Pesquisa

BIORREATORES
Fotos cedidas pelo autor

Biorreatores para células, tecidos e órgãos vegetais - Produção de mudas em larga escala
Introdução
João Batista Teixeira,
Ph.D., Biologia Celular batista@cenargen.embrapa.br Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia

A micropropagação é uma forma vegetativa de propagação de diferentes espécies de plantas por meio da técnica denominada cultura de tecidos. Essa técnica requer laboratórios bem estruturados e pessoal treinado. Em resumo, o procedimento envolve os seguintes passos: inicialmente, é feita a escolha da planta matriz e do tipo de material a ser utilizado, tais como

Figura 1. Sistema de biorreator de imersão temporária, desenvolvido pela Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia, utilizando tanque de ar comprimido

gemas, segmentos nodais, folhas, flores, etc. Em seguida, o material é desinfestado já em condições de laboratório em ambiente estéril, e introduzido em frascos igualmente estéreis, contendo meio de cultura esterilizado. Esse meio contém, todos os nutrientes necessários ao crescimento e desenvolvimento do material em cultivo, além de substâncias reguladoras de crescimento. Os frascos com o material são mantidos em salas

de crescimento, sob condições de temperatura, luminosidade e fotoperíodo adequados. Milhões de plantas são produzidas anualmente, em todo o mundo, por meio da micropropagação. Entretanto, esse método de multiplicação é altamente demandante de mão-de-obra e só em condições especiais tal procedimento deve ser utilizado. Basicamente, a escolha da micropropagação frente a outras formas de propagação baseia-se no valor venal da muda ou do produto a ser obtido pela muda micropropagada. A metodologia tradicional de micropropagação baseia-se em cultivos em pequenos frascos, com número reduzido de plântulas por frasco, e uso de meio nutritivo gelificado, o que acarreta intensa manipulação das culturas, e envolve, com isso um grande contingente de mão-de-obra especializada. Biorreatores podem ser conceituados como equipamentos para cultivo sob imersão temporária ou permanente de células, gemas, embriões ou qualquer tipo de propágulo que possa ser utilizado na micropropagação. Os biorreatores utilizam meio de cultura líquido, permitem a renovação do ar durante o cultivo, bem como o monitoramento de alguns parâmetros essenciais ao crescimento do propágulo, tais como pH, oxigênio dissolvido, temperatura, concentração de íons, etc. Os primeiros biorreatores derivaram dos equipamentos denominados fermentadores, os quais foram, há muitas décadas, desenvolvidos para cultivo de fungos e bactérias para fins industriais. Assim, os primeiros biorreatores testados para plantas continuaram sendo chamados de fermentadores, por serem utilizados basicamente para o cultivo de células vegetais isoladas, de forma mui-

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Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 24- janeiro/fevereiro 2002

ou maiores. 20 ou até mesmo 300 litros já tenham sido utilizados. gemas e plântulas.. 1994). Inicialmente. embora volumes menores como 250 e 500 ml. os autores utilizaram segmentos nodais de plântulas estabelecidas in vitro.44 micras de diâmetro.22 a 0. os biorreatores tradicionais apresentam os seguintes componentes: frasco de cultivo. Esses biorreatores são classificados pelo tipo de agitação e construção do frasco (Takayama & Akita. modelo compacto de 4 pares de frascos.1972. 1992. principalmente em hastes e gemas.nº 24. o dano mecânico é mínimo e é adequado ao 37 Figura 2. Basicamente. O tamanho do frasco de cultivo normalmente varia entre 1 e 20 litros. Para isso. Biorreator tipo tambor rotatório (“roller drum bioreactor”) Nesse tipo de biorreator. principalmente na década de 80. pH e oxigênio (Takayama & Akita. É basicamente utilizado para células e embriões somáticos (Kessel & Carr . é necessário que a hélice gire em velocidades suficientemente elevadas. mas que também são responsáveis por imprimir ao frasco de cultivo o movimento rotatório. gemas e hastes caulinares para fins de micropropagação é fundamentalmente a mesma dos equipamentos utilizados para cultivo de fungos. Os biorreatores são aplicados igualmente à produção de embriões somáticos (Tautorus et al.janeiro/fevereiro 2002 . Nesse caso.. além da germinação das sementes sintéticas. 1994). regra geral. Onishi et al. 1994). Denchev et al. Nesse tipo de biorreator. 1994). e uma série de modelos específicos para plantas foram desenvolvidos. o frasco de cultivo apresenta um envoltório metálico em forma de jaqueta. bactérias e células vegetais (Takayama & Akita. utilizando bomba compressora de ar to parecida com o que era feito com os fungos e bactérias. policarbonato. seguindo protocolos de cultivos convencionais em meio gelificado. a maioria dos frascos utilizados está na faixa de 1 a 4 litros (Takayama & Akita. 1993. embriões e plantas. tecidos. Akita & Takayama. combinada com o movimento de uma hélice no interior do frasco de cultivo (Takayama & Akita. Entretanto. 1988). que servem não apenas de apoio. Principais tipos de biorreatores utilizados para cultivo de hastes caulinares e embrião Vários tipos de biorreatores têm sido desenvolvidos e utilizados ou têm potencial de uso em cultivo de gemas. polipropileno ou qualquer outro material que suporte a autoclavagem a uma temperatura de 121 ° C durante 15 a 30 minutos. O primeiro relato sobre o uso de biorreatores para propagação vegetal foi primeiramente feito por Takayama e Misawa (1981) para micropropagação de begônia. Constituição básica dos biorreatores A constituição dos biorreatores usados para cultura de embrião. 1994). o que. Procedimentos similares foram adaptados para uma série de outras espécies vegetais (Noriega & Söndahl. Preil et al. Os frascos podem ser feitos de vidro. sensores de temperatura. Essa metodologia exige completo domínio sobre o processo de indução e seleção de calos embriogênicos. A grande desvantagem desse modelo de biorreator é que. Biorreatores tipo aerador agitador (“aeration agitation bioreactor”) Esse tipo de biorreator é o mais parecido com os fermentadores convencionais. 1992 e sementes sintéticas (Attree et al. O ar que entra no sistema é esterilizado ao ser forçado a passar através de uma membrana com poros de 0. A agitação é basicamente feita por meio de hélices conectadas a um eixo giratório. 1994. Recentemente. os biorreatores começaram a ser utilizados para cultivo de células. por onde circula água com temperatura pre-determinada. aço inoxidável.mais comum a injeção de um fluxo de ar a uma determinada pressão. 1994). Freqüentemente. motor elétrico conectado a um eixo que se estende até o interior do frasco. causa dano mecânico acentuado ao material em cultivo. bomba compressora de ar. para controle da temperatura de cultivo (Takayama & Akita. os fermentadores foram empregados com pouca ou nenhuma modificação para o cultivo de células vegetais. O frasco de cultura é desenhado de tal forma a permitir uma ótima aeração do meio de cultura. Biorreatores para cultivo de células vegetais foram bastante estudados. bem como da diferenciação e encapslulamento dos embriões somáticos.. pequenos ajustes foram feitos na taxa de renovação do ar e nas formas de agitação das células. A homogeneização do meio de cultura e a aeração do material em cultivo são feitos de diversas formas. o frasco de cultivo gira suavemente em movimentos rotacionais sobre dois eixos. para haver uma boa homogeneização do meio. sendo a Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento .. 1994). 1994). Sistema de biorreator. bem como uma homogeneização satisfatória com um mínimo de dano mecânico do material em cultivo. tendo como objetivo final a produção de mudas em larga escala..

Entretanto. que irão afetar o crescimento e desenvolvimento do material em cultivo. 1981.janeiro/fevereiro 2002 . que pode ser de teflon. uma vez que não há nenhum tipo de agitação. por onde o meio de cultura é descarregado (Styer. A homogeneização do meio. a homogeneização do meio de cultura fica prejudicada (Luttman et al. órgãos e plântulas. a hiperhidratação dos tecidos pode causar distúrbios fisiológicos sérios. Biorretor de aeração por membrana porosa ao oxigênio (“oxygen permeable membrane aerator bioreactor”) O frasco de cultura desse tipo de biorreator contém uma canalização fina em forma de espiral feita de material poroso ao oxigênio. drenado pela base de suporte e novamente bombeado e pulverizado a intervalos preestabelecidos (Ushiyama. Biorreator de aeração simples e coluna de bolha (“bubble column bioreactor”) A relação altura/diâmetro de 1 a 2 define o biorreator de aeração simples e se a relação é 3 ou acima. Esses modelos 38 de biorreatores apresentam bons resultados no cultivo de hastes caulinares. 1991).. a aeração é feita por sopramento do ar estéril sobre o meio de cultura. 1985). o que pode comprometer o crescimento. uma vez que há uma boa aeração e homogeneização do meio de cultura e pouco dano mecânico ao material em cultivo (Park et al. em seguida.. de células e tecidos. Esse tipo de Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento . com células embriogênicas de café em cultivo cultivo de embriões e plantas.. silicone. bem como a aeração são feitos via borbulhamento de ar no fundo do frasco. Esse modelo apresenta deficiência na aeração. Esse tipo de biorreator funciona satisfatoriamente bem para propagação via embriogênese somática (Wheat et al.nº 24. Esse modelo de biorreator não apresenta problemas relacionados com o dano mecânico. pulverizado sobre o material em cultivo é. Dependendo da espécie e do tipo de meio utilizado. através do qual o oxigênio passa para o meio de cultura. tecidos e órgãos porque não há dano mecânico nem agitação via borbulhamento. por Takayama & Misawa (1981). sobretudo. Eventualmente. Essa imersão contínua causa problemas de hiperhidratação dos tecidos. Detalhe dos frascos do biorreator. Visando a eliminar ou a minimizar Figura 3. entretanto. o que pode ser contornado com a inclusão de um sistema de aeração via injeção de ar estéril.biorreator apresenta excelentes resultados no cultivo de células. 1994). esse tipo de aeração pode ser combinado com agitação suave do meio (Ishibashi et al. Biorreator tipo borbulhamento (“air driven bioreactor”) O biorreator tipo borbulhamento apresenta uma constituição muito simples. bulbos. bem como pela aeração do material em cultivo. A única diferença desse biorreator para o modelo anterior é que o borbulhamento de ar é feito dentro de um tubo centralizado no frasco de cultivo. Biorreator do tipo sobre-aeração (“overlay aeration bioreactor”) Nesse modelo. Esse elemento é responsável igualmente pela homogeneização. 1989). o nível de oxigenação só é adequado quando se utilizam meios de cultura com alta viscosidade (Tanaka et al. com exceção daquele que utiliza um sistema de pulverização do meio. o biorreator é do tipo coluna de bolha. 1984). Biorreator do tipo fase gasosa (“gaseous phase bioreactor”) Esse modelo é equipado com um suporte perfurado sobre o qual o material em cultivo é posicionado. Biorreator do tipo levantamento de ar (“air lift bioreactor”) O meio de cultura nesse tipo de biorreator é movido de baixo para cima dentro de um tubo situado verticalmente no interior do frasco pelas bolhas de ar produzidas no fundo do frasco de cultivo. Biorreator tipo filtro rotatório (“spin filter biorreactor”) Biorreator de filtro rotatório apresenta um filtro conectado a um eixo central. 1986). Pode ser de dois tipos: aeração simples ou coluna de bolha. O inconveniente desse modelo é a não renovação do ar interno do frasco de cultivo. 1983). Biorreator de imersão temporária Em todos os modelos descritos anteriormente. O meio de cultura. Takayama et al. policarbonato ou polipropileno. Esse modelo apresenta bons resultados. 1987). Esse modelo de biorreator foi desenvolvido e utilizado primeiramente na micropropagacão. cormos e tubérculos (Takayama & Misawa. o material em cultivo permanece imerso continuamente no meio de cultura.

. o meio era retirado através de uma bomba de vácuo. com isso. 1993. Posteriormente. Visando a contoraclimatadas nar esse problema. Etienne et al. de tal forma que. em meio gelificado com agar. 1997. foi desenvolvido um modelo de biorreator chamado de imersão temporária (Alvard et al. o que. permanecendo aí até que o ciclo recomece. (1952). O sistema RITA® vem sendo utilizado para uma série de espécies vegetais. 1999). o explante se encontrava submerso e. no “auxophyton”.janeiro/fevereiro 2002 . delinearam e construíram um equipamento que foi denominado “auxophyton”. Em 1985.nº 24. O meio de cultura passa do compartimento inferior para o superior pela injeção de ar no compartimento inferior. em outra posição. faz com que o meio retorne ao compartimento inferior. um superior e um inferior. conseguindo. 1995).. Na realidade. 1995. por gravidade. Teisson et al. dando origem ao sistema de biorreator denominado RITA® (Teisson et al. no superior. com adição e remoção automática e periódica do meio líquido. conectados entre si por um tubo. Hastes de abacaxi. (1993) é constituído de um frasco de dois compartimentos. mas mantendo as mesmas características de funcionamento. O modelo desenvolvido por Alvard et al. um equipamento desenvolvido por Harris & Mason (1983). Em seguida. 1997. não submerso. Esse procedimento era repetido a cada semana. Após um período preestabelecido. Mudas alongadas de abacaxi. ocorre borbulhamento e aeração do meio em contato com o material em cultivo. a produção de brotos foi sete vezes superior ao rendimento obtido pelo mesmo período em meio com agar. para cultivo de explantes de uva em meio líquido em frascos tipo Erlenmeyer. Após 90 dias de cultivo no meio de imersão temporária... no qual plântulas eram cultivadas em um grande recipiente com meio gelificado. Nesse equipamento. um aumento da matéria fresca de 38. 1993). o princípio da imersão temporária para cultivo de fragmentos vegetais relativamente grandes foi primeiramente descrito por Steward et al. em certa posição. (1991) desenvolve39 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento . de tal forma que. Segundo Harris & Mason (1983). Steward et al. (1993) foi modificado no que se refere à construção. prontas para serem cultura.1 mg em meio gelificado para 98. Atken-Christie & Jones (1987) utilizaram igualmente um sistema de cultivo em imersão temporária na propagação de Pinus.6 mg em meio líquido. após a tratava de deficiência de multiplicação e alongamento em biorreator de oxigenação do meio de imersão temporária. Pouco tempo depois. o qual movimentava os frascos de cultura de forma rotacional sobre uma roda. o meio é drenado e o explante deixa de ficar em contato direto com o meio de cultura. O estoque inicial de explantes era obtido através do cultivo. O meio permanecia em contato com o explante por 4 a 6 horas. apresentava o mesmo princípio relatado por Steward et al. Tisserat & Vandercook desenvolveram um sistema de cultivo em imersão temporária. no momento seguinte. Nesse tipo de biorreator. apresentando resultados muito bons (Alvard et al.. O modelo desenvolvido por Alvard et al. Após esse período. Etienne et al. o frasco tipo Erlenmeyer era mudado automaticamente de posição a intervalos predeterminados. em cultivo. O ar é expelido através de um orifício na tampa do compartimento superior. esse método de cultivo por imersão temporária mostrou ser muito superior aos cultivos em meios gelificados. por 28 dias. submersos no meio líquido. em biorreator de imersão temporária. Simonton et al. o meio de cultura permanece em contato com o explante por um período predeterminado. Aitken-Chistie & Davies (1988) desenvolveram um sistema semi-automático de cultivo sob imersão temporária. (1952) e relatado por Harris & Mason (1983). a qual era periodicamente cheia de meio de cultura. em meio de multiplicação esse problema.Figura 4. (1952) demonstraram que raízes de cenoura imersos em meio líquido não apresentavam crescimento satisfatório e concluíram que o motivo se Figura 5. Quando todo o meio passa para o compartimento superior. o meio nutritivo líquido era colocado sobre o meio sólido sobre o qual estavam os explantes. a pressão do ar no compartimento inferior é aliviada. em determinado momento.. O meio de cultura é colocado no compartimento inferior e o material a ser cultivado. Nesse sistema. os segmentos de raiz eram expostos ao ar e. Cabasson et al. que consistia de uma grande câmara de cultura. Embora o controle da troca gasosa fosse insatisfatório. com diferentes tipos de explantes..

nº 24. b) a montagem é simples e os componentes (válvulas solenóides. por 40 ex. de acordo com um esquema de tempo preestabelecido. várias modificações estão sendo introduzidas no sistema. como o uso de um frasco relativamente grande. cujo período pode ser definido pelo temporizador. etc. c) de difícil manipulação durante as fases de esterilização. montagem e funcionamento. para fins de patenteamento um sistema de biorreator tomando como base o modelo desenvolvido por Alvard et al. Nos primeiros ensaios. (1993) e Lorenzo et al. além de propiciar uma Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento . carga. em termos gerais. conexões metálicas. mangueiras de silicone.. Estão igualmente em andamento os primeiros testes de cultivo de células embriogênicas de café. Em ambos os casos. em experimentos de multiplicação para fins de comparação com o cultivo em meio líquido estacionário e em meio gelificado. o equipamento pode funcionar sob regime de borbulhamento contínuo com diferentes fluxos de ar ou sob borbulhamento temporário. nitrogênio e gás carbônico. Para isso. No momento.. Figura 6. o que é determinado pela extensão das tubulações. tipo de tampa. Plantas aclimatadas de abacaxi. multiplicadas em biorreator de imersão temporária ram um equipamento automático de micropropagação. são equipamentos: a) complexos. que permite uma grande versatilidade de uso. filtros de ar.c) o sistema foi desenhado para comportar diferentes números de frascos de cultivo. O equipamento apresenta as seguintes características não encontradas em outros modelos de biorreatores: a) o equipamento pode utilizar diferentes tipos de frascos. bem como pela potência do compressor ou da fonte de ar comprimido. transformação de um modelo de imersão contínua para imersão temporária e vice-versa. h) o equipamento pode ser utilizado tanto para cultivo de células e embriões. Entretanto. o sistema foi testado para cultivo de microestacas de batata para microtuberização e hastes de abacaxi visando à multibrotação e ao alongamento das mudas. d) o equipamento pode ser montado em diferentes ambientes de intensidade de luz.janeiro/fevereiro 2002 . formato. (1999) para gemas de abacaxi. ainda. não foram apresentados detalhes adicionais da construção e funcionamento desse tipo de biorreator. Os modelos de biorreatores de imersão contínua encontrados na literatura científica. os quais podem variar em tamanho. Uma modificação mais recente do modelo de biorreator de imersão temporária foi feito por Lorenzo et al. fonte de ar comprimido. temporizadores. Esse sistema utiliza dois frascos. Por ser um equipamento recémdesenvolvido. etc. Embora esse sistema tenha apresentado uma excelente performance quanto ao preciso controle da exposição do explante ao meio de cultura. Por sua vez. (1998).) podem ser de fácil aquisição ou feitura. (1998) para micropropagação de gemas de cana-de-açúcar e Escalona et al.. estão em andamento testes definitivos com hastes de abacaxi. do ponto de vista de montagem e funcionamento. os resultados preliminares foram excelentes. além de alguns problemas de contaminação especialmente do tipo bacteriana. f) no regime de imersão contínua. no qual o meio líquido era injetado sobre as plântulas em cultivo. como células e gemas. O meio de cultura é transferido de um frasco para o outro por meio de um vácuo de 250 mm de Hg. os modelos de imersão temporária são mais simples na sua concepção. descarga e troca do meio de cultura. de difícil manuseio. alguns problemas foram identificados. constituição. são necessários pequenos ajustes no equipamento. b) destinam-se apenas ao cultivo sob condições de imersão contínua. sob regime de imersão temporária. sendo um para cultivo do material vegetal e outro para estocagem do meio de cultura. e) o equipamento pode ser utilizado para cultivo em regime de imersão temporária ou contínua. não permitindo versatilidade no seu uso. fotoperíodo e temperatura. como novos e mais adequados tipos de frascos e tampas e novos sistemas de iluminação com vistas a ajustá-lo para cultivo de explantes específicos. fluxômetro. g) o equipamento permite fazer. uso de uma fonte de ar artificial com dosagens específicas de oxigênio. Sistema de Biorreator desenvolvido pela Embrapa A Embrapa-Recursos Genéticos e Biotecnologia desenvolveu e submeteu ao INPI. transparência. quanto para gemas e segmentos nodais e raiz.

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