ELETROFORESE

Tcnica de separao de partculas atravs de corrente eltrica 1-Identificao de substncias 2-Homogeneidade de sistemas biolgicos 3-Determinao de pontos isoeltricos

Plo -

Plo +

ELETROFORESE LIVRE
Arne Tiselus- Premio Nobel em 1948

Este mtodo de soluo livre, era bastante limitado devido perturbaes: -ondas mecnicas -movimentos de conveco do lquido pelo aquecimento da soluo causado pela aplicao da diferena de potencial Perturbaes fazem com que a eletroforese se torne processo muito pouco reprodutvel , com as cargas de mesma natureza no migrando juntas, mas sim, dispersas.

Mtodos para minimizar estes problemas:

1-MATRIZES RGIDAS- SUPORTES papel de filtro, slica gel, membranas de acetato de celulose, gel de agarose, amido ou poliacrilamida, entre outros.

A eletroforese que utiliza suporte tambm conhecida como eletroforese de zona: Iniciada por Knig em 1937 na separao de veneno de cobra recorrendo a papel de filtro como meio-suporte, em 1946, Martin retomou esta eletroforese.
.

Dependendo do suporte que utilizamos para a eletroforese e da natureza das macromolculas, podemos separ-las: 1- com base na carga 2- com base em seu tamanho

Os suportes em gel apresentam grande capacidade de separar as molculas com base no tamanho molar

Eletroforese em suporte de papel muito eficiente no que diz respeito a separao de partculas com grande diferenas de cargas

Substncias anfteras indispensvel manter constante o pH do meio durante a eletroforese, pelo uso de solues-tampo.

Os principais tipos de eletroforese so: 1- Eletroforese capilar 2- Eletroforese em gel

ELETROFORESE EM GEL
1.Separar partculas por diferena de carga e massa 2.Aplicaao de corrente eltrica sobre o gel 3.Isolar DNA RNA e protenas

Eletroforese em gel de agarose

1-Gel gelitificado de agarose 2-Separa fragmentos longos de DNA 3-Corrente eltrica sobre gel 4-Partculas menores tem maior velocidade de chegar ate o plo positivo

Eletroforese em gel de policrilamida

1-Fragmentos pequenos de DNA ou outra molecula 2-Recupera e purifica amostras 3-Em cubas de vidros 4-Aplicacao de corrente

O gel de policrilamida pode ser:

1-Desnaturante : com presenca de ureia, separa e purifica fitas simples 2-No desnaturante : separa e purifica fitas duplas, sem presenca de ureia

ELETROFORESE CAPILAR EM ZONA OU EM SOLUO LIVRE

1- A ELETROFORESE CAILAR DE ZONA OU SOLUO LIVRE o modo mais utilizado devido simplicidade do equipamento e maior facilidade na otimizao das condies experimentais. 2- o capilar e os reservatrios contendo os eletrodos so cheios com um tampo (denominado eletrlito carreador), o qual conduz a corrente eltrica e fornece a capacidade tamponante. 3-se introduz uma amostra contendo uma mistura inica no capilar como uma banda de pequena espessura

4-Quando o campo eltrico aplicado, foras eltricas atuam nas cargas da camada difusa. 5-os ons arrastam molculas de gua, formando um fluxo que direcionado para o catodo, enquanto a parede do capilar permanecer negativa.

Eletroforese Capilar no Seqenciamento Automtico de DNA

1-Para decifrar o cdigo gentico humano, os cientistas do Projeto Genoma tiveram de enfrentar a enorme tarefa de localizar as dezenas de milhares de genes que se encontram no DNA humano e em seguida fazer o seqenciamento dos cerca de 3 bilhes de pares de bases contidas nos cromosomas

2-Com a tecnologia normalmente usada no incio dos anos 90, essa tarefa levaria bem mais de10 anos, com o custo de alguns bilhes de dlares. Foi o desenvolvimento da tcnica de eletroforese capilar, combinada ao uso de radiao laser, que permitiu acelerar o processo, uma vez que essa tcnica potencialmente de 50 a 100 vezes mais rpida que o mtodo tradicional.

3-A tcnica tradicional para seqenciamento de DNA o mtodo de Sanger, desenvolvida por Frederick Sanger, um dos ganhadores do prmio Nobel de Qumica de 1980. Esse mtodo utiliza enzimas especiais para sintetizar fragmentos de DNA que terminam quando uma determinada base (adenina, citosina, guanina ou timina) aparece ao longo da seqncia.

Na anlise STR, os examinadores devem: 1. extrair o DNA das clulas da amostra quantificar o DNA 2. transformar o DNA utilizando a tnica de PCR 3. utilizar eletroforese capilar para extrair o DNA transformado

CURIOSIDADE:

4-A anlise via Reao em Cadeia da Polimerase (PCR) uma tcnica mais recente que pode transformar o DNA em uma amostra bem menor. 5-O banco de dados CODIS do FBI utiliza amostras que passaram pela anlise STR examinando 13 locais. A probabilidade de duas pessoas possurem perfis STR de 13-loci idnticos de cerca de uma em um bilho.

Eletroforese Capilar em Gel (ECG)

1- Utilizada exclusivamente para separao de macromolculas 2- Quando a razo carga/raio dos analitos to prxima, que no possvel separ-los com o uso da eletroforese de zona tradicional. 3- ons menores migram mais rapidamente enquanto que solutos maiores ficam mais tempo retidos.

Princpio da Eletroforese Capilar em Gel

4- Teve incio com a utilizao de colunas

preenchidas com gis qumicos. 5- Esse mtodo foi descartado dado o grande nmero de problemas que surgiram,como: - aparecimento de bolhas (perda de condutividade), - reteno de fragmentos com alto peso molecular, - degradao do gel por hidrlise.

6- Tais problemas levaram formulao de novos

sistemas, denominados gis fsicos. 7- Gis fsicos: matrizes polimricas hidroflicas, dissolvidas em tampo apropriado -eliminar o fluxo eletroosmtico atravs de uma ligao covalente com os grupos da superfcie capilar -evitar a extruso do gel durante operao do sistema, atravs da ligao covalente com o gel

8- Os gis so estruturas delicadas, sujeitas a

mudanas de morfologia pela ao da

temperatura pH fora inica concentrao do meio.

9- Uma das principais vantagens de realizar

separaes por ECG que o formato do capilar, preenchido com gel possibilita a dissipao eficiente do calor gerado pelo efeito Joule, em razo da geometria do capilar e das propriedades anti-convectivas do gel.

Seqenciamento do DNA

Diferentes sistemas de revelao dos gis: a) brometo de etdio; b) nitrato de prata; c) raio X; d) quimiluminescncia; e) coomasie blue e f) fast blue BB salt, a e naftil acetato.

Aplicaes
1- Identificao de pessoas: em testes de
paternidade, comparando o DNA do suposto pai, da me e do filho; 2- na identificao de criminosos. 3- Na Industria Farmacutica (Vacinas, Reagentes de diagnstico); 4- Na Agropecuria (Animais e plantas transgnicos).

1. Coleta do sangue DNA

Como feito o exame de paternidade? 3. Digesto do 2. Extrao do 3. Amplificao do

DNA DNA

4. Eletroforese

5a. Southern Blotting

Hibridizao da membrana de nylon

6. Visualizao

Figura Incluso - Observe que um dos alelos (banda) do filho proveniente da me e o outro alelo proveniente do suposto pai. Neste

Figura Excluso - Observe que um dos alelos (banda) do filho proveniente da me. O outro alelo, no entanto, difere dos alelos do suposto pai. Neste caso, ocorreu uma