ARGUMENT

Imensa rezerv de ap este rspndit n natur dup cum urmeaz: - rezerva total de ap 1370 milioane km ; - rezerva de ap dulce 500000 1 million km n fluvii, lacuri i ap subteran i 25 milioane km de ap dulce n calote glaciare; - rezerva de ap n atmosfer 50000km (nori i vapori); - anual cad pe continente 120000 km de ap din precipitaii; - anual se evapor 500000 km de ap. Circuitul apei n natur este un proces foarte complex pentru c n urmrirea acestuia trebuie s se in seama de trei factori mai importani: - localizarea diferitelor forme de ap; - trecerea apei ntre diferite stadii de cazare; - sectoarele consumatoare de ap. O serie de calcule au artat c pe timp de un an, un metru cub de suprafa terestr primete aproximativ 1 million kilocalorii din energia solar, cldura capabil s vaporizeze un strat de ap cu grosimea de 1 1,30m. Vntul este acela care dup evaporare asigur circulaia i repartiia vaporilor de ap n atmosfer. n funcie de temperatur i gradul de saturaie al aerului, apa poate condensa n particule foarte fine (cea) sau n particule mai grosiere, lichide sau solide (norii). n condiii prielnice, norii dau natere la precipitaii care cad pe suprafaa pmntului sub form de ploaie, grindin sau zpad.

O parte din apa de precipitaie cade n fluvii, mri i oceane de unde rencepe ciclul de evaporare, ns alt aprte din apa condensat, sosit pe uscat, urmeaz ci diferite. Astfel, o ptrime formeaz uvoaie sau toreni, se scurge n prie, ruri, fluvii i ajunge n mri i oceane. Aproximativ jumtate din apa de precipitaii, dup atingerea uscatului nclzit se evapor imediat. Aceasta n special acolo unde nu exist posibiliti de a fi transportat n mri i oceane. La aceast ap evaporat se adaug i aceea provenit din transpiraia animalelor i vegetalelor. Cu excepia unor ape subterane de mare profunzime, apele naturale conin ntotdeauna microbi. Acetia provin din praful atmosferic i din solul splat sau traversat. Numrul de germeni pe unitatea de volum poate fi foarte mic n cazul unor ape reci i lipsite de materii organice sau poate fi foarte mare, n cazul apelor bogate n materii organice i n mod deosebit, cnd materiile organice provin prin descompunerea fiinelor vii (cadrave) sau din instalaiile sanitare. Din fericire, o mare parte din germenii patogeni pentru om (bacterii care transmit maladii) dispar repede n sol datorit concurenei vitale, dintre acetiai bacteriile humificante, nitrificante, ciuperci, antibiotice. Totui, atunci cnd terenurile sunt foarte fisurate, microbii patogeni pot ajunge cu uurin n apa freatic i deci, n fntni. Riscul cel mai mare este atunci cnd sursele de ap se afl n imediata vecintate a unor bonlavi de febr tifoid sau dezinterie i nu se iau msuri drastice de mpiedicare a contaminrii apei cu fecalele acestor bolnavi. Obiectul analizei bacteriologice a apei este de a depista prezena n ap a bacteriilor susceptibile de a provoca consumatorului maladii infecioase i totodat de a verifica eficiena mijloacelor de protecie mpotriva contaminrii surselor de ap. Analiza bacteriologic a apei nu poate fi efectuat de chimiti analiti obinuii, ci de bacteriologi specializai.
5

CAPITOLUL 1 MALADII PROVOCATE DE MICROORGANISMELE DIN AP

Febra tifoid Este cauzat de bacilul lui Eberth, Salomella typhi i de germenii paratifici A i B. n multe situaii, colibacilii, oaspei normali ai intestinului, cns sunt prezeni n ape, pot provoca entero-gastrite grave, n special la copii. Dezinteria Se datorete bacilului lui Flexner, Shigells paradysenteriae. Att febra tifoid, ct i dezinteria, care se dezvolt n aceleai condiii ecologice, nu se mai ntlnesc n rile cu servicii igienice i sanitare bine puse la punct. Totui, n regiunile cu puin ap i impur, aceste boli produc adevrate epidemii. Holera Este cauzat de germenul Vibrio cholerae i este foarte transmisibil prin intermediul apei. Tot printre germenii fecali patogeni ai intestinului se numr enterococul (Streptococus faecalis) i perfringens (Clostridium perfringens). Apa este mediul cel mai adecvat pentru rspndirea altor boli infecioase pe baz de bacterii: diareea infantil, cauzat de proteus; enterita pseudomonas, cauzat de bacilul Pseudomonas aeruginosa i tularemia cauzat de Pasteurella tularensis. Prin consumarea apei impure se pot transmite parazitoze animale i maladii pe baz de protozuare: dezenteria ambiant, cauzat de Entamoeba histolytica; spirochetoza ictereo-hemoragic, cauzat de Leptospira icterohemorragiae i posibil de a fi contractat i prin traversarea pielii de ctre parazitul respectiv. Exist i maladii pe baz de virui care se pot rspndi prin intermediul apei: hepatita infecioas i poliomielita. Din fericire, virusul foarte periculos al poliomielitei poate fi distrus prin dezinfectarea apei cu clor liber.

CAPITOLUL 2 NUMRAREA GLOBAL A BACTERIILOR

Maladiile infecioase susceptibile de a fi transmise de ctre ape sunt aproape ntotdeauna de o poluare cu fecale. Bacteriile patogene sunt cu mult mai puin numeroase fa de cele care triesc obinuit n intestin. Acestea din urm (colibacilii) sunt mult mai rezistente n apele naturale dect bacteriile patogene. Se poate deduce c o ap lipsit de colibacili nu poate conine bacterii patogene. i invers, prezena colibacililor presupune o poluare sigur cu fecale. Iat, deci, raiunea pentru care de mai multe ori se efectueaz numai numrarea global a bacteriilor.

2.1. METODA CULTURII PE GELOZ NUTRITIV

Cultura de gelatin, cu incubare la 18-20C, deci a fost utilizat mult vreme, treptat s-a abandonat datorit faptului c multe bacterii se dezvolt la temperaturi mai mari de 20C, la care nu rezist mediul de cultur. Geloza permite incubarea n limite mai largi de temperatur i acesta este motivul principal pentru care este mai frecvent utilizat. Mediul de cultur se prepar prin diluarea a 6 grame de pepton i 3 grame extract de drojdie de bere n ap distilat prin nclzire lent. Se adaug 15 grame de geloz splat i bine uscat ntr-un sac de tarlatan. Se sterilizeaz n autoclav la 118C, timp de 20 de minute. Se filtreaz n autoclav i ntr-un flux de vapori (pe un filtru fiert).

Se potrivete pH-ul la valoarea de 7,2 cu NaOH 1N, n prezen de rou de fenol, mediul fiind meninut la 50-60C. Apoi se completeaz volumul cu ap distilat la 1000ml. Lichidul cald se repartizeaz n pri de 15 ml, care se transfer n eprubete de 220x22mm. Se introduc eprubetele n autoclav la 115C, timp de 15-20 minute. pH-ul final al mediului trebuie s fie aproximativ 7, la temperatur ordinar. Mediul astfel preparat se poate conserva o lun de zile n frigider la 4-6C. Pentru numrare, n dou serii de cutii Petri, indice cu diametrul de 90mm, splate i sterilizate se transform n probe de ap, n mod gradat; 1ml; 1ml din proba diluat de 10 ori; 1ml din proba diluat de 100 de ori; 1ml din proba diluat de 1000 de ori. Mai bine este ca diluarea s se fac cu soluia Ringer ( ea nsi diluat de 3 ori cu ap distilat i apoi sterilizat). Apoi se aeaz pe baia de ap att tuburile din mediul nutritiv, ct i cutiile Petri cu probele i la 45C se transform mediile de geloz n fiecare cutie cu prob. Se agit coninutul ntr-o micare dute-vino i cutiile se aeaz pe o suprafa orizontal pentru rcire. O serie de cutii se incubeaz la 37 C i cealalt serie se incubeaz la 20-22 C, la ntuneric. Coloniile se numr dup 24 de ore, pentru probele inute la 37 C i dup 72 de ore pentru probele incubate la 20-22 C, imediat la scoaterea din incubator (etuv). Cu ajutorul unei lupe se numr coloniile i se iau n considerare numai probele n care se pot numra 50-300 de colonii. Numrul gsit pentru fiecare cutie se raporteaz la 1 ml de ap, n funcie de diluia corespunztoare i se adopt ca coninut final media numrtorilor, oferind un rezultat cuprins ntre limitele 50-300 pentru fiecare din cele 2 serii de culturi (la 37C i la 20-22 C).

2.2. METODA MEMBRANELOR FILTRANTE

n coada unei plnii Buchner (din sticl, porelan sau oel inoxidabil) se adapteaz un receptacul care conine o plac poroas (din sticl sau oel inoxidabil). Pe receptacul se aeaz cu atenie o membran filtrant de celuloz, de o anumit calitate (cu diametrul de 47mm, mprit n ptrate, ficare ptrat reprezentnd 1/100 din suprafaa total). Receptacul se monteaz la o lamp de vid.
8

nainte de trecerea probei de ap n plnie, toat instalaia de filtrare se sterilizeaz n autoclav la 121C. Se filtreaz un anumit volum din proba de analizat, apoi se spal plnia cu ap sterilizat. Toi germenii din proba de ap rmn pe membrana de celuloz. Cu ajutorul unei pense flambate se preleveaz membrana i cu faa inteferioar se aplic exact (fr s includ bule de aer) pe mediul de cultur dintr-o cutie Perti. Substanele nutritive dizolvate din mediu difuzeaz i permit dezvoltarea microbilor. Mediul nutritiv poate fi constituit din geloz peptonat cu extract de drojdie. Incubarea se poate face la 37 C, la 20-22 C sau la ambele temperaturi, dac s-au filtrat probe paralele de ap. Apoi se efectueaz numrtoarea, facilitat de mprirea suprafeei celulozei filtrante n ptrate. Metoda membranelor filtrante prezint un interes deosebit, deoarece se pot colecta microorganismele la suprafaa locului i n loc s se transporte probele de ap la laborator se trimite receptacolul cu membrana, nchise ermetic ntr-o cutie. Totodat, subliniem i faptul c aceast metod este inaplicabil pentru apele care conin numeroase suspensii minerale.

2.3. GERMENI TEST PENTRU CONTAMINAREA FECAL

Pentru depistarea contaminrii apei cu fecale se testeaz prezena germenilor califormi, streptococilor, bacteriilor sporulate Perfrigens i bacteriofagelor fecale.

2.3.1. COLIFORMI
Sunt microorganismele cele mai numeroase n materiile fecale. Depesc de 10-100 de ori enterococii i de 100-1000 ori perfringenii sporulai n probele de ap. n apele normale colibacilii nu mai ntlnesc aceleai condiii favorabile ca n intestin i de aceea dispar treptat. Astfel, colimetria (testarea germenilor coliformi) d rezultate foarte bune, atunci cnd este vorba de a depista o poluare recent. Coliformii sunt numeroi, ns amintim pe cei mai importani: genul ESCHERICHIA COLI specia ESCHERICHIA COLI ESCHERICHIA INTERMEDIUM ESCHERICHIA FREUNDII AEROHACTER AEROGENES KLEIBSIELLA AEROHACTER CLOACAE sau KLEIBSIELLA PARACOLOBACTRUM COLIFORME PARACOLOBACTRUM INTERMEDIUM PARACOLOBACTRUM AEROGENOIDES BACILLUS PARACOLI ANAEROGENES

AEROHACTER (KLEIBSIELLA)

PARACOLOBACTRUM

Diferenierea ntre speciile coliforme se poate efectua pe baza proprietilor acestora: dezvoltarea rapid n funcie de temperatur i mediu, fermentarea glucozei i lactozei cu producere de gaze, producere de aciditate, sintetizare de indol i acetilmetil-carbinol. Astfel ESCHERICHIA COLI se dezvolt bine i repede la 37C; fermenteaz glucoza sau lactoza la 44-45 C, cu producere de gaze; se dezvolt ntr-un mediu peptonat fenicat la 41,5C; produce indol prin cultur pe bulion peptonat la 44 C.

10

Toate speciile de ordinele Escherichia i Paracolobactrum, nsmnate pe un mediu de glucoz, pepton i la care se adaug fosfatul dipotasic, dezvolt aciditate (pus n eviden cu indicatorii rou de metil sau o-carboxibenzen azodimetilanilin). Speciile Klebsiella nu dau aceast reacie. Speciile Aerobacter i unele Paracolobactrum, nsmnate n acelai mediu de glucoz, pepton i K2HPO4, sintetizeaz compusul acetilmetil-carbinol, pus n eviden prin coloraia obinut cu naftol i NaOH. Speciile Escherichia nu dau aceast reacie. ESCHERICHIA INTERMEDIUM, AEROHACTER i majoritatea speciilor PARACOLOBACTRUM dezvolt amoniac, cnd se efectueaz culturi pe mediu citrat, fosfat de amoniu i alte sruri. Testul indicator cu bulion lactozat Se prepar un mediu concentrat (6g extract din carne de vit, 10g pecton, 10g lactoz) i un mediu diluat (3g extract de vit, 5g pecton i 5g lactoz). La ambele medii se adaug 1ml soluie alcoolic 3% de brom crezol purpur, se dizolv prin nclzire moderat cu ap distilat, se ajusteaz pH-ul la valoarea de 6,7-6,9 i se aduc separat la 1000ml ap distilat. Mediul concentrat se repartizeaz n eprubeta cu dimensiunile 220x22cm, iar mediul diluat n eprubete de 160x16mm. Volume de 10ml din mediile amintite, transvazate n eprubete i acoperite cu clopote de gaz, se sterilizeaz la 120C, timp de 20 minute. ntr-o serie de 10 eprubete cu mediul concentrat se introduc cte 10ml de ap. La fel, ntr-o serie de 5 eprubete cu mediul diluat se introduc cte 1ml din proba de ap, diluat de 10 ori, de 100 de ori i respectiv de 1000 de ori cu ap sterilizat. Toate eprubetele acoperite cu clopote de gaz se incubeaz la 130 C, timp de 48 de ore. Prezena coliformilor se pune n eviden prin virarea probelor de la rou-violet (pH>6,6), la galben (pH<5,4) i prin apariia gazelor n clopote. Estimarea numrului califormilor se efectueaz astfel: atunci cnd numrul de germeni este mic, numai eprubetele cu mediu n care s-a adugat ap de analizat nediluat arat reaciile pozitive i n acest caz se admite c fiecare din acceste eprubete conine cel puin o bacterie coliform. Dac numrul eprubetelor cu reacie pozitiv este n, numrul coliformilor n volumul de ap total real repartizat n eprubete n, se raporteaz n final numrul de coliformi la 100ml, n funcie de cantitatea de ap coninut n eprubete.
11

Se ntmpl i n cazul ca n eprubetele cu ap nediluat s se observe sau s nu se observe reacie, dar s se constate reacii pozitive n eprubetele cu probe diluate de ap i n acest caz se ine seama numai de acestea din urm. Astfel, dac se observ reacie n eprubeta care conine 1ml prob de ap diluat de 100 de ori, numrul de coliformi este 100x100 = 10000 pe 100ml prob. Microorganismele sunt rspndite ntr-un mod neuniform n probele de ap i din aceast cauz expresia numeric a rezultatului analizei se bazeaz pe calcule statistice, raportate la tabele indicatoare, care dau numrul cel mai probabil de germeni prezeni n 100 ml prob de ap. Numrul acesta, numit i indice NPP (n francez) sau MPN most probable number (n englez) se obine analiznd mai multe probe paralele, n aceleai condiii. Astfel, adugnd cte 10ml prob de ap n 5 eprubete cu mediul artat mai sus, sterilizat, dac reacia pozitiv se observ c n 1, 2, 3, 4, 5 eprubete, indicele NPP are valorile respective 2,2; 5,1; 9,2; 16,0; i . Testul indicator cu pepton tripsic i NaCl (Vincent) Se iau dou mediuri, unul mai concentrat (30g pepton tripsic, a0g NaCl). Se dizolv prin nclzire moderat cu ap distilat, se aduc la pH 7 i se completeaz cu ap distilat la 1000 ml. Se repartizeaz cte 10 ml din mediul concentrat n eprubete de 220x22mm i cte 10ml din mediul diluat n eprubete de 160x16mm. Se sterilizeaz 20 minute la 120C, n autoclav. n 10 eprubete cu mediul concentrat se transfer cte 10ml din proba de ap. La fel, n 5 eprubete cu mediul diluat se adaug cte 1ml din proba de ap i n 3 eprubete cu mediul diluat se adaug cte 1ml din proba de ap diluat respectiv de 10 ori, de 100 ori i 1000ori. n fiecare eprubet se adaug soluie 5% fenol n ap distilat, cu o pipet de 1ml, astfel nct concentraia final a fenolului n eprubet s fie de 0,85 . Probele se incubeaz timp de 48 ore la temperatura de 41,5C. Colibacilii sunt pui n eviden prin apariia unei tulbureli (opalescene). Estimarea se efectueaz ca i n cazul precedent, dar metoda prezint selectivitate, n special pentru colibacili.

12

Testul de confirmare cu lactoz biliat i verde brillant (Eikman) Mediul se prepar din 10g pepton tripsic i 10g lactoz, pentru 770ml ap distilat, la care se adaug 200ml bil (fiere) de vit, proaspt filtrat sau soluie 10% de bil deshidratat. Dup dizolvare, prin nclzire slab se potrivete pH-ul la valoarea de 7,2 i se trateaz cu 13,3ml soluie apoas 1 de verde brillant. Volume de 10ml se transfer n eprubete de 160x16mm cu clopot i se sterilizeaz 20 minute, la 120C. n eprubete cu bulion lactozat, care au dat reacii pozitive cu probele de ap cele mai diluate se transfer o pictur cu diametrul de 3mm din mediul (lactoz biliat-verde brilliant). Dup omogenizare, prin agitare lent, se sterilizeaz la 44C, n etuv, timp de 48 de ore. Apariia de gaze confirm prezena microorganismelor Escherichia coli.

Testul de confirmare cu eozin albastru de metilen Mediul solid se prepar din 10g pepton tripsic, 10g lactoz, 2g K2HPO4, 15g agar-agar, 0,4g eozin Y, 0,065g albastru de metilen i 1000ml de ap distilat. Se dizolv prin nclzire slab, se aduce la pH 7,2, se repartizeaz cte 15-20ml n eprubete de 220x22mm i se sterilizeaz 20 minute, la 120 grade Celsius. n vederea utilizrii, coninutul eprubetelor se topete cu ajutorul unei bi clocotite de ap, agitnd pn la apariia unei coloraii nchise purpur, se scurge n cutii Petri, cu diametrul de 90mm i se las s se solidifice n etuv, la 37 grade Celsius. Un grunte din acest mediu se transfer ca i mai sus n eprubetele cu bulion lactozat agitate, care au artar reacii pozitive pentru diluia maxim a probei de ap. Se incubeaz ntre 24 i 72 de ore, la 30 grade Celsius. Trei specii de Esherichia formeaz colonii mici, plate, colorate n violet nchis, cu reflexe metalice, mrginite de aureole roz, bacteriile Klebsiella formeaz colonii roz, convexe i cu un centru albstrui, iar microorganismele care nu fermenteaz lactoza formeaz colonii incolore.

13

Teste de verificare final Se aplic peste probele confirmate, cu mediile lactoz biliatverde brillant sau eozin-albastru de metilen i utilizeaz indolul, rou de metil, acetil-metil-carbinolul i citratul de sodiu. Prescurtat se numesc i teste IMVIC. Testul cu formare de INDOL 10g de pepton tripsic (fr indol) i 5g NaCl se dizolv prin nclzire uoar cu ap distilat. Se aduce la pH 7,2 i se completeaz la 1000ml cu ap distilat. Mediul se repartizeaz cte 10ml n eprubete de 160x16mm i se sterilizeaz timp de 20 minute n autoclav, la 120 grade Celsius. ntr-o serie din aceste eprubete se introduce cte un grunte din coninutul de reacie pozitiv al eprubetelor cu bulion lactozat sau pepton tripsic NaCl sau cte o poriune din coloniile dezvoltate n testele de confirmare i se in n etuv la 35 grade Celsius, timp de 24 de ore. n fiecare eprubet se adaug 0,3ml reactiv (5g paradimetil aminobenzaldehid n 75ml alcool izoamilic i 25ml HCl pur), se omogenizeaz prin agitare i se las n repaus 10 minute. n prezena speciei Escherichia coli stratul de alcool amilic se coloreaz n rou nchis. Dac stratul respectiv rmne galben, testul este negativ.

Testul cu rou de metil n 800ml ap se adaug 5g pepton tripsic, 5g glucoz i 5g fosfat dipotasic. Dup dizolvare, prin nclzire slab, timp de 20 de minute, se filtreaz, se potrivete pH-ul la valoarea de 7,5 i se completeaz volumul filtratului la 1000ml ap distilat. Volume de 10ml din aceast soluie se transfer n eprubete de 160x16mm sterilizate i apoi prin tindalizare se sterilizeaz, cte 20 minute consecutiv n trei zile. ntr-o serie de eprubete se nsmneaz cte un grunte din testele pozitive cu bulion lactozat, cu pepton tripsic NaCl sau cu o poriune din colonia dezvoltat pe mediul enzim-albastru de metilen i se in n etuv la 30 grade Celsius, timp de 5 zile. La 5ml din coninutul fiecrei eprubete se adaug cteva picturi de rou de metil (0,1g/l), 300 ml alcool etilic pur i se completeaz cu ap distilat 500 ml. Testul este pozitiv pentru coloraie roie (pH<4,4) i negativ pentru coloraie galben (pH>6).
14

Testul cu formare de acetilmetilcarbinol Se pregtesc eprubete cu soluii i se nsmneaz la fel ca i n cazul testului cu rou de metil. Apoi se in n etuv la 30 grade Celsius, timp de 48 de ore. Pentru a decela acetilmetilcarbinolul format de ctre cultur se adaug la 1ml din coninutul eprubetelor 0,6 ml soluie proaspt de alfa naftol (5g n 100 ml alcool etilic absolut) i 0,2 ml soluie de KOH 40%. Apariia unei coloraii rou purpuriu sau rubiniu, dup 2-4 ore, indic un rezultat pozitiv. Testul cu citrat Se prepar o soluie cu 1,5g NaNH4HPO4 * 4H2O, 1g K2HPO4, 0,2g MgSO4* 7H2O, 2,5-3g citrat trisodic cristalizat i ap distilat pn la 1000ml. Se ajusteaz pH-ul la valoarea de 6,8 i cte 5ml din soluie se repartizeaz n eprubete de 160x16mm. Se sterilizeaz 20 de minute, la temperatura de 120 grade Celsius. Se nsmneaz din aceleai culturi ca i n cele trei teste precedente, cu ajutorul unui fir de platin, pentru a evita, introducerea altui mediu nutritiv n afar de citrat. Se incubeaz n etuv la 30 grade Celsius, timp de 72-96 de ore. Dezvoltarea unor colonii constituie testul pozitiv. Cele 4 teste verificative (IMVIC) dau unele indicaii preioase asupra diferenierii speciilor bacteriene, aa cum se arat n tabelul 1.

15

Tabelul 1 Diferenierea speciilor bacteriene cu teste IMVIC Specia Escherichia Coli Escherichia Intermedium Escherichia freundii Aerobacter aerogenes Aerobacter Cloaccae Paracolobactrum intermedium Paracolobactrum aerogenoides Indol + +/+/+/+/+/Rou de metil + + + + +/Teste Acetilmetilcarbinol + + +/Citrat trisodic + + + + + +

Prin semnele + i se indic test pozitiv i respectiv test negativ. Teste cu membrane filtrante 100 ml de prob de ap potabil se filtreaz prin membrane (vezi metoda membranelor filtrante). Membrana cu concentratul de microorganisme se aplic peste un mediu de cultur preparat ca mai jos. Prin nclzire moderat se dizolv n 1000ml ap distilat 5g extract de carne, 10g pepton, 20g lactoz, 6g extract de drojdie de bere, 5ml soluie 1% albastru de bromtimol i 20g de agar splat. Se potrivete pH-ul la valoarea 7,2 se repartizeaz cte 100ml n vase de 150ml se astup vasele i se sterilizeaz 20 minute, la 120 grade Celsius.

16

Pentru utilizare, se lichefieaz coninutul vasului prin nclzire pe baie de ap i se trateaz cu 5ml soluie apoas 0,05% clorhidrat sau bromhidrat de trifeniltetrazoliu sterilizat i 5ml soluie apoas 0,2% de tergitol T (3,9 dietiltridecanol 6 sulfat de sodiu). Amestecul omogenizat prin agitare se transfer ntr+un strat cu grosimea de minimum 5mm n cutii Petri sterilizate. Se poate conserva 8 zile la 4-6 grade Celsius. Cnd totul este pregtit pentru analiz se usuc coninutul cutiilor Petri descoperite la 37 grade Celsius i peste mediu se aplic membrana cu concentratul de microorganisme. n mod obinuit, pentru fiecare prob de ap se obin dou membrane, fiecare aplicndu-se pe un mediu identic, dar separat. Probele se incubeaz, una la 37 grade Celsius i cealalt ntr-o atmosfer foarte umed la 44 grade Celsius i se studiaz dup 24 de ore. Escherichia formeaz colonii galbene cu centrul oranj, iar Klebsiella dau colonii roii numai prin incubare la 37 grade Celsius. Pe membrane filtrante se pot aplica toate testele IMVIC. Apele poluate cu germeni coliformi pot fi utilizate n agricultur, aa cum se constat n tabelul 2.

17

Tabelul 2 Calificarea apei i domeniile de utilizare dup indicatorii infecio-contagioi Calitatea apei Potabil Moderat poluat Germeni Coliformi/dm Pn la 10 10 - 10 Posibiliti de utilizare Utilizat pentru toate solurile i plantele Utilizat pentru toate solurile i plantele, cu excepia solurilor foarte permeabile i a plantelor cu destinaia alimentar i furajer n stare proaspt sau conservat prin congelare, murare, fr prelucrare termic Utilizat numai pentru soluri cu pnza de ap freatic peste 4m i pentru culturi ale cror produse sunt lucrate termic industrial, precum i produse vegetale, nealimentare.

Intens poluat

Peste 10

18

2.3.2. ENTEROCOCII
Streptococii fecali sau enterococii, existeni n mod normal n cile aparatului digestiv, n anumite condiii pot provoca unele maladii, ca enterocolite, afeciuni genitale, endocardite sau chiar septicemii. Cu mult mai puin rezisteni fa de coliformi, streptococii fecali dispar repede n apele naturale i sunt descompui instantaneu atunci cnd se efectueaz o dezinfecie cu ozon sau chiar clor liber. Enterococii, reprezentai prin Steptococus faecalis este o bacterie aerobian, se dezvolt uor pe medii de cultur obinuit la 37 grade Celsius i pot rezista chiar i 30 minute la 56 de grade Celsius. Prezena streptococilor fecali n ape poate fi pus n eviden cu ajutorul a dou teste succesive: azotur de sodiu i etil violet. Testul indicator cu pepton-glucoz-azotur de sodiu Se prepar dou medii: unul concentrat ( 30g pepton, 10g glocoz, 10g clorur de sodiu, 5,4g fosfat dipotasic, 0,4g azotur de sodiu) i altul diluat ( 20g pepton i jumtatea din cantitatea celorlalte substane). Se dizolv n ap distilat, prin nclzire slab, se potrivete pH-ul la valoarea 6,9-7 i se completeaz fiecare soluie cu ap distilat pn la un litru. n eprubete de 220X22 mm se repartizeaz cte 10 ml din mediul concentrat i n eprubete cu dimensiunile de 160X16 mm se transfer cte 10 ml din mediul diluat. Sterilizarea se efectueaz 20 de minute la 120 grade Celsius. n 5 eprubete din mediul concentrat se transfer cte 10 ml prob de ap, n dou eprubete cu mediul diluat se transfer cte 1ml prob de ap i n alte 3 eprubete cu mediu diluat se transfer cte 1 ml diluat de 10 ori, de 100 de ori, respectiv de 1000 de ori, cu ap sterilizat. Probele se incubeaz 24-48 de ore, la temperatura de 37 grade Celsius i apariia unei opalescene indic testul pozitiv. Estimarea se efectueaz aritmetic sau prin indicele de probabilitate, aa cum s-a artat la testul indicatori pentru coliformi, cu bulion lactozat.

19

Testul de confirmare cu azotur de sodiu i violet de etil Mediul se prepar asemntor cu mediul diluat din testul indicator de mai sus, cu deosebirea c se adaug 0,3 grame azotur de sodiu i 5ml de soluie apoas 0,01% de violet de etil. Se dizolv n ap distilat prin nclzire, se aduce la pH 7, se completeaz la 1 litru cu ap distilat. Apoi, cte 10 ml din soluie se transfer n eprubete de 160X16 mm i se sterilizeaz n autoclav 20 de minute la 120 grade Celsius. Cte o granul din proba pozitiv ( testul indicator anterior) se transfer ntr-o serie de eprubete cu mediu pe baz de violet de etil i se incubeaz 24-48 de ore la temperatura de 37 grade Celsius. Apariia unei tulbureli sau a unei aglomeraii violete, care se depune, confirm prezena streptococilor fecali.

2.3.3. BACTERII PERFRINGENS

Dintre bacteriile PERFRINGENS care triesc n intestin se deosebesc Clostridium welchii i Clostridium sporogenes. Existena sub form de spori le confer o rezisten foarte mare n timp ndelungat i n condiii defavorabile i din aceast cauz prezna lor n ape poate arta o poluare veche cu fecale. Interesant de semnalat este faptul c bacteriile perfringens rezist la cldur ct i la aciunea dezinfectant cu clor sau fenol. Proprietatea de a se dizolva pe un mediu care conine sulfit de sodiu i de a reduce ionul sulfit la hidrogen sulfurat, acesta din urm uor detectabil, d posibilitatea punerii n eviden a bacteriilor respective. Testul cu ficat carne-sulfit Mediul se preapr la 48-56 de grade Celsius, cu 9 litri de ap, n care se adaug 1,8 kg carne de vit degrasat, uscat i mrunit, 0,5 kg de ficat de vit uscat i mrunit, 75 ml HCl pur i 5 g pepsin cu titrul 500. amestecul se nclzete pe baie de ap la 40 grade Celsius, 20 de ore agitnd din timp n timp i n final se fierbe 5 minute. Se filtreaz. Bulionul se transfer n baloane i se sterilizeaz 20 de minute, la temperatura de 120 grade Celsius.

20

Un volum de 1000 ml din bulion se aduce la pH 7,6 cu NaOH i se trateaz cu 15 g agar splat. Se dizolv prin nclzire uoar i se sterilizeaz 10 minute la temperatura de 120 grade Celsius. Se filtreaz printr-o hrtie n atmosfer de vapori i se trateaz cu 2 g glucoz. Mediul, n volume de cte 20 de ml se transfer n eprubete cu dimensiunile de 220X22 mm i se sterilizeaz 30 de minute la 115 grade Celsius. Un numr de 4 eprubete cu mediu se topesc pe o baie de ap n clocot, n fiecare se adaug 1 ml soluie 10% tiosulfat de sodiu n ap sterilizat i 4 picturi de alaun feric 5% n ap sterilizat. Se amestec fr a introduce bule de aer. n alte 4 eprubete se introduc cte 5 ml de ap care se analizeaz, nclzit n prealabil 5 minute la temepratura de 80 grade Celsius, pentru a distruge toate bacteriile, cu excepia celor sporulate i peste aceste probe se transfer coninutul eprumetelor cu mediu sulfit. Se omogenizeaz prin amestecarea lent pentru a nu introduce bule de aer. Se incubeaz 24-48 de ore, la temepratura de 37 grade Celsius. Testul pozitiv se prezint prin dezvoltarea unor colonii nconjurtoare de o aureol neagr, care se numr n cei 20 ml prob de ap din cele 4 eprubete.

2.3.4. BACTERIOFAGE FECALE

Exist unele bacterii care triesc i se dezvolt prin consumarea altor bacterii, mpiedicnd manifestarea microbian a acestora din urm. Bacteriofagele sunt virui invizibili la microscopul obinuit, dar se pot fotografia la microscopul electronic. n aceste cazuri, bacteriofagii sunt elaborate de bacterii nsi i devin active fa de acestea. Deci, bacteriofagele triesc n toate mediile n care exist bacterii i punerea acestora n eviden conduce la indicaii preioase privind poluarea mediului respectiv. Analiza bacteriofagelor fecale nu se efectueaz n laboratoarele obinuite de supraveghere a apelor, ci numai n laboratoare speciale. Principiul pe care se bazeaz analiza este urmtorul: la un anumit volum din proba de ap care se analizeaz se adaug o cultur din specia bacterian ale ctei bacteriofage speciale se cerceteaz.

21

Dup incubare, se distruge colonia bacterian dezvoltat fr s se altereze eventualele bacteriofage preznte i active. De exemplu, prin nclzire la 56 de greade Celsius, timp de 30 de minute de distruge o colonie de Escherichia coli (dezvoltat prin incubarea la 37 de grade Celsius), fr s se distrug i bacteriofagele respective. Apoi la mediu se adaug o nou cultur din specia bacterian i dac aceasta nu se dezvolt, dup o nou incubare la 37 de grade Celsius, nseamn c n mediu sunt prezente bacteriofagele.

2.3.5. GERMENII PATOGENI

Aa cum s-a mai amintit, microbii patogeni sunt n numr foarte redus, fa de bacteriile fecale i din cauza condiiiloe neprielnice din ap, precum i datorit aciunii suprimante a bacteriilor fecale i a bacteriofagelor proprii, aceti microbi patogeni dispar treptat din mediul de analizat. Deci, analiza acestora n probele de ap trebuie efectuat imdiat dup recoltare. Germenii tifoidici (Salmonella) i germenii dezinterici (Shigella) Pentru analiz se recolteaz un volum mare de ap (minim 1 litru), n care germenii patogeni amintii se concentreaz pe hidroxid de aluminiu. Dup separare, prin centrifugare, la reziduu se adaug medii selective care blocheaz dezvoltarea bacteriilor fecale. Astfel, pentru Salmonella mediul selectiv faborabil este tetraionatul de sodiu, selenitul de sodiu sau sruri biliare, iar pentru Shigella sruri biliare sau eozin i albastru de metilen. Punerea n eviden a acestor germeni se poate efectua i cu ajutorul reaciilor antigenice (aglutinai specifici) de ctre laboratoarele foarte specializate.

22

Germenul holerei ( Vibrio comma ) Germenul fiind aerofil, se concentreaz i se dezvolt la suprafaa unei probe de ap, peptonat, salificat, adus la pH 8-9 i incubat la temepratura de 37 grade Celsius. O pictur din concentratul de la suprafa se nsmneaz ntr-un mediu selectiv de snge defibrinizat i alcalinizat la pH 8-9. colonii translucide de vibrio comma apar imediat, dar se dezvolt i n timp, naintea altor microbi. Dup separare, vibrionul se identific prin producerea de indol i nitrit ntr-o prob de ap tratat cu pepton i nitrat, prin fermentarea fructozei, fr fermentare de gaze, prin nefermentarea lactozei, prin lichefierea felatinei i aglutinizarea germenului de ctre un ser antivibrion holeric. Germenul icterului infecios Este o protozoobacteriacee patogen, care trebuie deosebit de cea nepatogen. Ambele specii sunt aerobiene stricte, de form spiralic, nu rezist la peste 50 grade Celsius i sunt dificile de a fi cultivate n laborator. Se pare, c totui se pot cultiva cu rezultate acceptabile pe ser de iepure, diluat cu o soluie fiziologic clorurat i adus la pH 7,6 (mediul lui Pettit). Dup Buttiaux (citat la metoda membranelor filtrante) metoda sigur de identificare a microbulului icterului infecios n ape este inocularea n cobaiul galben a unui concentrat obinut prin centrifugarea unui mare volum de ap. Dac dup cteva zile cobaiul moare, testul este pozitiv.

23

2.3.6. BACTERII AUTOTROFE

Germenii autotrofi se hrnesc numai cu substane minerale. Acetia sunt: nitrozanii, denitrifianii, fixatori de azot, atmosferic, sulfatoreductorii, sulfhidro-oxidanii, siderobacterii. Aciunea nedorit a bacteriilor autotrofe se manifest prin colorarea i tulburarea apei, corodarea instalaiilor de canalizare, apariia de depozite solide sau gelatinoase n interiorul conductelor de ap. n prezent se efectueaz studii pentru decelarea acestor bacterii i pentru gsirea mijloacelor de a le face inofensive.

24

CONCLUZII
Microorganismele din ap provoac maladii foarte grave, cum ar fi: febra tifoid, dizenteria, holera. Exist maladii pe baz de virui, care se pot rspndi prin intermediul apei: hepatita infecioas i poliomielita. Maladiile infecioase sunt cauzate de poluarea cu fecale. Metodele folosite pentru tratarea apei, pentru a elimina microorganismele din ap sunt: metoda culturii pe geloz nutritriv; metoda membranelor filtrante; metoda testelor pentru determinarea contaminrii cu fecale; cu germenii test: germenii coliformi, streptococi, bacterii sporulate Perfrigens i bacteriofage fecale. Pe lng bacteriile fecale, n apse mai gsesc i microbi (germeni) patogeni. Analiza acestora, n probele de ap trebuie efectuat imediat dup recoltare. Dintre germenii patogeni amintim: germenii tifoidici (Salmonella) i germenii dezinterici: Shigella), germenul holerei (Vibrio comma), germenul icterului infecios. Germenii autotrofi (bacteriile autotrofe) se hrnesc numai cu substane minerale. Acetia sunt: nitrozanii, nitrifianii, denitrifianii, fixatorii de azot atmosferic, sulfato-reductorii i sulfhidro-oxidanii. Lucrarea realizat este foarte important, deoarece prezint aproape toate metodele de analiz abcteriologic a apei.

25

BIBLIOGRAFIE 1. A. FLORESCU; D. NICULESCU; V. ISTODE Cartea instalatorului de reele de ap i canalizare Editura Tehnic Bucureti 1987 2. OVIDIU IANCULESCU; GH. IONESCU; RALUCA RACOVIEANU Epurarea apelor uzate Editura Matrix Rom Bucureti 2001

C. PTROESCU I.GNESCU Analiza apelor Editura Scrisul Romnesc Craiova 1980

3.

4.

I. TEODORESCU; N. FLORESCU Utilizrile apei n industrie Editura Tehnic Bucureti 1989

5. BLITZ Epurarea apelor uzate menajere i oreneti Editura Tehnic Bucureti 1990

6.

LUMINIA VLDESCU; LINA CHIRU Chimie (manual pentru clasa a IX-a) Editura All C1 Bucureti 1999

26