Hibridizao de cidos nucleicos

Como identificar o clone de interesse numa biblioteca genmica?

Hibridizao: DNA/DNA , antgenoanticorpo (sonda molecular)

Como identificar a expresso de um gene?

Hibridao DNA/RNA

Caractersticas das sondas de cidos nucleicos

Transcrio em srie

Propriedades dos cidos nucleicos

Proporo de bases em vrios organismos

Padro de difrao de raio X do DNA

Rosalind Franklin

Possibilidades de pareamento das bases

Watson e Crick

Replicao acurada do DNA

Purina s se pareia com pirimidina 2 cadeias de polinucleotdeos so ligadas por pontes de Hidrognio (2 ou 3) Cadeias polinucleotdicas so antiparalelas

Temperatura de fuso (Tm)

Temperatura em que das fitas esto no estado nativo e denaturadas. Depende de:

Temperatura de fuso (Tm)

Temperatura em que das fitas esto no estado nativo e denaturadas. Depende de: 1. Contedo de GC 2. Comprimento da cadeia de DNA 3. Concentrao de ctions (Tm aumenta com o aumento na 4. Imperfeies no pareamento 5. Efeito formamida e uria (diminuio da Tm) 6. Efeito do pH
concentrao salina).

Efeito do pH
A Tm varia pouco entre pH 5,0 e 8,0. Acima de pH 13 o DNA se denatura. Efeito til para Southern Blot

Denaturao e renaturao do DNA

Denaturao (ou melting): alta temperatura, alto pH. Renaturao: Formao de duplex em condies subdenaturante (Marmur e Doty, 1960)

Princpio do

Southern Blot

Hibridizao em Southern Blot

Mutao da anemia falciforme gera um RFLP doena especfico

 Southern blotting:

anlise de DNA Northern blotting: anlise de mRNA Western blotting: anlise de proteina

Hibridizao em Northern Blot: Anlise de expresso gnica

Nick translation

Como marcar a sonda com radioistopos ?

Randon primer

Marcao das extremidades de oligonucleotdeos por quinase ou klenow

Ribossondas (sondas de RNA)

Hibridizao de colnias

Sonda molecular

Obteno de uma sonda de DNA a partir da seqncia proteica

Western blotting

Identificando seqncias alvo

Hibridizao em dot blot