Laporan Praktikum Steril UJI PIROGEN

Disusun Oleh :

Ratu Nida F. Esfandiansyah Asrariandy Masda Raissa Nurhijriyah Hawa April Yani

260110090095 260110090096 260110090097 260110090098 260110090101

Laboratorium Steril Fakultas Farmasi Universitas Padjadjaran 2011

UJI PIROGEN

A. Definisi

Pirogen berasal dari kata pyro yang artinya keadaan yang berhubungan dengan panas, dan kata gen yang artinya membentuk atau menghasilkan. Pirogen adalah suatu produk mikroorganisme, terutama dari bakteri gram negatif (Teztee, 2009). Pirogen adalah senyawa dengan berat molekul tinggi yang dinyatakan sebagai senyawa lipopolisakarida yang diproduksi oleh kira-kira 5-10% massa total bakteri. Pirogen ini merupakan senyawa yang jika masuk ke dalam aliran darah akan mempengaruhi suhu tubuh dan biasanya menghasilkan demam. Pengobatan demam yang disebabkan oleh pirogen sangat sulit dan pada beberapa kasus dapat menyebabkan kematian. Pirogen berasal dari kelompok senyawa yang luas, meliputi endotoksin (LPS). Endotoksin adalah suatu molekul yang berasal dari membran luar bakteri gram negatif. Organisme gram negatif membawa 3-4 juta LPS pada permukaannya yang meliputi 75% permukaan membran luar (Sudjadi, 2008).

Pirogen merupakan substansi yang mampu menyebabkan demam dan sering mencemari sediaan farmasi. Sampai saat ini, substansi pirogenik yang diketahui paling aktif dan paling sering mencemari sediaan farmasi adalah endoktoksin, selain itu masih banyak substansi pirogenik lainnya seperti bakteri, fungi , DNARNA virus, protein, polipeptida dan lain (Usman, 1988). Endotoksin merupakan suatu produk mikroorganisme terutama dari bakteri gram negatif yang terdiri atas suatu senyawa kompleks lipopolysakarida yang pyrogenic, suatu protein dan suatu lipid yang inert. Pada saat ini endoktoksin diketahui merupakan pirogen yang paling kuat, namun kehadiran pirogen lain dalam suatu sediaan perlu diperhitungkan karena manusia tidak hanya dipengaruhi endoktoksin saja tetapi juga pirogen yang lain (Gennaro et al., 1990). Pada tahun 1923 Seibert membuktikan bahwa pirogen adalah substansi yang tidak tersaring, termostabil, dan non volatile. Pada tahun 1937 Co Tui membuktikan bahwa kontaminasi pirogen ini juga terjadi pada alat-alat seperti wadah-wadah untuk melarutkan obat suntik, juga pada zat kimia yang digunakan sebagai zat berkhasiat (Gennaro et al., 1990).

B.

Sifat Sifat Pirogen Pirogen memiliki sifat-sifat, diantaranya (Gennaro et al., 1990) :

Termostabil, sehingga hanya dapat dihilangkan dengan pemanasan pada suhu 6500C selama 1 menit, 2500C selama 15 menit atau 1800C selama 4 jam

Larut dalam air sehingga tidak bisa memakai penyaring bakteri Tidak dipengaruhi oleh bakterisida yang biasa Tidak menguap, destilasi biasa ada yang ikut bersama percikan air Berat molekul (BM) antara 15.000 4.000.000

Ukuran umumnya 1 50m

C. Penggolongan Pirogen Secara garis besar, pirogen dikelompokkan menjadi dua golongan (Gennaro et al., 1990) : 1. Pirogen Endogen Merupakan faktor-faktor yang berasal dari dalam tubuh kita sendiri sebagai reaksi kekebalan melawan kuman penyakit yang masuk ke tubuh. Misalnya interleukin-1 (IL-1), interleukin-6 (IL-6), alpha-interferon, dan tumor necrosis factor (TNF). 2. Pirogen Eksogen Merupakan faktor eksternal tubuh yang menyebabkan gangguan pada fungsi tubuh manusia. Misalnya bagian dari sel bakteri dan virus. Selain itu, bisa juga berupa zat racun (toksin) yang dihasilkan oleh bakteri atau virus tertentu. Jika suatu pirogen masuk ke tubuh, maka pirogen menjadi suatu benda asing yang dapat menimbulkan respon imun berupa demam. Demam yaitu suatu keadaan ketika temperatur tubuh diatas batas normal yang dapat disebabkan oleh kelainan dalam otak sendiri atau oleh bahanbahan toksik yang mempengaruhi pusat pengaturan temperatur. Penyebabpenyebab tersebut meliputi penyakit bakteri, tumor otak, dan keadaan lingkungan yang dapat berakhir dengan serangan panas (Gennaro et al., 1990). D. Sumber Pirogen Endotoksin dapat masuk ke dalam suatu sediaan injeksi melalui beberapa sumber, diantaranya(Gennaro et al., 1990) :

1. Air Air merupakan sumber endotoksin yang paling utama. Proses pembuatan sediaan steril harus dimulai dari penggunaan air bebas pirogen (air benarbenar tidak mengandung pirogen) atau non-pirogen (air mengandung kurang atau sama dengan 0,5 EU/mL. kondisi penyimpanan air harus baik sehingga tidak terdapat media pertumbuhan bakteri.

2. Wadah dan alat Baik wadah maupun alat merupakan sumber endotoksin yang cukup penting. Endotoksin dapat menempel dengan kuat pada gelas atau permukaan lainnya. Sisa cairan pada alat dapat menjadi media pertumbuhan bakteri. 3. Zat-zat kimia terlarut Zat kimia merupakan sumber endotoksin minor. Zat-zat kimia yang dihasilkan dari fermentasi, misalnya glukosa, fruktosa, natriu sitrat, garam fosfat, asam amino, heparin, dan beberapa antibiotic, memiliki tingkat risiko kontaminasi endotoksin yang tinggi. Zat kimia yang telah terlarut dapat mengalami kristalisasi atau memisah dari larutan (terbentuk endapan) yang mungkin mengandung endotoksin. Endotoksin dapat terperangkap di antara lapisan partikel zat tersebut. pada kasus seperti ini, zat kimia yang telah terkontaminasi dapat dimurnikan melalui proses rekristalisasi atau pencucian endapan.

E. Cara Pembebasan Pirogen

Karena pirogen memiliki sifat tahan terhadap panas pendidihan dan stabil terhadap panas pengeringan sampai suhu 180C. Oleh karena itu, untuk membuat suatu sediaan yang bebas pirogen, maka pirogen perlu dibebaskan dari (Stefanus,2006) :
1. Air atau larutan air

a. Dengan bantuan penyaring khusus Hal ini terjadi melalui adsorpsi pirogen pada material penyaring dengan menggunakan lapisan asbes selulosa yang berbeda-beda jenisnya menurut lebar porinya. b. Penyaring karbon aktif 0,1% dari volume total c. Sinar Gamma (kobalt 60) d. Ditambahkan hydrogen peroksida (H202) 0,1% dan dimasak selama 1 jam e. Ditambahkan 10 mL larutan kalium permanganate (KMnO4) 0,1 N dan 5 mL larutan natrium hidroksida (NaOH) 1 N per liter larutan sewaktu aquadest disuling.
f. Melalui metode elektroosmosis atau reverse osmosis. 2. Bahan obat atau bahan pembantu a. Melalui pemanasan selama 30 menit pada suhu 250C atau 1 jam pada

suhu 200C (untuk bahan tahan panas) b. Dilarutkan, kemudian dibebaspirogen

3. Wadah, bahan tutup, dan sebagainya

a. Gelas piala, corong, ampul, botol infuse, dan lainnya membebaskan pirogen dengan cara sterilisasi

b. Metode kimi penggunaan asam kromsulfat atau asam nitrat dibilas kembali dengan air suling bebas pirogen
c. Material karet silicon dipanaskan 30 menit pada suhu 90C dalam

larutan fenil merkuriborat 0,002%

d. Autoklaf suhu 121-124C selama 120 menit

e. Disterilkan secara dingin, yaitu dengan penyinaran sinar terionisasi atau dengan etilen oksida

F.

Penentuan Pirogen

Secara garis besar, penentuan pirogen dibagi menjadi 2 jenis. Yaitu, penentuan pirogen secara fisikokimia dan penentuan pirogen secara biologis.

A. Penentuan pirogen secara fisiko kimia (kuantitatif pirogen) 1. Dengan fotokolorimetri Reagen Tetrabrom phenolphtalein (TBP) dengan penambahan asam asetat 0,2 N sehingga timbul warna 2. Polarografi Pirogen mempunyai panjang gelombang maksimum oksigen pada polarografi 3. Elektroforesis 4. Spektrofotometri

Pirogen mempunyai absorpsi spectrum ultraviolet pada E maksimum 265 m

B. Penentuan pirogen secara biologis (kualitatif pirogen) Adapun tahapannya, yaitu :

i. Pengujian pengukuran temperature badan hewan percobaan

Persiapan :

Hewan percobaan : Efek pirogen tidak hanya ditentukan oleh pirogen itu, tetapi juga oleh spesies penerima injeksi Hewan percobaan : kelinci Himalaya putih (sensitivitas tinggi terhadap pirogen) Tempat penyuntikan I.V. pada telinga kelinci Syarat (Ph. Ind. III) : kelinci yang digunakan harus selama seminggu sebelum pengujian tidak menunjukkan penurunan berat badan Alat :
Thermometer yang dipakai ketelitian 0,1 dan dapat memasuki

dubur kelinci kurang lebi 5 cm

 Jarum terbuat dari kaca atau bahan lain yang cocok dan tahan

pemanasan 250 Sediaan uji : Zat uji diencerkan dengan larutan NaCl P steril bebas pirogen

Prosedur kerja :
1.

Kelinci dimasukkan ke kotak dengan penahan yang cukup longgar, badan bebas, kelinci dapat duduk dengan bebas

2.

Uji pendahuluan :

Ruang harus tenang, di ruang dengan perbedaan terhadap temperature pemeliharaan tidak boleh lebih dari 3C

1 malam hingga pengujian selesai kelinci tidak diberi makan dan selama waktu pengujian tidak diberi minum

Catat temperature badan kelinci dengan interval tidak lebih dari 30 menit yang dimulai 90 menit sebelum penyuntikan hingga tiga jam sesudah penyuntikan dengan laruan NaCl P steril bebas pirogen

Kelinci yang menunjukkan beda temperature lebih besar dari 0,6C tidak dapat digunakan untuk pengujian utama

3.

Pengujian utama

1 kelompok hewan percobaan terdiri dari 3 ekor kelinci Hangatkan sediaan uji hingga temperature kurang lebih 38,5C

Suntikkan perlahan-lahan ke dalam vena auricularis tiap kelinci

Lama penyuntuikan tidak lebih dari 4 menit dan volume sediaan uji tidak kurang dari 0,5 mL dan tidak lebih dari 10 mL per kg berat badan

Jika gagal, ulangi pengujian hingga 4 kali, tiap kelompok uji terdiri dari 3 ekor kelinci

4.

Penafsiran hasil Temperature awal adalah temperature rata-rata 2 pembacaan temperature dengan interval 30 menit dan dilakukan 40 menit sebelum penyuntikan sediaan uji Temperature maksimum adalah temperature tertinggi yang dicatat selama 3 jam setelah penyuntikan sediaan uji Catat suhu badan kelinci dengan interval tidak lebih dari 30 menit yang dimulai 90 menit sebelum penyuntikan hingga 3 jam setelah penyuntikan Kelinci memenuhi syarat :
-

Bila antar kelinci perbedaan suhu awal tidak lebih dari 1C

Kelinci tidak memenuhi syarat :

-

Perbedaan temperature awal lebih besar dari 0,2c Temperatur awal lebih kecil dari 38C dan tidak lebih besar dari 39,8C

Sediaan uji dinyatakan memenuhi syarat :

Jika jumlah respon tidak melebihi kolom 2 dan dinyatakan tidak memenuhi syarat jika jumlah respon melebihi kolom 3 untuk tiap kelompok

Jika jumlah respon terletak antara kolom 2 dan kolom 3, pengujian diulangi

Jika pengujian keempat jumlah respon melebih 6,6C sediaan uji dinyatakan tidak memenuhi syarat

ii. Perhitungan sel darah putih Injeksi obat suntik yang mengandung pirogen pada pembuluh baik darah kelinci akan menyebabkan terjadinya percobaan sel-sel darah putih Misal : penurunan limfosit dan menaikkan neutrofi ini menjadi indikator terhadap adanya aktivitas pirogen.

iii. Test Limulus Amebocyte Lystate (LAL) Prinsip : penggumpalan ekstrak cair sel darah kepiting ladam kuda (Limulus polyphemus) dengan adanya pirogen. LAL test merupakan metoda yang sensitive untuk penentuan endotoksin bakteri gram negatif atau lipopolisakarida (pirogen).

Di mana lipid A dari molekul endotoksin dapat memberikan reaksi menjadi gel dari limulus lystate

Ada kecocokan atau persamaan hasil antara LAL dengan test kelinci

Cara uji in vitro dengan menggunakan sifat membentuk gel dari lisat amebasit dari limulus polifemus. Uji ini 5-10 kali lebih sensitif dari Rabbit test. Kondisi LAL-test: a. pH larutan 6-7 b. suhu 37oC c. kontrol negatif: aquadest (pelarut) d. kontrol positif (pirogen/endotoksin) e. keuntungan: cepat, mudah, praktis

Gambar 1. Limulus Amebocyte Lysate (LAL) untuk deteksi endotoksin Reagensia LAL dibuat dari ekstrak set darah Horseshoe Crab dari spesies Limulus polvphentus, yaitu jenis invertebrata yang telah hidup pada jaman pra sejarah. Corpuscula darah Limulus hanya terdiri dari satu macam set darah yang disebut sebagai Amoebocvte. Amoebocvte dalam banyak hal menyerupai platelet, tetapi ukurannya agak lebih besar.

Untuk mendapatkan reaksi yang optimal antara reagensia LAL dengan endotoksin, Thomas J. Novitsky (1984) menyebutkan perlunya unsur-unsur yang harus ada dalam reagensia LAL, yaitu :

pro-clotting enzynze (zymogen).

clotting protein (coagulogen).

Garam anorganik

Uji LAL didasarkan atas kemampuan endotoksin menyebabkan koagulasi "protein coagulogen", sebagai unsur reagensia LAL, sehingga terbentuk "Gel". Untuk mengevaluasi hasil reaksi tersebut, Marlys Weary (1986) menyebutkan adanya 4 metode dasar yang dapat dipakai, yaitu antara lain : The gel-clot end point test: The turbidometric assay; The cobrimetric assay; dan Chromogenis substrate test. Metode yang disebutkan pertama adalah yang paling sering digunakan untuk mengevaluasi Uji LAL. Sebagai gambaran masing-masing metode dan tahapan-tahapan untuk melakukan uji LAL adalah sebagai berikut : "The gel-clot end point test" (Uji penggumpalan gelatin) Reagensia LAL dicampur dengan sampel larutan uji dalam tabling galas masing-masing dengan volume sama yaitu 1,0 ml. Setelah dicampur, tabung gelas tersebut diinkubasi pada temperatur 37C 2C selama 60 menit 1 menit.

 Pembacaan pengujian larutan yaitu tabung galas dari inkubator diambil dengan hati-hati, kemudian membaliknya 180, sehingga permukaan atas tabung berada di bagian bawah. Hasil pembacaan adalah : Positif (+) jika terbentuk gelatin padat yang tetap, berarti contoh larutan tersebut mengandung sedikitnya sama dengan sensitivitas reagensia yang digunakan. Negatif (-) jika tidak terbentukgelatin padat yang tetap, berarti bahwa contoh larutan uji tersebut tidak mengandung endotoksin atau lebih sedikit daripada sensitivitas reagensia yang digunakan (Usman, 1988). Dalam menginterpretasikan hasil pembacaan untuk memperkirakan kandungan endotoksin dalam contoh, tergantung pada sensitivitas reagensia. Oleh karena itu dalam melakukan pengujian perlu memilih reagensia yang sesuai dengan kebutuhan, karena begitu banyak macam reagensia dengan sensitivitas bermacam-macam. Hampir setiap reagensia me- merlukan penanganan dan penyimpanan yang berlainan. Demikian juga tentang persiapan dan pelaksanaan pengujian LAL. Sebagai contoh perbandingan tentang variasi pengelolaan dari berbagai reagensia dalam pengujian LAL. Pemakaian reagensia dan contoh larutan uji selanjutnya dikenal sebagai metode method dan dengan volume 0,1 ml, makro. D. Kruger (1982) dalam

artikelnya menyebutkan bahwa saat ini telah dikembangkan suatu micro lamellae micro method. Jika dibandingkan dengan makro, kedua metoda tersebut menggunakan volume reagensia yang lebih sedikit, yaitu 10 ul. Dengan demikian kedua metode ini lebih menghemat pemakaian reagensia. Pembacaan hasil pada kedua metode tersebut, pembentukan gelatin tidak diamati dalam tabung gelas seperti pada metode makro, tetapi diamati dengan microscope slide. D. Kruger (1982) juga telah melakukan suatu perbandingan menggunakan metode makro dan mikro, ternyata memperlihatkan hasil yang tidak berbeda (Usman, 1988).

The turbidometric test" (uji kekeruhan) Dalam metode ini, cara inkubasi adalah sama seperti metode yang telah disebutkan di atas. Kalau dalam metode I tersebut evaluasi hasil diamati dari terbentuknya gelatin, sebalknya dalam metode ini dicegah jangan sampai terbentuk gelatin. Cara menghindari terbentuknya gel yaitu dengan mengencerkan reagen LAL atau dengan menambah volume larutan uji sebelum pengujian mulai dilakukan. Dalam metode ini yang diharapkan adalah terbentuknya kekeruhan, yaitu sebagai akibat presipitasi "protein coagulogen". Dasar dari metode ini yaitu peningkatan jumlah endotoksin akan menyebabkan bertambahnya kekeruhan dan bertambahnya kekeruhan ini sebanding dengan bertambahnya endotoksin (Usman, 1988). Nilai optical density dibaca dengan menggunakan spektro- fotometer. Hasil yang didapat akan memberikan konsentrasi endotoksin secara kuantitatif, yaitu dengan mengekstrapolasikan dalam kurva standar, dan kurva standar diperoleh dengan membuat scri konsentrasi endotoksin (Usman, 1988).

"The colorimetric test" (uji warna) Metode ini didasarkan atas terbentuknya warna, sedangkan caranya hampir sama dengan metode kedua. Namun dalam metode ini presipitasi protein dengan menggunakan centri fuge. Konsentrasi endotoksin dalam suatu contoh juga diperoleh dengan mengekstrapolasikan dalam kurva standar dan pembacaan juga menggunakan spektrofotometer (Usman, 1988).

"The chromogenic subsrate test"

Metode ini berbeda dengan metode-metode yang terdahulu. Metode yang disebutkan sebelumnya tergantung sepenuhnya pada reagensia LAL, terutama kandungan "protein coagulogen" di dalamnya yang berfungsi membentuk gelatin protein. Sedangkan metode ini, fungsi untuk membentuk gel protein yaitu dari suatu substrat kromogenik sintetis untuk menggantikan "protein coagulogen". Substrat kromogenik sintetis ini mengandung rangkaian asam amino yang sama seperti koagulogen reagensia. Pembacaan hasil juga seperti pada 2 metode sebelumnya, yaitu dengan menggunakan spektrofotometer (Usman, 1988). Meskipun demikian, pengujian pirogenitas menggunakan kelinci masih menjadi pilihan utama karena (Fifi, 2010) :

Metode ini telah lama dikenal dan digunakan untuk menguji berbagai sediaan dan terbukti memberikan hasil memuaskan.

Kelinci memiliki sensitivitas terhadap substansi pirogenik yang mirip dengan manusia. Kenaikan suhu kelinci akibat substansi-pirogenik, sampai batas tertentu masih dapat diterima oleh manusia; sehingga kenaikan suhu kelinci tersebut dapat distandardisasi terhadap substansi pirogenik yang dapat diterima manusia. Bangham menyebutkan, uji kelinci menggambarkan seluruh respon farmakologis terhadap pirogen dan relevan dengan respon pada manusia.

Metode kelinci mampu mendeteksi semua pirogen termasuk endoktoksin sedangkan LAL tidak.

Sedangkan

kelemahan

metode

uji

pirogenitas

menggunakan

kelinci

dibandingkan dengan LAL Test antara lain (Fifi, 2010) :

Memerlukan pemeliharaan dan perawatan hewan dan laboratorium yang lebih intensif. Hewan harus dipelihara dalam ruangan dengan temperatur tidak jauh berbeda dengan tempat percobaan. Pemeliharaan hewan harus

dilakukan dengan sebaik mungkin untuk menghindari infeksi penyakit yang dapat mengganggu percobaan atau mengacaukan interpretasi hasil. Berat badan kelinci harus dijaga jangan sampai mengalami penurunan yang berarti dalam 1 minggu menjelang digunakan;

Sensitivitas dipengaruhi oleh musim, kegaduhan, kegelisahan, makanan dan lain sebagainya. Kegelisahan akan dapat menyebabkan kenaikan suhu relatip tinggi, sehingga mengacaukan interpretasi hasil;

Variabilitas biologis. Respon setiap kelinci terhadap substansi yang sama belum tentu sama, sehingga terdapat variasi kenaikan suhu pada tiap kelinci. DAFTAR PUSTAKA

Fifi.2010.Pirogenitas.

http://coretanfifi.wordpress.com/2010/03/27/pirogenitas/.

[Diakses tanggal 6Maret 2010] Gennaro,A.R, et al. 1990. Remingtons Pharmaceutical Science. 18th Edition. Pensylvania : Marck Publishing Company

Lucas, S. 2006. Formulasi Steril. Yogyakarta : Penerbit Andi

Sudjadi. 2008. Bioteknologi Kesehatan. Yogyakarta : Penerbit Kanisius (Anggota IKAPI)

Teztee.2009.http://widanindri.blogspot.com/2009/05/pyrogen-pirogen-200c.html. [Diakses tanggal 6 Maret 2010].

Usman Suwandi, 1988. Uji Pirogenitas dengan Kelinci dan Limulus Amebocyt Lysate, Cermin Dunia Kedokteran No. 52.