favorecer a injeção de moléculas de maior mobilidade. vácuo ou gravidade. Esse aspecto traz à técnica uma enorme vantagem às demais por conta da pequena demanda de amostra. A injeção hidrodinâmica consiste na injeção de amostra com base no uso de pressão. concentração da amostra. no entanto. DETECÇÃO: Geralmente os mesmos detectores utilizados em CLAE. não há possibilidade de eletroforese capilar preparativa. uma forma de injeção que não produz amostras representativas dentro do equipamento. através da formação de um circuito elétrico entre o recipiente que contém a amostra e o eletroferógrafo. ou seja.

Ler também na Farmacopeia Brasileira 5ª Edição (a parte de fluxo eletroosmótico é muito bem explicadinha lá) e no livro de Química Analítica de Skoog (tem todas as técnicas cromatográficas.Detectores de fluorescência (detectores de laser induzido por fluorescência ou LIF) .Dectores de absorbância (UV. v. 493-511. ou seja. isto é. 1997. 1996. visível. UV-DAD. o detector ideal deve ser versátil. 19. Os principais detectores utilizados em eletroforese capilar podem ser em linha. Mecanismos de separação em eletroforese capilar. F. M. p. UV-indireta) . na extremidade final do capilar. ou após a coluna. praticamente). p. 173-181. 2. sensível. enquanto a solução ainda migra capilar. F. Química Nova. Eletroforese capilar: conceitos básicos. 20. 5.Amperometria e condutivimetria (menos empregados em eletroforese capilar) A espectrometria de massas é um tipo de detecção que é realizado no final capilar. VANTAGENS DA ELETROFORESE CAPILAR:  Separações de alta eficiência (número alto de pratos teóricos comparativamente à CLAE)  Tempos de análise relativamente curtos (poucos minutos)  Instrumentação relativamente simples  Pequena demanda de amostra  Não há alargamento de bandas  Diminuição do efeito Joule (o calor é dissipado mais facilmente dentro do capilar)  Possibilidade de automatização REFERÊNCIAS QUE EU SUGIRO (ARTIGOS EM PORTUGUÊS):  TAVARES. Química Nova. linha de base estável. M. M. v. M.Como em qualquer análise.  TAVARES. baixo nível de ruido. ampla faixa de linearidade. Os principais detectores em linhas para eletroforese capilar são: . n. . robusto e responsivo a vários tipos de analitos e a escolha do detector vai depender das propriedas fisico-químicas do analito. n.

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