Pesquisa

BIORREATORES
Fotos cedidas pelo autor

Biorreatores para células, tecidos e órgãos vegetais - Produção de mudas em larga escala
Introdução
João Batista Teixeira,
Ph.D., Biologia Celular batista@cenargen.embrapa.br Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia

A micropropagação é uma forma vegetativa de propagação de diferentes espécies de plantas por meio da técnica denominada cultura de tecidos. Essa técnica requer laboratórios bem estruturados e pessoal treinado. Em resumo, o procedimento envolve os seguintes passos: inicialmente, é feita a escolha da planta matriz e do tipo de material a ser utilizado, tais como

Figura 1. Sistema de biorreator de imersão temporária, desenvolvido pela Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia, utilizando tanque de ar comprimido

gemas, segmentos nodais, folhas, flores, etc. Em seguida, o material é desinfestado já em condições de laboratório em ambiente estéril, e introduzido em frascos igualmente estéreis, contendo meio de cultura esterilizado. Esse meio contém, todos os nutrientes necessários ao crescimento e desenvolvimento do material em cultivo, além de substâncias reguladoras de crescimento. Os frascos com o material são mantidos em salas

de crescimento, sob condições de temperatura, luminosidade e fotoperíodo adequados. Milhões de plantas são produzidas anualmente, em todo o mundo, por meio da micropropagação. Entretanto, esse método de multiplicação é altamente demandante de mão-de-obra e só em condições especiais tal procedimento deve ser utilizado. Basicamente, a escolha da micropropagação frente a outras formas de propagação baseia-se no valor venal da muda ou do produto a ser obtido pela muda micropropagada. A metodologia tradicional de micropropagação baseia-se em cultivos em pequenos frascos, com número reduzido de plântulas por frasco, e uso de meio nutritivo gelificado, o que acarreta intensa manipulação das culturas, e envolve, com isso um grande contingente de mão-de-obra especializada. Biorreatores podem ser conceituados como equipamentos para cultivo sob imersão temporária ou permanente de células, gemas, embriões ou qualquer tipo de propágulo que possa ser utilizado na micropropagação. Os biorreatores utilizam meio de cultura líquido, permitem a renovação do ar durante o cultivo, bem como o monitoramento de alguns parâmetros essenciais ao crescimento do propágulo, tais como pH, oxigênio dissolvido, temperatura, concentração de íons, etc. Os primeiros biorreatores derivaram dos equipamentos denominados fermentadores, os quais foram, há muitas décadas, desenvolvidos para cultivo de fungos e bactérias para fins industriais. Assim, os primeiros biorreatores testados para plantas continuaram sendo chamados de fermentadores, por serem utilizados basicamente para o cultivo de células vegetais isoladas, de forma mui-

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Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 24- janeiro/fevereiro 2002

O ar que entra no sistema é esterilizado ao ser forçado a passar através de uma membrana com poros de 0. 1988). Denchev et al. causa dano mecânico acentuado ao material em cultivo. bem como uma homogeneização satisfatória com um mínimo de dano mecânico do material em cultivo. É basicamente utilizado para células e embriões somáticos (Kessel & Carr . policarbonato. Para isso. sendo a Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento . A agitação é basicamente feita por meio de hélices conectadas a um eixo giratório. 1994). para haver uma boa homogeneização do meio. além da germinação das sementes sintéticas. bactérias e células vegetais (Takayama & Akita.22 a 0. os fermentadores foram empregados com pouca ou nenhuma modificação para o cultivo de células vegetais. utilizando bomba compressora de ar to parecida com o que era feito com os fungos e bactérias. os biorreatores tradicionais apresentam os seguintes componentes: frasco de cultivo. o que.. Nesse caso. aço inoxidável. modelo compacto de 4 pares de frascos. o frasco de cultivo gira suavemente em movimentos rotacionais sobre dois eixos.. Biorreatores para cultivo de células vegetais foram bastante estudados. 1994). Preil et al. que servem não apenas de apoio. pH e oxigênio (Takayama & Akita. combinada com o movimento de uma hélice no interior do frasco de cultivo (Takayama & Akita. Biorreator tipo tambor rotatório (“roller drum bioreactor”) Nesse tipo de biorreator. Akita & Takayama. os biorreatores começaram a ser utilizados para cultivo de células. tecidos. 20 ou até mesmo 300 litros já tenham sido utilizados. Constituição básica dos biorreatores A constituição dos biorreatores usados para cultura de embrião. e uma série de modelos específicos para plantas foram desenvolvidos. A grande desvantagem desse modelo de biorreator é que. Inicialmente. 1994). O frasco de cultura é desenhado de tal forma a permitir uma ótima aeração do meio de cultura.. ou maiores. bem como da diferenciação e encapslulamento dos embriões somáticos. Os biorreatores são aplicados igualmente à produção de embriões somáticos (Tautorus et al. Entretanto. embriões e plantas. tendo como objetivo final a produção de mudas em larga escala. mas que também são responsáveis por imprimir ao frasco de cultivo o movimento rotatório. gemas e plântulas. Recentemente. Os frascos podem ser feitos de vidro. bomba compressora de ar. Essa metodologia exige completo domínio sobre o processo de indução e seleção de calos embriogênicos. Biorreatores tipo aerador agitador (“aeration agitation bioreactor”) Esse tipo de biorreator é o mais parecido com os fermentadores convencionais. Sistema de biorreator. polipropileno ou qualquer outro material que suporte a autoclavagem a uma temperatura de 121 ° C durante 15 a 30 minutos.janeiro/fevereiro 2002 . Nesse tipo de biorreator. Principais tipos de biorreatores utilizados para cultivo de hastes caulinares e embrião Vários tipos de biorreatores têm sido desenvolvidos e utilizados ou têm potencial de uso em cultivo de gemas.mais comum a injeção de um fluxo de ar a uma determinada pressão. O primeiro relato sobre o uso de biorreatores para propagação vegetal foi primeiramente feito por Takayama e Misawa (1981) para micropropagação de begônia. Procedimentos similares foram adaptados para uma série de outras espécies vegetais (Noriega & Söndahl. os autores utilizaram segmentos nodais de plântulas estabelecidas in vitro. principalmente na década de 80.nº 24. a maioria dos frascos utilizados está na faixa de 1 a 4 litros (Takayama & Akita. Onishi et al. por onde circula água com temperatura pre-determinada. principalmente em hastes e gemas.. sensores de temperatura. 1994. gemas e hastes caulinares para fins de micropropagação é fundamentalmente a mesma dos equipamentos utilizados para cultivo de fungos. Basicamente. Esses biorreatores são classificados pelo tipo de agitação e construção do frasco (Takayama & Akita. embora volumes menores como 250 e 500 ml. 1994). 1994). para controle da temperatura de cultivo (Takayama & Akita.1972. 1993. 1992. Freqüentemente. A homogeneização do meio de cultura e a aeração do material em cultivo são feitos de diversas formas. o frasco de cultivo apresenta um envoltório metálico em forma de jaqueta. o dano mecânico é mínimo e é adequado ao 37 Figura 2. 1994). O tamanho do frasco de cultivo normalmente varia entre 1 e 20 litros.. 1994). 1992 e sementes sintéticas (Attree et al. motor elétrico conectado a um eixo que se estende até o interior do frasco.44 micras de diâmetro. 1994). seguindo protocolos de cultivos convencionais em meio gelificado. regra geral. é necessário que a hélice gire em velocidades suficientemente elevadas. pequenos ajustes foram feitos na taxa de renovação do ar e nas formas de agitação das células.

Esse tipo de biorreator funciona satisfatoriamente bem para propagação via embriogênese somática (Wheat et al. com células embriogênicas de café em cultivo cultivo de embriões e plantas. uma vez que há uma boa aeração e homogeneização do meio de cultura e pouco dano mecânico ao material em cultivo (Park et al. silicone. policarbonato ou polipropileno. em seguida. Pode ser de dois tipos: aeração simples ou coluna de bolha. Esse modelo de biorreator não apresenta problemas relacionados com o dano mecânico. A única diferença desse biorreator para o modelo anterior é que o borbulhamento de ar é feito dentro de um tubo centralizado no frasco de cultivo.. 1994). cormos e tubérculos (Takayama & Misawa. tecidos e órgãos porque não há dano mecânico nem agitação via borbulhamento. Esse modelo apresenta bons resultados. 1986). de células e tecidos. Takayama et al. o que pode comprometer o crescimento. Esse tipo de Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento . o material em cultivo permanece imerso continuamente no meio de cultura. Biorreator tipo borbulhamento (“air driven bioreactor”) O biorreator tipo borbulhamento apresenta uma constituição muito simples. 1983). esse tipo de aeração pode ser combinado com agitação suave do meio (Ishibashi et al. 1987). Detalhe dos frascos do biorreator. pulverizado sobre o material em cultivo é. Esse elemento é responsável igualmente pela homogeneização. o que pode ser contornado com a inclusão de um sistema de aeração via injeção de ar estéril. que pode ser de teflon. sobretudo. a hiperhidratação dos tecidos pode causar distúrbios fisiológicos sérios. Esses modelos 38 de biorreatores apresentam bons resultados no cultivo de hastes caulinares. que irão afetar o crescimento e desenvolvimento do material em cultivo. Biorreator de aeração simples e coluna de bolha (“bubble column bioreactor”) A relação altura/diâmetro de 1 a 2 define o biorreator de aeração simples e se a relação é 3 ou acima. entretanto. Biorreator do tipo fase gasosa (“gaseous phase bioreactor”) Esse modelo é equipado com um suporte perfurado sobre o qual o material em cultivo é posicionado. Entretanto. o nível de oxigenação só é adequado quando se utilizam meios de cultura com alta viscosidade (Tanaka et al. O inconveniente desse modelo é a não renovação do ar interno do frasco de cultivo. por Takayama & Misawa (1981). bem como pela aeração do material em cultivo. Biorretor de aeração por membrana porosa ao oxigênio (“oxygen permeable membrane aerator bioreactor”) O frasco de cultura desse tipo de biorreator contém uma canalização fina em forma de espiral feita de material poroso ao oxigênio. 1985). 1991). 1981. através do qual o oxigênio passa para o meio de cultura. bem como a aeração são feitos via borbulhamento de ar no fundo do frasco. com exceção daquele que utiliza um sistema de pulverização do meio.janeiro/fevereiro 2002 . a aeração é feita por sopramento do ar estéril sobre o meio de cultura. Esse modelo apresenta deficiência na aeração. órgãos e plântulas. Dependendo da espécie e do tipo de meio utilizado. drenado pela base de suporte e novamente bombeado e pulverizado a intervalos preestabelecidos (Ushiyama.biorreator apresenta excelentes resultados no cultivo de células. a homogeneização do meio de cultura fica prejudicada (Luttman et al. 1989).nº 24.. por onde o meio de cultura é descarregado (Styer. Biorreator do tipo sobre-aeração (“overlay aeration bioreactor”) Nesse modelo. o biorreator é do tipo coluna de bolha. A homogeneização do meio. Essa imersão contínua causa problemas de hiperhidratação dos tecidos. Esse modelo de biorreator foi desenvolvido e utilizado primeiramente na micropropagacão. bulbos. Biorreator tipo filtro rotatório (“spin filter biorreactor”) Biorreator de filtro rotatório apresenta um filtro conectado a um eixo central. 1984). Biorreator de imersão temporária Em todos os modelos descritos anteriormente.. Eventualmente. uma vez que não há nenhum tipo de agitação. Visando a eliminar ou a minimizar Figura 3. Biorreator do tipo levantamento de ar (“air lift bioreactor”) O meio de cultura nesse tipo de biorreator é movido de baixo para cima dentro de um tubo situado verticalmente no interior do frasco pelas bolhas de ar produzidas no fundo do frasco de cultivo. O meio de cultura.

Figura 4. não submerso. um superior e um inferior. o que. (1993) é constituído de um frasco de dois compartimentos. Atken-Christie & Jones (1987) utilizaram igualmente um sistema de cultivo em imersão temporária na propagação de Pinus. Nesse equipamento. Em 1985. Posteriormente. Na realidade.. com isso. O ar é expelido através de um orifício na tampa do compartimento superior. 1995. (1952) demonstraram que raízes de cenoura imersos em meio líquido não apresentavam crescimento satisfatório e concluíram que o motivo se Figura 5. no “auxophyton”. a produção de brotos foi sete vezes superior ao rendimento obtido pelo mesmo período em meio com agar. Esse procedimento era repetido a cada semana. para cultivo de explantes de uva em meio líquido em frascos tipo Erlenmeyer.. 1997. o meio nutritivo líquido era colocado sobre o meio sólido sobre o qual estavam os explantes. Etienne et al. Mudas alongadas de abacaxi.. o meio de cultura permanece em contato com o explante por um período predeterminado. Simonton et al. Tisserat & Vandercook desenvolveram um sistema de cultivo em imersão temporária. no qual plântulas eram cultivadas em um grande recipiente com meio gelificado. conseguindo. Visando a contoraclimatadas nar esse problema. em certa posição. permanecendo aí até que o ciclo recomece...nº 24. (1991) desenvolve39 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento . o frasco tipo Erlenmeyer era mudado automaticamente de posição a intervalos predeterminados. Pouco tempo depois.. por gravidade. Após esse período. foi desenvolvido um modelo de biorreator chamado de imersão temporária (Alvard et al. Nesse sistema.janeiro/fevereiro 2002 . apresentava o mesmo princípio relatado por Steward et al. Teisson et al. submersos no meio líquido. o meio era retirado através de uma bomba de vácuo. O modelo desenvolvido por Alvard et al. (1993) foi modificado no que se refere à construção. Nesse tipo de biorreator. Steward et al. Cabasson et al. de tal forma que. O meio de cultura é colocado no compartimento inferior e o material a ser cultivado. o meio é drenado e o explante deixa de ficar em contato direto com o meio de cultura. Segundo Harris & Mason (1983). Aitken-Chistie & Davies (1988) desenvolveram um sistema semi-automático de cultivo sob imersão temporária.. por 28 dias. O meio de cultura passa do compartimento inferior para o superior pela injeção de ar no compartimento inferior. Quando todo o meio passa para o compartimento superior. 1999). a pressão do ar no compartimento inferior é aliviada. faz com que o meio retorne ao compartimento inferior. o princípio da imersão temporária para cultivo de fragmentos vegetais relativamente grandes foi primeiramente descrito por Steward et al. com diferentes tipos de explantes. no momento seguinte. (1952). em biorreator de imersão temporária. no superior. de tal forma que. Após 90 dias de cultivo no meio de imersão temporária. Em seguida. O sistema RITA® vem sendo utilizado para uma série de espécies vegetais. o explante se encontrava submerso e. um aumento da matéria fresca de 38. O meio permanecia em contato com o explante por 4 a 6 horas. Etienne et al. ocorre borbulhamento e aeração do meio em contato com o material em cultivo. prontas para serem cultura. delinearam e construíram um equipamento que foi denominado “auxophyton”. (1952) e relatado por Harris & Mason (1983). que consistia de uma grande câmara de cultura. 1993). em cultivo. conectados entre si por um tubo. 1993.1 mg em meio gelificado para 98. apresentando resultados muito bons (Alvard et al. em outra posição. em meio de multiplicação esse problema. em meio gelificado com agar. em determinado momento. esse método de cultivo por imersão temporária mostrou ser muito superior aos cultivos em meios gelificados. 1995). a qual era periodicamente cheia de meio de cultura. com adição e remoção automática e periódica do meio líquido. após a tratava de deficiência de multiplicação e alongamento em biorreator de oxigenação do meio de imersão temporária. 1997. Após um período preestabelecido. o qual movimentava os frascos de cultura de forma rotacional sobre uma roda. O estoque inicial de explantes era obtido através do cultivo. mas mantendo as mesmas características de funcionamento. os segmentos de raiz eram expostos ao ar e. dando origem ao sistema de biorreator denominado RITA® (Teisson et al. O modelo desenvolvido por Alvard et al.6 mg em meio líquido. Hastes de abacaxi. um equipamento desenvolvido por Harris & Mason (1983). Embora o controle da troca gasosa fosse insatisfatório.

várias modificações estão sendo introduzidas no sistema. sob regime de imersão temporária. quanto para gemas e segmentos nodais e raiz. nitrogênio e gás carbônico. Para isso.. os resultados preliminares foram excelentes. b) a montagem é simples e os componentes (válvulas solenóides. (1999) para gemas de abacaxi. uso de uma fonte de ar artificial com dosagens específicas de oxigênio. fotoperíodo e temperatura. Figura 6. como células e gemas. (1998). sendo um para cultivo do material vegetal e outro para estocagem do meio de cultura. descarga e troca do meio de cultura. como o uso de um frasco relativamente grande. fluxômetro. que permite uma grande versatilidade de uso. transformação de um modelo de imersão contínua para imersão temporária e vice-versa. Os modelos de biorreatores de imersão contínua encontrados na literatura científica. cujo período pode ser definido pelo temporizador. formato. Estão igualmente em andamento os primeiros testes de cultivo de células embriogênicas de café. de acordo com um esquema de tempo preestabelecido. tipo de tampa. O meio de cultura é transferido de um frasco para o outro por meio de um vácuo de 250 mm de Hg. bem como pela potência do compressor ou da fonte de ar comprimido. carga. multiplicadas em biorreator de imersão temporária ram um equipamento automático de micropropagação.c) o sistema foi desenhado para comportar diferentes números de frascos de cultivo. c) de difícil manipulação durante as fases de esterilização. constituição. (1993) e Lorenzo et al. conexões metálicas. Plantas aclimatadas de abacaxi. b) destinam-se apenas ao cultivo sob condições de imersão contínua. (1998) para micropropagação de gemas de cana-de-açúcar e Escalona et al.. o que é determinado pela extensão das tubulações. Sistema de Biorreator desenvolvido pela Embrapa A Embrapa-Recursos Genéticos e Biotecnologia desenvolveu e submeteu ao INPI. Esse sistema utiliza dois frascos.janeiro/fevereiro 2002 . Por sua vez. e) o equipamento pode ser utilizado para cultivo em regime de imersão temporária ou contínua. fonte de ar comprimido. além de alguns problemas de contaminação especialmente do tipo bacteriana. f) no regime de imersão contínua. em experimentos de multiplicação para fins de comparação com o cultivo em meio líquido estacionário e em meio gelificado. No momento. filtros de ar. alguns problemas foram identificados. de difícil manuseio.nº 24. além de propiciar uma Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento . para fins de patenteamento um sistema de biorreator tomando como base o modelo desenvolvido por Alvard et al. Por ser um equipamento recémdesenvolvido. não foram apresentados detalhes adicionais da construção e funcionamento desse tipo de biorreator. temporizadores. por 40 ex. Nos primeiros ensaios. montagem e funcionamento. h) o equipamento pode ser utilizado tanto para cultivo de células e embriões.. g) o equipamento permite fazer. em termos gerais. transparência. o equipamento pode funcionar sob regime de borbulhamento contínuo com diferentes fluxos de ar ou sob borbulhamento temporário. os quais podem variar em tamanho. etc. como novos e mais adequados tipos de frascos e tampas e novos sistemas de iluminação com vistas a ajustá-lo para cultivo de explantes específicos. Em ambos os casos. mangueiras de silicone. são equipamentos: a) complexos. não permitindo versatilidade no seu uso. são necessários pequenos ajustes no equipamento. d) o equipamento pode ser montado em diferentes ambientes de intensidade de luz. os modelos de imersão temporária são mais simples na sua concepção. etc. Uma modificação mais recente do modelo de biorreator de imersão temporária foi feito por Lorenzo et al. Entretanto. estão em andamento testes definitivos com hastes de abacaxi. no qual o meio líquido era injetado sobre as plântulas em cultivo. Embora esse sistema tenha apresentado uma excelente performance quanto ao preciso controle da exposição do explante ao meio de cultura. O equipamento apresenta as seguintes características não encontradas em outros modelos de biorreatores: a) o equipamento pode utilizar diferentes tipos de frascos. do ponto de vista de montagem e funcionamento. o sistema foi testado para cultivo de microestacas de batata para microtuberização e hastes de abacaxi visando à multibrotação e ao alongamento das mudas.) podem ser de fácil aquisição ou feitura. ainda.

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