Preparo de meio mnimo essencial de Eagle (E-MEM) para cultivos celulares.

Preparo de PBS Preparo de tripsina/versene Preparo de meio de congelamento para clulas 1. Meio Mnimo Essencial de Eagle (MEM) - Pesar 9,60 g de MEM (GIBCO 145000-083) e colocar em um copo de Beaker ou Erlenmeyer. - Colocar gua desmineralizada at completar cerca de 900 mL. - Dissolver utilizando uma barra e um agitador magntico. - Ajustar o pH em 7.2 a 7.4 com bicarbonato de sdio. - Ajustar o volume at 100 mL com gua destilada. - Filtrar o meio utilizando um filtro SEITZ com placa EKS-1 (filtro 0,2 milimicra) ou Millipore equivalente. - Manter em refrigerao. 2. PBS (Tampo salina/fosfato para cultivos celulares) - Pesar 8 g de NaCl - Pesar 0.2 g de KCl - Pesar 0.57 g de Na2HPO4 2H2O - Pesar 0.2 g de KH2PO4 - Adicionar todos os reagentes acima em um Beaker ou Erlenmeyer - Adicionar gua desmineralizada at cerca de 900 mL. - Ajustar o pH em 7.2 com o sal cido (KH2) ou o sal bsico (Na2H), conforme necessrio. - Completar o volume q.s.p. 1 litro. - Autoclavar por 30 minutos a 121oC 3. Soluo de Tripsina/Versene (EDTA) - Pesar 8 g de NaCl - Pesar 1 g de Glicose - Pesar 0.4 g de KCl - Pesar 0.5 g de Tripsina 1:250 - Pesar 0.2 g de Verseno - Adicionar todos os reagentes acima em um Beaker ou Erlenmeyer - Adicionar 1 ml de vermelho de fenol (previamente preparado em soluo a 1%) - Adicionar gua desmineralizada at completar 1 litro - Ajustar o pH em 7.6 com bicarbonato de sdio - Adicionar TRIS, se for o caso - Filtrar o meio utilizando um filtro SEITZ com placa EKS-1 - Fracionar a soluo em volumes de 200 ml em frascos de vidro e armazenar Refrigerado 4. Preparo de Meio de congelamento de clulas - usar DMSO ou Glicerina na proporo de 10% do volume final do meio - usar soro bovino estril na proporo de 20% do volume final do meio - usar meio MEM (tem 4.1.) na proporo de 70% do volume final do meio OBS: para congelar clulas de uma garrafa de 25 cm2 dever ser preparado no mnimo 6 ml de meio.