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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE – CCS INSTITUTO DE BIOFÍSICA CARLOS CHAGAS FILHO – IBCCF CIÊNCIAS

BIOLÓGICAS: BIOFÍSICA FISIOLOGIA CELULAR – CFF223

Autofagia
• • Autofagia é induzida por sinais extracelulares e intracelulares. Este processo dinâmico envolve a formação e fusão de membranas, incluindo a formação autofagossomo, fusão autofagossomo-lisossomo, e degradação do conteúdo intra-autofagossomal por hidrolases lisossomais.

(Tanida, I., 2011)

. 2011) .Formação do autofagossomo • • • • Iniciação Maturação Fusão autofagossomo-lisossomo (vacúolo autofágico degradativo) Degradação – enzimas hidrolíticas lisossomais (Tanida. I.

T.. 2011) ..Conjugação do LC3 (Keiji. O. Yoshinori.

incluindo o Bax. . •As análises sequencial. promovem a autofagia por interromper. estrutural e funcional revelaram que Beclin 1 contém um domínio BH3.Beclin 1 •Beclin 1 interage com Bcl-2 e Bcl-xL para inibir a autofagia. que é responsável pela sua ligação com Bcl-2 e Bcl-xL. •Acredita-se que vários membros pró-apoptóticos da família Bcl-2. Bak e Bad. a interação entre Beclin e Bcl-2/Bcl-xL. competitivamente.

Estaurosporina induz autofagia seguida por apoptose •Número de autofagossomas foi aumentado em 3 h e reduzido a 12 h. •Aumento progressivo da LC3-II em 3-12 h e depois houve uma redução em 18 horas.redução da formação de autofagossoma e dos níveis de LC3-II. . •Bafilomycina A1 (BA1) .

•As características apoptóticas foram evidentes como observado pela coloração de anexina V/PI .Estaurosporina induz autofagia seguida por apoptose •O desaparecimento de autofagossomas e níveis reduzidos de LC3-II foram correlacionados com um aumento da apoptose.

Estaurosporina induz autofagia seguida por apoptose .

•A clivagem podia ser completamente inibida em células que superexpressam Bcl-2 . •Ao mesmo tempo. a ativação da caspase-3 foi detectável.Beclin 1 é clivada pela caspase-3 nos sítios 124 e 149 de aa •Produtos clivados da Beclin 1 começaram a ser mostrados em 3 h após o tratamento com estaurosporina.

•Os 2 dois produtos de clivagem podem ser completamente inibidos por z-VAD-fmk. .Beclin 1 é clivada pela caspase-3 nos sítios 124 e 149 de aa •A análise da sequência revelou que Beclin 1 tem dois sítios típicos de clivagem pela caspase nas posições 124 e 149.

asparaginas por alaninas nas posições 124 e 149 da Beclin 1. isoladamente ou em conjunto. mas não para D124/149A •Expressão de tipo selvagem e mutante duplo D124/149A em células HeLa tratadas com STS . •Caspase-3 ativada foi capaz de clivar qualquer dos D124A e D149A.Beclin 1 é clivada pela caspase-3 nos sítios 124 e 149 de aa •Substituição.

Mutantes Beclin 1 inibem autofagia celular •A formação de autofagossomas foi aumentada nas células que expressavam Beclin 1 selvagem em resposta à fome. •O nº de autofagossomas foi reduzido nas células que expressavam os outros mutantes. .

.Mutantes Beclin 1 inibem autofagia celular •A formação de autofagossomas foi aumentada nas células que expressavam Beclin 1 selvagem em resposta à estaurosporina. •O nº de autofagossomas foi reduzido nas células que expressavam os outros mutantes.

. •As células que superexpressam Bcl-2 foi utilizada como controle negativo.Mutantes Beclin 1 inibem autofagia celular •Grande parte do LC3-I foi convertido para LC3-II nas células que expressam o tipo selvagem Beclin 1. mas muito menos nas células expressando o mutante não-clivável D1-149 ou D150450.

Mutantes Beclin 1 aumentam a sensibilidade à morte celular •A ativação de caspase e da morte celular foram aumentadas nas células que expressam as formas truncadas de Beclin 1 quando comparadas com as das células Beclin 1 selvagem após tratamento com estaurosporina .

uma vez que se dá início a apoptose durante o tratamento com STS.A clivagem de Beclin 1 perturba a sua interação com Bcl-2 •A interação foi quase completamente interrompida. a interação entre a proteína Bcl-2 e D1149 não foi observada. •Na presença de z-VAD-fmk. •O mutante duplo não-clivável exibiu uma capacidade reduzida para interagir com Bcl-2 . •Embora D150-450 interaja a fracamente com Bcl-2. a dissociação Beclin 1/Bcl-2 foi amplamente bloqueada.

que podem ser restaurados pela reintrodução de Beclin 1 selvagem. .Os efeitos da Beclin 1 e seus mutantes na autofagia e apoptose em células Beclin KD •A formação do autofagossomo sob estimulação de estaurosporina foi reduzida em células Beclin 1 KD.

•A mudança de LC3-I a LC3-II pode ser recuperada por expressar um RNAi de Beclin 1 selvagem nas células. mas não D150-450. também aumentou ligeiramente o nível LC3-II .Os efeitos da Beclin 1 e seus mutantes na autofagia e apoptose em células Beclin KD •Beclin 1 KD apresentou um nível reduzido de LC3-II. •O mutante não clivável e D1-149.

Os efeitos da Beclin 1 e seus mutantes na autofagia e apoptose em células Beclin KD • wt Beclin 1 inibiu a morte celular enquanto que o mutante não-clivável aumentou a sensibilidade à estaurosporina. •D150-450 foi capaz de aumentar significativamente a morte de células na presença ou ausência de estaurosporina .

. •Os resultados oferecem novas perspectivas para a compreensão da interação de autofagia e apoptose.Discussão •Autofagia é uma das primeiras respostas de sobrevivência na apoptose de células competentes. •Existem 2 locais de clivagem da caspase-3 ao lado do domínio BH3 em Beclin 1. descobrimos que o produto N-terminal da Beclin 1 clivada (D150-450) por si só é suficiente para induzir a morte celular independente de qualquer estimulação apoptótica. •Surpreendentemente.