Vrus Entomopatognicos no

Pesquisa

BICHO DA SEDA
o Brasil, a sericicultura uma importante atividade agroindustrial que contribui substancialmente para a economia rural. O Pas o 4 produtor mundial de casulos verdes1 e de fios de seda. A cadeia produtiva da seda no Brasil apresenta um faturamento

Rose Meire Costa Brancalho

Profa. Dra. Departamento de Cincias Biolgicas UNIOESTE-Campus de Cascavel, CCBS/CCB Cascavel PR rosebrancalhao@uol.com.br

Fotos e ilustraes cedidas pela autora

Taxonomia e citopatologia causada por Nucleopolyhedrovirus em clulas de Bombyx mori

bruto anual da ordem de US$ 129 milhes, a maior parte na forma de divisas auferidas com exportaes, uma vez que 97% da produo de fios de seda destinado a esse mercado. O Paran o principal estado produtor, concentrando 83,59% da produo nacional. Atualmente, 241 municpios paranaenses so produtores de casulos verdes e 7.634 o nmero de criadores existentes nesses municpios, explorando uma rea de 34 mil hectares de amoreira, e gerando mais de 35.000 empregos diretos na zona rural (Watanabe et al., 2000). A atividade tem-se desenvolvido sobretudo nas pequenas propriedades rurais, onde predomina o trabalho familiar, representando uma alternativa importante para a melhoria da renda dessas propriedades e contribuindo de forma significativa para a diminuio do xodo rural. Somando-se a essas caractersticas, a sericicultura contribui para o desenvolvimento sustentvel do pas, em virtude de seu relevante aspecto social e por se tratar de atividade de baixo impacto no meio ambiente. A sericicultura abrange o cultivo da amoreira (Morus sp.), a produo e o preparo dos ovos, e a criao das lagartas do bicho-da-seda. Parte dessa fase do ciclo de vida do inseto conduzida por produtores rurais, produzindo os casulos que as indstrias transformam em fios e tecidos de seda. O bicho-daseda da amoreira, Bombyx mori (Lepidoptera: Bombycidae), contribui com 95% da produo total de fios de seda, utilizados na confeco de diferentes tipos de tecidos (Fonseca & Fonseca, 1986; Watanabe et al., 2000). Nos vrios estgios do seu ciclo de vida, o bicho-da-seda sensvel a doenas e ataques de pragas e parasitos. Entre

Fig. 1 - Corte histolgico do tecido gorduroso de lagartas de B. mori de 5 estdio, no 5 dia ps-inoculao com BmNPV. Colorao: Azan modificado. Observem-se vrias clulas em diferentes fases da infeco; os poliedros apresentam-se corados em vermelho no interior das clulas e no meio extracelular; 400 X. Em detalhe, A- ncleo hipertrofiado com os poliedros maduros (em vermelho), B- ncleo de clula gordurosa sadia processada da mesma maneira que o material infectado e utilizado como controle nos experimentos. Envoltrio nuclear (EN), citoplasma (C), membrana plasmtica (M); 1.000 X

Casulos verdes- casulos coletados pelo produtor, nos barraces de criao do bicho-da-seda e encaminhados aos entrepostos de compra das indstrias de fiao. Esses ainda apresentam as crislidas vivas. No entreposto, os casulos verdes so desidratados em um secador que mata as crislidas.
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Tabela 1- Sinais e sintomas observados nas lagartas de B. mori de 5 estdio, que caracterizam a doena causada por NPV. Dias de infeco 4-5 5-7 Sintomas mudana na colorao do tegumento (branco para branco-amarelado); diminuio na alimentao. inchao das membranas intersegmentais; parada na alimentao; comportamento alterado, busca de lugares mais altos e deslocamento aleatrio; rastro lquido leitoso; incio da morte de lagartas. fragilidade e ruptura do tegumento. incio do encasulamento e produo de casulos defeituosos.
infecta predominantemente, insetos holometbolos, particularmente os da ordem Lepidoptera. Taxonomicamente apresenta-se dividida nos gneros Nucleopolyhedrovirus (NPV) e Granulovirus (GV). Os NPV so constitudos por uma molcula de DNA de filamento duplo, que se asssocia com protenas do capsdeo formando o nucleocapsdeo (Bilimoria, 1991; Murphy et al., 1995). NPV podem abrigar partculas virais ou vrions contendo apenas um nucleocapsdeo por envelope, single (S), cujo gentipo conhecido como SNPV; ou vrios nucleocapsdeos por envelope multiple (M), no caso do gentipo MNPV. No Brasil, NPV infectando lagartas de B. mori foram detectados em 1976, por GATTI et al., e 1979, por ONGARELLI, ambos no estado de So Paulo. No estado do Paran, maior produtor de seda no Brasil, poucos so os trabalhos com o NPV. Assim sendo, o presente estudo foi desenvolvido para se verificar a ocorrncia de NPV, procedendo sua identificao taxonmica; utilizar o isolado geogrfico do BmNPV (Bombyx mori NPV) para anlise do seu ciclo reprodutivo em clulas alvos, atravs de estudos citopatolgicos. PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL Foram utilizadas lagartas hbridas do bicho-da-seda da amoreira, Bombyx mori, de 5 estdio ou instar, sadias e com suspeita de infeco viral. O material suspeito incluiu lagartas originalmente coletadas doentes e mortas. As coletas foram realizadas diretamente nos barraces de criao de produtores rurais, localizados nas regies Norte, Oeste e Sul do estado do Paran. Em laboratrio, as lagartas suspeitas de infeco foram armazenadas a temperatura de -4C. Para a pr-identificao do agente infeccioso, as lagartas suspeitas foram maceradas em gua destilada, sendo o macerado filtrado em algodo. Esse foi observado ao microscpio de luz para a
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os agentes patognicos j descritos, citam-se protozorios, vrus, fungos e bactrias. As doenas causadas por esses patgenos ocorrem em quase todas as reas de criao do mundo, e as doenas virais, quando no tomadas as medidas profilticas, so responsveis por quase 70% das perdas, representando mundialmente um srio problema para a sericicultura (Fonseca & Fonseca, 1986; Sengupta et al., 1990). Baculoviridae uma importante famlia de vrus entomopatognicos, que

Fig. 2- Microscopia eletrnica de transmisso de lagarta de B. mori de 5 instar, no 5 dia psinoculao com o BmMNPV. Visualiza-se, no ncleo de uma clula traqueal o incio da replicao do NPV, com formao do estroma virognico (EV). Cromatina (CR), envoltrio nuclear (EN) e citoplasma celular (C). Escala 1 m

verificao da presena ou no de corpos de ocluso de origem viral, atravs de preparaes rpidas, a fresco e corado pelo Azocarmin G (Brancalho, 2000). Confirmada a presena dos corpos de ocluso, esse macerado foi centrifugado por trs vezes a 2.000 rpm em microcentrfuga por 10 minutos, sendo descartados os sobrenadantes e o material restante ressuspendido em gua destilada a cada centrifugao. Aps esse tempo, os corpos de ocluso foram recolhidos, colocados em frascos esterilizados e armazenados a -10C at o momento de usar. O material resultante dessa semi-purificao, denominado inculo, foi pulverizado sobre folhas de amoreira a uma concentrao de 2,26 x 106 COP/ml (COP= corpos de ocluso polidricos), e essas folhas fornecidas na alimentao de lagartas sadias do 5 estdio. Os sintomas manifestados pelas lagartas doentes foram observados e anotados diariamente em fichas prprias. Em diferentes tempos ps-inoculao (durante onze dias com intervalos
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Fig. 3- Microscopia eletrnica de transmisso de lagarta de B. mori de 5 instar, no 5 dia psinoculao com o BmMNPV. Parte do ncleo de uma clula traqueal mostrando nucleocapsdeos no envelopados (NE), situados, preferencialmente, no interior do EV, e nucleocapsdeos envelopados (E), na periferia do EV e prximos ao envoltrio nuclear (EN). Envoltrio nuclear (EN), citoplasma celular (C), mitocndria (Mt). Escala 1 m

Fig. 4- Microscopia eletrnica de transmisso de lagarta de B. mori de 5 instar, no 5 dia ps-inoculao com o BmMNPV. Mostra, em detalhe, os nucleocapsdeos no envelopados (NE) e os nucleocapsdeos envelopados (E) ou vrions. Vrions em cortes longitudinal () e transversal (). Escala 0,1 m

RESULTADOS E DISCUSSO As observaes dirias das lagartas de B. mori revelaram uma srie de sintomas caractersticos (tabela 1) de doena causada por Nucleopolyhedrovirus (NPV) (Granados & Williams, 1986; Hanada & Watanabe, 1986; Fonseca & Fonseca, 1986; Sengupta et al., 1990; Adams & McClintock, 1991; Brancalho, 1998). As anlises citopatolgicas e histopatolgicas dos tecidos gorduroso e traqueal revelaram a presena de corpos de ocluso de forma polidrica, ou poliedros, no ncleo das clulas infectadas. Poliedros so estruturas virais caractersticas de duas famlias de vrus entomopatognicos, Baculoviridae (NPV) e Reoviridae (Cypovirus), que infectam B. mori. A ausncia de infeco no citoplasma das clulas permitiu a distino de infeco por NPV, pois Cypovirus se multiplica no citoplasma celular (Adams & McClintock, 1991; Murphy et al., 1995). Os poliedros foram detectados primeiro nas clulas do tecido gorduroso, a partir do 4 dia ps-inoculao com o

de vinte e quatro horas), as lagartas foram anestesiadas e dissecadas, o tecido gorduroso e traqueal foram rapidamente retirados e colocados no fixador. No estudo com a microscopia de luz foi utilizado o fixador DuBosq Brasil. Posteriormente, o material foi passado pelas etapas convencionais dos preparados histolgicos (Brancalho, 1998); e corado pela tcnica de Azan, modificada para corpos de ocluso virais, segundo Hamm (1966). Nos estudos ultra-estruturais, os tecidos foram mergulhados em soluo fixadora de Karnovsky refrigerada e reduzidos a fragmentos, de aproximadamente, 1 mm3. O processamento para microscopia eletrnica seguiu o protocolo descrito por Brancalho (1998). O fluxograma da metodologia descrita apresentado no esquema 1.

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Fig. 5- Microscopia eletrnica de transmisso de lagarta de B. mori de 5 instar, no 7 dia psinoculao com o BmMNPV. Parte do ncleo de uma clula traqueal mostrando os poliedros em formao (PI). Nucleocapsdeos no envelopados (NE) e nucleocapsdeos envelopados (E). Envoltrio nuclear (EN), citoplasma celular (C). Escala 1 m NPV. Os ncleos apresentavam-se hipertrofiados e em diferentes estgios da infeco, indicando uma replicao assincrnica do vrus (fig. 1). Nestes ncleos a primeira estrutura visvel o viroplasma ou estroma virognico (EV) (fig. 2), onde os nucleocapsdeos no-envelopados so produzidos e, posteriormente, adquirem o envelope formando os vrions (fig. 3). A figura 4 apresenta em detalhe o nucleocapsdeo no-envelopado e o nucleocapsdeo envelopado ou vrion. No desenvolvimento do processo infeccioso os vrions so ocludos dentro de um corpo de ocluso de forma polidrica, o poliedro (fig. 5). Nesta fase, o EV apresentava-se envolto por poliedros de tamanhos variados, representando diferentes estgios do desenvolvimento da estrutura polidrica, que cresce pelo acmulo e cristalizao contnuos da protena poliedrina (fig. 6). Cada poliedro apresentava-se constitudo por muitos vrions. Ao final do ciclo reprodutivo desse

Fig. 6- Microscopia eletrnica de transmisso de lagarta de B. mori de 5 instar, no 7 dia psinoculao com o BmMNPV. Mostra, em detalhe, o processo de formao do poliedro, onde os nucleocapsdeos envelopados (E) ou vrions agregam-se em torno da matriz densa, constituda de poliedrina (MT), que cresce conforme vai havendo a agregao de mais vrions. Escala 0,1 m

vrus, ocorre citlise e, conseqente, liberao dos poliedros j maduros na cavidade geral do corpo do inseto (fig. 7). Todas estas etapas so condizentes com a citopatologia da infeco causada por NPV (Granados & Williams, 1986; Adams & McClintock, 1991; Brancalho, 1998). Os dados ultra-estruturais revelaram a presena de um ou mais nucleocapsdeos por envelope (fig. 7, detalhe), caracterstica diagnstica para os MNPV (Granados & Williams, 1986; Blissard e Rohrmann, 1990; Adams e McClintock, 1991; Murphy et al., 1995). O MNPV um gentipo virulento, uma vez que maior o nmero de nucleocapsdeos por envelope (Tanada & Kaya, 1993). A virulncia desse isolado geogrfico do BmMNPV pode ser constatada pelo curto intervalo de tempo levado para o incio da morte das lagartas, a partir do 5 dia psinoculao e, pela morte de 80% das lagartas ao final dos experimentos. As 20% restantes construram casulos de baixa qualidade e, em sua maioria, mor-

reram na fase de pupa. Contudo, ressalta-se que este perodo que vai da infeco pelo baculovrus at a morte da lagarta doente , tambm, afetado por outros fatores, incluindo a idade da lagarta, as condies ambientais, a quantidade de vrus ingerido, a densidade populacional das lagartas, a disponibilidade de alimento e a incidncia de outros patgenos (Longworth, 1973; Granados & Williams, 1986; Hanada & Watanabe, 1986). Os poliedros so estruturas de resistncia, que persistem por longo tempo no meio ambiente (David, 1975; Longworth, 1973; Cianciarullo et al., 1977; Lewis & Rollinson, 1978; Blissard & Rohrmann, 1990; Adams & McClintock, 1991; Bilimoria, 1991). Assim, torna-se essencial, que ao se detectar a presena deste vrus, as lagartas infectadas sejam imediatamente eliminadas, pois uma vez doentes elas no se curam (Hanada & Watanabe, 1986). Alm disso, estas lagartas representam um foco potencial de vrus, eliminando poliedros infectivos atravs da boca, do nus e do tegumento rompido, na forma de um liquido leitoso. Este lquido , tambm, constitudo pela hemolinfa e por restos de clulas lisadas pelo vrus (Granados & Williams, 1986; Sengupta et al., 1990; Adams & McClintock, 1991; Bilimoria, 1991; Brancalho, 1998). Os poliedros eliminados aderemse facilmente s folhas da amoreira, possibilitando sua ingesto por lagartas sadias; e uma vez que a via oral a principal via de entrada dos NPV (Longworth, 1973; Sengupta et al., 1990; Vasconcelos, 1996), estes podem reiniciar seu processo infeccioso no novo hospedeiro. Soma-se a isto o deslocamento aleatrio e o geotropismo negativo exibido pelas lagartas infectadas, alteraes comportamentais comuns nas infeces pelo baculovrus, o que auxilia ainda mais na disperso da doena dentro dos barraces de criao (Granados & Williams, 1986; Hanada & Watanabe, 1986; Brancalho, 1998). O produtor rural deve ainda ter especial ateno com os resduos (restos de ramos da amoreira, fezes) da criao do bicho-da-seda. No aconselhvel seu uso, sem tratamento prvio, como adubo nas plantaes de amoreira, uma vez que os NPV podem, tambm, permanecer no solo de uma estao para outra e vir a ser reintroduzidos nos barraces de criao. O mesmo cuidado deve ser tomado na desinfeco de utenslios e do prprio barraco de criao.
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Fig. 7- Microscopia eletrnica de transmisso de lagarta de B. mori de 5 instar, no 7 dia ps-inoculao com o BmNPV. Mostra dois poliedros associados (irregulares), no meio extracelular, liberados aps a lise celular. No seu interior, aparecem nucleocapsdeos envelopados (vrions), em cortes longitudinal () e transversal (). Matriz do poliedro, constituda de poliedrina (MT). Escala 1 m. Em detalhe, aspectos de nucleocapsdeos envelopados individualmente (a), em par (b) ou em grupo de trs (c), o que permite classificar taxonomicamente como BmMNPV. Escala 0,1 m. A ultra-estrutura do vrion indicado em a, est representada diagramaticamente abaixo. No caso de a, no possvel individualizar o capsdeo

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