I Escola Brasileira de Inteligncia Artificial e Bioinformtica InBio So Carlos

Mdulo: Biologia Molecular

Responsvel: Dr. Flvio Henrique Silva

Uma atividade de difuso do:

- Dezembro de 2001 -

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ndice

Introduo ......................................................................................................................... 2 O cido Desoxirribonuclico DNA............................................................................... 2 O Dogma Central da Biologia Molecular ....................................................................... 5 Perpetuao da informao gentica (replicao) ......................................................... 7 Decodificando o DNA (Transcrio e Traduo)........................................................... 9 Manipulao do DNA ....................................................................................................... 11 Enzimas de restrio e vetores......................................................................................... 11 Amplificao do DNA in vitro: A reao em cadeia da polimerase PCR............. 13 Clonagem ........................................................................................................................... 15 de cidos nuclicos ........................................................................................................... 17 Seqenciamento de DNA.................................................................................................. 18 Utilizao da tecnologia do DNA recombinante ............................................................ 19 Produo de protenas ...................................................................................................... 19 Tipagem -DNA "fingerprint" .......................................................................................... 20 Aplicaes na medicina .................................................................................................... 22 Terapia Gnica .................................................................................................................. 23 Leitura Recomendada ...................................................................................................... 24

Nota: Esta apostila foi elaborada por alunos do curso de Introduo engenharia gentica da UFSCar (ano de 1999), com superviso, adaptaes e edies do Prof. Flvio Henrique Silva.

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Introduo
O cido Desoxirribonuclico - DNA Foi intuitivamente que o homem comeou a fazer uso da gentica a seu favor. J em 9000 A.C., mesmo sem compreender alguns conceitos, que seriam descobertos mais tarde, o homem selecionou as melhores sementes para o plantio e escolheu os animais mais vigorosos para a reproduo. Os primeiros filsofos da humanidade j falavam de alguns fenmenos genticos (sem saber a suas causas) e com o desenvolver da sociedade pessoas de todas as reas como mdicos, matemticos, fsicos, padres e filsofos, tambm contriburam com idias para o entendimento da hereditariedade. No sculo XVII, um monge Augustiniano chamado Gregor Mendel, deu o primeiro grande passo para desvendar a hereditariedade. Atravs da anlise dos cruzamentos entre ervilhas, Mendel deduziu a presena de fatores hereditrios que eram propagados de forma estvel de gerao a gerao, sendo responsveis pela formao de caractersticas individuais. Com o avano dos estudos de biologia celular, pde-se determinar quais os principais componentes moleculares da clula. Durante muito tempo as protenas carregaram o papel de propagadoras da informao hereditria. Em 1928, Frederick Griffth, um mdico londrino, em experimentos com Pneumococcus, clulas bacterianas causadoras de pneumonia, descobriu o fenmeno da transformao. Neste experimento foi mostrado que Pneumococcus patognicos, portadores de cpsulas, quando mortos por calor e colocados em contato com clulas de uma linhagem no encapsulada, e no patognica, era capaz de transformar as clulas no patognicas em clulas patognicas encapsuladas e letais (figura 1).

Figura 1- O experimento que levou Griffith a propor um "Princpio Transformante". Camundongos que recebiam a mistura de bactrias patognicas mortas e no patognicas vivas morriam por pneumonia e possuam clulas encapsuladas (patognicas em seu sangue). Alguns anos mais tarde, em 1942, Avery e colaboradores, baseados no experimento de Griffith, separaram o extrato celular em vrias fraes (protenas, DNA, RNA, lipdeos e carboidratos) e repetiram o experimento com os Pneumococcus. Apenas a frao contendo DNA recuperou a capacidade das bactrias formarem novamente a cpsula. A frao de DNA no perdia a sua capacidade transformante
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quando tratada com proteases ou quando era aquecido, todavia, o mesmo no valia para o tratamento com DNAse. Outro experimento que ajudou a confirmar que o DNA era o material gentico, foi o clssico experimento do liquidificador de Alfred Hershey e Martha Chase em 1952. Para esse experimento marcaram-se duas culturas de fagos T2, uma com fosfato radioativo (32P) e outra com enxofre radioativo (35S), sendo que o fosfato se incorporaria ao DNA e o enxofre s protenas. De infeces paralelas de E. coli com fagos marcados com enxofre e fosfato radioativos foram tiradas amostras em diferentes tempos e estas, foram agitadas em um liquidificador de forma a separar as cpsulas dos fagos das bactrias. Aps isso, as culturas foram centrifugadas, pois as cpsulas virais ficariam no sobrenadante e as clulas ficariam no precipitado. Foi constatado que grande parte do 32 P ficava na frao bacteriana, enquanto que a maior parte da frao protica ficava no sobrenadante. Dessa forma, Hershey e Chase constataram que o que passava para dentro da bactria, e que era responsvel pela formao dos outros fagos, era o DNA e no as protenas.

Figura 2- O experimento do liquidificador de Hershey e Chase para ajudar a confirmar que o DNA o responsvel pela hereditariedade. Apesar da constatao de que o DNA desempenhava um papel imprescindvel na hereditariedade, a comunidade cientfica ainda relutava um pouco para consider-lo como o carregador da informao gentica. Em 1953 James Watson e Francis Crick, baseados em vrios trabalhos da poca sobre o DNA (Como o trabalho de Chargaff, sobre a composio do DNA e as propores das bases e os trabalhos de Wilkins com
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difrao de raios-X de molculas de DNA), publicaram na revista cientfica Nature um trabalho denominado Molecular Structure of Nucleic Acids- A Structure for Deoxyribose Nucleic Acid (Estrutura molecular dos cidos nuclicos- Uma Estrutura para o cido Desoxirribonuclico), que descrevia a estrutura do DNA. Watson e Crick descreveram o DNA como uma dupla fita, enrolada em hlice ao redor de um eixo, sendo as fitas antiparalelas. O DNA possui uma estrutura peridica que se repete a cada 10 nucleotdeos. As bases nitrogenadas das duas fitas esto voltadas para o interior da hlice e pareiam de forma complementar entre si, na qual Adenina se liga a Timina e Guanina se liga a Citosina (figura 3).

Figura 3 - A ligao entre os nucleotdeos, A com T e C com G, e duas representaes da estrutura do DNA. Somente depois do modelo de Watson e Crick o DNA foi considerado o material gentico, pois sua prpria estrutura j dava fortes indcios de como ocorreria a sua propagao (Replicao) e como era guardada a informao gentica. No mesmo ano, Watson e Crick publicaram mais dois trabalhos falando sobre o assunto e em um deles, devido obviedade do seu modelo, so discutidas as implicaes moleculares do modelo na gentica, comentando sobre as mutaes e sobre a replicao. O reconhecimento final do trabalho de Watson e Crick veio em 1963 com o recebimento do Prmio Nobel.

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Figura 4 Os descobridores da estrutura do DNA: Watson ( direita) e Crick ( esquerda)

O Dogma Central da Biologia Molecular O dogma central define o paradigma da biologia molecular, em que a informao perpetuada atravs da replicao do DNA e traduzida atravs de dois processos: A transcrio que converte a informao do DNA em uma forma mais acessvel (uma fita de RNA complementar) e atravs da traduo que converte a informao contida no RNA em protenas (Figura 5).

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Figura 5. O Dogma Central da Biologia Molecular. A exceo a replicao retroviral, na qual o RNA viral molde para sntese do DNA do provrus.

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Perpetuao da informao gentica (replicao) A replicao o processo pelo qual uma molcula de DNA se duplica dando origem a duas molculas idnticas a molcula inicial e envolve um conjunto de protenas. O primeiro passo para a replicao do DNA a abertura das fitas, feita pela enzima helicase. Para manter as fitas desenroladas protenas chamadas SSBP (single strand binding protein) se ligam nas fitas recm-desenroladas evitando que se associem de novo. Com o desenrolamento das fitas em um ponto, as regies adjacentes sofrem um super-enrolamento, o que dificultaria a continuao do processo. As topoisomerases resolvem esse problema fazendo cortes em uma das fitas de DNA, que se desenrola, e religando-as, diminuindo a tenso provocada por esse superenrolamento. A sntese de novas fitas feita pela enzima DNA-polimerase, sendo que esta enzima no pode sintetizar outra fita a partir de nucleotdeos livres. Dessa forma, a DNA polimerase precisa de um Primer, que um pedao de RNA sintetizado por uma RNA polimerase especial chamada Primase (Figura 6).

Figura 6 Esquema mostrando o papel das protenas envolvidas na replicao. Em bactrias existem trs tipos de polimerases: A DNA polimerase I, possui baixa capacidade de polimerizao 5 3 e a nica que possui atividade exonuclesica 5 3em DNA dupla fita. A DNA polimerase II, possui uma capacidade de polimerizao baixssima e o seu papel na clula ainda no foi muito bem elucidado. A DNA polimerase III, a principal responsvel pela sntese das fitas de DNA devido a sua alta capacidade de polimerizao.

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Aps a sntese do primer de RNA, a DNA polimerase III pode comear a polimerizao no sentido 5 3. Alm da polimerizao, a DNA-polimertase III possui atividade exonuclesica 3 5, essa atividade permite que logo aps serem adicionados, os nucleotdeos sejam retirados e conferido se o seu pareamento est correto (A com T e C com G). Esta atividade chamada atividade Editorial. Como as fitas de DNA so antiparalelas, e a DNA polimerase caminha em um sentido no DNA, apenas uma das fitas ser sintetizada continuamente, e tem o nome de leading strand (fita contnua) e a outra fita ser sintetizada descontinuamente, chamada lagging strand(fita descontnua). A sntese da fita lagging feita em pequenas partes. O primer de RNA sintetizado e a fita lagging sofre um loop de forma que a polimerizao ocorre na mesma direo que ocorre a polimerizao da fita leading. Desta forma, a fita complementar fita lagging formada em pequenos fragmentos de aproximadamente 100 bases chamados fragmentos de Okazaki, que possuem esse nome devido ao seu descobridor, Reiji Okazaki. Logo aps a sntese das fitas pela DNA-polimerase III, entra em cena a DNApolimerase I, que retira os primers de RNA ( atividade exonuclesica 5 3) e os substitui por nucleotdeos de DNA (desoxinucleotdeos). Aps a substituio do primer, o primeiro nucleotdeo do fragmento de Okazaki no est ligado ao ltimo nucleotdeo do fragmento anterior, ento uma enzima chamada ligase catalisa essa ligao. Dessa forma, as duas fitas de DNA j esto terminadas e naturalmente se enrolam formando a dupla hlice. A replicao em eucariotos segue o mesmo padro, a maior das diferenas est nas polimerases que so cinco (, , , e ) sendo uma exclusivamente mitocondrial () e as outras quatro nucleares. As polimerases , e se correlacionam funcionalmente com as polimerases I, III e II de procariotos respectivamente.

Figura 7 - Esquemas mostrando como ocorre a replicao contnua e descontnua e o produto final da replicao
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Decodificando o DNA (Trancrio e Traduo): A Trancrio o processo de formao de uma fita de RNA complementar a uma regio do DNA. Os RNAs formados durante a transcrio podem ser de trs tipos: o RNAm (mensageiro) que aquele RNA que contm a seqncia que codifica uma protena; o RNAt (transportador) que carreia os aminocidos at os ribossomos e possibilita a leitura da informao contida no RNAm durante a traduo e o RNAr (ribossmico) que faz parte da estrutura dos ribossomos. A enzima responsvel pela transcrio a RNA polimerase, que nos procariotos nica, enquanto nos eucariotos elas so em trs (RNA pol I, II e III). Para iniciar a trancrio, a RNA polimerase deve reconhecer um local especfico onde comear a sntese. Esse local chama-se promotor. O reconhecimento da RNA polimerase aos promotores se d graas ao fator sigma, que liga-se RNA polimerase fazendo com que estas tenham maior afinidade com as seqncias promotoras. Os promotores contm seqncias consenso localizadas antes do incio da transcrio, a distncias especficas. Os promotores procariticos geralmente localizamse na regio 10 e 35 do incio da transcrio e as seqncias consenso mais conhecidas so o TATA box na regio 10 (TATAAT) e a seqncia TTGACA na regio 35. Existem vrios tipos de promotores e fatores sigma correspondentes e essa variedade que permite que as funes celulares possam ser reguladas mantendo o equilbrio das atividades celulares. Nos eucariotos, o processo de iniciao e regulao da transcrio muito mais complexo, envolvendo um nmero e diversidade maior de seqncias promotoras e de fatores de transcrio (anlogos ao fator sigma). A RNA polimerase liga-se ao promotor e inicia a sntese da fita de RNA complementar a fita molde at parar em uma regio chamada terminador, que tambm uma seqncia de consenso. Em procariotos, que no possuem envoltrio nuclear, a transcrio ocorre no mesmo lugar onde ocorre a traduo, dessa forma, to logo o RNA comece a ser formado, a traduo j se inicia. Por esse motivo diz-se que a transcrio e a traduo nos procariotos acoplada. Nos eucariotos a transcrio ocorre no ncleo e a traduo ocorre no citoplasma. O RNA recm sintetizado nos eucariotos ainda precisa passar por vrias modificaes antes de estar pronto (retirada dos ntrons, adio de uma cauda de poli Adenina, adio de 7-Metil Guanosina na primeira base do RNA e outras). A Traduo converte a informao na forma de trincas de nucleotdeos em aminocidos, que daro origem a uma protena. A transcrio ocorre em uma estrutura citoplasmtica chamada ribossomo, formada por vrias protenas e RNAr. O ribossomo dividido em duas subunidades, uma subunidade menor (30S em bactrias e 40S em eucariotos) e uma subunidade maior (50S em bactrias e 60S em eucariotos). Considerando o modelo bacteriano, o incio da traduo se d quando a subunidade 30S liga-se ao cdon de iniciao AUG (com raras excees, a traduo sempre comea no cdon AUG, correspondente a uma metionina) e logo em seguida o met-tRNA e a subunidade 50S ligam-se ao complexo 30S-RNAm, tudo isso com o auxlio de fatores de iniciao (IFs). O ribossomo reconhece a trinca correta da metionina, a iniciadora, atravs do pareamento de uma seqncia do RNAr 16S da subunidade menor com uma seqncia no RNAm que fica prxima ao incio da traduo chamada seqncia de Shine-Delgarno. O ribossomo possui dois sitios de entrada da RNAt, o stio P (peptdeo) e o stio A (aminocido). O primeiro RNAt entra no stio P e o segundo entra no A, algumas enzimas da subunidade 50S do ribossomo fazem a ligao do primeiro aminocido com
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o segundo, promovendo a ligao peptdica, dessa forma, no stio A ficar o segundo RNAt com um dipeptdeo. Atravs de um processo chamado translocao o ribossomo se desloca um cdon a frente de forma que o dipeptdeo-RNAt fica na stio P. A partir da, esse processo se repete, formando um tripeptdeo no stio A que translocado para o stio P formando assim sucessivamente a protena. A traduo termina quando o ribossomo encontra um cdon de terminao, que no codifica nenhum aminocido, so eles: UGA, UAG e UAA. A estes cdons se liga um fator para terminao da sntese (RF- Releasing Factor) Aps a traduo as protenas ainda tm que passar por algumas modificaes para que possam exercer adequadamente suas funes.

Figura 8 - Esquema mostrando a transcrio e a traduo em eucariotos.

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Manipulao do DNA
Enzimas de restrio e vetores. Quando se trata de biologia molecular, as enzimas de restrio e os vetores sempre estaro presentes, pois so usados em quase todos (se no em todos) os trabalhos dessa rea. As enzimas de restrio so enzimas que cortam o DNA em seqncias especficas. As enzimas de restrio fazem parte de um sistema celular de modificao e restrio que tem como funo proteger a clula contra DNAs estranhos. O sistema funciona da seguinte forma: Enzimas especficas metilam algumas bases em algumas seqncias especficas do DNA da clula e dentro dessa clula existem enzimas de restrio que reconhecem essas seqncias e clivam o DNA, a no ser que esteja metilado. Dessa forma, o DNA celular est a salvo das enzimas de restrio e qualquer DNA estranho que entre na clula e possua a seqncia de reconhecimento das enzimas de restrio ser clivado. Depois da descoberta desse sistema vrias enzimas de restrio de vrios organismos foram identificadas e hoje centenas so comercialmente avaliveis. A seguir uma tabela com alguns exemplos de enzimas de restrio, sua origem e seus stio de clivagem: (os espaos entre as bases mostram os pontos de corte). Tabela 1. Exemplos de enzimas de restrio e organismos de origem Denominao Origem Seqncia de reconhecimento 5 G AATTC 3 Eco RI Escherichia coli RY 13 3 CTTAA G 5 5 A AGCTT 3 Hind III Haemophilus influenzae Rd 3 TTCGA A 5 5 GGTAC C 3 Kpn I Klebsiela pneumoniae 3 C CATGG 5 5 C TCGAG 3 Xho I Xantomonas hilicola 3 GAGCT C 5 Vetores so o meio pelo qual pode-se artificialmente ou naturalmente, carrear informaes para dentro de um organismo. Os vetores mais comuns so os plasmdeos, os bacterifagos, os cosmdeos e os YACs (Yeast Artificial Cromossome - cromossomo artificial de levedura). Os plasmdeos so sem dvida, os vetores mais usados. Os plasmdeos so DNAs circulares, que existem naturalmente em bactrias todavia, plasmdeos foram manipulados pelo homem com vrias finalidades. Os plasmdeos geralmente possuem um gene de resistncia a um antibitico, uma regio de clonagem com stios de enzimas de restrio, para inserir DNAs de qualquer origem e uma origem de replicao para que esse plasmdeo possa se replicar dentro da clula. Os plasmdeos podem conter promotores de transcrio fortes para expressar protenas dentro de outros organismos, sendo chamados assim de plasmdeos de expresso (Figura 9 - Esse assunto ser tratado com mais detalhes em outra parte dessa apostila) .

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Figura 9. Exemplo de um plasmdeo contendo resistncia ao antibitico Kanamicina. O plasmdeo em questo utilizado para expresso de protenas heterlogas em bactrias. A protena expressa sob controle de um promotor viral (fago T7) e em fuso com a Glutationa S-Transferase, o que facilita processos posteriores de purificao.
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Os bacterifagos so vrus que infectam bactrias. Para serem utilizados como vetores do seu material gentico so retiradas determinadas seqncias que so substitudas pela seqncia de interesse. A molcula recombinante introduzida em fagos vazios que so ento utilizados para infectar bactrias e propagar o DNA de interesse. Os cosmdeos so muito semelhantes a plasmdeos, possuindo porm uma seqncia de fago, que possibilita seu posterior empacotamento em cpsulas virais. Diferente de plasmdeos, eles comportam insertos de tamanhos maiores, acima de 20 Kb. Os YACs so, como o nome j diz, cromossomos artificiais de leveduras e geralmente so usados quando se quer ter um grande pedao de DNA exgeno dentro de uma levedura. Possuem seqncias centromricas e telomricas para que funcione perfeitamente como um cromossomo. Amplificao do DNA in vitro: A reao em cadeia da polimerase - PCR O avano das tcnicas de Biologia Molecular tem revolucionado os conhecimentos sobre o genoma, incluindo o da espcie humana, quanto a sua estrutura, expresso e funo. Entretanto, um fator limitante sempre foi a pequena quantidade de material disponvel para o estudo. O mtodo para anlise de DNA proposto por Saiki e cols. em 1985, o da Reao em Cadeia da Polimerase (PCR), permitiu um grande avano neste sentido. Este mtodo tem como princpios bsicos a de oligonucleotdeos (primers) a regies especficas da molcula de DNA e a ao da DNA polimerase. A partir da tornou-se possvel amplificar um nmero ilimitado de seqncias alvo, as quais podem ser estudadas por mtodos convencionais de anlise do DNA. A tcnica de PCR tem por objetivo amplificar uma seqncia alvo especfica por meio de uma enzima termoestvel, in vitro. Neste mtodo utiliza-se alm desta enzima, os quatro nucleotdeos e um par de primers ( aproximadamente 20pb ) que flanqueiam a regio a ser amplificada. Estes primers so utilizados para direcionar a sntese do DNA, em ciclos repetidos. Em cada ciclo, as fitas servem de molde para a gerao de novas fitas, como ilustra a figura 10.

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Figura 10. Representao esquemtica da amplificao utilizando PCR.

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Cada ciclo se inicia com a desnaturao da dupla-hlice do DNA, elevado altas temperaturas (91-95 C), por aproximadamente 1 minuto. Esta etapa seguida da dos primers ao DNA molde, a temperaturas que variam de 53-65o C por 1 a 2 minutos, posteriormente ocorre a elongao de cadeia por ao da polimerase, em geral entre temperaturas de 65-72o C durante 2 a 5 minutos. O nmero de ciclos varia de acordo com o objetivo e condies utilizadas. At 1987, a tcnica da PCR era limitada principalmente devido instabilidade trmica da enzima, cuja atividade diminua com o calor, se fazendo necessrio sua reposio ao trmino de cada ciclo. Este problema foi solucionado com a utilizao de uma outra polimerase descoberta em Thermus aquaticus, a Taq DNA polimerase, que se apresenta extremamente estvel em altas temperaturas, dispensando novas adies a cada ciclo. Clonagem Uma das contribuies mais valiosas da tecnologia gentica para a pesquisa biolgica consiste na possibilidade de clonagem de seqncias de DNA. Para isto, um fragmento de DNA de qualquer origem incorporado em um plasmdeo pequeno, com o qual o hospedeiro (em geral a bactria Escherichia coli) ser transformado. Este plasmdeo, incluindo o fragmento de DNA nele incorporado, se reproduz no hospedeiro, originando um certo nmero de cpias de si e conseqentemente do DNA estranho. O uso de enzimas de restrio um dos passos essenciais desta tcnica; com elas o preparado de DNA em questo cortado em fragmentos precisamente definidos. Se a enzima de restrio usada for do tipo que corta as duas fitas do dplex assimetricamente, os fragmentos por ela originados possuiro extremidades em fita nica, com seqncias complementares idnticas. Em temperaturas fisiolgicas, os cortes realizados pela enzima de restrio nas fitas de DNA, mesmo que deslocadas algumas bases, causam uma quebra irreparvel no dplex: as poucas pontes de hidrognio restantes no so o bastante para manter os fragmentos juntos. Em temperaturas mais baixas, quando o movimento trmico das molculas menor, algumas poucas pontes de hidrognio j so suficientes para manter a unio da estrutura. A conseqncia prtica disso que os fragmentos, s por resfriamento se colam uns aos outros devido a renaturao das curtas extremidades em fita nica (resultado da clivagem por enzimas de restrio). Por intermdio da enzima ligase, a continuidade dessas fitas pode ser restaurada juntando dessa forma duas fitas de DNA de origens diferentes. Quando junta-se um pedao qualquer de DNA a um plasmdeo, mantendo a possibilidade de se propagar indefinidamente este DNA, d-se o nome de clone,. Nem sempre a eficincia com que o DNA a ser clonado incorporado ao plasmdeo satisfatria. Por isso desenvolveram-se diferentes sistemas seletivos para as situaes desejadas. Por exemplo, pode-se escolher como veculo de clonagem um plasmdeo contendo um fator de resistncia a um antibitico, de modo que, em meio contendo o antibitico em questo, somente os hospedeiros que aceitaram o plasmdeo com o fator de resistncia podem formar colnias. O plasmdeo com o fator de resistncia para ser interessante neste caso tem que estar carregando o DNA a ser clonado. Para se distinguir entre veculos com ou sem o DNA exgeno, lana-se mo de um outro fator no plasmdeo localizado no ponto de ao da enzima de restrio. Se a estrutura anelar do plasmdeo for restaurada e o gene indicador voltar a sua funo normal, ento o veculo est sem o DNA estranho; porm se o fragmento de DNA tiver sido inserido nesse ponto, o gene indicador perde sua funo. Para este segundo
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indicador pode-se utilizar outra resistncia a antibiticos: as colnias crescidas no primeiro meio seletivo podem ser transferidas para outro meio, pela tcnica de carimbo, testando assim sua resistncia ao segundo antibitico. Hoje vrios outros mtodos foram desenvolvidos para se confirmar a presena de um fragmento inserido em um plasmdeo, todavia, a maioria se baseia nesse princpio de possuir um gene indicador no stio de restrio onde ser feita a clonagem. Recentemente tm-se utilizado genes suicidas, os quais, se no forem interrompidos por um DNA clonado, produziro protenas txicas para a clula. Portanto, apenas sero viveis colnias portando plasmdeos recombinantes. A primeira clonagem foi feita no ano de 1973 por Stanley Cohen e Herbert Boyer, e inicialmente as clonagens eram feitas usando-se como inserto fragmentos de DNA resultantes de clivagem de DNAs totais, dessa forma, o rendimento das clonagens era muito baixo. A tcnica de PCR veio como um grande aliado para a clonagem, pois com ela, pode-se clonar amplificaes, aumentando assim o rendimento (devido ao aumento no nmero de insertos) e a confiabilidade do experimento. Vrias tcnicas utilizam essa ferramenta, entre elas pode-se citar o seqnciamento de DNA e a produo de protenas em laboratrio, que sero explicadas em outros captulos dessa apostila.

Figura 11 Esquema mostrando a clonagem de um fragmento de DNA em um plasmdeo usando-se a enzima Eco RI.
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Hibridao de cidos nuclicos DNAs com seqncias de bases especficas podem ser identificados por uma tcnica desenvolvida por Edwin Southern conhecida como Southern Blotting. Essa tcnica baseia-se em fazer uma eletroforese em gel, e transferir o DNA, na forma de fita simples, do gel de eletroforese para uma membrana de nitrocelulose ou nylon (que possui afinidade por DNA), que ser uma rplica do gel. Essa transferncia feita em meio alcalino para desnaturar o DNA, deixando-o assim em fita simples. Essa membrana, que contm o DNA desnaturado, ento colocada em contato com fragmentos de DNA, complementares a seqncia alvo, marcados com fsforo radioativo ou fosfatase alcalina. Esses fragmentos marcados, chamados sondas, hibridaro nas suas regies complementares e quando a membrana for lavada, apenas as sondas hibridadas permanecero na membrana. Essa membrana ento colocada em contato com um filme fotogrfico, que apresentar marcas na altura das bandas que contiverem a seqncia alvo, devido as sondas que emitem radiao (no caso das marcadas com fsforo radioativo) ou algum outro comprimento de onda capaz de marcar o filme fotogrfico (outros tipos de marcao de sondas). Seqncias de RNAs podem tambm ser detectadas por uma tcnica, que usa o mesmo princpio chamada Northern Blotting; assim como protenas que podem ser detectadas usando-se seus anticorpos como sonda na tcnica chamada Western Blotting ou Imunoblotting. A Hibridao uma tcnica muito utilizada em laboratrios de biologia molecular. Suas aplicaes vo desde tipagem de indivduos (teste de paternidade, identificao de criminosos) at a descoberta de novos genes envolvidos nos mais diversos processos celulares.

Figura 12 Esquema mostrando o procedimento da tcnica de Hibridao.

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Seqenciamnto de DNA Antes de 1975, pensar em tentar seqenciar cromossomos era praticamente inconcebvel. Na melhor das hipteses, era uma tarefa trabalhosa requerendo muitos anos de trabalho. No final de 1976, o cromossomo inteiro do fago X174, de 5.387 nucleotdeos tinha sido seqenciado. Hoje possvel obter as seqncias de nucleotdeos de genes de cromossomos eucariticos inteiros, e estes dados so armazenados em bancos de dados em computadores para referncia posterior. Foi desenvolvido nesta poca, quase que simultaneamente, duas tcnicas que promoveram uma revoluo na "arte" de seqenciar DNA. O desenvolvimento de outras tcnicas, como a descoberta de enzimas de restrio (uso na preparao de segmentos especficos de cromossomos); o aperfeioamento da eletroforese em gel at o ponto em que fragmentos de DNA que diferem em comprimento por um nico nucleotdeo pudessem ser resolvidos, e o desenvolvimento de tcnicas de clonagem de genes (preparao de grandes quantidades de um determinado gene ou seqncia de DNA de interesse) viabilizaram o seqenciamento. Em 1975, F. Sanger e colaboradores desenvolveram um mtodo enzimtico com terminadores de cadeia especficos, para gerar quatro populaes de fragmentos que terminam em As,Gs, Cs e Ts, respectivamente. O mtodo de Sanger utiliza de terminadores de cadeia chamados de 2'3'didesoxinucleotdeos trifosfatos. As DNA polimerases necessitam de um OH- 3' livre na fita de DNA iniciadora. Se um 2' 3' didesoxinucleotdeo adicionado extremidade de uma cadeia, ele ir bloquear a extenso subseqente desta cadeia, uma vez que os 2' 3' dideoxinucleotdeos possuem um grupo OH- 3' trocado por um H. O seqenciamento feito da seguinte maneira: Quatro reaes so feitas em paralelo, cada uma delas contendo um dos quatro terminadores de cadeia 2', 3'-didesoxi: ddGTP,ddATP, ddCTP e ddTTP. As quatro reaes contm: uma fita molde (simples fita), a seqncia de nucleotdeos a ser determinada, uma fita iniciadora com uma hidroxila 3 livre (normalmente obtida por sntese qumica), os quatro precursores de DNA: dGTP, dATP, dTTP e dCTP, um deles pelo menos radioativo (32P -dCTP ), e o "fragmento Klenow"da DNA polimerase I de E. Coli. O "fragmento Klenow"representa 2/3 DNA polimersica I de E.Coli produzido por clivagem com enzima proteoltica tripsina. O fragmento possui as atividades polimersica 5' 3' e exonuclesica 3' 5' da DNA polimerase I, mas no possui atividade exonuclesica 5' 3'. Esta atividade exonuclesica 5' 3' critica para a tcnica, pois se esta atividade estiver presente, ela ir reduzir a fita iniciadora a partir da extremidade 5'. O importante nesta tcnica de seqenciamento usar a relao correta do didesoxirribonucleosdeo trifosfato normal (por exemplo, dGTP na reao 1) e de didesoxirribonucleosdeo trifosfato terminador (por exemplo ddGTP na reao 1),de modo a obter uma populao de cadeias nascentes terminando em todas as posies de nucleotdeos possveis (por exemplo,em todos os Cs de fita-molde na reao 1). A relao de 100 desoxirribonucleosdeos trifosfatos para 1 didesoxirribonucleosdeo trifosfato normalmente d a freqncia de terminao desejada em cada stio potencial de terminao. Os produtos das quatro reaes so ento separados por eletroforese em gel de poliacrilamida e as posies dos produtos de reao radiativos (cadeias nascentes de DNA) so determinadas por autorradiografia. Uma vez que as cadeias menores migram distncias maiores no gel, a seqncia de nucleotdeos definida pelas cadeias nascentes
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dada pela leitura na direo 5 do gel.

3 , a partir da parte de baixo (anodo) at o topo (catodo)

Figura 13 - Esquema mostrando como feito o seqnciamento de DNA pelo mtodo dos desoxirribonucleotdeos desenvolvido por Sanger Atualmente no so utilizados nucleotdeos radioativos. Os didesoxinucleotdeos so marcados com substncias fluorescentes que emitem em comprimentos de onda diferentes. Desta forma, os fragmentos que incorporam estes nucleotdeos podem ser identificados aps excitao com laser e identificao de cada fluorescncia. Isso possibilita que a reao seja feita em um nico tubo. Alm disso, so utilizadas enzimas termoestveis em substituio Klenow e T7 DNA polimerase. A reao, que no uma amplificao, apenas extenso, realizada de forma cclica. Isso faz com que possam ser obtidas seqncias a partir de uma quantidade menor de DNA e tambm auxilia no seqenciamento de regies que possuem estruturas que, em temperaturas mais baixas, impedem a ao das polimerases. A utilizao de temperaturas mais altas (70oC) evita este problema. Atualmente so utilizados seqenciadores automticos que permitem a realizao de seqncias em larga escala.

Utilizao da tecnologia do DNA recombinante

Produo de protenas A produo de protenas em laboratrio uma tcnica que vem sendo cada vez mais utilizada. Essa produo feita atravs de uma tcnica chamada expresso heterloga, que consiste em produzir em um organismo protenas originrias de outros (Ex: produo de hormnios humanos em leveduras). Para modificar esses organismos, normalmente utiliza-se de plasmdeos como vetores. Esses vetores devem possuir algumas caractersticas desejveis: um promotor de transcrio
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forte, especfico para o organismo que produzir a protena, que funcionar somente na presena de alguma substncia indutora (IPTG, Metanol, Celulose, Arabinose, etc); um gene de seleo, que confere uma caracterstica diferencial entre as clulas com e sem o vetor (crescimento em meio mnimo, resistncia a antibiticos, etc) e um stio para clonagem. Em um sistema bastante utilizado, a fase aberta de leitura do gene que codifica a protena a ser produzida clonada no vetor, aps o promotor forte e uma seqncia de 18 (dezoito) nucleotdeos que codificam 6 (seis) histidinas, que serviro para futura purificao em coluna de afinidade. Esse vetor recombinante servir para transformar o organismo que produzir a protena. Esse vetor pode ficar na clula de duas formas: como uma estrutura circular de replicao autnoma (plasmdeo), ou pode integrar-se no genoma do organismo atravs de uma recombinao homloga. As clulas transformadas so crescidas at ficarem bem vigorosas e ento adiciona-se a substncia indutora que promover a transcrio e traduo do gene de interesse em grandes quantidades. A protena de interesse estar ento em grande quantidade na clula, todavia, para t-la na forma pura precisa-se separ-la das outras protenas celulares. Foi pensando nisso que as 6 (seis) histidinas foram adicionadas protena, pois essa cauda de histidina possui afinidade por nquel. Desta forma, aps separao de todas as protenas celulares por uma coluna com uma resina complexada com nquel, as protenas que possurem a cauda de histidina (somente a de interesse) ficaro grudadas na resina e as outras passaro direto. Para retirar a sua protena da coluna de nquel, s passar um tampo que reduza a afinidade das histidinas ao nquel, geralmente contendo um competidor. A tcnica de expresso pode apresentar muitas variaes, desde o promotor usado at o organismo produtor. Cada um desses fatores confere vantagens e desvantagens em relao a outro. Como exemplo pode-se comparar a expresso em fungos e em bactrias: As bactrias possuem crescimento muito mais rpido, todavia geralmente apresentam problemas ao expressar protenas muito grandes (formao de corpos de incluso), alm disso, no realizam modificaes ps-traducionais, enquanto que os fungos, apesar de crescerem mais lentamente possuem mecanismos que possibilitam que a protena fique na sua forma ativa e com modificaes ps-traducionais. So desvantagens destes ltimos a difcil manipulao e a presena de proteases. Em ultima escala, a transformao pode ser feita em organismos inteiros, criando os organismos transgnicos. H toda uma discusso tica por trs dos transgnicos, todavia, os transgnicos podem em muitos casos ser a soluo para vrios problemas mundiais como a fome e a falta de espao. A produo de protenas em laboratrio um grande avano para a cincia, graas a ela, facilitou-se muito a determinao da estrutura de protenas, que podem estar envolvidas em doenas, possibilitando a fabricao de drogas para bloquear ou controlar a sua ao ou as protenas purificadas podem ser usadas diretamente no tratamento de doenas como diabetes (insulina), nanismo (Hormnio de Crescimento) entre outras. Tipagem -DNA "fingerprint" DNA "fingerprint" um termo utilizado para referir-se ao teste de identificao de indivduos atravs do exame de DNA. Este termo impresso digital nada tem a ver com o recurso datiloscpio tradicional. Mas foi adotado porque no h, tambm, duas estruturas de DNA iguais entre as pessoas. Trata-se de um mtodo revolucionrio para a identificao de indivduos, a partir do qual possvel estabelecer, com preciso absoluta, vnculos genticos para efeito de investigao de paternidade, casos de crianas trocadas na maternidade ou
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seqestradas, construo de rvores genealgicas para estabelecimento de direito a heranas e esclarecimentos de crimes. O cientista ingls, Allec Jeffreys, na Universidade de Leicester, descobriu que certas regies do DNA humanos podiam ser examinadas atravs de ferramentas de engenharia gentica. At o final da dcada de oitenta a Cincia Mdica dispunha dos testes clssicos, envolvendo os antgenos eritrocitrios e o exame do HLA (Human Leukocyte Antigen). O advento do exame de DNA proporcionou um avano significativo em certas eventualidades, principalmente quando as probabilidades de paternidade, calculadas atravs de testes convencionais, eram baixas ou de magnitude insuficiente para que a paternidade biolgica fosse claramente estabelecida. Deve-se ter em mente que o exame de DNA exclui, praticamente, 100% dos falsos pais biolgicos, e possibilita o clculo da probabilidade de paternidade sempre em valores acima de 99,9%. O exame de DNA j se encontra padronizado em seus procedimentos tcnicos (American Association of Blood Banks 1990) e se encontra validado pela justia e plenamente aceito em vrios pases. De posse desta ferramenta de alta tecnologia e poder de resoluo sem precedentes , ento, possvel a elucidao de casos complexos de investigao de paternidade, inclusive aqueles em que o suposto pai encontra-se falecido ou no se encontra disponvel para o teste. Em humanos, apenas 5% do genoma total contm informao de aproximadamente 50.000 a 100.000 genes que governam funes celulares. Os restantes 95% de DNA, no codificam protenas e onde se encontram as regies repetitivas, que so seqncias que se repetem vrias vezes. Existem dois tipos de repeties no genoma, uma quando as seqncias repetidas ocorrem uma ao lado da outra (em "tandem") e a outra quando as repeties ocorrem de forma aleatria no genoma. Vrias classes de seqncias repetitivas de DNA tm sido escritas e caracterizadas em vrias espcies de animais e vegetais. Estas diferem no nmero e na composio dos nucleotdeos. A diferena entre dois indivduos pode ser determinada atravs do polimorfismo dessas regies repetitivas do DNA, que diferem de tamanho (nmero de repeties) dentro de uma populao. A caracterizao pode ser feita de duas formas: por PCR ou por hibridao. Por PCR utiliza-se primers que flanqueiam as regies repetitivas, amplificando-as. Dependendo do tamanho da regio repetitiva, os fragmentos podero ser maiores ou menores e podero ser diferenciados atravs de eletroforese em gel. A limitao dessa tcnica por PCR est no tamanho da regio repetitiva que no pode ser muito grande, dessa forma, o nmero de alelos geralmente menor. A caracterizao por consiste em cortar o DNA com enzimas de restrio, correr em gel de agarose, transferi-lo para uma membrana e usar como sondas a seqncia cerne da repetio. A Hibridao permite identificar regies repetitivas maiores (algumas vezes de dezenas de milhares de bases), que possuem um maior polimorfismo e so mais confiveis. O resultado de cada uma dessas regies e dado por um padro de duas faixas (bandas) representando os dois alelos daquele loco (j que o ser humano diploide). Com a anlise de vrias regies repetitivas, pode-se ento obter um padro (quase) individual. Nos casos de criminalstica, o DNA do criminoso obtido na cena do crime comparado com o DNA dos suspeitos, podendo-se dessa forma, identificar com grande confiabilidade se algum dos suspeitos o criminoso. A extrao de DNA pode ser feita de sangue, fios de cabelo (bulbo), plos, manchas de sangue ou esperma, ossos, pedaos de pele e at de insetos hematfagos (carrapatos e caros). Nos casos de paternidade, o padro do filho colocado em comparao com o do suposto pai e com o da me, um dos alelos (bandas) do filho vem da me, o outro, vem do pai verdadeiro. Analisando-se vrias regies pode-se ento incluir o pai com grande grau de certeza (aprox. 99,99%) ou exclui-lo da paternidade do filho.
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O diagrama abaixo mostra um caso de identificao de paternidade.

Padro

Me

Filho

Suposto Pai

Figura 14- Esquema mostrando resultado de um teste de paternidade para um loco. Um alelo do filho vem da me (verde) e o outro (azul) tem que vir do pai biolgico. Esse um caso de incluso no qual o suposto pai o pai da criana (ao menos considerando esse loco).

Aplicaes na medicina O primeiro trabalho documentado sobre as aplicaes dos produtos da PCR data de 1985 e relata a mutao que causa a anemia falciforme. Nos dias de hoje, a biologia molecular tem contribudo muito com a medicina, principalmente no que diz respeito a diagnsticos de doenas. Distrofia muscular do tipo Duchene e do tipo Becker, fibrose cstica do pncreas e AIDS so apenas alguns exemplos de doenas que podem ser diagnosticadas por tcnicas de biologia molecular. O PCR a tcnica mais usada para diagnsticos de doenas. Por PCR, pode-se tambm detectar mutaes em oncogenes (p53, K-ras e BRCA 1 e 2); detectar a causa de infeces atravs de marcadores moleculares especficos, canalizando o tratamento de forma eficiente; verificar tendncia genticas a enfarto atravs da tipagem do gene ACE (enzima conversora de angiotensina) e fazer vrios diagnsticos pr-natais. Como exemplo de um diagnstico feito por PCR, pode-se citar o diagnstico da Distrofia muscular de Duchene (DMD). Essa doena caracteriza-se por uma degenerao progressiva e irreversvel dos msculos esquelticos. determinada por um gene do cromossomo X, e o padro de herana recessivo ligado ao X, afetando apenas indivduos do sexo masculino. O gene da DMD foi clonado em 1987 e possui 2,5 milhes de pares de bases, de onde cerca de 99% so ntrons. A identificao da deleo em pacientes com suspeita de DMD/DMB extremamente importante para o prognstico clnico e o aconselhamento gentico.

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Figura 15 Eletroforese em gel de agarose mostrando 4 resultados de diagnsticos de DMD, C representa o controle (indivduo sem delees); os indivduos 2 e 3 no apresentam deleo para nenhum dos xons testados; o indivduo 1 apresenta deleo do xon 48 e o indivduo 4 apresenta deleo nos xons 45 e 48 (Figura retirada do Captulo 7 do livro de cidos Nuclicos, captulo escrito pelas Dras Maria Rita Passos Bueno e Mayana Zatz. O livro foi organizado pelo Dr. Francisco J. S. Lara)

Terapia Gnica Alm do diagnstico a biologia molecular proporciona tambm procedimentos para correo de doenas genticas. Desta forma, genes defeituosos podem ser substitudos por genes normais utilizando vetores especficos (retrovrus, adenovrus, etc...) para carrear estes genes. Isso j foi feito com sucesso para corrigir a Sndrome da Imunodeficincia Congnita, causada por mutaes no gene que codifica a enzima Adenosina Deaminase (ADA) e tambm para a Fibrose Cstica, causada por mutaes na CFTR (Cystic Fibrosis Transmembrane Regulator). Embora alguns sucessos j tenham sido obtidos, faz-se necessria ainda muita pesquisa, principalmente relativa ao desenvolvimento de vetores seguros para transporte dos genes de interesse. Alm disso, este tipo de terapia ainda muito cara, tornado-a impraticvel nos moldes atuais.

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Leitura Recomendada

Francisco J.S. Lara - de cidos Nuclicos (1995) - Sociedade Brasileira de Gentica Lodish et al., Molecular Cell Biology (1999) W.H. Freeman and Company, New York, 4th Ed Watson et al., Recombinant DNA (1992) Ed. Scientific American Books, New York, 2nd Ed Strachan and Read , Human Molecular Genetics (2000) - BIOS Scientific Publishers Ltd, 2nd Ed Ninfa and Ballou, Fundamental Laboratory Approaches for Biochemistry and Biotechnology (1998) - Fitzgerald Science Press, Inc., Bethesda, Maryland, USA Lubert Stryer, Bioqumica (1996) Guanabara Koogan S.A., RJ, Brasil, 4a Ed. Benjamin Lewin, Genes VII (2000) Oxford University Press, Inc., New York Voet and Voet, Biochemistry (1997) John Wiley & Sons, New York, 2nd Ed.

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