Pesquisa

BIORREATORES
Fotos cedidas pelo autor

Biorreatores para células, tecidos e órgãos vegetais - Produção de mudas em larga escala
Introdução
João Batista Teixeira,
Ph.D., Biologia Celular batista@cenargen.embrapa.br Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia

A micropropagação é uma forma vegetativa de propagação de diferentes espécies de plantas por meio da técnica denominada cultura de tecidos. Essa técnica requer laboratórios bem estruturados e pessoal treinado. Em resumo, o procedimento envolve os seguintes passos: inicialmente, é feita a escolha da planta matriz e do tipo de material a ser utilizado, tais como

Figura 1. Sistema de biorreator de imersão temporária, desenvolvido pela Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia, utilizando tanque de ar comprimido

gemas, segmentos nodais, folhas, flores, etc. Em seguida, o material é desinfestado já em condições de laboratório em ambiente estéril, e introduzido em frascos igualmente estéreis, contendo meio de cultura esterilizado. Esse meio contém, todos os nutrientes necessários ao crescimento e desenvolvimento do material em cultivo, além de substâncias reguladoras de crescimento. Os frascos com o material são mantidos em salas

de crescimento, sob condições de temperatura, luminosidade e fotoperíodo adequados. Milhões de plantas são produzidas anualmente, em todo o mundo, por meio da micropropagação. Entretanto, esse método de multiplicação é altamente demandante de mão-de-obra e só em condições especiais tal procedimento deve ser utilizado. Basicamente, a escolha da micropropagação frente a outras formas de propagação baseia-se no valor venal da muda ou do produto a ser obtido pela muda micropropagada. A metodologia tradicional de micropropagação baseia-se em cultivos em pequenos frascos, com número reduzido de plântulas por frasco, e uso de meio nutritivo gelificado, o que acarreta intensa manipulação das culturas, e envolve, com isso um grande contingente de mão-de-obra especializada. Biorreatores podem ser conceituados como equipamentos para cultivo sob imersão temporária ou permanente de células, gemas, embriões ou qualquer tipo de propágulo que possa ser utilizado na micropropagação. Os biorreatores utilizam meio de cultura líquido, permitem a renovação do ar durante o cultivo, bem como o monitoramento de alguns parâmetros essenciais ao crescimento do propágulo, tais como pH, oxigênio dissolvido, temperatura, concentração de íons, etc. Os primeiros biorreatores derivaram dos equipamentos denominados fermentadores, os quais foram, há muitas décadas, desenvolvidos para cultivo de fungos e bactérias para fins industriais. Assim, os primeiros biorreatores testados para plantas continuaram sendo chamados de fermentadores, por serem utilizados basicamente para o cultivo de células vegetais isoladas, de forma mui-

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Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 24- janeiro/fevereiro 2002

Nesse caso. Recentemente. 1994). sensores de temperatura. o que. O frasco de cultura é desenhado de tal forma a permitir uma ótima aeração do meio de cultura. tendo como objetivo final a produção de mudas em larga escala.. bem como da diferenciação e encapslulamento dos embriões somáticos. Os frascos podem ser feitos de vidro. o frasco de cultivo apresenta um envoltório metálico em forma de jaqueta. embora volumes menores como 250 e 500 ml.. 1994). Para isso.janeiro/fevereiro 2002 . tecidos.. a maioria dos frascos utilizados está na faixa de 1 a 4 litros (Takayama & Akita. Sistema de biorreator. 1992. combinada com o movimento de uma hélice no interior do frasco de cultivo (Takayama & Akita.1972. Akita & Takayama. Nesse tipo de biorreator. causa dano mecânico acentuado ao material em cultivo. policarbonato. seguindo protocolos de cultivos convencionais em meio gelificado. por onde circula água com temperatura pre-determinada. o frasco de cultivo gira suavemente em movimentos rotacionais sobre dois eixos. 1988). Onishi et al. Biorreatores para cultivo de células vegetais foram bastante estudados. Essa metodologia exige completo domínio sobre o processo de indução e seleção de calos embriogênicos.22 a 0. regra geral. A homogeneização do meio de cultura e a aeração do material em cultivo são feitos de diversas formas. 1994). e uma série de modelos específicos para plantas foram desenvolvidos. para haver uma boa homogeneização do meio.44 micras de diâmetro. 1994). motor elétrico conectado a um eixo que se estende até o interior do frasco. ou maiores. O primeiro relato sobre o uso de biorreatores para propagação vegetal foi primeiramente feito por Takayama e Misawa (1981) para micropropagação de begônia. Constituição básica dos biorreatores A constituição dos biorreatores usados para cultura de embrião. O ar que entra no sistema é esterilizado ao ser forçado a passar através de uma membrana com poros de 0. além da germinação das sementes sintéticas. modelo compacto de 4 pares de frascos.. bomba compressora de ar. Preil et al. pH e oxigênio (Takayama & Akita. principalmente em hastes e gemas. Esses biorreatores são classificados pelo tipo de agitação e construção do frasco (Takayama & Akita. que servem não apenas de apoio. os fermentadores foram empregados com pouca ou nenhuma modificação para o cultivo de células vegetais. 1994). 1994). Denchev et al. Entretanto. os autores utilizaram segmentos nodais de plântulas estabelecidas in vitro. utilizando bomba compressora de ar to parecida com o que era feito com os fungos e bactérias. 1994). É basicamente utilizado para células e embriões somáticos (Kessel & Carr . os biorreatores tradicionais apresentam os seguintes componentes: frasco de cultivo. para controle da temperatura de cultivo (Takayama & Akita. bem como uma homogeneização satisfatória com um mínimo de dano mecânico do material em cultivo. gemas e plântulas. bactérias e células vegetais (Takayama & Akita.. o dano mecânico é mínimo e é adequado ao 37 Figura 2. 1993.mais comum a injeção de um fluxo de ar a uma determinada pressão. 1994). Basicamente. Principais tipos de biorreatores utilizados para cultivo de hastes caulinares e embrião Vários tipos de biorreatores têm sido desenvolvidos e utilizados ou têm potencial de uso em cultivo de gemas. pequenos ajustes foram feitos na taxa de renovação do ar e nas formas de agitação das células. Freqüentemente. mas que também são responsáveis por imprimir ao frasco de cultivo o movimento rotatório. aço inoxidável. os biorreatores começaram a ser utilizados para cultivo de células. sendo a Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento . Inicialmente. 1994. Procedimentos similares foram adaptados para uma série de outras espécies vegetais (Noriega & Söndahl. polipropileno ou qualquer outro material que suporte a autoclavagem a uma temperatura de 121 ° C durante 15 a 30 minutos. O tamanho do frasco de cultivo normalmente varia entre 1 e 20 litros. embriões e plantas. gemas e hastes caulinares para fins de micropropagação é fundamentalmente a mesma dos equipamentos utilizados para cultivo de fungos.nº 24. A agitação é basicamente feita por meio de hélices conectadas a um eixo giratório. 1992 e sementes sintéticas (Attree et al. 20 ou até mesmo 300 litros já tenham sido utilizados. é necessário que a hélice gire em velocidades suficientemente elevadas. Os biorreatores são aplicados igualmente à produção de embriões somáticos (Tautorus et al. principalmente na década de 80. A grande desvantagem desse modelo de biorreator é que. Biorreatores tipo aerador agitador (“aeration agitation bioreactor”) Esse tipo de biorreator é o mais parecido com os fermentadores convencionais. Biorreator tipo tambor rotatório (“roller drum bioreactor”) Nesse tipo de biorreator.

bem como a aeração são feitos via borbulhamento de ar no fundo do frasco. policarbonato ou polipropileno. drenado pela base de suporte e novamente bombeado e pulverizado a intervalos preestabelecidos (Ushiyama. bulbos. Esse modelo apresenta deficiência na aeração. uma vez que não há nenhum tipo de agitação. o que pode comprometer o crescimento. sobretudo. Esse modelo de biorreator não apresenta problemas relacionados com o dano mecânico. por Takayama & Misawa (1981). o que pode ser contornado com a inclusão de um sistema de aeração via injeção de ar estéril. Biorreator do tipo levantamento de ar (“air lift bioreactor”) O meio de cultura nesse tipo de biorreator é movido de baixo para cima dentro de um tubo situado verticalmente no interior do frasco pelas bolhas de ar produzidas no fundo do frasco de cultivo. 1983). Visando a eliminar ou a minimizar Figura 3. a hiperhidratação dos tecidos pode causar distúrbios fisiológicos sérios. O inconveniente desse modelo é a não renovação do ar interno do frasco de cultivo. o biorreator é do tipo coluna de bolha. esse tipo de aeração pode ser combinado com agitação suave do meio (Ishibashi et al. uma vez que há uma boa aeração e homogeneização do meio de cultura e pouco dano mecânico ao material em cultivo (Park et al. Biorreator de aeração simples e coluna de bolha (“bubble column bioreactor”) A relação altura/diâmetro de 1 a 2 define o biorreator de aeração simples e se a relação é 3 ou acima. Detalhe dos frascos do biorreator. Esse tipo de biorreator funciona satisfatoriamente bem para propagação via embriogênese somática (Wheat et al. 1985). Esse elemento é responsável igualmente pela homogeneização. 1986). Entretanto. a aeração é feita por sopramento do ar estéril sobre o meio de cultura. através do qual o oxigênio passa para o meio de cultura. Esses modelos 38 de biorreatores apresentam bons resultados no cultivo de hastes caulinares. órgãos e plântulas. 1991). A única diferença desse biorreator para o modelo anterior é que o borbulhamento de ar é feito dentro de um tubo centralizado no frasco de cultivo.janeiro/fevereiro 2002 .nº 24. pulverizado sobre o material em cultivo é. A homogeneização do meio.biorreator apresenta excelentes resultados no cultivo de células. 1989). o material em cultivo permanece imerso continuamente no meio de cultura. 1981. Biorretor de aeração por membrana porosa ao oxigênio (“oxygen permeable membrane aerator bioreactor”) O frasco de cultura desse tipo de biorreator contém uma canalização fina em forma de espiral feita de material poroso ao oxigênio. Esse tipo de Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento . Pode ser de dois tipos: aeração simples ou coluna de bolha. 1984). Takayama et al. com células embriogênicas de café em cultivo cultivo de embriões e plantas. Biorreator do tipo sobre-aeração (“overlay aeration bioreactor”) Nesse modelo. Esse modelo apresenta bons resultados. por onde o meio de cultura é descarregado (Styer. silicone. Eventualmente. Esse modelo de biorreator foi desenvolvido e utilizado primeiramente na micropropagacão. Biorreator tipo filtro rotatório (“spin filter biorreactor”) Biorreator de filtro rotatório apresenta um filtro conectado a um eixo central. a homogeneização do meio de cultura fica prejudicada (Luttman et al.. em seguida.. Essa imersão contínua causa problemas de hiperhidratação dos tecidos. Biorreator de imersão temporária Em todos os modelos descritos anteriormente. que pode ser de teflon. 1994). com exceção daquele que utiliza um sistema de pulverização do meio. bem como pela aeração do material em cultivo. o nível de oxigenação só é adequado quando se utilizam meios de cultura com alta viscosidade (Tanaka et al. tecidos e órgãos porque não há dano mecânico nem agitação via borbulhamento. de células e tecidos. Dependendo da espécie e do tipo de meio utilizado. O meio de cultura.. Biorreator tipo borbulhamento (“air driven bioreactor”) O biorreator tipo borbulhamento apresenta uma constituição muito simples. Biorreator do tipo fase gasosa (“gaseous phase bioreactor”) Esse modelo é equipado com um suporte perfurado sobre o qual o material em cultivo é posicionado. cormos e tubérculos (Takayama & Misawa. entretanto. que irão afetar o crescimento e desenvolvimento do material em cultivo. 1987).

nº 24. O meio de cultura é colocado no compartimento inferior e o material a ser cultivado. os segmentos de raiz eram expostos ao ar e. o meio era retirado através de uma bomba de vácuo. foi desenvolvido um modelo de biorreator chamado de imersão temporária (Alvard et al. Nesse sistema. Cabasson et al. não submerso. Segundo Harris & Mason (1983). (1993) é constituído de um frasco de dois compartimentos. por 28 dias. de tal forma que.1 mg em meio gelificado para 98. O sistema RITA® vem sendo utilizado para uma série de espécies vegetais. Steward et al. em outra posição. o qual movimentava os frascos de cultura de forma rotacional sobre uma roda. (1991) desenvolve39 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento . após a tratava de deficiência de multiplicação e alongamento em biorreator de oxigenação do meio de imersão temporária. Esse procedimento era repetido a cada semana. Etienne et al. Nesse equipamento. que consistia de uma grande câmara de cultura. delinearam e construíram um equipamento que foi denominado “auxophyton”. no superior. Em 1985. de tal forma que. um superior e um inferior. no qual plântulas eram cultivadas em um grande recipiente com meio gelificado. apresentava o mesmo princípio relatado por Steward et al.. prontas para serem cultura. Embora o controle da troca gasosa fosse insatisfatório. submersos no meio líquido. faz com que o meio retorne ao compartimento inferior. em determinado momento. Hastes de abacaxi. esse método de cultivo por imersão temporária mostrou ser muito superior aos cultivos em meios gelificados. permanecendo aí até que o ciclo recomece. em cultivo. 1999). 1995. dando origem ao sistema de biorreator denominado RITA® (Teisson et al.. ocorre borbulhamento e aeração do meio em contato com o material em cultivo.Figura 4. o princípio da imersão temporária para cultivo de fragmentos vegetais relativamente grandes foi primeiramente descrito por Steward et al. o meio nutritivo líquido era colocado sobre o meio sólido sobre o qual estavam os explantes. a qual era periodicamente cheia de meio de cultura. O ar é expelido através de um orifício na tampa do compartimento superior. O modelo desenvolvido por Alvard et al. 1993. Simonton et al. 1997. a produção de brotos foi sete vezes superior ao rendimento obtido pelo mesmo período em meio com agar. Na realidade.. conseguindo. (1993) foi modificado no que se refere à construção.6 mg em meio líquido. a pressão do ar no compartimento inferior é aliviada. apresentando resultados muito bons (Alvard et al. (1952). um aumento da matéria fresca de 38.. O estoque inicial de explantes era obtido através do cultivo. em biorreator de imersão temporária. um equipamento desenvolvido por Harris & Mason (1983). Quando todo o meio passa para o compartimento superior.janeiro/fevereiro 2002 . o explante se encontrava submerso e. Teisson et al. 1995). o meio é drenado e o explante deixa de ficar em contato direto com o meio de cultura. em certa posição. conectados entre si por um tubo. o meio de cultura permanece em contato com o explante por um período predeterminado. em meio de multiplicação esse problema. Após esse período. mas mantendo as mesmas características de funcionamento. Atken-Christie & Jones (1987) utilizaram igualmente um sistema de cultivo em imersão temporária na propagação de Pinus. (1952) demonstraram que raízes de cenoura imersos em meio líquido não apresentavam crescimento satisfatório e concluíram que o motivo se Figura 5. com adição e remoção automática e periódica do meio líquido. Nesse tipo de biorreator. (1952) e relatado por Harris & Mason (1983).. Após um período preestabelecido. O modelo desenvolvido por Alvard et al. Tisserat & Vandercook desenvolveram um sistema de cultivo em imersão temporária. O meio de cultura passa do compartimento inferior para o superior pela injeção de ar no compartimento inferior. O meio permanecia em contato com o explante por 4 a 6 horas. 1993). com diferentes tipos de explantes. Mudas alongadas de abacaxi. 1997. Pouco tempo depois. em meio gelificado com agar. Aitken-Chistie & Davies (1988) desenvolveram um sistema semi-automático de cultivo sob imersão temporária. Após 90 dias de cultivo no meio de imersão temporária. o frasco tipo Erlenmeyer era mudado automaticamente de posição a intervalos predeterminados. para cultivo de explantes de uva em meio líquido em frascos tipo Erlenmeyer.. o que. com isso. no momento seguinte. Posteriormente. Etienne et al. Visando a contoraclimatadas nar esse problema. no “auxophyton”. Em seguida. por gravidade..

quanto para gemas e segmentos nodais e raiz. várias modificações estão sendo introduzidas no sistema. de acordo com um esquema de tempo preestabelecido. de difícil manuseio. Em ambos os casos. Nos primeiros ensaios. (1993) e Lorenzo et al. d) o equipamento pode ser montado em diferentes ambientes de intensidade de luz. além de alguns problemas de contaminação especialmente do tipo bacteriana. mangueiras de silicone. o sistema foi testado para cultivo de microestacas de batata para microtuberização e hastes de abacaxi visando à multibrotação e ao alongamento das mudas. O meio de cultura é transferido de um frasco para o outro por meio de um vácuo de 250 mm de Hg. sob regime de imersão temporária. que permite uma grande versatilidade de uso. transformação de um modelo de imersão contínua para imersão temporária e vice-versa. Estão igualmente em andamento os primeiros testes de cultivo de células embriogênicas de café. etc. Esse sistema utiliza dois frascos. Embora esse sistema tenha apresentado uma excelente performance quanto ao preciso controle da exposição do explante ao meio de cultura. como células e gemas. para fins de patenteamento um sistema de biorreator tomando como base o modelo desenvolvido por Alvard et al. Sistema de Biorreator desenvolvido pela Embrapa A Embrapa-Recursos Genéticos e Biotecnologia desenvolveu e submeteu ao INPI. em experimentos de multiplicação para fins de comparação com o cultivo em meio líquido estacionário e em meio gelificado. ainda. (1999) para gemas de abacaxi. g) o equipamento permite fazer. estão em andamento testes definitivos com hastes de abacaxi. no qual o meio líquido era injetado sobre as plântulas em cultivo. o que é determinado pela extensão das tubulações. Entretanto. Por ser um equipamento recémdesenvolvido. fluxômetro.janeiro/fevereiro 2002 .c) o sistema foi desenhado para comportar diferentes números de frascos de cultivo. carga. como novos e mais adequados tipos de frascos e tampas e novos sistemas de iluminação com vistas a ajustá-lo para cultivo de explantes específicos. O equipamento apresenta as seguintes características não encontradas em outros modelos de biorreatores: a) o equipamento pode utilizar diferentes tipos de frascos. Para isso. tipo de tampa. temporizadores. cujo período pode ser definido pelo temporizador. além de propiciar uma Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento . como o uso de um frasco relativamente grande. uso de uma fonte de ar artificial com dosagens específicas de oxigênio. os resultados preliminares foram excelentes. bem como pela potência do compressor ou da fonte de ar comprimido. o equipamento pode funcionar sob regime de borbulhamento contínuo com diferentes fluxos de ar ou sob borbulhamento temporário. f) no regime de imersão contínua.) podem ser de fácil aquisição ou feitura. os quais podem variar em tamanho. multiplicadas em biorreator de imersão temporária ram um equipamento automático de micropropagação. Plantas aclimatadas de abacaxi. Os modelos de biorreatores de imersão contínua encontrados na literatura científica. em termos gerais. formato. Figura 6. b) destinam-se apenas ao cultivo sob condições de imersão contínua. c) de difícil manipulação durante as fases de esterilização. nitrogênio e gás carbônico. (1998). por 40 ex. são equipamentos: a) complexos. fonte de ar comprimido. montagem e funcionamento. No momento. etc. conexões metálicas. b) a montagem é simples e os componentes (válvulas solenóides. são necessários pequenos ajustes no equipamento. h) o equipamento pode ser utilizado tanto para cultivo de células e embriões. Por sua vez. alguns problemas foram identificados.. constituição. descarga e troca do meio de cultura. não permitindo versatilidade no seu uso. não foram apresentados detalhes adicionais da construção e funcionamento desse tipo de biorreator. e) o equipamento pode ser utilizado para cultivo em regime de imersão temporária ou contínua. fotoperíodo e temperatura... sendo um para cultivo do material vegetal e outro para estocagem do meio de cultura. filtros de ar. os modelos de imersão temporária são mais simples na sua concepção. Uma modificação mais recente do modelo de biorreator de imersão temporária foi feito por Lorenzo et al. do ponto de vista de montagem e funcionamento.nº 24. transparência. (1998) para micropropagação de gemas de cana-de-açúcar e Escalona et al.

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