Pesquisa

BIORREATORES
Fotos cedidas pelo autor

Biorreatores para células, tecidos e órgãos vegetais - Produção de mudas em larga escala
Introdução
João Batista Teixeira,
Ph.D., Biologia Celular batista@cenargen.embrapa.br Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia

A micropropagação é uma forma vegetativa de propagação de diferentes espécies de plantas por meio da técnica denominada cultura de tecidos. Essa técnica requer laboratórios bem estruturados e pessoal treinado. Em resumo, o procedimento envolve os seguintes passos: inicialmente, é feita a escolha da planta matriz e do tipo de material a ser utilizado, tais como

Figura 1. Sistema de biorreator de imersão temporária, desenvolvido pela Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia, utilizando tanque de ar comprimido

gemas, segmentos nodais, folhas, flores, etc. Em seguida, o material é desinfestado já em condições de laboratório em ambiente estéril, e introduzido em frascos igualmente estéreis, contendo meio de cultura esterilizado. Esse meio contém, todos os nutrientes necessários ao crescimento e desenvolvimento do material em cultivo, além de substâncias reguladoras de crescimento. Os frascos com o material são mantidos em salas

de crescimento, sob condições de temperatura, luminosidade e fotoperíodo adequados. Milhões de plantas são produzidas anualmente, em todo o mundo, por meio da micropropagação. Entretanto, esse método de multiplicação é altamente demandante de mão-de-obra e só em condições especiais tal procedimento deve ser utilizado. Basicamente, a escolha da micropropagação frente a outras formas de propagação baseia-se no valor venal da muda ou do produto a ser obtido pela muda micropropagada. A metodologia tradicional de micropropagação baseia-se em cultivos em pequenos frascos, com número reduzido de plântulas por frasco, e uso de meio nutritivo gelificado, o que acarreta intensa manipulação das culturas, e envolve, com isso um grande contingente de mão-de-obra especializada. Biorreatores podem ser conceituados como equipamentos para cultivo sob imersão temporária ou permanente de células, gemas, embriões ou qualquer tipo de propágulo que possa ser utilizado na micropropagação. Os biorreatores utilizam meio de cultura líquido, permitem a renovação do ar durante o cultivo, bem como o monitoramento de alguns parâmetros essenciais ao crescimento do propágulo, tais como pH, oxigênio dissolvido, temperatura, concentração de íons, etc. Os primeiros biorreatores derivaram dos equipamentos denominados fermentadores, os quais foram, há muitas décadas, desenvolvidos para cultivo de fungos e bactérias para fins industriais. Assim, os primeiros biorreatores testados para plantas continuaram sendo chamados de fermentadores, por serem utilizados basicamente para o cultivo de células vegetais isoladas, de forma mui-

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Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 24- janeiro/fevereiro 2002

1972. 1994). A agitação é basicamente feita por meio de hélices conectadas a um eixo giratório. gemas e hastes caulinares para fins de micropropagação é fundamentalmente a mesma dos equipamentos utilizados para cultivo de fungos.. o frasco de cultivo apresenta um envoltório metálico em forma de jaqueta. principalmente na década de 80. motor elétrico conectado a um eixo que se estende até o interior do frasco. Nesse caso. Biorreator tipo tambor rotatório (“roller drum bioreactor”) Nesse tipo de biorreator. Os biorreatores são aplicados igualmente à produção de embriões somáticos (Tautorus et al. bomba compressora de ar. Onishi et al. 1994). Inicialmente. Entretanto. os biorreatores começaram a ser utilizados para cultivo de células. A grande desvantagem desse modelo de biorreator é que. os biorreatores tradicionais apresentam os seguintes componentes: frasco de cultivo. O frasco de cultura é desenhado de tal forma a permitir uma ótima aeração do meio de cultura.44 micras de diâmetro. o que. e uma série de modelos específicos para plantas foram desenvolvidos. 1994). 1994). 1994). por onde circula água com temperatura pre-determinada. Biorreatores para cultivo de células vegetais foram bastante estudados. regra geral. Constituição básica dos biorreatores A constituição dos biorreatores usados para cultura de embrião. O primeiro relato sobre o uso de biorreatores para propagação vegetal foi primeiramente feito por Takayama e Misawa (1981) para micropropagação de begônia. Essa metodologia exige completo domínio sobre o processo de indução e seleção de calos embriogênicos. além da germinação das sementes sintéticas. modelo compacto de 4 pares de frascos. embriões e plantas. aço inoxidável. o frasco de cultivo gira suavemente em movimentos rotacionais sobre dois eixos. principalmente em hastes e gemas. 1993. pequenos ajustes foram feitos na taxa de renovação do ar e nas formas de agitação das células... Nesse tipo de biorreator. tecidos. Procedimentos similares foram adaptados para uma série de outras espécies vegetais (Noriega & Söndahl. polipropileno ou qualquer outro material que suporte a autoclavagem a uma temperatura de 121 ° C durante 15 a 30 minutos. Biorreatores tipo aerador agitador (“aeration agitation bioreactor”) Esse tipo de biorreator é o mais parecido com os fermentadores convencionais. sensores de temperatura. bem como uma homogeneização satisfatória com um mínimo de dano mecânico do material em cultivo.mais comum a injeção de um fluxo de ar a uma determinada pressão. É basicamente utilizado para células e embriões somáticos (Kessel & Carr .janeiro/fevereiro 2002 . 1994. combinada com o movimento de uma hélice no interior do frasco de cultivo (Takayama & Akita. mas que também são responsáveis por imprimir ao frasco de cultivo o movimento rotatório. policarbonato. Freqüentemente. o dano mecânico é mínimo e é adequado ao 37 Figura 2. a maioria dos frascos utilizados está na faixa de 1 a 4 litros (Takayama & Akita.22 a 0. 1994). Denchev et al. os autores utilizaram segmentos nodais de plântulas estabelecidas in vitro. A homogeneização do meio de cultura e a aeração do material em cultivo são feitos de diversas formas. causa dano mecânico acentuado ao material em cultivo. 1992 e sementes sintéticas (Attree et al.. embora volumes menores como 250 e 500 ml.nº 24. que servem não apenas de apoio. seguindo protocolos de cultivos convencionais em meio gelificado. é necessário que a hélice gire em velocidades suficientemente elevadas. para haver uma boa homogeneização do meio. bem como da diferenciação e encapslulamento dos embriões somáticos. para controle da temperatura de cultivo (Takayama & Akita. Os frascos podem ser feitos de vidro. Recentemente. pH e oxigênio (Takayama & Akita. os fermentadores foram empregados com pouca ou nenhuma modificação para o cultivo de células vegetais. Principais tipos de biorreatores utilizados para cultivo de hastes caulinares e embrião Vários tipos de biorreatores têm sido desenvolvidos e utilizados ou têm potencial de uso em cultivo de gemas. Para isso. Akita & Takayama. Sistema de biorreator. Basicamente. Esses biorreatores são classificados pelo tipo de agitação e construção do frasco (Takayama & Akita. gemas e plântulas. bactérias e células vegetais (Takayama & Akita. 1994). 1994). utilizando bomba compressora de ar to parecida com o que era feito com os fungos e bactérias. 1992. tendo como objetivo final a produção de mudas em larga escala. 1988).. sendo a Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento . 20 ou até mesmo 300 litros já tenham sido utilizados. O tamanho do frasco de cultivo normalmente varia entre 1 e 20 litros. Preil et al. ou maiores. O ar que entra no sistema é esterilizado ao ser forçado a passar através de uma membrana com poros de 0.

o que pode ser contornado com a inclusão de um sistema de aeração via injeção de ar estéril. A única diferença desse biorreator para o modelo anterior é que o borbulhamento de ar é feito dentro de um tubo centralizado no frasco de cultivo.. bulbos. órgãos e plântulas. policarbonato ou polipropileno. Biorreator tipo filtro rotatório (“spin filter biorreactor”) Biorreator de filtro rotatório apresenta um filtro conectado a um eixo central. Biorreator do tipo sobre-aeração (“overlay aeration bioreactor”) Nesse modelo. Entretanto. A homogeneização do meio. a homogeneização do meio de cultura fica prejudicada (Luttman et al. Esse modelo apresenta deficiência na aeração.. bem como pela aeração do material em cultivo. Esse modelo de biorreator foi desenvolvido e utilizado primeiramente na micropropagacão. Eventualmente. 1983). por onde o meio de cultura é descarregado (Styer. cormos e tubérculos (Takayama & Misawa. pulverizado sobre o material em cultivo é. 1989). Biorreator de aeração simples e coluna de bolha (“bubble column bioreactor”) A relação altura/diâmetro de 1 a 2 define o biorreator de aeração simples e se a relação é 3 ou acima. Biorreator de imersão temporária Em todos os modelos descritos anteriormente. Biorretor de aeração por membrana porosa ao oxigênio (“oxygen permeable membrane aerator bioreactor”) O frasco de cultura desse tipo de biorreator contém uma canalização fina em forma de espiral feita de material poroso ao oxigênio. Esses modelos 38 de biorreatores apresentam bons resultados no cultivo de hastes caulinares. o que pode comprometer o crescimento. uma vez que há uma boa aeração e homogeneização do meio de cultura e pouco dano mecânico ao material em cultivo (Park et al.nº 24. Biorreator tipo borbulhamento (“air driven bioreactor”) O biorreator tipo borbulhamento apresenta uma constituição muito simples. Esse modelo de biorreator não apresenta problemas relacionados com o dano mecânico. Essa imersão contínua causa problemas de hiperhidratação dos tecidos. através do qual o oxigênio passa para o meio de cultura. o biorreator é do tipo coluna de bolha. 1984). 1991). Esse tipo de Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento . Visando a eliminar ou a minimizar Figura 3. Dependendo da espécie e do tipo de meio utilizado. sobretudo. Esse elemento é responsável igualmente pela homogeneização. Biorreator do tipo fase gasosa (“gaseous phase bioreactor”) Esse modelo é equipado com um suporte perfurado sobre o qual o material em cultivo é posicionado. Pode ser de dois tipos: aeração simples ou coluna de bolha.biorreator apresenta excelentes resultados no cultivo de células. o material em cultivo permanece imerso continuamente no meio de cultura. a aeração é feita por sopramento do ar estéril sobre o meio de cultura. drenado pela base de suporte e novamente bombeado e pulverizado a intervalos preestabelecidos (Ushiyama.. Esse modelo apresenta bons resultados. 1985). com células embriogênicas de café em cultivo cultivo de embriões e plantas. Biorreator do tipo levantamento de ar (“air lift bioreactor”) O meio de cultura nesse tipo de biorreator é movido de baixo para cima dentro de um tubo situado verticalmente no interior do frasco pelas bolhas de ar produzidas no fundo do frasco de cultivo. uma vez que não há nenhum tipo de agitação. em seguida. Esse tipo de biorreator funciona satisfatoriamente bem para propagação via embriogênese somática (Wheat et al. Takayama et al. 1986). tecidos e órgãos porque não há dano mecânico nem agitação via borbulhamento. que irão afetar o crescimento e desenvolvimento do material em cultivo. O inconveniente desse modelo é a não renovação do ar interno do frasco de cultivo. por Takayama & Misawa (1981). com exceção daquele que utiliza um sistema de pulverização do meio. esse tipo de aeração pode ser combinado com agitação suave do meio (Ishibashi et al. de células e tecidos. silicone. 1981. entretanto. o nível de oxigenação só é adequado quando se utilizam meios de cultura com alta viscosidade (Tanaka et al. que pode ser de teflon.janeiro/fevereiro 2002 . O meio de cultura. a hiperhidratação dos tecidos pode causar distúrbios fisiológicos sérios. bem como a aeração são feitos via borbulhamento de ar no fundo do frasco. 1987). 1994). Detalhe dos frascos do biorreator.

faz com que o meio retorne ao compartimento inferior. apresentando resultados muito bons (Alvard et al. o que. o frasco tipo Erlenmeyer era mudado automaticamente de posição a intervalos predeterminados. por 28 dias. 1999). Visando a contoraclimatadas nar esse problema. para cultivo de explantes de uva em meio líquido em frascos tipo Erlenmeyer. dando origem ao sistema de biorreator denominado RITA® (Teisson et al. (1952) demonstraram que raízes de cenoura imersos em meio líquido não apresentavam crescimento satisfatório e concluíram que o motivo se Figura 5. um superior e um inferior. no superior. Após um período preestabelecido. 1997. 1995. Mudas alongadas de abacaxi. O meio de cultura passa do compartimento inferior para o superior pela injeção de ar no compartimento inferior. de tal forma que. Etienne et al. Após esse período. em meio de multiplicação esse problema. Nesse tipo de biorreator. Teisson et al. Quando todo o meio passa para o compartimento superior. O estoque inicial de explantes era obtido através do cultivo. no qual plântulas eram cultivadas em um grande recipiente com meio gelificado. conseguindo. O modelo desenvolvido por Alvard et al. o meio de cultura permanece em contato com o explante por um período predeterminado. Segundo Harris & Mason (1983). os segmentos de raiz eram expostos ao ar e. em determinado momento. (1952).Figura 4. (1991) desenvolve39 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento .. Tisserat & Vandercook desenvolveram um sistema de cultivo em imersão temporária. Posteriormente.. por gravidade. a qual era periodicamente cheia de meio de cultura. Hastes de abacaxi. a produção de brotos foi sete vezes superior ao rendimento obtido pelo mesmo período em meio com agar. prontas para serem cultura. um aumento da matéria fresca de 38. o meio é drenado e o explante deixa de ficar em contato direto com o meio de cultura. Esse procedimento era repetido a cada semana. O meio de cultura é colocado no compartimento inferior e o material a ser cultivado. no “auxophyton”. Cabasson et al.6 mg em meio líquido. a pressão do ar no compartimento inferior é aliviada. com adição e remoção automática e periódica do meio líquido. permanecendo aí até que o ciclo recomece. com diferentes tipos de explantes. Nesse equipamento. conectados entre si por um tubo... no momento seguinte. em certa posição. de tal forma que. (1993) foi modificado no que se refere à construção. o explante se encontrava submerso e. (1952) e relatado por Harris & Mason (1983). Steward et al. que consistia de uma grande câmara de cultura. 1993. submersos no meio líquido. Atken-Christie & Jones (1987) utilizaram igualmente um sistema de cultivo em imersão temporária na propagação de Pinus. um equipamento desenvolvido por Harris & Mason (1983). O modelo desenvolvido por Alvard et al. o meio era retirado através de uma bomba de vácuo. Em 1985. mas mantendo as mesmas características de funcionamento.. 1997.nº 24. em cultivo. Após 90 dias de cultivo no meio de imersão temporária. esse método de cultivo por imersão temporária mostrou ser muito superior aos cultivos em meios gelificados. não submerso. 1993). Simonton et al. Em seguida. foi desenvolvido um modelo de biorreator chamado de imersão temporária (Alvard et al.janeiro/fevereiro 2002 . Etienne et al. em biorreator de imersão temporária. em meio gelificado com agar. O ar é expelido através de um orifício na tampa do compartimento superior. Nesse sistema. em outra posição. Embora o controle da troca gasosa fosse insatisfatório. com isso. Aitken-Chistie & Davies (1988) desenvolveram um sistema semi-automático de cultivo sob imersão temporária. ocorre borbulhamento e aeração do meio em contato com o material em cultivo. delinearam e construíram um equipamento que foi denominado “auxophyton”. O meio permanecia em contato com o explante por 4 a 6 horas.. Na realidade.1 mg em meio gelificado para 98. apresentava o mesmo princípio relatado por Steward et al. após a tratava de deficiência de multiplicação e alongamento em biorreator de oxigenação do meio de imersão temporária. o qual movimentava os frascos de cultura de forma rotacional sobre uma roda. (1993) é constituído de um frasco de dois compartimentos.. O sistema RITA® vem sendo utilizado para uma série de espécies vegetais. Pouco tempo depois. 1995). o princípio da imersão temporária para cultivo de fragmentos vegetais relativamente grandes foi primeiramente descrito por Steward et al. o meio nutritivo líquido era colocado sobre o meio sólido sobre o qual estavam os explantes.

d) o equipamento pode ser montado em diferentes ambientes de intensidade de luz. são necessários pequenos ajustes no equipamento. e) o equipamento pode ser utilizado para cultivo em regime de imersão temporária ou contínua. Uma modificação mais recente do modelo de biorreator de imersão temporária foi feito por Lorenzo et al. multiplicadas em biorreator de imersão temporária ram um equipamento automático de micropropagação. carga. os quais podem variar em tamanho. b) a montagem é simples e os componentes (válvulas solenóides. os resultados preliminares foram excelentes. do ponto de vista de montagem e funcionamento. quanto para gemas e segmentos nodais e raiz.nº 24. em termos gerais. Por sua vez. o sistema foi testado para cultivo de microestacas de batata para microtuberização e hastes de abacaxi visando à multibrotação e ao alongamento das mudas. como o uso de um frasco relativamente grande. bem como pela potência do compressor ou da fonte de ar comprimido. montagem e funcionamento.. que permite uma grande versatilidade de uso. sob regime de imersão temporária. descarga e troca do meio de cultura. No momento. (1998). O meio de cultura é transferido de um frasco para o outro por meio de um vácuo de 250 mm de Hg. não permitindo versatilidade no seu uso. Esse sistema utiliza dois frascos. conexões metálicas.. em experimentos de multiplicação para fins de comparação com o cultivo em meio líquido estacionário e em meio gelificado. por 40 ex. constituição. estão em andamento testes definitivos com hastes de abacaxi. mangueiras de silicone. Sistema de Biorreator desenvolvido pela Embrapa A Embrapa-Recursos Genéticos e Biotecnologia desenvolveu e submeteu ao INPI. como novos e mais adequados tipos de frascos e tampas e novos sistemas de iluminação com vistas a ajustá-lo para cultivo de explantes específicos..c) o sistema foi desenhado para comportar diferentes números de frascos de cultivo. Nos primeiros ensaios. (1993) e Lorenzo et al. Plantas aclimatadas de abacaxi. b) destinam-se apenas ao cultivo sob condições de imersão contínua. são equipamentos: a) complexos. fonte de ar comprimido. etc. h) o equipamento pode ser utilizado tanto para cultivo de células e embriões. Para isso. Embora esse sistema tenha apresentado uma excelente performance quanto ao preciso controle da exposição do explante ao meio de cultura. fotoperíodo e temperatura. g) o equipamento permite fazer. etc.) podem ser de fácil aquisição ou feitura. sendo um para cultivo do material vegetal e outro para estocagem do meio de cultura. (1999) para gemas de abacaxi. nitrogênio e gás carbônico. os modelos de imersão temporária são mais simples na sua concepção. O equipamento apresenta as seguintes características não encontradas em outros modelos de biorreatores: a) o equipamento pode utilizar diferentes tipos de frascos. Entretanto. cujo período pode ser definido pelo temporizador. temporizadores. f) no regime de imersão contínua.janeiro/fevereiro 2002 . como células e gemas. transparência. Figura 6. o equipamento pode funcionar sob regime de borbulhamento contínuo com diferentes fluxos de ar ou sob borbulhamento temporário. de difícil manuseio. Em ambos os casos. transformação de um modelo de imersão contínua para imersão temporária e vice-versa. várias modificações estão sendo introduzidas no sistema. o que é determinado pela extensão das tubulações. além de propiciar uma Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento . Os modelos de biorreatores de imersão contínua encontrados na literatura científica. para fins de patenteamento um sistema de biorreator tomando como base o modelo desenvolvido por Alvard et al. c) de difícil manipulação durante as fases de esterilização. (1998) para micropropagação de gemas de cana-de-açúcar e Escalona et al. ainda. tipo de tampa. alguns problemas foram identificados. Por ser um equipamento recémdesenvolvido. além de alguns problemas de contaminação especialmente do tipo bacteriana. de acordo com um esquema de tempo preestabelecido. no qual o meio líquido era injetado sobre as plântulas em cultivo. fluxômetro. filtros de ar. Estão igualmente em andamento os primeiros testes de cultivo de células embriogênicas de café. formato. não foram apresentados detalhes adicionais da construção e funcionamento desse tipo de biorreator. uso de uma fonte de ar artificial com dosagens específicas de oxigênio.

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