Pesquisa

BIORREATORES
Fotos cedidas pelo autor

Biorreatores para células, tecidos e órgãos vegetais - Produção de mudas em larga escala
Introdução
João Batista Teixeira,
Ph.D., Biologia Celular batista@cenargen.embrapa.br Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia

A micropropagação é uma forma vegetativa de propagação de diferentes espécies de plantas por meio da técnica denominada cultura de tecidos. Essa técnica requer laboratórios bem estruturados e pessoal treinado. Em resumo, o procedimento envolve os seguintes passos: inicialmente, é feita a escolha da planta matriz e do tipo de material a ser utilizado, tais como

Figura 1. Sistema de biorreator de imersão temporária, desenvolvido pela Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia, utilizando tanque de ar comprimido

gemas, segmentos nodais, folhas, flores, etc. Em seguida, o material é desinfestado já em condições de laboratório em ambiente estéril, e introduzido em frascos igualmente estéreis, contendo meio de cultura esterilizado. Esse meio contém, todos os nutrientes necessários ao crescimento e desenvolvimento do material em cultivo, além de substâncias reguladoras de crescimento. Os frascos com o material são mantidos em salas

de crescimento, sob condições de temperatura, luminosidade e fotoperíodo adequados. Milhões de plantas são produzidas anualmente, em todo o mundo, por meio da micropropagação. Entretanto, esse método de multiplicação é altamente demandante de mão-de-obra e só em condições especiais tal procedimento deve ser utilizado. Basicamente, a escolha da micropropagação frente a outras formas de propagação baseia-se no valor venal da muda ou do produto a ser obtido pela muda micropropagada. A metodologia tradicional de micropropagação baseia-se em cultivos em pequenos frascos, com número reduzido de plântulas por frasco, e uso de meio nutritivo gelificado, o que acarreta intensa manipulação das culturas, e envolve, com isso um grande contingente de mão-de-obra especializada. Biorreatores podem ser conceituados como equipamentos para cultivo sob imersão temporária ou permanente de células, gemas, embriões ou qualquer tipo de propágulo que possa ser utilizado na micropropagação. Os biorreatores utilizam meio de cultura líquido, permitem a renovação do ar durante o cultivo, bem como o monitoramento de alguns parâmetros essenciais ao crescimento do propágulo, tais como pH, oxigênio dissolvido, temperatura, concentração de íons, etc. Os primeiros biorreatores derivaram dos equipamentos denominados fermentadores, os quais foram, há muitas décadas, desenvolvidos para cultivo de fungos e bactérias para fins industriais. Assim, os primeiros biorreatores testados para plantas continuaram sendo chamados de fermentadores, por serem utilizados basicamente para o cultivo de células vegetais isoladas, de forma mui-

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Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 24- janeiro/fevereiro 2002

1994)... tecidos. bactérias e células vegetais (Takayama & Akita. Procedimentos similares foram adaptados para uma série de outras espécies vegetais (Noriega & Söndahl. 1994). 1993. 1994. seguindo protocolos de cultivos convencionais em meio gelificado. pH e oxigênio (Takayama & Akita. pequenos ajustes foram feitos na taxa de renovação do ar e nas formas de agitação das células.22 a 0. tendo como objetivo final a produção de mudas em larga escala. Para isso. embriões e plantas. 1992 e sementes sintéticas (Attree et al. ou maiores. 1994). A agitação é basicamente feita por meio de hélices conectadas a um eixo giratório. 1992. Principais tipos de biorreatores utilizados para cultivo de hastes caulinares e embrião Vários tipos de biorreatores têm sido desenvolvidos e utilizados ou têm potencial de uso em cultivo de gemas.1972. bem como uma homogeneização satisfatória com um mínimo de dano mecânico do material em cultivo. Freqüentemente. A homogeneização do meio de cultura e a aeração do material em cultivo são feitos de diversas formas. embora volumes menores como 250 e 500 ml. utilizando bomba compressora de ar to parecida com o que era feito com os fungos e bactérias. Denchev et al. O tamanho do frasco de cultivo normalmente varia entre 1 e 20 litros. 20 ou até mesmo 300 litros já tenham sido utilizados. É basicamente utilizado para células e embriões somáticos (Kessel & Carr . a maioria dos frascos utilizados está na faixa de 1 a 4 litros (Takayama & Akita. 1994). causa dano mecânico acentuado ao material em cultivo. é necessário que a hélice gire em velocidades suficientemente elevadas. que servem não apenas de apoio. principalmente em hastes e gemas. modelo compacto de 4 pares de frascos.nº 24. 1994). Constituição básica dos biorreatores A constituição dos biorreatores usados para cultura de embrião. para haver uma boa homogeneização do meio. por onde circula água com temperatura pre-determinada. combinada com o movimento de uma hélice no interior do frasco de cultivo (Takayama & Akita. os biorreatores tradicionais apresentam os seguintes componentes: frasco de cultivo. 1994). o dano mecânico é mínimo e é adequado ao 37 Figura 2. principalmente na década de 80. Os frascos podem ser feitos de vidro.mais comum a injeção de um fluxo de ar a uma determinada pressão.janeiro/fevereiro 2002 .. O frasco de cultura é desenhado de tal forma a permitir uma ótima aeração do meio de cultura. Biorreator tipo tambor rotatório (“roller drum bioreactor”) Nesse tipo de biorreator. bomba compressora de ar. Essa metodologia exige completo domínio sobre o processo de indução e seleção de calos embriogênicos. mas que também são responsáveis por imprimir ao frasco de cultivo o movimento rotatório. bem como da diferenciação e encapslulamento dos embriões somáticos. O primeiro relato sobre o uso de biorreatores para propagação vegetal foi primeiramente feito por Takayama e Misawa (1981) para micropropagação de begônia. 1988).. gemas e plântulas. Akita & Takayama. sensores de temperatura. 1994). para controle da temperatura de cultivo (Takayama & Akita. Preil et al. Recentemente. Os biorreatores são aplicados igualmente à produção de embriões somáticos (Tautorus et al. os biorreatores começaram a ser utilizados para cultivo de células. sendo a Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento . Nesse caso. o frasco de cultivo gira suavemente em movimentos rotacionais sobre dois eixos. A grande desvantagem desse modelo de biorreator é que. o frasco de cultivo apresenta um envoltório metálico em forma de jaqueta. 1994). gemas e hastes caulinares para fins de micropropagação é fundamentalmente a mesma dos equipamentos utilizados para cultivo de fungos. e uma série de modelos específicos para plantas foram desenvolvidos. motor elétrico conectado a um eixo que se estende até o interior do frasco. O ar que entra no sistema é esterilizado ao ser forçado a passar através de uma membrana com poros de 0. policarbonato. Inicialmente. regra geral. Sistema de biorreator.44 micras de diâmetro. Biorreatores para cultivo de células vegetais foram bastante estudados. Onishi et al. Nesse tipo de biorreator. os autores utilizaram segmentos nodais de plântulas estabelecidas in vitro. os fermentadores foram empregados com pouca ou nenhuma modificação para o cultivo de células vegetais. o que. Biorreatores tipo aerador agitador (“aeration agitation bioreactor”) Esse tipo de biorreator é o mais parecido com os fermentadores convencionais. aço inoxidável. Esses biorreatores são classificados pelo tipo de agitação e construção do frasco (Takayama & Akita. além da germinação das sementes sintéticas. Entretanto.. Basicamente. polipropileno ou qualquer outro material que suporte a autoclavagem a uma temperatura de 121 ° C durante 15 a 30 minutos.

Dependendo da espécie e do tipo de meio utilizado. o material em cultivo permanece imerso continuamente no meio de cultura. Biorreator de imersão temporária Em todos os modelos descritos anteriormente. com exceção daquele que utiliza um sistema de pulverização do meio.. Biorreator tipo borbulhamento (“air driven bioreactor”) O biorreator tipo borbulhamento apresenta uma constituição muito simples. por onde o meio de cultura é descarregado (Styer. pulverizado sobre o material em cultivo é. 1994). Entretanto. O inconveniente desse modelo é a não renovação do ar interno do frasco de cultivo. o biorreator é do tipo coluna de bolha. Esse modelo apresenta deficiência na aeração. A homogeneização do meio. o que pode ser contornado com a inclusão de um sistema de aeração via injeção de ar estéril. Esse modelo de biorreator não apresenta problemas relacionados com o dano mecânico. Takayama et al. Biorreator do tipo fase gasosa (“gaseous phase bioreactor”) Esse modelo é equipado com um suporte perfurado sobre o qual o material em cultivo é posicionado. Biorreator de aeração simples e coluna de bolha (“bubble column bioreactor”) A relação altura/diâmetro de 1 a 2 define o biorreator de aeração simples e se a relação é 3 ou acima. Biorreator do tipo levantamento de ar (“air lift bioreactor”) O meio de cultura nesse tipo de biorreator é movido de baixo para cima dentro de um tubo situado verticalmente no interior do frasco pelas bolhas de ar produzidas no fundo do frasco de cultivo. bulbos. a aeração é feita por sopramento do ar estéril sobre o meio de cultura.janeiro/fevereiro 2002 . Esse modelo de biorreator foi desenvolvido e utilizado primeiramente na micropropagacão. Biorreator tipo filtro rotatório (“spin filter biorreactor”) Biorreator de filtro rotatório apresenta um filtro conectado a um eixo central. por Takayama & Misawa (1981). cormos e tubérculos (Takayama & Misawa. Detalhe dos frascos do biorreator. Pode ser de dois tipos: aeração simples ou coluna de bolha. drenado pela base de suporte e novamente bombeado e pulverizado a intervalos preestabelecidos (Ushiyama. através do qual o oxigênio passa para o meio de cultura. Esse modelo apresenta bons resultados. com células embriogênicas de café em cultivo cultivo de embriões e plantas. uma vez que há uma boa aeração e homogeneização do meio de cultura e pouco dano mecânico ao material em cultivo (Park et al. o nível de oxigenação só é adequado quando se utilizam meios de cultura com alta viscosidade (Tanaka et al. Biorreator do tipo sobre-aeração (“overlay aeration bioreactor”) Nesse modelo. Essa imersão contínua causa problemas de hiperhidratação dos tecidos. esse tipo de aeração pode ser combinado com agitação suave do meio (Ishibashi et al. A única diferença desse biorreator para o modelo anterior é que o borbulhamento de ar é feito dentro de um tubo centralizado no frasco de cultivo. 1984).. Biorretor de aeração por membrana porosa ao oxigênio (“oxygen permeable membrane aerator bioreactor”) O frasco de cultura desse tipo de biorreator contém uma canalização fina em forma de espiral feita de material poroso ao oxigênio. Esse tipo de biorreator funciona satisfatoriamente bem para propagação via embriogênese somática (Wheat et al.nº 24. 1986). entretanto. Eventualmente. O meio de cultura. Esses modelos 38 de biorreatores apresentam bons resultados no cultivo de hastes caulinares. Esse tipo de Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento . 1991). Esse elemento é responsável igualmente pela homogeneização. a homogeneização do meio de cultura fica prejudicada (Luttman et al. 1989). a hiperhidratação dos tecidos pode causar distúrbios fisiológicos sérios. silicone. em seguida. de células e tecidos. 1985).biorreator apresenta excelentes resultados no cultivo de células. o que pode comprometer o crescimento. bem como pela aeração do material em cultivo. uma vez que não há nenhum tipo de agitação. 1981. que pode ser de teflon. que irão afetar o crescimento e desenvolvimento do material em cultivo. órgãos e plântulas. policarbonato ou polipropileno. bem como a aeração são feitos via borbulhamento de ar no fundo do frasco. tecidos e órgãos porque não há dano mecânico nem agitação via borbulhamento. Visando a eliminar ou a minimizar Figura 3. 1987). 1983).. sobretudo.

esse método de cultivo por imersão temporária mostrou ser muito superior aos cultivos em meios gelificados. de tal forma que. prontas para serem cultura.. Etienne et al. O meio de cultura é colocado no compartimento inferior e o material a ser cultivado. O meio de cultura passa do compartimento inferior para o superior pela injeção de ar no compartimento inferior. Pouco tempo depois. (1952) demonstraram que raízes de cenoura imersos em meio líquido não apresentavam crescimento satisfatório e concluíram que o motivo se Figura 5. com isso. mas mantendo as mesmas características de funcionamento.. no qual plântulas eram cultivadas em um grande recipiente com meio gelificado. dando origem ao sistema de biorreator denominado RITA® (Teisson et al. O sistema RITA® vem sendo utilizado para uma série de espécies vegetais. 1995. de tal forma que.Figura 4. o que. em outra posição. após a tratava de deficiência de multiplicação e alongamento em biorreator de oxigenação do meio de imersão temporária. um superior e um inferior. Visando a contoraclimatadas nar esse problema. Em seguida. a pressão do ar no compartimento inferior é aliviada. que consistia de uma grande câmara de cultura.. Nesse equipamento. Posteriormente. (1993) é constituído de um frasco de dois compartimentos. Nesse sistema. Esse procedimento era repetido a cada semana. por gravidade. conectados entre si por um tubo. o meio de cultura permanece em contato com o explante por um período predeterminado. (1952).1 mg em meio gelificado para 98. Teisson et al. Etienne et al. com diferentes tipos de explantes. apresentava o mesmo princípio relatado por Steward et al. Cabasson et al.janeiro/fevereiro 2002 . Aitken-Chistie & Davies (1988) desenvolveram um sistema semi-automático de cultivo sob imersão temporária. no momento seguinte. os segmentos de raiz eram expostos ao ar e. o princípio da imersão temporária para cultivo de fragmentos vegetais relativamente grandes foi primeiramente descrito por Steward et al. O meio permanecia em contato com o explante por 4 a 6 horas. no “auxophyton”. permanecendo aí até que o ciclo recomece.. (1991) desenvolve39 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento .. 1999). para cultivo de explantes de uva em meio líquido em frascos tipo Erlenmeyer. o explante se encontrava submerso e. O modelo desenvolvido por Alvard et al. 1993. 1993).. Steward et al. conseguindo. O modelo desenvolvido por Alvard et al. por 28 dias. em determinado momento. em meio gelificado com agar.. (1952) e relatado por Harris & Mason (1983). no superior. (1993) foi modificado no que se refere à construção. a qual era periodicamente cheia de meio de cultura. um aumento da matéria fresca de 38. ocorre borbulhamento e aeração do meio em contato com o material em cultivo. Segundo Harris & Mason (1983). em biorreator de imersão temporária. a produção de brotos foi sete vezes superior ao rendimento obtido pelo mesmo período em meio com agar. um equipamento desenvolvido por Harris & Mason (1983). o qual movimentava os frascos de cultura de forma rotacional sobre uma roda. Mudas alongadas de abacaxi. foi desenvolvido um modelo de biorreator chamado de imersão temporária (Alvard et al. O estoque inicial de explantes era obtido através do cultivo. Embora o controle da troca gasosa fosse insatisfatório. em certa posição. o meio é drenado e o explante deixa de ficar em contato direto com o meio de cultura. O ar é expelido através de um orifício na tampa do compartimento superior. Simonton et al. Em 1985. o meio era retirado através de uma bomba de vácuo. Após 90 dias de cultivo no meio de imersão temporária. com adição e remoção automática e periódica do meio líquido. faz com que o meio retorne ao compartimento inferior. 1995). submersos no meio líquido. Atken-Christie & Jones (1987) utilizaram igualmente um sistema de cultivo em imersão temporária na propagação de Pinus. Na realidade. não submerso. delinearam e construíram um equipamento que foi denominado “auxophyton”. o frasco tipo Erlenmeyer era mudado automaticamente de posição a intervalos predeterminados. 1997.6 mg em meio líquido. Após esse período. apresentando resultados muito bons (Alvard et al.nº 24. o meio nutritivo líquido era colocado sobre o meio sólido sobre o qual estavam os explantes. Hastes de abacaxi. Tisserat & Vandercook desenvolveram um sistema de cultivo em imersão temporária. 1997. Quando todo o meio passa para o compartimento superior. Nesse tipo de biorreator. Após um período preestabelecido. em cultivo. em meio de multiplicação esse problema.

filtros de ar. são equipamentos: a) complexos. de acordo com um esquema de tempo preestabelecido. Os modelos de biorreatores de imersão contínua encontrados na literatura científica. ainda. por 40 ex. O meio de cultura é transferido de um frasco para o outro por meio de um vácuo de 250 mm de Hg. Entretanto. e) o equipamento pode ser utilizado para cultivo em regime de imersão temporária ou contínua. formato. uso de uma fonte de ar artificial com dosagens específicas de oxigênio. carga. Figura 6. os modelos de imersão temporária são mais simples na sua concepção. além de propiciar uma Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento . Plantas aclimatadas de abacaxi. fotoperíodo e temperatura. O equipamento apresenta as seguintes características não encontradas em outros modelos de biorreatores: a) o equipamento pode utilizar diferentes tipos de frascos. os quais podem variar em tamanho. f) no regime de imersão contínua. temporizadores. fluxômetro. No momento..) podem ser de fácil aquisição ou feitura. os resultados preliminares foram excelentes. do ponto de vista de montagem e funcionamento. conexões metálicas. d) o equipamento pode ser montado em diferentes ambientes de intensidade de luz. Nos primeiros ensaios. h) o equipamento pode ser utilizado tanto para cultivo de células e embriões. além de alguns problemas de contaminação especialmente do tipo bacteriana. Esse sistema utiliza dois frascos.. g) o equipamento permite fazer. b) a montagem é simples e os componentes (válvulas solenóides. etc. sendo um para cultivo do material vegetal e outro para estocagem do meio de cultura.nº 24.. em termos gerais. montagem e funcionamento. constituição. tipo de tampa. não foram apresentados detalhes adicionais da construção e funcionamento desse tipo de biorreator. Sistema de Biorreator desenvolvido pela Embrapa A Embrapa-Recursos Genéticos e Biotecnologia desenvolveu e submeteu ao INPI. transparência. (1998). alguns problemas foram identificados. multiplicadas em biorreator de imersão temporária ram um equipamento automático de micropropagação. c) de difícil manipulação durante as fases de esterilização. (1999) para gemas de abacaxi. Para isso. são necessários pequenos ajustes no equipamento. Por sua vez. o equipamento pode funcionar sob regime de borbulhamento contínuo com diferentes fluxos de ar ou sob borbulhamento temporário. mangueiras de silicone. várias modificações estão sendo introduzidas no sistema. de difícil manuseio. como o uso de um frasco relativamente grande. o sistema foi testado para cultivo de microestacas de batata para microtuberização e hastes de abacaxi visando à multibrotação e ao alongamento das mudas. descarga e troca do meio de cultura. quanto para gemas e segmentos nodais e raiz. como novos e mais adequados tipos de frascos e tampas e novos sistemas de iluminação com vistas a ajustá-lo para cultivo de explantes específicos. b) destinam-se apenas ao cultivo sob condições de imersão contínua. cujo período pode ser definido pelo temporizador.c) o sistema foi desenhado para comportar diferentes números de frascos de cultivo. no qual o meio líquido era injetado sobre as plântulas em cultivo. bem como pela potência do compressor ou da fonte de ar comprimido. transformação de um modelo de imersão contínua para imersão temporária e vice-versa. o que é determinado pela extensão das tubulações. que permite uma grande versatilidade de uso. Por ser um equipamento recémdesenvolvido. fonte de ar comprimido. Embora esse sistema tenha apresentado uma excelente performance quanto ao preciso controle da exposição do explante ao meio de cultura. sob regime de imersão temporária. em experimentos de multiplicação para fins de comparação com o cultivo em meio líquido estacionário e em meio gelificado. Em ambos os casos. etc. Uma modificação mais recente do modelo de biorreator de imersão temporária foi feito por Lorenzo et al. como células e gemas. estão em andamento testes definitivos com hastes de abacaxi. Estão igualmente em andamento os primeiros testes de cultivo de células embriogênicas de café. para fins de patenteamento um sistema de biorreator tomando como base o modelo desenvolvido por Alvard et al. (1993) e Lorenzo et al. não permitindo versatilidade no seu uso.janeiro/fevereiro 2002 . (1998) para micropropagação de gemas de cana-de-açúcar e Escalona et al. nitrogênio e gás carbônico.

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