Le matériel utilises dans nos travaux pratiques

Le bec bensen est un instrument très important pour les manipulations

microbiologiques, l’utilité de bec besen est de confer une zone d’asepsie environ 20
cm de rayon.

Les pipettes ; dans ce TP en a besoin de pipette graduée de 10 ml et 2 ml, les

pipettes sont utilisées lors de la dilution et notamment pour l’ensemencement (2ml-
1ml).

Boite de pétri pour recueillir la culture

Tube à essais : pour recueillir les dilutions successives.

Flacon :recueillir la dilution mère.

La stérilisation ;

Avant tout une manipulation, le matériel doit être stérile, cette dernière est mises en
place grâce au four pasteur 160 c° pour 1heure ou 180 c° pour 30 min.

Les pipettes sont bouchées a l’aide d’un couton cardé puis envelopper par de papier
ou de l’aluminium.

Le même procéder est le mêmes pour les flacons, les tubes a essais et les boite de
pétri.

Le milieu de culture ; pour la flore totale aérobie mésophile existent plusieurs types
de milieux de cultures qui peuvent être utilisées PCA, TGEA, TDYM, gélose nutritive.

Mais dans notre TP en utilisées le milieu PCA. Ce milieu est utilisé pour le
dénombrement des microorganismes aérobies revivifiables aussi nommé FMAR .
PCA vient de l'anglais Plate Count Agar, ce qui veut dire gélose pour le
dénombrement. C'est un milieu ordinaire, sans inhibiteurs, le but étant de compter
l'ensemble des bactéries capable de croître 30°C qui ont été sur une surface ou dans
un aliment.
D’unecomposition qui la suivante ;

Peptone : 0.5 g

Extrait de levure : 2.5g

Glucose : 1g

Agar : 15

Ph= 7

La décontamination de paillasse se fait par les détergents et / ou les désinfectants.

Organisation de lieu de travaille ;

Le manipulateur doivent être assise et tout droit vers le bec bensen. Éviter de parler
lors de la manipulation.

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 Les tubes et les flacons a gauche de manipulateur, les pipettes sont a droite.

Partie Théorique
Généralité :
La Flore Mésophile Aérobie Totale (FMAT) est un indicateur sanitaire qui permet
d'évaluer le nombre d'UFC (Unité Formant une Colonie) présentes dans un produit ou
sur une surface. Ce dénombrement se fait à 30 °C ce qui permet de dénombrer trois
grands types de flore :
• la flore thermophile, température optimale de croissance à 45 °C ;
• la flore mésophile, température optimale de croissance entre 20 °C et 40 °C ;
• la flore psychrophile, température optimale de croissance à 20 °C.
• la flore pathogéne, température optimale de croissance à 37 °C
Comme il s'agit d'un milieu ordinaire, la plupart des micro-organismes peuvent se
développer, sauf ceux qui sont exigeants et les micro-organismes anaérobies stricts. Il
est donc préférable de parler de Flore Mésophile Aérobie à 30 °C que de « flore
totale ».
L'unité est l'UFC (Unité Formant Colonie) car une colonie observable sur la gélose peut
venir d'un micro-organisme isolé, d'une spore ou encore d'une association de micro-
organismes.
Intérêt de TP
Ce TP donne une idée sur la charge bactérienne globale de lait, un excès de FMAT
est la conséquence soit d’une pollution soit d’une mauvaise conservation
(température de conservation trop élevée et/ou durée de conservation trop longue).
Partie pratique
Dilution :
En milieu aseptique, en prélève 10ml de lait cru et on le met dans un flacon qui
contenus 90ml d’eau physiologique( ou d’urée trypthophane ), (1/10 -1 ) avecune
homogénéisation en suite.
Un millilitre du flacon est prélevé avec une pipette graduée, et transversé dans un
tube contenant 9 ml d’eau physiologique afin de réaliser une dilution au 1/10-2 :
L'opération est renouvelée en changeant de pipette et en versant de nouveau 1 ml
dans un nouveau tube d'eau physiologique, et ainsi de suite, jusqu'à ce que la
concentration en bactéries devienne relativement faible. Les tubes sont homogénéisés
entre chaque dilution.

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 Mises en gélose
Comme dit précédemment, la gélose PCA est une gélose standard pour le
dénombrement. Les boîtes de Pétri sont annotées et doivent contenir sur la tranche :
• la date ;
• la dilution utilisée ;
• la température d'incubation ;
• la durée d'incubation.
• le groupe et le sous groupe ;
On prend une nouvelle pipette et à partir de la dernière dilution, on prélève 1 mL de
dilution qui sera réparti en goutte au fond de la boîte correspondante. L'opération est
renouvelée pour la seconde boîte. On remonte jusqu'à la dilution supérieure sans
changer de pipette, jusqu'à la première dilution.
Les gouttes sont ensuite recouvertes d'une couche de gélose PCA en surfusion, et le
tout est homogénéisé avec des mouvements circulaires. On s'arrange pour que la
gélose ne soit pas trop chaude de façon à ne pas tuer les bactéries.
Une fois la gélose refroidie, on la passe une seconde couche de gélose PCA, ce qui a
pour effet d'immobiliser les bactéries, et donc de former des colonies bien définies. On
met à incuber à 30 °C pendant 72 h. On considère que les colonies sont dénombrables
si leur nombre est compris entre 30 et 300. Au dessus de 300, elles sont
indénombrables, et en dessous de 30 on considère qu'elles sont trop rares pour être
dénombrées.

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La lecture

Après incubation des boites a 30 °c en 24, 48,….72h, les résultats sont comme la
suite.

Pour la dilution 1 /10-3 le nombre des colonies est de 52 colonies et pour la dilution
1/10-4 le nombre des colonies et de 02 colonies.

On néglige la deuxième lecture car le dénombrement ce fait dans l’intervalle 30 à

300 colonies.

Le nombre des colonies est multiplier a l’inverse de la dilution on obtient 52. 1000
est égale a 52000 GAMT à la dilution 1/10-3 .

application numérique :

N =∑ colonies D/(n1+(1-n)

: nombre d' UFC par gramme ou par mL de produit initial ;

: sommes des colonies des boîtes interprétables ;

: nombre de boîtes considérées à la première dilution retenue ;

D : facteur de la dilution retenue.

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N = 52 * 103 /3 N = 52000/3 N = 17333,33 UFC/ml