Direccionamiento de protenas

Modificacin de protenas
1. Las protenas sufren modificaciones post-traduccionales (luego de la traduccin) y co-traduccionales (durante la traduccin). 2. La actividad biolgica puede depende de las modificaciones que sufra el polipptido y de su forma de plegado para alcanzar su estructura funcional. 3. La espectrometra de masas es uno de los mejores mtodos para identificar las modificaciones. Dado que cada aminocido tiene una masa y propiedades caractersticas, los fragmentos de protenas tendrn una masa y carga diferencial que nos permitirn reconocerlos MODIFICACIONES COVALENTES responden a una seal de fosforilacin, por la cual una kinasa fosforila a la protena en cuestin activndola. Luego una fosfatasa remueve el grupo fosfato adicionado cuando la seal desaparece y la protena pierde su actividad. MODIFICACIONES NO COVALENTES responden a seales de unin a GTP, por la cual la protena a regular se puede unir al GTP y ser activa; pero en ausencia de la seal, se hidroliza el GDP y la protena pierde su actividad.

Modificaciones post-traduccionales Plegado y procesamiento de protenas

Durante la traduccin, se puede producir el plegado a medida que la protena sale del ribosoma. Estas protenas puede asumir su estructura nativa 3D espontneamente. Otras protenas requieren de chaperonas para su plegado, siendo las chaperonas protenas accesorias y de ayuda en dicho proceso.

Modificaciones en el amino-terminal y en el carboxilo-terminal

Se produce el clivaje de la formil-metionina (Met ) en el caso de protenas bacterianas y de la metionina (Met) en el caso de las protenas eucariotas. Otros aminocidos pueden ser removidos tambin.
for

Se produce la acetilacin de los residuos N-terminales y modificacin de los mismos (sobre todo en protenas que son reclutadas). Se puede remover el pptido seal de localizacin de las protenas, en el caso de protenas se secrecin o de protenas de membranas. Tambin se pueden remover los aminocidos del extremo C-terminal. Se dan, adems, modificaciones en los grupos internos de la protena.

Modificacin de aminocidos individuales

FOSFORILACIN: Se da generalmente en residuos de serina (Ser), treonina (Thr) y tirosina (Tyr) por reacciones enzimticas llevadas a cabo por kinasas especificas. Las ms comunes son en serina y tirosina. CARBOXILACIN: Se adiciona un grupo carboxilo extra a los residuos de aspartato (Asp) y glutamato (Glu). METILACIN: Se adiciona un grupo metilo a los residuos de lisina (Lys) y glutamato (Glu). 1

ISOPRENILACIN: Adicin de un grupo isoprenol a una protena que puede darse en el C-terminal o en el N-terminal. El isoprenol es un derivado intermedio en la biosntesis del colesterol. Este proceso puede darse en varios aminocidos diferentes. El grupo isoprenol es proporcionado por una cadena hidrofbica dadora pirofosfato (se liberan los fosfatos luego de la unin). ADICIN DE GRUPOS PROSTTICOS: Se puede dar por unin covalente o no covalente (quelacin) a grupos prostticos requeridos para la actividad de la protena. Ejemplos de estos son el citocromo C o el grupo Hemo de las hemoglobinas, globinas, mioglobinas, etc. PROCESAMIENTO PROTEOLTICO: Algunos tipos de protenas son sintetizadas como precursores largos e inactivos de protenas, los cuales deben ser clivados para obtener la protena con actividad individual. FORMACIN DE PUENTES DISULFURO: Se produce espontneamente entre residuos de cistenas (Cys), los cuales se aproximan durante el plegado de la protena, y ayudan a estabilizar la estructura tridimensional de la misma. Esta unin Cys-Cys slo se da en las condiciones estricas y en el entorno adecuado, proporcionado por la estructura tridimensional protena durante el plegado. GLICOSILACIN: Adicin de oligosacaridos a las protenas, usualmente en el N de la cadena lateral de residuos de asparagina (Asn) y/o en el O de las cadenas de serina y treonina. Los mecanismos de N- u O-glicosilacin son diferentes. Los azucares son transferidos en su mayora por dolicol-fosfato. Este es un lpido de la membrana del retculo endoplasmtico.

Direccionamiento de protenas Hay dos mecanismos de direccionamiento mayormente reconocidos:

Ribosomas libres en el citosol la traduccin se da en ribosomas libres en el citosol y la protena es luego translocada a su posicin determinada, la cual puede ser el ncleo, la mitocondria, los cloroplastos o los peroxisomas (por cuatro mecanismos distintos). Las protenas del citosol simplemente permanecen all. Ribosomas unidos a membranas la traduccin se da en ribosomas que estn asociados a la membrana del compartimento donde la protena debe ser dirigida. Estas son protenas de membrana plasmtica, protenas de secrecin o protenas de lisosomas. Todas estas protenas se mueven entre endomembranas (retculo endoplasmtico, aparato de golgi, membrana plasmtica) siendo transportadas por vesculas que recorren el citoesqueleto. La ruta de transporte comn a todos estos procesos comienza en el RER.

Direccionamiento de protenas sintetizadas en ribosomas unidos a membranas Protenas de secrecin: va secretoria

Un experimento histrico (del tipo pulse and chase) permiti observar como las protenas se mueven de un compartimiento a otro en el tiempo, y tambin como salen de una clula (pudiendo ingresar en otras). Se utilizaron clulas del pncreas que generan enzimas digestivas para estudiar esta va, porque se sabe que dicho rgano secreta sustancias exocrinas al intestino delgado. El ensayo const de: 1. Se utilizaron 3 juegos de clulas pancreticas (pedacitos de tejido) las cuales fueron incubadas con aminocidos radiactivos por 3 minutos y luego fueron lavados para eliminar los aminocidos marcados libres que no fueran incorporados a las protenas (pulse). A los 3 minutos se tomo el pedacito de tejido y se lav nuevamente, se lo fij para frenar la actividad biolgica y porque se quiere tomar una foto observando la posicin de las protenas marcadas (para la fijacin se puede usar glutaraldehido). Con un ultramicrtomo se realiz un corte muy fino de esta capa de clulas y se lo fij a una grilla de microscopio electrnico, se bao el corte con un gel de bromuro de plata y se realizo el revelado. All donde existiera depsito de plata es donde se encontraran las protenas marcadas. A los 7 minutos se tomo el segundo pedacito de tejido y se le realiz el mismo procedimiento (chase). A los 120 minutos se tomo el ltimo pedacito de tejido y se le realiz el mismo procedimiento (chase).

2.

3. 4.

Se esperaba observar el movimiento de las protenas radiactivas desde su posible sitio de traduccin hasta su excrecin y por el procedimiento (marcar, lavar y perseguir) se lo llama de pulse and chase. Los resultados obtenidos fueron:

Las clulas pancreticas sintetizan y secretan la mayora de las protenas que se requieren en el tracto digestivo. Ests clulas fueron marcadas con aminocidos radiactivos para estudiar la va intracelular por la cual eran secretadas. Luego de poco tiempo de incubacin con los aminocidos radiactivos (3 minutos-pulse) se revel por autoradiografa y se observ que la sntesis de protenas se localizaba en el retculo endoplasmtico rugoso. Se continu con la incubacin sin aminocidos marcados (chase) y a diferentes tiempos de revel, observando que las protenas se movieron del RER al aparato de Golgi y luego, a travs de vesculas secretorias, se encontraron en la membrana plasmtica y en el exterior celular.

Conocimientos actuales
Se sabe que la ruta secretoria comienza en el RER, pero luego puede diferenciarse a tres vas, segn:

En todos los casos las protenas se formar en la superficie del RER donde sufren los procedimiento de modificacin posttraduccional. En vesculas formadas por la membrana de este orgnulo, son transportadas hasta el aparato de Golgi, donde tambin pueden ser modificadas. VA DE SECRECIN CONSTITUTIVA las protenas se secrecin y de membrana plasmtica son encapsuladas en vesculas que se mueven (por el citoesqueleto) hasta la membrana plasmtica y se fusionan con ella, liberando las protenas se secrecin al exterior celular y quedndose con las protenas que le corresponden. VA DE SECRECIN REGULADA las protenas de secrecin y algunas sustancias de desecho son encapsuladas en vesculas secretorias, pero estas no se mueven y fusionan con la membrana plasmtica hasta que no reciben una seal especfica (que puede provenir de una cascada de sealizacin transduccional). Cuando la seal se presenta, la vescula se fusiona y su contenido es liberado al exterior celular. VA DE LISOSOMAS REGULADA las protenas de conformacin de lisosomas se mantienen en el aparato de Golgi hasta que una seal intracelular desencadene el proceso de formacin lisosomal, por el cual todas estas protenas y mayormente enzimas, quedan incorporadas en vesculas que no son excretadas al exterior, sino que cumplen funciones dentro de la clula y conforman un orgnulo propio. Deben existir seales para reconocer las protenas del lisosoma.

Transporte vesicular
Las protenas y los lpidos son llevados desde el RER al aparato de Golgi en vesculas de transporte que surgen de la membrana del RER y se fusionan luego para formar un compartimento intermediario de carcter vesicular y tubular entre el RE y el Golgi, llamado ERGIC. Las protenas son tomadas luego del ERGIC y transportadas en vesculas, liberndolas en el Golgi. Las protenas de membrana siempre mantienen la misma orientacin en el Golgi y en el RER.

Transporte retrgrado
Para evitar la prdida de membranas y superficie del RER y recapturar las protenas que deben residir en l, existe un transporte retrgrado por el cual se fusionan vesculas provenientes del cis-Golgi y del ERGIC, con el RE. Estas vas de recuperacin dependen de seales de recuperacin del RE. Las protenas que estn destinadas a permanecer en el lumen del RER son marcadas con una secuencia en su extremo c-terminal, la cual corresponde a: KDEL de Lys-Asp-Glu-Leu. Estas protenas son exportadas del RER al Golgi en un proceso o ruta de secrecin no selectiva, pero son reconocidos por receptores especiales ubicados en el compartimiento intermediario del ER-Golgi (ERGIC) o en el aparato de Golgi, y son selectivamente rescatados y transportados a su destino de residencia. 4

Transporte a la membrana plasmtica en clulas polarizadas

Protenas especificas son dirigidas a la cara apical o a la cara basolateral a partir del brazo trans del aparato de Golgi de manera diferenciada y gracias a la presencia de receptores vesiculares en las caras internas de cada una de las caras. Las uniones estrechas entre clulas mantienen la identidad apical y basolateral de las otras caras, previniendo la difusin de protenas entre esos dominios.

Direccionamiento diferenciado a la cara apical o basolateral.

DIRECCIONAMIENTO DIRECTO DEL TRANS-GOLGI las vesculas correspondientes a cada cara se dirigen especficamente a ellas, llevando las protenas adecuadas. DIRECCIONAMIENTO INDIRECTO VA ENDOSOMAS todas las vesculas se fusionan con la cara basolateral, tanto las que llevan protenas de dicha cara y las de la cara apical. Estas ltimas son recapturadas y redirigidas por endosomas a su cara correspondiente.

Hiptesis de la seal de localizacin

Gunter Blodel propuso: las protenas secretadas al espacio extracelular contienen una seal intrnseca que las dirige hacia y a travs de las membranas basando su justificacin en que: existe un pool de subunidades ribosmicas sobre cada mRNA que se traduce, si la seal de localizacin es traducida, es reconocida por receptores especiales del RER que hacen que la sntesis contine en su membrana y luego chupa a las protenas hacia su interior. Segn:

La secuencias seal dirige una protena hacia su localizacin apropiada en la clula y a menudo, es eliminada durante el transporte o despus de que la protena haya alcanzado su destino final.

Cesar Milstein comprob esta hiptesis. En la traduccin carente de vesculas microsomales, se generaba una protena de 2-3 KDa libre en solucin. Cuando la traduccin se realizaba en presencia de vesculas microsomales o de membranas, el tamao de la protena obtenido era menor y esta se encontraba dentro de la vescula. Por electroforesis poda comprobar que:

Surge entonces la idea de que el transporte de proteinas al interior de la vesicula est relacionado con el clivaje de una porcin de la misma. Realizando un mapa peptidico se puedo observar que le falta una porcion en el extremo N-terminal. 5

Proceso de experimentacin:
1. PREPARACIN DE LOS MICROSOMAS: a. Ruptura de las clulas por disrupcin b. Formacin de microsomas c. Centrifugacin en gradiente de densidad d. Seleccin de microsomas rugosos

2.

3.

4.

5.

6.

TRADUCCION IN VITRO EN AUSENCIA DE MICROSOMAS: Se realiza la traduccin in vitro solo con presencia de ribosomas, mRNA y aminocidos radiactivos, una vez terminado el proceso, se adicionan microsomas. Finalmente por filtracin o centrifugacin se separan lo microsomas y se puede analizar donde est la proteina traducida. En este caso no se produce remocin del extremo N-terminal y las proteinas no ingresan a los microsomas. TRADUCCION IN VITRO EN PRESENCIA DE MICROSOMAS: Se realiza la transcripcin in vitro con presencia de ribosomas, mRNA, aminocidos radiactivos y microsomas, una ves terminado se analiza la ubicacin de las proteinas por filtracin o por sedimentacin. Se observa que las proteinas se encuentran en el interior del microsoma y que son ms cortas, faltandoles una porcin del extremo N-terminal. Esto significa que existe una importacin co-traduccional de las proteinas al interior de los microsomas y que dicho proceso requiere de la proteolisis post-traduccional del extremo n-terminal. TRADUCCION IN VITRO EN PRESENCIA DE MICROSOMAS Y TRATAMIENTO CON PROTEASAS: Este tipo de traduccin da lugar a proteinas maduras dentro de los microsomas, lo que significa que las proteasas no podrn atacarlas y por lo tanto la proteina no ser degradad. TRADUCCION IN VITRO EN AUSENCIA DE MICROSOMAS Y TRATAMIENTO CON PROTEASAS: Como este tipo de traduccin da lugar a proteinas inmaduras en solucin, pueden ser encontradas por las proteasas y degradada (procedimiento de control de la actividad de proteasas y de que los microsomas son los que protegen a la proteina madura). TRADUCCION IN VITRO EN PRESENCIA DE MICROSOMAS, LISIS DE LOS MISMOS Y TRATAMIENTO CON PROTEASAS: Cuando se produce esta traduccin se obtienen microsomas con proteinas maduras en su interior, si estos son tratadas con un agente disruptor de membranas, el microsoma se lisar liberando las proteinas y si ahora se agrega a proteasa, las proteinas maduras sern degradadas.

Un electroforesis en gel desnaturalizante (SDS-Page) de los resultados obtenidos de sera:

Transporte a travs de la membrana del RE (importe co-traduccional)

Para que se produzca la interaccin ribosoma-membrana del RE, debe intervenir una ribonucleoprotena llamada partcula de reconocimiento de la seal (SRP) que es la encargada de reconocer la secuencia seal. Esta contiene un sitio de unin especfico para la seal que es un receptculo hidrofbico y tiene una estructura particular, con un dominio de pausa de la traduccin, que le permite frenar la sntesis del polipptido hasta que el ribosoma no se halle en la membrana plasmtica del RE. La SRP es un complejo en forma de varilla que contiene un RNA de 300 nt y 6 protenas diferentes, con una masa molecular combinada de 325.000. Una subunidad proteica de SRP se une directamente a la secuencia seal, inhibiendo la elongacin por bloque estrico de la entrada del aminoacil-tRNA y la de la peptidiltransferasa. Otra subunidad proteica une e hidroliza GTP. El receptor de SRP es un heterodmero de subunidades y , en el cual ambas se unen e hidrolizan GTP durante la va de direccionamiento. Ahora, el mecanismo de direccionamiento de protenas secretoras es co-traduccional y se puede describir en pasos, segn:

 PASO 1: las subunidades ribosmicas se unen en un complejo de iniciacin en el codn de inicio y empieza la sntesis de protenas. A medida que la secuencia seal emerge del ribosoma durante la sntesis del polipptido, dado que se encuentra en el extremo N-terminal que es el primero en ser sintetizado, es reconocida y unida a la partcula de reconocimiento de la seal (SRP). PASO 2: la SRP une GTP y detiene la elongacin del polipptido cuando alcanza aproximadamente 70 aminocidos y la secuencia seal emergi completamente del ribosoma. La SRP-GTP permite el movimiento del ribosoma hasta la membrana del RE, donde se une con su receptor de SRP-GTP en la cara citoslica del RE. Esta unin SRP-receptor produce un cambio conformacional en la SRP que induce a la hidrlisis del GTP por lo que es liberada permitiendo la sntesis de protenas. PASO 3: la SRP es liberada y el ribosoma se mantiene unido a la membrana del RE por el complejo de translocacin de protenas, en este caso el Sec61 (SEC de secrecin). La secuencia seal es insertada en el canal de membrana y se reanuda la sntesis del polipptido, al mismo tiempo que el complejo de translocacin, impulsado por ATP, va introduciendo el polipptido en crecimiento dentro de la luz del RE. PASO 4: continua la traduccin y el crecimiento del pptido, el cual el translocado a travs de la membrana. Se produce el clivaje de la secuencia seal por la peptidasa seal y la liberacin del polipptido en el lumen del RE. PASO 5: finalmente, el ribosoma se disocia y se recicla, mientras que la protena sufre todos sus procesos de modificacin y plegamiento. Adems, las protenas requieren de ayuda accesoria para plegarse correctamente y obtener su actividad funcional y estructura particular, esta ayuda en proporcionada por las chaperonas. Son protena que se asocian a regiones hidrofbicas del polipptido a medida que este ingresa en el RE, para impedir que secuencias del mismo se asocian prematuramente antes de terminar la sntesis.

Modo inusual de translocacin al RE (importe post-traduccional)

Las protenas que estn destinadas al importe posttraduccional al RE son sintetizadas en ribosomas libres en el citosol y mantienen una conformacin no funcional gracias a las chaperonas citoslicas. Las seales de localizacin o pptidos seal de estos polipptidos son reconocidas por el complejo de translocacin (en este caso Sec62/63 asociado a Sec61) que promueven el paso de la protena desplegada, como si fuera un fideo, a travs del canal. En el interior del RE el polipptido es recibido por otras chaperonas reticulares que lo estabilizan para que luego de ingresar completamente tome su conformacin funcional.

Protenas de membrana
Estas pueden ser protenas integrales de membrana, protenas perifricas o protenas asociadas a protenas de membrana. La diferenciacin se basa en la cantidad de dominios y tipos de dominios que poseen. En la imagen se pueden observar 6 tipos de protenas de membranas diferenciadas en: 1. 2. 3. 4. 5. 6. Protena Integral: Dominio extracelular simple hidroflico, dominio intermembrana hidrofbico que la atraviesa una nica vez en la forma de -hlice y dominio intracelular simple hidroflico. Protena integral: Dominio extracelular simple hidroflico, dominio intermembrana hidrofbico que la atraviesa 3 veces con 3 -hlices, y dominio intracelular simple hidroflico. Protena perifrica: no tienen dominio extracelular ni dominio intermembrana. Presenta solo un dominio citoslico hidroflico que se encuentra anclado a la membrana por una parte hidrofbica pequea. Protena perifrica: no tiene dominio intracelular ni dominio intermembrana. Presenta solo un dominio extracelular hidroflico que se encuentra anclado a la membrana por una pequea parte hidrofbica. Protena asociada a protena integral de membrana por cara citoslica. Protena asociada a protena integral de membrana por cara extracelular.

Perfil de hidrofobicidad de protenas de membrana integrales

Un ejemplo del tipo de perfil que se obtiene para protenas transmembrana responde a: en el eje de abscisas esta el nmero de aminocidos de la protena desde el extremo en el que se comienza a estudiar que generalmente es el N-terminal y en ordenadas el ndice de hidrofobicidad (valores positivos son regiones hidrofbicas y valores negativos implica regiones hidroflicas).

La glicoporina presenta una nica regin hidrofbica porque lo que se puede suponer que atraviesa una nica vez la membrana y tiene dos grandes dominios hidroflicos, uno extracelular y otro citoslico. La bacteriodopsina presenta 7 regiones hidrofbicas, por lo cual podra atravesar la membrana 7 veces, y presenta regiones hidroflicas de corta longitud, por lo tanto sus dominios citoslicas y extracelular son muy pequeos.

Anclaje a la membrana de protenas perifricas por grupos no aminoacdicos La bicapa lipdica:

Las membranas biolgicas forman la barrera protectora que solo permite la entrada y salida de ciertas sustancias a las clulas. Las membranas plasmticas son superficies extraordinariamente finas y complejas que rodean a las clulas; tienen carcter lipdico y encierran al citoplasma (incluyendo el citosol y todos los orgnulos celulares) y el ncleo celular.

La membrana celular est atravesada por protenas integrales. Estas protenas actan como filtros selectivos y como mecanismos de transporte activo, responsable de hacer entrar nutrientes y de expulsar productos al exterior celular. Otras protenas incluidas en la membrana pueden captar las seales externas y provocar respuestas celulares a los cambios ambientales. Tambin existen protenas perifricas que no atraviesan la membrana en su totalidad, pudindose encontrar por arriba y por debajo de la misma.

Anclaje mediante cadenas hidrocarbonadas, lpidos y glicolpidos:

Algunas protenas se encuentran ancladas a la membrana plasmtica y expuestas hacia la cara extracelular por anclajes GPI (glicosilfosfatidilinositol) adicionados a su extremo C-terminal de la protena en el RE (modificacin post-traduccional). Estas pueden ser glicosiladas y expuestas en la cara extracelular tal como Thy-1. El anclaje GPI consta de dos cidos grasos en la membrana que se unen a una cadena de oligosacrido (formando por inositol y otros azucares), y termina en una unin etanolamina con una cistena del extremo C-terminal de la protena.

Luego de la insercin en la membrana del RE, algunas protenas son transferidas a anclas GPI
Esta transferencia est relacionada con el reconocimiento clula-clula y la respuesta a los efectos ambientales, dado que las protenas que presentan este tipo de anclas son expuestas al exterior y estarn en contacto con sustancias efectoras y dems. Si bien las protenas ya pueden tener un dominio intermembrana, se produce el cambio del modelo de ancla y se lo exporta a la cara extracelular de la bicapa lipdica celular. La regin intermembrana de la protena es clivada en su dominio C-terminal, y el nuevo dominio C-terminar es unido por un grupo amino a la etanolamina del GPI inmediatamente despus de que la traduccin se completa, dejando las protenas ancladas a la membrana.

Glicosilacin de protenas (simultaneo a la sntesis de las mismas)

Las protenas recin sintetizadas son ulteriormente modificadas en la luz del RE de diversas maneras. Hay dos tipos de glicosilacin: una se da sobre los tomos de nitrgeno y otra sobre los de oxigeno. La N-glicosilacin se da generalmente por unin al N de la asparagina. Generalmente, en la N-glicosilacin el oligosacrido ya formado de 14 aminocidos se une a la Asp, y luego es modificado a otros tipos de oligosacridos, los cuales se clasifican como: de alta manosa, complejos o hbridos, pero siempre conservan un ncleo pentasacrido procedente del oligosacrido original. La O-glicosilacin se da por unin al O de la serina o tirosina. En la O-glicosilacin se une de a un azcar para formar el oligosacrido in situ. 10

Reaccin comn de N-glicosilacin por pre-formacin del oligosacrido que luego es adicionado a la protena en el RER Preformacin del oligosacrido
El dolicol-fosfato es un lpido de membrana del RE que permite la formacin de un rbol de oligosacrido por N-glicosilacin cuando se encuentra en la cara citoslica de la membrana. El oligosacrido ncleo se forma por adicin sucesiva de unidades de monosacridos en el citosol; se le agregan azucares provenientes de nucletido-azucares gracias a la accin de una glicosiltransferasas. Cuando el oligosacrido alcanz un tamao umbral, se realiza un mecanismo de flip-flop por el cual el lpido se mueve a la cara interior de la membrana del RE y se transporta el oligosacrido al lumen del RE. Aqu contina su diferenciacin y finalizacin, dando como resultado el precursor completo de lo que ser el oligosacrido de unin a protenas especficas. Los precursores sintticos que aportan residuos de manosa y glucosa adicionales al oligosacrido en formacin en la luz del RE son derivados del dolicolfosfato.

Unin a la protena
A medida que se produce la sntesis de la protena, se da tambin el proceso de glicosilacin. El primer paso es la transferencia del oligosacrido formando por 14 residuos de azucares al pptido en crecimiento en el RE del dolicol-fosfato a un residuo de Asn del polipptido en crecimiento. El oligosacrido estaba unido al lpido carrier (dolicol-fosfato) en la membrana del RE, y en transferido a la unidad aceptora de asparagina en el polipptido.

Modificacin del oligosacrido

Una vez unido el precursor del oligosacrido a la protena, se contina con la sntesis protena y la modificacin del oligosacrido agregado en el RE. El oligosacrido tambin ser modificado en el aparato de Golgi, en rutas que difieren segn el tipo de protena. Estos procesos son realizados por endoglicosilasas y otras protenas (es un proceso co-traduccional y post-traduccional). Los cinco primeros residuos de azucares persisten en todas las estructuras final de oligosacridos unidos por enlace N. El dolicol-fosfato liberado es nuevamente translocado, de forma que se encuentre en la cara citoslica y puede reutilizarse.

O-glicosilacin y el grupo sanguneo

El tipo de sangre (A, B u O) es determinado por dos tipos de glicosiltransferasas. El antgeno O es un lpido glicosilado por glucosa, galactosa, N-acetilglucosamina y fucosa. Cuando acta la enzima: GalNac-transferasa (N-acetilgalactosido transferasa) se produce la modificacin del antgeno O a A. En cambio, cuando acta la enzima Gal-transferasa (Galactosido transferasa) se produce la modificacin del antgeno O a B. La presencia o ausencia de estas enzimas en sangre determina el antgeno y el tipo de sangre. Las mutaciones en los genes de las enzimas definen que tipo de antgeno se tiene.

Glicosilacin en bacterias
Antes se crea que los procariotas no tenan mecanismos de glicosilacin co-traduccional, pero luego se descubri que estos mecanismos si existan y que podan ser utilizados para modificar a E.Coli y obtener un sistema procariota de produccin de protenas eucariotas con su respectiva glicosilacin. Es un concepto importante y de aplicabilidad muy grande en biotecnologa.

Modificaciones post-transcripcionales en el RER y su control

Luego de la sntesis de polipptidos en la membrana y en el lumen del RER, estos sufren cinco tipo de modificaciones: 11

1. 2. 3. 4. 5.

Formacin de puentes o uniones disulfuro. Plegado correcto. Adicin y procesamiento de carbohidratos. Clivajes proteolticos especficos (formando pptidos ms pequeos) Ensamble de protenas multimricas.

Formacin de puentes disulfuro y plegado en el lumen del RE

En el lumen del RE existe la actividad de la enzima disulfuro-isomerasa (PDI) que es la encargada de romper las uniones disulfuro formadas prematuramente que impiden el correcto plegado de la protena y permiten la formacin de los puentes correctos y la finalizacin del plegamiento. En el interior celular hay un ambiente reductor asegurado por la presencia del glutatin (GSH). Cuando aumenta la relacin glutatin reducido (GSH)/glutatin oxidado (GSSG), se refleja el aumento en la capacidad reductora del medio intracelular. La relacin normal GSH:GSSG es de 50:1 en el citosol; el GSSG del citosol es reducido por la enzima glutatin-reductasa, usando electrones del agente reductor NADPH. Entonces, las protenas citoslicas en bacterias y eucariotas, no pueden utilizar los puentes disulfuro como fuerza para estabilizar porque la elevada relacin GSH:GSSG podra dirigir el sistema en la direccin de ruptura de los enlaces de sulfuro.

Direccionamiento de protenas sintetizadas en ribosomas libres en el citosol

Este tipo de direccionamiento se da con protenas que son sintetizadas en el citosol y que luego deben llegar a compartimento especiales. Aunque las mitocondrias y cloroplastos contengan DNA, la mayora de sus protenas estn codificadas en el DNA nuclear y deben ser dirigidas al orgnulo apropiado., as como tambin las protenas nucleares deben ingresar en el ncleo luego de su sntesis citoplasmtica (donde se encuentra la maquinaria de traduccin). Para estudiar este tipo de direccionamiento y la localizacin de la protena se realizan estudios de traduccin in vitro (libre de clulas) y se adicionan luego las mitocondrias o cloroplastos segn a donde este destinada la protena. El procedimiento experimental sera: 1. 2. Traduccin in vitro en ausencia de clulas de una protena, por ejemplo mitocondrial, con su secuencia de sealizacin (se realiza por duplicado). Agregado de mitocondrias a uno de los duplicados. Las protenas se movilizarn al interior de la mitocondria debido a la presencia de su secuencia de localizacin mitocondrial, la cual es removida y degradada luego del ingreso de la protena al sitio. Agregado de tripsina a la muestra con mitocondrias y a la muestra sin mitocondrias. En el caso de la muestra sin mitocondrias, la protena ser degradada rpidamente. En el caso de la muestra con mitocondrias, la protena no ser degradada y la longitud total ser menor (por eliminacin del pptido seal).

3.

12

Direccionamiento mitocondrial Elementos requeridos:

1. 2. 3. 4. 5. Una o ms seales de la protena la cantidad depende si la localizacin es la membrana mitocondrial externa, el espacio intermembrana, la membrana mitocondrial interna o el interior mitocondrial. Un receptor que reconozca la seal y direcciona la protena de manera correcta. Una maquinaria de translocacin, un canal. Energa para abrir la compuesta y translocar la protena es utilizado el gradiente electroqumico de membrana como fuente de energa. Chaperonas para desplegar la protena ya sintetizada y permitir que esta atraviese el estrecho canal de la membrana mitocondrial y chaperonas que reciban la protena dentro de la mitocondria.

Mecanismo:
Las protenas precursoras destinadas a mitocondrias tienen generalmente secuencias seal N-terminales a las que se unen chaperonas citoslicas. Los precursores son repartidos a receptores en la superficie exterior del orgnulo y luego a canales proteicos, que pueden abarcar solo la membrana externa de la mitocondria (torn 44), o la membrana externa y interna a la vez (torn 40-tim 44). Torn: transporte a travs de la membrana externa. Transloca el precursor al espacio intermembrana. Tim: transporte a travs de a membrana interna. Transloca el precursor a la matriz mitocondrial. La translocacin a travs del canal est facilitada por la hidrlisis de ATP o GTP y, en algunos casos, por el potencial electroqumico de membrana. En el interior del orgnulo, la secuencia seal del precursor es eliminada y la protena madura se pliega. Las secuencia seal mitocondrial tienen de 20 a 35 aminocidos y son ricas en Ser, Thr y residuos bsicos. Las precursores proteicos mitocondriales se unen a Hsp70 (protena de choque trmico 70) o a MSF (factor de estimulacin de la importacin mitocondrial). Estas chaperonas estabilizan la conformacin desplegada de las protenas para que pasen por el canal. 13

Direccionamiento al cloroplasto y relacin con el mitocondrial:

El direccionamiento al cloroplasto sigue patrones similares. Una variacin interesante tiene lugar en las protenas destinadas a los tilacoides. Estas protenas tienen una secuencia seal bifuncional. La porcin N-terminal se la secuencia seal dirige la protena al estroma del cloroplasto, el resto de la secuencia la dirige al tilacoide. En la figura se observa a la izquierda el direccionamiento hacia la matriz mitocondrial, mediada por Hsp70, torn, tim y ATP. A la derecha se muestra el direccionamiento a los tilacoides el cloroplasto, mediada por una secuencia seal bifuncional. El mecanismo de cloroplastos est menos estudiado y conocido.

Direccionamiento nuclear Elementos requeridos:

1. Una regin seal de localizacin nuclear en este tipo de direccionamiento la secuencia seal no es clivada. Esto sucede porque la mayora de las protenas nucleares pueden entrar y salir del mismo, y para que puedan volver a ingresar al ncleo luego de cada divisin celular en la cual la envoltura nuclear es desorganizada. Un receptor que reconozca la seal y direcciona la protena. Una maquinaria de translocacin, un canal o poro. Energa para translocar la protena.

2. 3. 4.

Poros nucleares:
El complejo de poro nuclear (NPC) es importante para la translocacin de molculas pequeas y molculas de gran tamao al interior del ncleo. Las molculas pequeas pueden pasar a travs de la membrana y por canales pequeos por difusin simple. Las molculas de gran tamao requieren de transporte activo y poro especializados.

Seal de localizacin nuclear (NLS):

Estas seales son de gran importancia en el direccionamiento de protenas al ncleo celular. Son seales con un bloque de varios aminocidos bsicos que pueden ser nicas o bipartitas, adems pueden no estar localizadas en el extremo N-terminal y si dentro de la secuencia de la protena Las seales nicas generalmente se encuentran en los extremos de las protenas y pueden ser clivadas (aunque este es un proceso que no se da siempre y tambin pueden encontrarse en el interior proteico). Las seales bipartitas no son clivadas, porque implicaran la unin correcta de los extremos proteicos, lo que dara una mayor proporcin de error. Para saber que bloque de aminocidos bsicos dentro de la protena es la NLS se pueden realizar dos procedimientos diferentes: 1. Mutacin de un bloque en especial: En este tipo de experimentacin se realiza una mutacin en el gen de la protena que presenta una NLS, de manera que la misma deje de ser funcional. Si el bloque de aminocidos bsicos mutados era el correcto, la protena no se encontrar en el ncleo. Si el bloque no era el correcto, la protena aun ser transportada al ncleo. La posicin de la misma se puede revelar por inmunofluorescencia. El SD40 es un poliomavirus de DNA con genoma circular cerrado pequeo. Su origen de replicacin es reconocido por el antgeno T, el cual debe tener una seal de localizacin nuclear para poder ingresar al ncleo y localizar su DNA diana. Se tiene el gen clonado de esta protena en un plsmido, el cual es mutado y transfectado. Luego se localiza la protena por inmunofluorescencia y se observa que sucedi:

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La microfotografa de inmunofluorescencia muestra la localizacin celular de SD40 utilizando el antgeno T que contiene un pptido corto como NLS. En la figura (A) el antgeno T normal contiene una secuencia rica en lisinas que permite su importacin al ncleo, y en reconocido por un anticuerpo anti-antgeno T. En la figura (B) el antgeno T con su NLS alterada (una treonina remplazo una de sus lisinas) permanece en el citosol. 2. Agregado de bloque de aa a otra protena que no tenga NLS: El procedimiento inverso sera colocar el bloque de aminocidos bsicos a ensayar en una protena citoslica que no tenga NLS. Si el bloque es funcional la protena se movilizar al ncleo, y si no suceder lo contrario.

Demostracin de que la NLS del antgeno T que reconoce a SV40 puede dirigir el transporte al ncleo. En (A) la piruvato kinasa normal es visualizada en el citosol por inmunofluorescencia luego del tratamiento del cultivo de clulas con un anticuerpo especfico. En (B) la protena piruvato kinasa quimrica que contiene el bloque de aminocidos del antgeno T, es encontrada en el ncleo. Esta protena quimrica fue expresada por transfeccin de un plsmido construido por fusin del gen viral que codifica SV40 para el antgeno T y el gen de piruvato kinasa.

Protenas transportadoras-receptoras:
Son protenas encargadas de la importacin, recepcin y transporte, dado que reconocen las secuencias NLS. Pueden actuar de diferentes maneras: A. Muchos receptores de importacin nuclear se unen a los poros nucleares y a las seales de localizacin nuclear de protenas transportadoras que son dirigen la importacin de las protenas especificas que deben ir al ncleo. Hay tres tipos de protenas transportadoras que tienen diferentes secuencias de localizacin nuclear, y se unen de diferente manera al receptor. B. Hay un cuarto tipo de protena transportadora que requiere de un adaptador para interaccionar con el receptor nuclear. El adaptador esta estructuralmente relacionado con los receptores de importacin nuclear y reconocen la secuencia de localizacin de las protenas transportadoras. Ellas tambin contienen una secuencia de localizacin que las unen al receptor.

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La importina es una protena encargada del transporte de polipptidos al ncleo. Tiene una seal de localizacin nuclear intrnseca y reconoce otras secuencias del tipo, acta como una lanzadera (toma las protenas del citosol, las transporta al ncleo ingresando con ellas, las deja all y sale del ncleo en busca de otra protena citoslica con NLS). La entrada y salida del ncleo de molculas de gran tamao es controlado cuidadosamente por los complejos de poro nuclear (NPCs). Sin embargo, las molculas pequeas pueden entrar al ncleo sin regulacin. Macromolculas como RNA o protenas requieren de la asociacin a carioferinas (protenas involucradas en el transporte en general) llamadas importinas, para entrar al ncleo, y exportinas, para salir

Mecanismo en general:

La importacin al ncleo est facilitada por un conjunto de protenas que establecen un ciclo entre el citosol y el ncleo, entre las cuales se encuentran las importinas y y una pequea GTPasa denominada Ran. Un heterodmero entre estas dos importinas acta como receptor soluble para las protenas destinadas al ncleo, en el cual la subunidad se une a protenas en el citosol que tengan una NLS. El complejo de la protena con la secuencia NLS y la importina se unen al poro nuclear y es translocada a travs del poro mediante un mecanismo dependiente de energa que requiere la GTPasa Ran. Las dos subunidades de importina se separan luego de la translocacin y la protena con la secuencia NLS tambin se separa de la importina dentro del ncleo. Las importinas son exportadas del ncleo para repetir el proceso. Se desconoce porque la importina no se queda unida a protenas con NLS dentro del ncleo.

Ensamble de ribosomas:
Las protenas ribosmicas son importadas al ncleo desde el citoplasma y permiten el inicio del ensamblaje en el pre-rRNA que ser clivado. A medida que el pre-rRNA es procesado, protenas ribosmicas adicionales y el rRNA 5S se ensamblan para formar partculas pre-ribosmicas. El paso final es la maduracin y la exportacin de los pre-ribosomas al citoplasma, dando como resultado las subunidades 40S y 60S.

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Direccionamiento en bacterias
Las bacterias pueden dirigir protenas a las membranas internas o externas, el especio periplasmtico entre estas dos membranas o al medio extracelular. Utilizan secuencias seal en el extremo N-terminal de las protenas. La mayor parte de las protenas exportadas usa una ruta comn que se da luego de la traduccin de la protena.

1. El polipptido sintetizado se une a la chaperona SecB por su secuencia seal. Esta impide el plegamiento de la protena. 2. La protena unida es transferida a SecA, una protena asociada al complejo de translocacin SecYEG que acta como receptor y como ATPasa de translocacin. 3. SecB es liberada y SecA se inserta en la membrana, forzando a la exportacin de unos 20aa de la protena a travs del complejo de translocacin. 4. La hidrlisis de ATP por SecA suministra energa para un cambio conformacin que produce que SecA abandone la membrana y libere al polipptido. 5. SecA une otra molecula de ATP y un nuevo fragmento de 20 aa es empujado a travs de la membrana mediante el complejo de translocacin. Estos ltimos pasos se repiten hasta que: 6. La protena entera pas al otro lado de la membrana y fue liberada.

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