LAPORAN PRAKTIKUM BIOTEKNOLOGI PERTANIAN KULTUR EMBRIO

Disusun Oleh: Nama NIM : Aminatus Sholikah : 115040213111035

Kelompok : Kamis, 06.00-07.30 Asisten : Putu Shantiawan Prayoga

PROGRAM STUDI AGROEKOTEKNOLOGI FAKULTAS PERTANIAN UNIVERSITAS BRAWIJAYA MALANG 2012

I.

PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang Penyerbukan dan pembuahan dapat berhasil namun setelah persilangan buatan seringkali dijumpai permasalahan antara lain buah yang terbentuk gugur saat embrio belum matang, terbentuk buah dengan endosperm yang kecil atau terbentuk buah dengan embrio yang kecil dan lemah. Kondisi tersebut dapat menghambat program pemuliaan tanaman karena embrio muda, embrio dengan endosperm kecil atau embrio kecil dan lemah seringkali tidak dapat berkecambah secara normal dalam kondisi biasa. Untuk mengatasi hal tersebut di atas maka embrio tersebut dapat diselamatkan dan ditanam secara aseptis dalam media buatan sehingga dapat berkecambah dan menghasilkan tanaman utuh. Teknik untuk menanam embrio muda ini dikenal dengan sebutan penyelamatan embrio (embryo rescue). Selain teknik penyelamatan embrio ini dikenal juga teknik kultur embrio (embryo culture), yaitu penanaman embrio dewasa pada media buatan secara aseptis. Embrio culture adalah salah satu teknik kultur jaringan yang pertama kali berhasil. Aplikasi kultur embrio ini antara lain perbanyakan tanaman, pematahan dormansi untuk mempercepat program pemuliaan serta perbanyakan tanaman yang sulit berkecambah secara alami. 1.2 Tujuan Tujuan dari praktikum kali ini adalah untuk mengetahui dan memahami serta mempraktekannya langsung dalam kultur embrio dengan menggunakan biji kacang tanah secara baik dan benar. Selain itu, dapat mengetahui hasil dari penanaman embrio kacang tanah pada media agar.

II.

TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Morfologi Kacang Tanah dan Biji Anggrek Morfologi Kacang Tanah Biji kacang tanah terdapat di dalan polong. Kulit luar (testa) bertekstur keras, berfungsi untuk melindungi biji yang berada di dalamnya. Biji terdiri atas lembaga dan keeping biji, diliputi oleh kulit ari tipis(tegmen). Biji berbentuk bulat agak lonjong atau bulat dengan ujung agak datar karena berhimpitan dengan butir biji yang lain selagi di dalam polong. Warna kulit biji bervariasi: merah jambu, merah, cokelat, merah tua, dan ungu. Biji kecil berukuran sekitar 20 g/100 biji, biji sedang sekitar 50 g/100 biji, dan biji besar lebih dari 50 g/100 iji. Varietas local pada umumnya memiliki biji kecil yaitu 30-40 g/100 biji. Rendemen biji dari polong berkisar antara 50 %-70 % (Purwono dan Purnamawati, 2007). Morfologi Biji Anggrek

Menurut Sumartono, (1981), bunga anggrek mengandung ribuan sampai jutaan biji yang sangat halus, berwarna kuning sampai coklat. Pembiakkan dengan biji lebih sukar dibandingkan dengan cara-cara lainnya, karena biji anggrek sangat kecil dan mudah diterbangkan angin. Selain itu, biji anggrek keadaannya tidak sempurna karena tidak mempunyai lembaga atau cadangan makanannya, maka pembiakan dengan biji yang dilakukan orang bertujuan untuk mendapatkan jenis baru. Biji diperolehnya dari penyerbukan serbuk sari pada putik. Di hutan penyerbukan terjadi dengan bantuan serangga. Namun, secara sengaja kita dapat melakukan penyerbukan, dengan mengambil serbuk sari dengan alat dan letakkan pada kepala putik sehingga terjadi pembuahan.

2.2 Kondisi Optimum Untuk Tumbuh Kacang Tanah Dan Anggrek

Iklim yang dibutuhkan tanaman kacang tanah adalah 0 0 bersuhu tinggi antara 25 -32 C. Sedikit lembab (rH 65%75%). Curah hujan 800-1300mm per tahun dan tempat terbuka. Suhu optimum untuk pertumbuhan kacang tanah 0 0 0 berkisar 25 -30 C di bawah suhu 25 C perkembangan akan o terhambat dan suhu diatas 35 C berpengaruh terhadap produksi bunga (Weiss, 1983). Media tumbuh yang baik bagi anggrek (famili Orchidaceae) harus memenuhi beberapa persyaratan, antara lain tidak lekas melapuk dan terdekomposisi, tidak menjadi sumber penyakit bagi tanaman, mempunyai aerasi dan draenase yang baik serta lancar, mampu mengikat air dan zat-zat hara secara optimal, dapat mempertahankan kelembaban di sekitar akar, untuk pertumbuhan anggrek dibutuhkan ph media 5-6, ramah lingkungan serta mudah didapat dan relative murah harganya (Ginting, 2008).
2.3 Teknik Kultur Embryo Kacang Tanah dan Embryo Resque Biji Anggrek Teknik Kultur Embryo Kacang Tanah Menurut Sulichantini (2007), teknik kiltur embrio pada kacang tanah adalah sebagai berikut : Bahan dan Alat Bahan yang digunakan adalah benih kacang tanah, zat pengatur tumbuh Picloram, media dasar Murashige dan Skoog (MS), Tween-20, sabun cair, Bayclin, alkohol 90 %, agar, sukrosa, akuades, dan spirtus. Alat yang digunakan adalah Laminar Air Flow Cabinet, timbangan analitik, pH meter, autoklaf, oven, hot plate, lampu spirtus, lemari pendingin, gelas ukur, botol kultur, pipit ukur, cawan petri, gelas pengaduk, erlenmeyer, pinset, scalpel, gunting, karet

hisap, hand sprayer, botol kultur, alumunium foil, karet gelang, dan pot pengecambahan. Pembuatan Media Media yang dibuat ada 4 macam, yaitu media untuk pengecambahan benih, media induksi embriogenesis, media pematangan embrio, dan media pengecambahan. Induksi Embrio Somatik Penyiapan Bahan Tanaman Benih kacang tanah yang digunakan disterilkan dengan larutan 30 % Bayclin selama 20 menit. Kedalam larutan tersebut ditambahkan dua tetes Tween 20 sebagai surfaktan. Benih yang telah disterilkan dibilas dua kali dengan air steril. Benih tersebut selanjutnya ditanam dalam media perkecambahan selama 2 hari. Penanaman dan pemeliharaan eksplan Leaflet yang berasal dari biji kacang tanah yang telah dikecambahkan pada media induksi embrio somatik yang terdiri dari lima konsentrasi Picloram (4, 8, 12, 16, dan 20 mg L-1). Subkultur dilakukan setiap dua minggu dengan menggunakan media yang sama dengan masing-masing perlakuan. Subkultur dilakukan sampai akhir pengamatan. Kultur diletakkan pada ruang inkubasi dengan suhu ruang berkisar antara 25 C sampai 28 C di ruang gelap. Disekitar kultur disterilkan dengan menggunakan alcohol 70 % setiap hari. Ruang inkubasi selalu dipelihara agar bersih dan steril. Pengamatan dilakukan terhadap morfogenesis eksplan seperti terbentuknya kalus, terbentuknya embrio somatik primer, terbentuknya embrio somatic sekunder, fenotipe kalus, fenotipe embrio somatik, dan jumlah embrio somatik yang terbentuk. Pematangan Embrio Somatik Embrio somatik yang dihasilkan pada media induksi selanjutnya dipindahkan pada media pematangan embrio

somatik sesuai dengan masing-masing perlakuan (Tabel 1). Subkultur dilakukan setiap dua minggu dengan menggunakan media yang sama dengan masing-masing perlakuan. Kultur diletakkan pada ruang inkubasi dengan suhu ruang berkisar antara 25 Oc sampai 28 oC di ruang gelap. Disekitar kultur disterilkan dengan menggunakan alkohol 70 % setiap hari. Ruang inkubasi selalu dipelihara agar bersih dan steril. Pengecambahan Embrio Somatik Embrio somatik yang dihasilkan selanjutnya dikecambahkan pada media pengecambahan (Tabel 1). Subkultur dilakukan setiap tiga minggu dengan menggunakan media yang sama untuk masing-masing perlakuan. Subkultur dilakukan sampai akhir pengamatan. Kultur diletakkan pada ruang inkubasi dengan suhu ruang berkisar antara 25 C sampai 28 C di ruang dengan pencahayaan yang berasal dari lampu TL 40 watt. Disekitar kultur disterilkan dengan menggunakan alkohol 70 % setiap hari. Ruang inkubasi selalu dipelihara agar bersih dan steril. Teknik kultur embryo rescue pada anggrek Teknik kultur embryo rescue pada tanaman anggrek adalah sebagai berikut : 1. Sterilisasi kapsul/benih anggrek: Lebih baik menggunakan kapsul (buah anggrek) yang belum terbuka, karena sterilisasi lebih mudah. Sterilisasi kapsul yang belum terbuka dengan cara merendam dalam 95% alkohol dan flaming. Di dalam laminer, buka kapsul dengan menggunakan skalpel steril. Biji dalam kapsul biasanya steril. Jika kapsul sudah terbuka, benih perlu disterilisasi. Rendam dalam 2% NaOCl. 2. Cara penanaman benih anggrek (Pierik)

 Benih ditaburkan pada permukaan media padat dalam wadah dengan permukaan luas, misalnya botol jam atau botol saus yang diletakkan mendatar. Jangan terlalu banyak benih yang ditanam, supaya setelah benih berkecambah tidak terlalu rapat. Perlu subkultur 2 -3 kali sebelum ditransfer ke tanah. (Sumarsih, 2007) 2.4 Contoh Aplikasi Kultur Embryo Contoh aplikasi kultur embrio adalah sebagai berikut : 1. Memecahkan dormansi Pada Musa balbisiana, tidak mungkin memeperoleh perkecambahan secara normal. Cherry, hazel, acer : tanaman yang memiliki dormansi panjang 2. Mencegah gugurnya embrio pada persilangan interspesifik Persilangan ini sering menghasilkan biji dengan endosperm yang tidak sempurna, atau embrio yang lemah, kecil. Contoh : kacang, kapas, tomat, dan padi. 3. Hibridisasi untuk produksi triploid (buah tanpa biji) Jeruk triploid Citrus sinensis Diploid citrus X tetraploid citrus = jeruk tanpa biji. Pisang triploid Musa acuminatia (AA) X Musa balbisiana (BB) = pisang tanpa biji (AAB). (Sumarsih, 2007) 2.5 Faktor yang Mempengaruhi Keberhasilan Kultur Embryo dan Embryo Resque

Faktor yang mempengaruhi kesuksesan kultur embrio adalah (Zulkarnain, 2009) : Genotipe : Pada suatu spesies, embrio mudah diisolasi dan tumbuh, sementara tanaman lain susah. Tahap (stage) embrio diisolasi The bigger the better.

Kondisi tumbuh tanaman Inang : Sebaiknya ditumbuhkan di rumah kaca/ kondisi terkontrol. Embrio mesti cukup besar dan berkualitas tinggi.

Kondisi media kultur embrio harus diperhatikan, seperti Hara makro dan mikro, Ph 5.0 6.0, Sukrosa sbg sumber energi. Embrio belum matang perlu 8 12%, matang perlu 3%, Auksin dan sitokinin tidak diperlukan. GA untuk memecahkan dormansi, Vitamin (optional), Senyawa organik (opt), air kelapa, casein hydrolisate, glutamin (penting) (Luri, 2009).

III.

BAHAN DAN METODE

3.1 Alat, Bahan, dan Fungsi A. Alat Pinset : untuk mengambil bahan Scalpel : untuk memotong bahan Bunsen : untuk mensterilkan alat LAFC : sebagai tempat proses kultur embrio Botol Kultur : sebagai tempat tumbuh embrio Cawan Petri : sebagai tempat saat pengambilan embrio B. Bahan Alkohol : untuk mensterilkan alat Aquades : untuk mensterilkan bahan Detergen : untuk mensterilkan bahan Bayclean : untuk mensterilkan bahan Eksplan Kacang Tanah : sebagai bahan pengamatan

3.2 Cara Kerja Pembuatan Media Kultur (Diagram Alir) Kultur embrio kacang tanah Siapkan buah kacang tanah

Siapkan alkohol, aquades, deterjen, bayclean, explan kacang tanah

Cuci buah kacang tanah dengan deterjen 5%, banlate 0.3% Tiriskan dan cuci dengan bayclean 10%

Bilas dengan aquades

LAFC

Buah celupkan ke alkohol

Taruh ke cawan petri

Bunsen dan pinset dibakar dahulu

Dibelah dan diambil isinya

Pindahkan isinya ke botol kultur

Semprot tutup dengan alkohol

Tutup botol kultur 3.3 Analisa Perlakuan Hal pertama yang dilakukan pada praktikum kultur embrio ini adalah menyiapkan alat dan bahan yang diperlukan. Embrio yang akan digunakan adalah embrio kacang tanah, maka siapkan kacang tanah, siapkan alkohol, aquades, dan deterjen. Setelah disiapkan, cuci biji kacang tanah dengan deterjen 5%, kemudian tiriskan dan cuci

dengan banlate 0.3%, dan ditiriskan lagi lalu cuci dengan bayclean 10%. Kemudian rendam biji kacang tanah dengan aquades. Biji kacang tanah tadi kemudian dibawa ke ruang kultur, dan mulai melakukan kultur embrio dalam LAFC. Sebelum diambil isinya, biji kacang tanah tadi dicelupkan ke alkohol, kemudian ditaruh ke cawan petri. Alat-alat seperti pinset dan scalpel disterilkan terlebih dahulu dengan membakarnya pada bunsen. Kemudian biji kacang tanah siap dibelah dan diambil isinya, yaitu bahan yang akan ditumbuhkan untuk kultur embrio ini. Setelah didapat isinya, pindahkan pada botol kultur. Sebelum itu, semprot tutup botol kultur dan penutupnya agar steril. Lalu tutup botol hingga rapat agar kontaminan tidak dapat masuk.

IV.

HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Hasil Pengamatan I. Botol ke 1. Kondisi eksplan Eksplan berhasil tumbuh dari ketiga embrio yang ditanam. Kontaminasi Kontaminasi oleh jamur Keterangan pertumbuhan Eksplan telah berhasil ditumbuhkan, namun terkontaminasi oleh jamur sehingga pertumbuhan tanaman terganggu.

2.

Eksplan berhasil tumbuh dari ketiga embrio yang ditanam.

Kontaminasi oleh jamur

Eksplan telah berhasil ditumbuhkan, namun terkontaminasi oleh jamur sehingga pertumbuhan tanaman terganggu.

3.

Eksplan berhasil tumbuh dari ketiga embrio yang

Kontaminasi oleh jamur

Eksplan telah berhasil ditumbuhkan, namun

ditanam.

terkontaminasi oleh jamur sehingga pertumbuhan tanaman terganggu.

4.

Eksplan berhasil tumbuh dari ketiga embrio yang ditanam.

Kontaminasi oleh jamur

Eksplan telah berhasil ditumbuhkan, namun terkontaminasi oleh jamur sehingga pertumbuhan tanaman terganggu.

5.

Eksplan berhasil tumbuh dari ketiga embrio yang ditanam.

Kontaminasi oleh jamur

Eksplan telah berhasil ditumbuhkan, namun terkontaminasi oleh jamur sehingga pertumbuhan tanaman terganggu.

Pengamatan II. Botol ke 1. Kondisi eksplan Eksplan berhasil tumbuh dari ketiga embrio yang ditanam. Kontaminasi Kontaminasi oleh jamur Keterangan pertumbuhan Eksplan telah berhasil ditumbuhkan, namun terkontaminasi oleh jamur sehingga pertumbuhan tanaman terganggu.

2.

Eksplan berhasil tumbuh dari ketiga embrio yang ditanam.

Kontaminasi oleh jamur

Eksplan telah berhasil ditumbuhkan, namun terkontaminasi oleh jamur sehingga pertumbuhan tanaman terganggu.

3.

Eksplan berhasil tumbuh dari ketiga embrio yang ditanam.

Kontaminasi oleh jamur

Eksplan telah berhasil ditumbuhkan, namun terkontaminasi oleh jamur sehingga pertumbuhan tanaman terganggu.

4.

Eksplan berhasil tumbuh dari ketiga embrio yang ditanam.

Kontaminasi oleh jamur

Eksplan telah berhasil ditumbuhkan, namun terkontaminasi oleh jamur sehingga pertumbuhan tanaman terganggu.

5.

Eksplan berhasil tumbuh dari ketiga embrio yang ditanam.

Kontaminasi oleh jamur

Eksplan telah berhasil ditumbuhkan, namun terkontaminasi oleh jamur sehingga pertumbuhan tanaman terganggu.

4.2 Pembahasan Pada pengamatan pertama telah diketahui bahwa eksplan embrio kacang tanah yang ditanam telah berhasil tumbuh pada keseluruhan botol. Hal ini dicirikan bahwa plumula telah tumbuh dan akar primer telah mulai memanjang. Namun, dari pengamatan pertama hingga pengamatan terakhir, diketahui bahwa eksplan yang ditumbuhkan telah terkontaminasi oleh jamur, hal ini ditandakan dengan tumbuhnya hifa pada media tanam. Hifa ini berwarna putih hingga abu-abu kehitaman, serta adapula yang berwarna hitam pada persebaran sporangiumnya. Diperkirakan jamur yang tumbuh ini adalah dari jenis jamur Rhizopus. Ciri morfologi koloni: hifa seperti benang berwarna putih sampai kelabu hitam; bagian tertentu tampak sporangium dan sporangiofora berupa titik-titik hitam seperti jarum pentul. Ciri mikroskopis: hifa tanpa sekat, terdapat rizoid dan sporangiospora (Sulistyawati dan Listyawati, 2001). 4.3 Pembahasan tentang Pertumbuhan Kultur Embrio dan Embrio Rescue Dibandingkan Dengan Literatur Menurut Risza (1994), kultur embrio berfungsi untuk mematahkan dormansi biji dan menghilangkan pengaruh inhibitor sehingga embrio dapat tumbuh dengan baik. Pada praktikum yang dilakukan, dapat dilihat bahwa setiap eksplan yang tidak terkontaminasi dalam botol kultur dapat tumbuh dengan baik, walaupun di sekitarnya ada kontaminasi berupa jamur tumbuh. Mungkin pertumbuhan akan terganggu jika terus dibiarkan jamur berkembang tanpa ada pembersihan atau pemindahan eksplan. Pertumbuhan eksplan ditandai dengan adanya plumula dan akar yang tumbuh dari eksplan yang ditanam. Sesuai dengan literatur, yaitu menurut Hendriyanti, dkk (2010) bahwa embrio yang telah mengalami perkembangan lebih lanjut dengan ciri-ciri telah tumbuh tunas atau akar, maka dapat dipindah ke media baru pula. Kontaminasi yang terdapat pada botol kultur berupa jamur yang dicirikan dengan adanya hifa berwarna putih. Menurut Tuhuteru, dkk (2012), kontaminasi yang disebabkan oleh

cendawan mula-mula terlihat dipermukaan dan atau tepi media yang kontak langsung dengan dinding botol. Jika dibiarkan maka cendawan tersebut akan menutupi seluruh permukaan media. Kontaminasi yang disebabkan oleh bakteri terjadi langsung pada eksplan, yang ditandai dengan munculnya lendir berwarna putih keruh disekeliling plantlet. Sedangkan kontaminasi akibat jamur, terdapat hifa putih. Kontaminasi diduga terjadi karena kurang bersihnya botol, peralatan saat pembuatan media, suhu ruang kultur yang berubah-ubah saat botol disimpan di rak kultur dan adanya bakteri yang terbawa dari sumber eksplan. Kontaminasi juga sangat ditentukan oleh sterilitas ruangan.

V.

PENUTUP

5.1 Kritik Dari hasil praktikum yang telah dilakukan, dapat diketahui bahwa eksplan yang ditanam telah berhasil ditumbuhkan, hal ini terbukti bahwa plumula dan akar tanaman telah terlihat memanjang. Namun kondisi media akar telah terkontaminasi oleh jamur, hal ini ditandai dengan adanya hifa yang berwarna putih hingga keabu-abuan bahkan berwarna hitam. Kontaminasi ini seharusnya tidak terjadi jika sterilisasi dilakukan secara maksimal. Kontaminasi diduga terjadi karena kurang bersihnya botol, peralatan saat pembuatan media, suhu ruang kultur yang berubah-ubah saat botol disimpan di rak kultur dan adanya bakteri yang terbawa dari sumber eksplan. Kontaminasi juga sangat ditentukan oleh sterilitas ruangan. 5.2 Saran Dari hasil praktikum ini, maka perlu ditingkatkan lagi mengenai sterilisasi yang dilakukan.

DAFTAR PUSTAKA

Ginting, 2008. Membuat Media Tumbuh Anggrek. KP Penelitian Tanaman Hias, Deptan Dimuat pada surat kabar Sinar Tani, 7 13 Mei 2008 Hendriyanti, Dessy., dkk. 2010. Wirausaha Tanaman Anggrek Secara Kultur Jaringan. Yogyakarta: Jurusan Budidaya Pertanian. Fakultas Pertanian Luri, S. 2009. Kultur Kalus. <URL: http://kulturjaringan.blogspot.com/2009/03/kultur-kalus.html>. Diakses tanggal 4 Desember 2012. Purwono dan Heni P. 2007. Budidaya 8 Jenis Tanaman Pangan Unggul. Penebar Swadaya. Depok. Risza, Suyatno. 1994. Kelapa Sawit, Upaya Meningkatkan Produktivitas. Yogyakarta: Kanisius. Sulichantini, Ellok Dwi. 2007. Jurnal : Produksi Plantet dari Embrio Somatik Kacang Tanah. Laboratorium Bioteknologi Tanaman Fakultas Pertanian Universitas Mulawarman Jl. Tanah Grogot, Kampus Gunung Kelua, Samarinda 75123 Sulistyawati dan Listyawati. 2001. Keanekaragaman Jenis Mikroorganisme Sumber Kontaminasi Kultur In vitro di Sub-Lab. Biologi Laboratorium MIPA Pusat UNS. Surakarta : Jurusan Biologi FMIPA UNS. Sumarsih, Sri. 2011. Materi Kuliah : Kultur Organ (Kultur Embrio). Yogyakarta : UPN Veteran Yogyakarta. Tuhuteru, S. M. L. Hehanussa, dan S.H.T. Raharjo. 2012. PERTUMBUHAN DAN PERKEMBANGAN ANGGREK Dendrobium anosmum PADA MEDIA KULTUR IN VITRO DENGAN BEBERAPA KONSENTRASI AIR KELAPA.

Jurusan Budidaya Pertanian, Fakultas Pertanian, Universitas Pattimura. Agrologia, Vol. 1, No. 1, April 2012, Hal. 1-12 Weiss, E.A. 1983. Oil Seed Crops. Logman Inc. New Cork. USA Zulkarnain. 2009. Kultur Jaringan Tanaman. Solusi Perbanyakan Tanaman Budi Daya. Bumi Aksara. Jakarta.