PREPARO DE MATERIAIS PARA ANLISES LABORATORIAIS

CENTRIFUGAO A centrifugao um processo de separao em que a fora centrfuga relativa gerada pela rotao da amostra usada para sedimentar slidos em lquidos, ou lquidos imiscveis de diferentes densidades, separando-os. usada em diferentes aplicaes laboratoriais, industriais e domsticas. Princpio fsico A fora centrfuga relativa (FCR) gerada quando uma partcula ou conjunto de partculas sujeito a um movimento circular. De acordo com a primeira lei de Newton, uma partcula em movimento uniforme linear no perturbada por foras exteriores continuar com este tipo de movimento. Isto significa que ter uma velocidade constante e uma trajectria rectilnea. Quando a partcula forada a descrever uma trajectria circular (tomando portanto uma determinada velocidade angular), uma fora exercida na partcula de modo a tentar continuar na trajectria rectilnea. Essa a fora centrfuga relativa, cuja intensidade aumenta com o quadrado da velocidade angular, sendo directamente proporcional ao raio da circunferncia descrita e massa da partcula. Esta relao matematicamente descrita da seguinte forma: F = mv/R = 4 m nR, em que F o mdulo da intensidade da fora centrfuga, m a massa da partcula, R o seu raio e n o nmero de rotaes por segundo. Isto significa que quanto maior for o nmero de rotaes por segundo, maior ser a fora centrfuga aplicada na partcula. Do mesmo modo, quanto maior for o raio da circunferncia descrita pela partcula, maior ser a fora centrfuga. A fora centrfuga relativa calculada da seguinte forma: FCR = 0.00001118 R N onde R o raio de centrifugao, em centmetros, e N a velocidade de centrifugao em rotaes por minuto (rpm). A unidade de medida da fora centrfuga relativa o "g", sendo 1g equivalente acelerao da gravidade na superfcie da terra. Usualmente mede-se a velocidade de centrifugao em rotaes por minuto (rpm), apesar de tratar-se de uma informao indireta da eficincia da centrifugao.

Centrfugas ou Centrifugadores So equipamentos que aplicam a fora centrfuga relativa em determinado objeto atravs da rotao do mesmo em torno de um eixo. Em Biologia, Bioqumica e Qumica

Uma centrfuga de bancada. A centrifugao uma tcnica fundamental usada em diversos ramos da Qumica, Biologia e Bioqumica para a separao de amostras. Em geral, estas so introduzidas em tubos de diferentes tamanhos, que so dispostos num rotor de centrfuga. As centrfugas esto normalmente adaptadas para a utilizao de diferentes tipos e tamanhos de rotores, conforme a velocidade e aplicao desejadas. Enquanto que microcentrfugas de bancada podem centrifugar tubos entre os 200 L e os 2 mL de volume, centrfugas de grande porte podem usar tubos de volume muito varivel, tipicamente at 1 L. Separao de diferentes fases Uma das aplicaes mais frequentes da centrifugao na separao de diferentes fases de uma amostra, em especial uma fase slida de uma aquosa. Partculas insolveis numa amostra sedimentam no fundo do tubo de centrfuga, restando o chamado sobrenadante (fase lquida) por cima do sedimento. O sobrenadante ento aspirado ou decantado e o sedimento retirado do tubo. Esta tcnica usada, por exemplo, na separao de membranas celulares (insolveis em gua) e citoplasma (solvente celular aquoso) aps ruptura de clulas. Tambm usada para a separao dos elementos figurados do sangue e o plasma sanguneo, em que as clulas (eritrcitos, leuccitos,

plaquetas) so depositados no tubo, podendo o plasma ser separado e analisado. Centrifugao diferencial A centrifugao diferencial foi desenvolvida nos anos 60 do sculo XX por Christopher John Champerline e Juan Burdettee. Consiste em sujeitar uma amostra feita homognea (homogenato) de um tecido ou rgo (por exemplo, fgado) a repetidas centrifugaes, aumentando de cada vez a fora centrfuga. Hoje em dia esta tcnica largamente substituda pela centrifugao isopcnica. Esta tcnica permite a separao de diferentes organelos celulares de eucariontes, como mitocndrios, ncleo celulares e microssomas (resduos do retculo endoplasmtico). Usando esta tcnica, as partculas mais densas sedimentam primeiro; nas centrifugaes subsequentes, as partculas de menor densidade sedimentam ento. Centrifugao isopcnica ou de equilbrio A centrifugao isopcnica, tambm chamada centrifugao de equilbrio, usada na separao de macromolculas recorrendo a gradientes de concentrao da soluo base usada para a separao das partculas. Uma das aplicaes deste tipo de centrifugao na separao de molculas de DNA usando cloreto de csio (CsCl). uma tcnica sensvel, capaz de separar molculas de DNA de igual dimenso mas diferindo apenas na sua proporo AT/GC (proporo entre as bases adenina e timina e as bases guanina e citosina). Neste tipo de centrifugao, a amostra de DNA a separar misturada com CsCl e posta a centrifugar a cerca de 10 000 g durante um prolongado perodo de tempo (tipicamente entre dois e trs dias). O cloreto de csio usado numa concentrao em que toma uma densidade muito prxima da do DNA. Aps este tempo, um gradiente de cloreto de csio ser formado e o DNA separa-se segundo as suas propores AT/GC em diferentes bandas ao longo do tubo. Os gradientes de sacarose so utilizados na separao de partculas como organelos celulares e vrus, sendo uma alternativa centrifugao diferencial. Nestes, um gradiente de densidade de sacarose obtido adicionando cuidadosamente no tubo de centrfuga camadas de solues de sacarose de diferentes concentraes, comeando pela mais alta. Um gradiente tpico usa 70% a 20% (p/v), com decrementos de 10%, mas estes valores dependem largamente da amostra a separar. A amostra colocada no topo do tubo e ultracentrifugada. As partculas migram em direco ao fundo do tubo e estacionam nas zonas do gradiente com densidade idntica. A amostra assim dividida em diferentes camadas ao longo do tubo pode ser retirada aspirando cuidadosamente cada camada. Uma modificao do gradiente de sacarose consiste na utilizao de solues de apenas 70% e 20%(p/v). A soluo de 70% depositada no fundo do tubo e

a de 20% preenche o restante tubo; a amostra tambm depositada no topo, migrando durante a centrifugao para a interface com a soluo de 70%. Esta tcnica permite a concentrao de partculas de uma amostra sem que estas entrem em contacto com a parede do tubo, evitando um stress mecnico que muitas vezes provoca a desintegrao dessas partculas. Ultracentrifugao O termo ultracentrifugao aplica-se centrifugao que necessita de um tipo especfico de centrfuga (ultracentrfuga). As velocidades alcanadas pelos rotores nestas centrfugas so muito elevadas, obtendo-se aceleraes at 500 000 g. Neste tipo de centrfuga, a cmara onde se situa o rotor refrigerada e encontra-se sob vcuo, para evitar o sobreaquecimento por atrito com o ar e para permitir que altas velocidades sejam atingidas. A ultracentrifugao usada para a sedimentao de macromolculas; sob determinadas condies, acontece tambm uma distribuio no uniforme de molculas de menores dimenses ao longo do tubo. A sedimentao depende da massa, forma e densidade das molculas, bem como da densidade do solvente. O rotor e velocidade de rotao apropriados so usados dependendo da utilizao. possvel calcular o coeficiente de sedimentao (unidade: Svedberg, S) atravs da ultracentrifugao. Este coeficiente proporcional massa e densidade da substncia, dependendo tambm da forma das suas molculas. Assim sendo, partculas de grande massa molecular e densidade sedimentam mais facilmente, enquanto que partculas com forma alongada sedimentam mais lentamente (devido ao maior atrito com o solvente). Uma aplicao clssica deste coeficiente visvel na classificao de subunidades dos ribossomas que, dependendo do seu tamanho, tm diferentes coeficientes de sedimentao: por exemplo, a subunidade pequena dos ribossomas bacterianos chamada 16S e a sua sequncia nucleotdica serve de base em estudos filogenticos. A ultracentrfuga foi inventada em 1925 por Theodor Svedberg, que ganhou o prmio Nobel da Qumica em 1926 pelo seu trabalho em sistemas coloidais, em que usou a sua inveno.

DESTILAO BALO DE DESTILAO: O balo de destilao uma vidraria utilizada em laboratrios com principal objetivo de conter algum lquido (mistura) que ser levado ebulio para que o componente mais voltil seja completamente vaporizado e posteriormente destilado. Possui fundo chato e constitudo de borossilicato (uma miscelnea de xidos de silcio, sdio, alumnio e boro comercialmente conhecido pelo nome pirex), pois como entra em contato direto com uma chama ou superfcie aquecida, o

material de constituio deve ser demasiado resistente (alm de inerte frente boa parte das substncias qumicas). Para que a destilao ocorra satisfatoriamente, preciso que os componentes possuam pontos de ebulio relativamente distantes. Caso contrrio, a destilao simples no pode ser aplicada: para a separao de uma mistura azeotrpica (que se comporta como uma substncia pura, por possuir ponto de ebulio constante e fixo assim, toda a soluo ferve a uma mesma temperatura, no havendo, portanto, distino entre o ponto de ebulio entre um componente ou outro) necessrio adicionar outro componente que forme azetropo com algum dos anteriores. Dessa forma, o componente livre pode ser separado.

AUTOCLAVAO O termo esterilizao refere-se completa eliminao de patgenos, agente biolgico com capacidade de reproduo ou potencial infeccioso. A esterilizao o melhor mtodo de eliminao do risco biolgico. O uso da autoclave o mtodo mais utilizado nas instituies de sade e pesquisa, assegurando a completa destruio de microrganismos. Este processo geralmente envolve aquecimento da gua em uma cmara sob presso gerando vapor sob uma presso de 15 psi, o que ocorre em temperatura de cerca de 121 C por no mnimo 15 minutos. O tempo medido aps a temperatura do material envolvido atingir 121 C. O fator crtico nesta fase a garantia que no fique ar preso no interior do autoclave, o que pode impedir que a temperatura no interior do aparelho atinja os 121o C . para isto deve haver um monitoramento da temperatura com um termmetro-manmentro, bem como controle do processo com uso de um indicador qumico ou biolgico. Caso ocorra interrupo no processo de aquecimento durante a marcao do tempo, TODO O PROCESSO deve ser repetido. Controle do processo O melhor controle para esterilizao o uso de esporos de Bacillus stearothermophilus, que so includos com o material a ser esterilizado dentro do autoclave. Esta cultura pode ser adquirida comercialmente sendo a apresentao em ampolas com meio de cultivo e indicador de pH. Aps a esterilizao as ampolas so incubadas na temperatura adequada e verificadas para a viragem do indicador, o que indica que houve crescimento microbiano e falha no processo de autoclavao. Em uma perfeita esterilizao no haver crescimento microbiano ou viragem do pH. Os indicadores qumicos tambm podem ser empregados no controle de esterilizao por autoclavao. A fita de autoclave um exemplo deste indicador. Neste caso o indicador na fita branca muda para uma cor negra ou cinza, indicando que houve uma autoclavao eficiente.

Material necessrio para a validao do processo. Um dos processos deve ser utilizado. FITA INDICADORA ou INDICADOR BIOLGICO- Para este ultimo ainda so necessrios os seguintes complementos: 1. Ampolas contendo esporos de Bacillus stearothermophilus 2. Incubadora para a cultura 121o C Sobrevive por Morre em 5 min. 13 min.

Teste B. stearothermophilus

Atividade autoclavao

Fita indicadora

autoclavao

Torna-se No muda de escura cor Em relao Em relao tempo/ tempo/ temperatura temperatura eficientes ineficientes 121o C /15 minutos

Critrios de aceitabilidade A fita indicadora deve mudar de cor Os esporos no devem crescer aps incubao da ampola Registro Registrar o resultado em uma planilha de controle de esterilizao.

Forno Pasteur O uso de esterilizao seca (Forno Pasteur) menos eficiente que a esterilizao pelo vapor do autoclave. A esterilizao pelo calor seco eficiente quando realizada 160- 180 C por perodos de 2 4 horas. Neste processo o ponto crtico a composio qumica de material que est sendo esterilizado, bem como o arranjo do material no forno. Material termolbil no deve ser utilizado no processo. Descontaminao (Desinfeco) Pode ser definida como a reduo da maioria ou eliminao dos microrganismos patognicos em uma superfcie ou objeto, tornando este objeto incapaz de transmitir doenas. Fatores que determinam a efetividade de um desinfetante a) concentrao do princpio ativo

b) quantidade de material orgnico no material a ser descontaminado c) tempo necessrio para a ao d) temperatura e pH e) nvel de contaminao f) tipo de contaminao envolvida g) caractersticas fsicas do material a ser descontaminado Desinfetantes lquidos Estes devem ser estocados nos frascos originais em um ambiente de uso exclusivo do pessoal de limpeza. Apenas pequenas quantidades devem ser estocadas no ambiente nos setores para uso rotineiro. As solues diludas de acordo com as especificaes para uso devem ser estocadas por um pequeno perodo, no mximo 48 horas para evitar perda de atividade do produto. Estes frascos devem conter as especificaes do produto, bem como o grau de toxicidade que este apresenta, alm da data de preparo e validade. 1) lcool etlico 80% Eficiente desnaturante de lipdios de vrus envelopados e clulas vegetativas de bactrias. No corrosivo. Evapora rapidamente e bastante inflamvel. Uso: descontaminao de superfcies (exceto acrlico) ou na antisepsia da pele, durante a coleta de material para anlise. No utilizar em regio de mucosas. 2) lcool etlico iodado (lcool etlico 80% + 2% de iodo cristal dissolvido) Mais eficiente que o lcool etlico puro devido ao efeito halogneo do iodo. Eficiente desnaturante de lipdios de vrus envelopados e clulas vegetativas de bactrias. No corrosivo. Evapora rapidamente e bastante inflamvel. Uso: descontaminao de superfcies (exceto acrlico). Seu uso deve ser evitado na anti-sepsia durante a coleta devido alergia ao iodo apresentada por alguns pacientes. 3) Formaldeido e glutaraldedo O uso do Formaldedo na descontaminao ideal a 5% de concentrao do gs na gua. Atividades de descontaminao sob refrigerao utilizando formaldedo devem ser evitadas, pois este ultimo em baixas temperaturas perde atividade. Uma desvantagem do seu uso o odor irritante liberado, podendo causar hipersensibilidade. O glutaraldedo prefervel por ser menos irritante. EPIs especiais principalmente com proteo para os olhos e aparelho respiratrio devem ser utilizados. Uso: Descontaminao de pequenos equipamentos, ou superfcies com alto grau de contaminao. Principalmente em equipamentos metlicos por ser menos corrosivo. 4) Componentes fenlicos Com odor desagradvel e altamente corrosivo, deve ser evitado no laboratrio.

Uso: latas de lixo (creolina) 5) Quaternrios de amnio Excelentes desinfetantes, com baixa toxicidade e resduos corados, bem como liberao de odores. Apresentam em grande espectro de ao, inclusive contra os bacilos da tuberculose, esporos bacterianos e fungos Descontaminao de tubos, lminas, pipetas e ponteiras, bem como superfcies. Ex. GERMEKIL 6) Componentes clorados Amplamente utilizados , apresentam um grande espectro de ao. Pouco ativo em presena de grandes quantidades de material orgnico. Altamente oxidante e extremamente corrosivo em metais. As solues diludas perdem atividade rpido principalmente quando expostas luz. Desta forma, os frascos devem ser escuros e as solues trocadas a cada 24 horas. A gua sanitria, 25 hipoclorito de sdio, a mais utilizada entre as preparaes comerciais. Uso: Superfcies e cho para a limpeza de rotina. Deve ser utilizada proteo especiais para os olhos e aparelho respiratrio durante a aplicao. 7) Compostos iodados Utilizados geralmente associados com outros compostos (detergentes, lcool, etc). Deve haver um cuidado especial com os indivduos alrgicos. Uso: Equipamentos e superfcies contaminadas ou na anti-sepsia da pele em pacientes no alrgicos. Ex. iodine