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Pesquisa

BIORREATORES
Fotos cedidas pelo autor

Biorreatores para células, tecidos e órgãos vegetais - Produção de mudas em larga escala
Introdução
João Batista Teixeira,
Ph.D., Biologia Celular batista@cenargen.embrapa.br Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia

A micropropagação é uma forma vegetativa de propagação de diferentes espécies de plantas por meio da técnica denominada cultura de tecidos. Essa técnica requer laboratórios bem estruturados e pessoal treinado. Em resumo, o procedimento envolve os seguintes passos: inicialmente, é feita a escolha da planta matriz e do tipo de material a ser utilizado, tais como

Figura 1. Sistema de biorreator de imersão temporária, desenvolvido pela Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia, utilizando tanque de ar comprimido

gemas, segmentos nodais, folhas, flores, etc. Em seguida, o material é desinfestado já em condições de laboratório em ambiente estéril, e introduzido em frascos igualmente estéreis, contendo meio de cultura esterilizado. Esse meio contém, todos os nutrientes necessários ao crescimento e desenvolvimento do material em cultivo, além de substâncias reguladoras de crescimento. Os frascos com o material são mantidos em salas

de crescimento, sob condições de temperatura, luminosidade e fotoperíodo adequados. Milhões de plantas são produzidas anualmente, em todo o mundo, por meio da micropropagação. Entretanto, esse método de multiplicação é altamente demandante de mão-de-obra e só em condições especiais tal procedimento deve ser utilizado. Basicamente, a escolha da micropropagação frente a outras formas de propagação baseia-se no valor venal da muda ou do produto a ser obtido pela muda micropropagada. A metodologia tradicional de micropropagação baseia-se em cultivos em pequenos frascos, com número reduzido de plântulas por frasco, e uso de meio nutritivo gelificado, o que acarreta intensa manipulação das culturas, e envolve, com isso um grande contingente de mão-de-obra especializada. Biorreatores podem ser conceituados como equipamentos para cultivo sob imersão temporária ou permanente de células, gemas, embriões ou qualquer tipo de propágulo que possa ser utilizado na micropropagação. Os biorreatores utilizam meio de cultura líquido, permitem a renovação do ar durante o cultivo, bem como o monitoramento de alguns parâmetros essenciais ao crescimento do propágulo, tais como pH, oxigênio dissolvido, temperatura, concentração de íons, etc. Os primeiros biorreatores derivaram dos equipamentos denominados fermentadores, os quais foram, há muitas décadas, desenvolvidos para cultivo de fungos e bactérias para fins industriais. Assim, os primeiros biorreatores testados para plantas continuaram sendo chamados de fermentadores, por serem utilizados basicamente para o cultivo de células vegetais isoladas, de forma mui-

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Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 24- janeiro/fevereiro 2002

seguindo protocolos de cultivos convencionais em meio gelificado. motor elétrico conectado a um eixo que se estende até o interior do frasco. gemas e plântulas. Nesse caso. bem como da diferenciação e encapslulamento dos embriões somáticos. Biorreator tipo tambor rotatório (“roller drum bioreactor”) Nesse tipo de biorreator. tecidos. causa dano mecânico acentuado ao material em cultivo. é necessário que a hélice gire em velocidades suficientemente elevadas. Basicamente. polipropileno ou qualquer outro material que suporte a autoclavagem a uma temperatura de 121 ° C durante 15 a 30 minutos. Inicialmente. Essa metodologia exige completo domínio sobre o processo de indução e seleção de calos embriogênicos. Procedimentos similares foram adaptados para uma série de outras espécies vegetais (Noriega & Söndahl. tendo como objetivo final a produção de mudas em larga escala. O ar que entra no sistema é esterilizado ao ser forçado a passar através de uma membrana com poros de 0. que servem não apenas de apoio. 1992 e sementes sintéticas (Attree et al. principalmente em hastes e gemas. 1994). sendo a Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento . os biorreatores tradicionais apresentam os seguintes componentes: frasco de cultivo. Biorreatores tipo aerador agitador (“aeration agitation bioreactor”) Esse tipo de biorreator é o mais parecido com os fermentadores convencionais. embora volumes menores como 250 e 500 ml. o dano mecânico é mínimo e é adequado ao 37 Figura 2. 1994). O frasco de cultura é desenhado de tal forma a permitir uma ótima aeração do meio de cultura. Nesse tipo de biorreator.1972. 1994). por onde circula água com temperatura pre-determinada. Constituição básica dos biorreatores A constituição dos biorreatores usados para cultura de embrião. 1994. sensores de temperatura. 1994). Freqüentemente. Os biorreatores são aplicados igualmente à produção de embriões somáticos (Tautorus et al. 20 ou até mesmo 300 litros já tenham sido utilizados. Recentemente. Principais tipos de biorreatores utilizados para cultivo de hastes caulinares e embrião Vários tipos de biorreatores têm sido desenvolvidos e utilizados ou têm potencial de uso em cultivo de gemas. regra geral. bactérias e células vegetais (Takayama & Akita. O primeiro relato sobre o uso de biorreatores para propagação vegetal foi primeiramente feito por Takayama e Misawa (1981) para micropropagação de begônia. gemas e hastes caulinares para fins de micropropagação é fundamentalmente a mesma dos equipamentos utilizados para cultivo de fungos. 1988). o frasco de cultivo gira suavemente em movimentos rotacionais sobre dois eixos.janeiro/fevereiro 2002 . a maioria dos frascos utilizados está na faixa de 1 a 4 litros (Takayama & Akita. A homogeneização do meio de cultura e a aeração do material em cultivo são feitos de diversas formas. os biorreatores começaram a ser utilizados para cultivo de células. É basicamente utilizado para células e embriões somáticos (Kessel & Carr . Onishi et al. e uma série de modelos específicos para plantas foram desenvolvidos. mas que também são responsáveis por imprimir ao frasco de cultivo o movimento rotatório. ou maiores. os autores utilizaram segmentos nodais de plântulas estabelecidas in vitro.. para controle da temperatura de cultivo (Takayama & Akita. A grande desvantagem desse modelo de biorreator é que. 1994). os fermentadores foram empregados com pouca ou nenhuma modificação para o cultivo de células vegetais.22 a 0. policarbonato. 1994). bem como uma homogeneização satisfatória com um mínimo de dano mecânico do material em cultivo. Preil et al. Biorreatores para cultivo de células vegetais foram bastante estudados. embriões e plantas. Akita & Takayama. combinada com o movimento de uma hélice no interior do frasco de cultivo (Takayama & Akita.nº 24. A agitação é basicamente feita por meio de hélices conectadas a um eixo giratório.. utilizando bomba compressora de ar to parecida com o que era feito com os fungos e bactérias. Para isso. pH e oxigênio (Takayama & Akita. modelo compacto de 4 pares de frascos.. 1992.. o que. o frasco de cultivo apresenta um envoltório metálico em forma de jaqueta. Os frascos podem ser feitos de vidro. Entretanto. 1994). Denchev et al. além da germinação das sementes sintéticas. aço inoxidável. 1994). principalmente na década de 80.mais comum a injeção de um fluxo de ar a uma determinada pressão. para haver uma boa homogeneização do meio. Sistema de biorreator. O tamanho do frasco de cultivo normalmente varia entre 1 e 20 litros. Esses biorreatores são classificados pelo tipo de agitação e construção do frasco (Takayama & Akita.. pequenos ajustes foram feitos na taxa de renovação do ar e nas formas de agitação das células.44 micras de diâmetro. bomba compressora de ar. 1993.

em seguida. bem como pela aeração do material em cultivo. que irão afetar o crescimento e desenvolvimento do material em cultivo. drenado pela base de suporte e novamente bombeado e pulverizado a intervalos preestabelecidos (Ushiyama. Takayama et al.. Biorreator de imersão temporária Em todos os modelos descritos anteriormente. Pode ser de dois tipos: aeração simples ou coluna de bolha. O meio de cultura. Biorreator do tipo sobre-aeração (“overlay aeration bioreactor”) Nesse modelo. que pode ser de teflon. 1981. Essa imersão contínua causa problemas de hiperhidratação dos tecidos. Esse tipo de biorreator funciona satisfatoriamente bem para propagação via embriogênese somática (Wheat et al. Biorretor de aeração por membrana porosa ao oxigênio (“oxygen permeable membrane aerator bioreactor”) O frasco de cultura desse tipo de biorreator contém uma canalização fina em forma de espiral feita de material poroso ao oxigênio. o que pode comprometer o crescimento. Biorreator tipo filtro rotatório (“spin filter biorreactor”) Biorreator de filtro rotatório apresenta um filtro conectado a um eixo central. Esses modelos 38 de biorreatores apresentam bons resultados no cultivo de hastes caulinares. a homogeneização do meio de cultura fica prejudicada (Luttman et al. entretanto. Visando a eliminar ou a minimizar Figura 3. Esse modelo de biorreator não apresenta problemas relacionados com o dano mecânico. com células embriogênicas de café em cultivo cultivo de embriões e plantas. cormos e tubérculos (Takayama & Misawa. o material em cultivo permanece imerso continuamente no meio de cultura. Eventualmente. Esse modelo apresenta deficiência na aeração. uma vez que há uma boa aeração e homogeneização do meio de cultura e pouco dano mecânico ao material em cultivo (Park et al. 1991).janeiro/fevereiro 2002 . Biorreator de aeração simples e coluna de bolha (“bubble column bioreactor”) A relação altura/diâmetro de 1 a 2 define o biorreator de aeração simples e se a relação é 3 ou acima. Entretanto. Esse elemento é responsável igualmente pela homogeneização. pulverizado sobre o material em cultivo é. A única diferença desse biorreator para o modelo anterior é que o borbulhamento de ar é feito dentro de um tubo centralizado no frasco de cultivo. 1985). sobretudo. 1983). 1984). com exceção daquele que utiliza um sistema de pulverização do meio. silicone. Detalhe dos frascos do biorreator. a hiperhidratação dos tecidos pode causar distúrbios fisiológicos sérios. Esse tipo de Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento . Biorreator do tipo levantamento de ar (“air lift bioreactor”) O meio de cultura nesse tipo de biorreator é movido de baixo para cima dentro de um tubo situado verticalmente no interior do frasco pelas bolhas de ar produzidas no fundo do frasco de cultivo. Esse modelo apresenta bons resultados. bem como a aeração são feitos via borbulhamento de ar no fundo do frasco. 1989).. através do qual o oxigênio passa para o meio de cultura. 1986). Biorreator do tipo fase gasosa (“gaseous phase bioreactor”) Esse modelo é equipado com um suporte perfurado sobre o qual o material em cultivo é posicionado. Esse modelo de biorreator foi desenvolvido e utilizado primeiramente na micropropagacão. por onde o meio de cultura é descarregado (Styer. A homogeneização do meio. de células e tecidos. o que pode ser contornado com a inclusão de um sistema de aeração via injeção de ar estéril. órgãos e plântulas. 1994). tecidos e órgãos porque não há dano mecânico nem agitação via borbulhamento. por Takayama & Misawa (1981). bulbos. policarbonato ou polipropileno.biorreator apresenta excelentes resultados no cultivo de células. a aeração é feita por sopramento do ar estéril sobre o meio de cultura. O inconveniente desse modelo é a não renovação do ar interno do frasco de cultivo.. Biorreator tipo borbulhamento (“air driven bioreactor”) O biorreator tipo borbulhamento apresenta uma constituição muito simples. esse tipo de aeração pode ser combinado com agitação suave do meio (Ishibashi et al.nº 24. o biorreator é do tipo coluna de bolha. o nível de oxigenação só é adequado quando se utilizam meios de cultura com alta viscosidade (Tanaka et al. 1987). Dependendo da espécie e do tipo de meio utilizado. uma vez que não há nenhum tipo de agitação.

o meio é drenado e o explante deixa de ficar em contato direto com o meio de cultura. após a tratava de deficiência de multiplicação e alongamento em biorreator de oxigenação do meio de imersão temporária. Atken-Christie & Jones (1987) utilizaram igualmente um sistema de cultivo em imersão temporária na propagação de Pinus. faz com que o meio retorne ao compartimento inferior. em certa posição. 1999). O meio de cultura é colocado no compartimento inferior e o material a ser cultivado. o princípio da imersão temporária para cultivo de fragmentos vegetais relativamente grandes foi primeiramente descrito por Steward et al. conseguindo. Posteriormente. ocorre borbulhamento e aeração do meio em contato com o material em cultivo. Em 1985. para cultivo de explantes de uva em meio líquido em frascos tipo Erlenmeyer. Em seguida. com diferentes tipos de explantes. um superior e um inferior. O modelo desenvolvido por Alvard et al.. O meio de cultura passa do compartimento inferior para o superior pela injeção de ar no compartimento inferior. (1993) é constituído de um frasco de dois compartimentos. por gravidade. Visando a contoraclimatadas nar esse problema. Etienne et al. a produção de brotos foi sete vezes superior ao rendimento obtido pelo mesmo período em meio com agar. apresentava o mesmo princípio relatado por Steward et al. Após esse período. Nesse equipamento. em determinado momento. com adição e remoção automática e periódica do meio líquido. apresentando resultados muito bons (Alvard et al.1 mg em meio gelificado para 98. (1991) desenvolve39 Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento . Etienne et al. em outra posição. de tal forma que. Tisserat & Vandercook desenvolveram um sistema de cultivo em imersão temporária. o meio era retirado através de uma bomba de vácuo. no momento seguinte. Na realidade. a qual era periodicamente cheia de meio de cultura. Após um período preestabelecido. um equipamento desenvolvido por Harris & Mason (1983).. no superior. que consistia de uma grande câmara de cultura. Segundo Harris & Mason (1983). dando origem ao sistema de biorreator denominado RITA® (Teisson et al. mas mantendo as mesmas características de funcionamento. O sistema RITA® vem sendo utilizado para uma série de espécies vegetais. 1993. esse método de cultivo por imersão temporária mostrou ser muito superior aos cultivos em meios gelificados. em cultivo. o qual movimentava os frascos de cultura de forma rotacional sobre uma roda. Embora o controle da troca gasosa fosse insatisfatório. (1952) demonstraram que raízes de cenoura imersos em meio líquido não apresentavam crescimento satisfatório e concluíram que o motivo se Figura 5. os segmentos de raiz eram expostos ao ar e. o que. (1952) e relatado por Harris & Mason (1983). O ar é expelido através de um orifício na tampa do compartimento superior. Aitken-Chistie & Davies (1988) desenvolveram um sistema semi-automático de cultivo sob imersão temporária. 1993).Figura 4. em biorreator de imersão temporária. Quando todo o meio passa para o compartimento superior. 1997. Hastes de abacaxi. por 28 dias.janeiro/fevereiro 2002 .nº 24. o meio de cultura permanece em contato com o explante por um período predeterminado. Esse procedimento era repetido a cada semana. no qual plântulas eram cultivadas em um grande recipiente com meio gelificado.6 mg em meio líquido.. Teisson et al.. 1995. conectados entre si por um tubo. 1995). Nesse tipo de biorreator. no “auxophyton”. permanecendo aí até que o ciclo recomece. o meio nutritivo líquido era colocado sobre o meio sólido sobre o qual estavam os explantes. com isso. um aumento da matéria fresca de 38. Nesse sistema.. O estoque inicial de explantes era obtido através do cultivo.. em meio de multiplicação esse problema. Steward et al.. foi desenvolvido um modelo de biorreator chamado de imersão temporária (Alvard et al. não submerso. submersos no meio líquido. Simonton et al. O meio permanecia em contato com o explante por 4 a 6 horas. Cabasson et al. (1993) foi modificado no que se refere à construção. 1997. de tal forma que. a pressão do ar no compartimento inferior é aliviada. Mudas alongadas de abacaxi. o frasco tipo Erlenmeyer era mudado automaticamente de posição a intervalos predeterminados. (1952). Pouco tempo depois. O modelo desenvolvido por Alvard et al. delinearam e construíram um equipamento que foi denominado “auxophyton”. em meio gelificado com agar. Após 90 dias de cultivo no meio de imersão temporária. o explante se encontrava submerso e. prontas para serem cultura.

fluxômetro. carga. Para isso. descarga e troca do meio de cultura. Por sua vez. O meio de cultura é transferido de um frasco para o outro por meio de um vácuo de 250 mm de Hg. formato. (1999) para gemas de abacaxi. Em ambos os casos. Uma modificação mais recente do modelo de biorreator de imersão temporária foi feito por Lorenzo et al. como células e gemas. como o uso de um frasco relativamente grande. várias modificações estão sendo introduzidas no sistema. são equipamentos: a) complexos. uso de uma fonte de ar artificial com dosagens específicas de oxigênio. o sistema foi testado para cultivo de microestacas de batata para microtuberização e hastes de abacaxi visando à multibrotação e ao alongamento das mudas. h) o equipamento pode ser utilizado tanto para cultivo de células e embriões. para fins de patenteamento um sistema de biorreator tomando como base o modelo desenvolvido por Alvard et al. quanto para gemas e segmentos nodais e raiz. O equipamento apresenta as seguintes características não encontradas em outros modelos de biorreatores: a) o equipamento pode utilizar diferentes tipos de frascos. não foram apresentados detalhes adicionais da construção e funcionamento desse tipo de biorreator. em experimentos de multiplicação para fins de comparação com o cultivo em meio líquido estacionário e em meio gelificado. do ponto de vista de montagem e funcionamento.c) o sistema foi desenhado para comportar diferentes números de frascos de cultivo. transparência. e) o equipamento pode ser utilizado para cultivo em regime de imersão temporária ou contínua. ainda. Entretanto.nº 24. b) a montagem é simples e os componentes (válvulas solenóides. Esse sistema utiliza dois frascos. Sistema de Biorreator desenvolvido pela Embrapa A Embrapa-Recursos Genéticos e Biotecnologia desenvolveu e submeteu ao INPI. além de alguns problemas de contaminação especialmente do tipo bacteriana. No momento. etc. de acordo com um esquema de tempo preestabelecido. Estão igualmente em andamento os primeiros testes de cultivo de células embriogênicas de café. bem como pela potência do compressor ou da fonte de ar comprimido. (1998).. temporizadores. (1998) para micropropagação de gemas de cana-de-açúcar e Escalona et al. não permitindo versatilidade no seu uso. g) o equipamento permite fazer. fotoperíodo e temperatura.) podem ser de fácil aquisição ou feitura. f) no regime de imersão contínua.. os modelos de imersão temporária são mais simples na sua concepção. (1993) e Lorenzo et al. filtros de ar. alguns problemas foram identificados. em termos gerais. c) de difícil manipulação durante as fases de esterilização. etc. que permite uma grande versatilidade de uso. além de propiciar uma Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento . de difícil manuseio. Os modelos de biorreatores de imersão contínua encontrados na literatura científica. cujo período pode ser definido pelo temporizador.. como novos e mais adequados tipos de frascos e tampas e novos sistemas de iluminação com vistas a ajustá-lo para cultivo de explantes específicos. b) destinam-se apenas ao cultivo sob condições de imersão contínua.janeiro/fevereiro 2002 . tipo de tampa. estão em andamento testes definitivos com hastes de abacaxi. o que é determinado pela extensão das tubulações. d) o equipamento pode ser montado em diferentes ambientes de intensidade de luz. sendo um para cultivo do material vegetal e outro para estocagem do meio de cultura. Por ser um equipamento recémdesenvolvido. montagem e funcionamento. conexões metálicas. constituição. o equipamento pode funcionar sob regime de borbulhamento contínuo com diferentes fluxos de ar ou sob borbulhamento temporário. Figura 6. nitrogênio e gás carbônico. os resultados preliminares foram excelentes. multiplicadas em biorreator de imersão temporária ram um equipamento automático de micropropagação. Embora esse sistema tenha apresentado uma excelente performance quanto ao preciso controle da exposição do explante ao meio de cultura. no qual o meio líquido era injetado sobre as plântulas em cultivo. mangueiras de silicone. transformação de um modelo de imersão contínua para imersão temporária e vice-versa. os quais podem variar em tamanho. por 40 ex. Nos primeiros ensaios. fonte de ar comprimido. Plantas aclimatadas de abacaxi. sob regime de imersão temporária. são necessários pequenos ajustes no equipamento.

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