TD3 : Mutants thermosensibles

Mutant : organisme qui a subit un changement hrditaire dans son information gntique. L'ensemble des bactries de la colonie porteront la mme mutation que la bactrie de dpart. Croissance thermosensibles : les mutants sont sensibles la chaleur. Si la temprature augmente, les mutants ont des problmes de croissance. Exprience 1 : On a donc cherch isoler des mutants thermosensibles. Comment les isole t-on ? Sachant qu'E.coli pousse de tempratures comprises entre 30 et 42C (T optimale = 37C). Un agent mutagne, l'thyl mthane sulfonate a t utilis sur une culture en phase exponentielle de croissance en milieu complexe. Sur 2.10^5 colonies testes seulement 200 colonies taient thermosensibles. Quelle est la frquence des bactries mutes ?

Comment les isole-t-on ? Souche sauvage (LB + phase exponentielle) milieu liquide complexe -> mutagnse -> augmente la frquence de mutation. L'ethyl mthane sulfonate s'intercale dans l'ADN et provoque une erreur lors de la rplication. On se place en phase exponentielle pour tre sure qu'il y ait croissance car la mutation peut toucher des gnes de croissance. Milieu complexe : ainsi touts les facteurs de croissance de la bactrie sont prsents.

Bactrie 1 heure 30C -> dilutions et talements : -> souche sauvage -> mutants non thermosensibles -> mutants thermosensibles On fait des dilutions et talements dans le but de sparer ces 3 types de bactries.

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Grce au repiquage 30C, nous avons une copie de la bactrie qui est thermosensible et qui n'a pas pousse 37C

Frquence = (mutants thermosensibles / colonies testes) = (200 / 2.10^5) = 10^(-3) = 1/1000 bactrie mute Exprience 2 : On a recommenc 5 fois cette exprience et choisi chaque fois une vingtaine de colonies thermosensibles. Pourquoi avoir fait 5 expriences diffrentes plutt que d'avoir isol 100 colonies de l'exprience 1 ? On veut 100 mutants muts 100 endroits diffrents. Si on prend 100 colonies de l'exprience 1, il y a un risque d'y avoir des mutations identiques. Etapes sensible : le passage 1 cellule 2 cellules. Exprience 3 : Par un test de complmentation chez ces mutants, on montre que 7 d'entre eux appartiennent tous au mme groupe de complmentation. Que concluez vous de cette exprience ? Test de complmentation : fait d'introduire 1 ou plusieurs gnes qui permet de rcuprer un phnotype normal par le biais d'un plasmide qui contient le gne sauvage, production d'une protine fonctionnelle qui va remplacer la protine mute responsable de la thermosensibilisation.

Le mme gne est touch mais pas forcement la mme mutation et au mme endroit.

Exprience 4 : On nomme le gne isol dans l'exprience 3 ynaE. Par des techniques de gntique molculaire qui fonctionnent trs bien chez cette bactrie, on essaye de construire une souche dlete pour ce gne. Un tel mutant n'est jamais obtenu. Discutez ce rsultat ngatif. Proposez un test de complmentation pour l'exprience 3. Comment observer des phnotypes pour ce gne ? (question type examen).

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Comment savoir si le gne d'intrt (o il y a la mutation) est coup ou non ? Digestion mnage -> beaucoup de fragments diffrents -> clonage d'un fragment = 1 plasmide (insertion du fragment d'ADN dans plasmide).

Pour faire ceci, le plasmide doit respecter 3 critre : - prsence d'un unique site de restriction pour l'enzyme utilise. - prsence d'un gne de slection sur le plasmide -> la reconnaissance se fait grce un antibiotique. Permet de slectionner les bactries ayant reues le plasmide. - origine de rplication compatible avec celle du chromosome -> ainsi, il y a une copie de plasmide dans chaque cellule lle. On obtient pas de cellule lle sans plasmide.

Banque de plasmides ---transformation---> souche thermosensible 1 plasmide -> 1 bactrie Beaucoup de bactrie sans plasmide -> +AntiB -> talement 42C -> extraction d'ADN plasmidique

Transformation : introduction d'ADN tranger dans une bactrie.

Dans le milieu, on ajoute un antibiotique (AntiB) qui permet d'liminer les bactries n'ayant pas de plasmide. Les bactries qui ne poussent pas = bactries thermosensibles qui ont reu le plasmide et donc le gne d'intrt -> permet de pousser 42C. Extraction ADN plasmidique pour squencer la zone d'introduite. Issu de la souche sauvage (wt). On sait que la mutation est porte par le gne ynaE. On ne fait donc le squenage du gne ynaE pour la souche sauvage et celle mute -> comparaison. Permet de savoir exactement la nature et la position de la mutation.

Gne indispensable : qui produit une protine indispensable la survie de la bactrie.

Comment observer des phnotypes pour ce gne ? Essayer diffrents milieux. Raction face aux antibiotiques. Production de protases. Calcul de rendement.

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Exprience 5 : Observations microscopiques pour la souche sauvage (WT), un des mutants thermosensibles (ynaETS1) et ynaETS1 complment (TS1c)

A 30C : C : lgrement plus grands, plus attachs incurvs -> la forme est modie. E : plus long, plus courb, quantit moins importante -> pas normal, on devrait avoir quelque chose qui se rapproche de la souche sauvage (A).

A 42C : D : moins de bactries, plus longues -> problmes de division cellulaire. F : se rapproche de la souche sauvage (B), mais on ne rcupre pas compltement un phnotype sauvage. Pourquoi ne rcupre t-on pas un phnotype sauvage ? -> expression diffrente d'un gne prsent sur le plasmide compare celle du chromosome Exprience 6 : La souche sauvage WT et le mutant ynaETS1 sont cultivs 30C. En pleine phase exponentielle de croissance et au temps T0, de la thymidine tritie est ajoute au milieu de la culture. Une heure aprs, la moiti de chaque culture est place 42C. Le nombre de bactries/ml (x10^8) et le nombre de thymidine tritie incorpore dans les cellules/ml (x10^5) sont mesurs diffrents temps. Au vu des rsultats, pouvez vous proposer une fonction pour le gne ynaE.

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Le gne ynaE est impliqu dans la rplication.

WT : croissance meilleur 42C qu' 30C. TS : 30C croissance identique WT, 42C ne pousse pas. Par l'intgration de thymidine tritie, on regarde la rplication. La rplication est stoppe pour TS 42C.

Quelle phase de la rplication est bloque ?

La terminaison : la radioactivit aurait augment fortement or ce n'est pas le cas. On termine les rplications qui taient commences avant le passage 42C -> provoque la hausse de 1,2 1,3 cpm -> c'est donc l'initiation qui est touche. ynaE code pour la protine DnaE (au niveau de l'origine de rplication). DnaE perd sa conformation 42C.

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