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UNIVERSIDADE FEDERAL DA BAHIA UFBA INSTITUTO MULTIDISCIPLINAR DE SADE IMS BIOQUMICA I

Profa. Ms. Danila Souza Oliveira Coqueiro Roteiro de Aula Prtica: Espectrofotometria A capacidade que as diversas substncias qumicas tm de absorverem luz em determinados comprimentos de onda pode ser utilizada para a sua determinao quantitativa e qualitativa, uma vez que o espectro de absoro caracterstico para uma determinada substncia e a quantidade de absoro (intensidade) dependente da concentrao do composto. A determinao da concentrao de um soluto em uma soluo problema por espectrofotometria envolve a comparao da absorbncia da soluo problema com a soluo de referncia, na qual j se conhece a concentrao do soluto. Em geral, utilizada uma soluo-padro com diferentes concentraes (pontos), que tem sua absorbncia determinada. Esses pontos so preparados diluindo-se a soluo-padro na proporo necessria para obteno das concentraes desejadas. Com os valores de absorbncia e de concentrao conhecidos, pode-se traar um grfico cujo perfil conhecido como curva-padro ou curva de calibrao. Nesse grfico, a reta, que deve passar obrigatoriamente pela origem, indica a proporcionalidade entre o aumento da concentrao e da absorbncia e a poro linear correspondente ao limite de sensibilidade do mtodo espectrofotomtrico para o soluto em questo. OBJETIVO Determinar o espectro de absoro da soluo de alaranjado de metila Caracterizar o comprimento de onda onde ocorre absoro mxima Construir uma curva-padro para o corante no comprimento de onda () adequado MATERIAIS E REAGENTES Materiais Espectrofotmetro Agitador para tubos Grade com tubos de ensaio (10 ml) Pipeta automtica de 1 ml Ponteiras de 1 ml Cubetas de vidro Papel guardanapo macio Frasco para descarte gua destilada Papel toalha Reagentes Alaranjado de metila 0,01 mg/ml (diluir 1mg em 100 ml de gua)

PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL 1. Utilizar cubetas padronizadas (absorbncias prximas no = 450 nm); 2. Em uma cubeta, colocar 2 ml de alaranja de metila 0,01 mg/ml; 3. Utilizando gua destilada como branco, calibrar o espectrofotmetro em T = 100% (Abs = 0); 4. Varrer o espectro com a soluo conforme esquema abaixo, calibrando o espectrofotmetro com o branco em cada utilizado: (nm) Abs alaranjado de metila 430 440 450 460 470 480 490 500 510
5.

Selecionar o mximo da soluo

para a construo da respectiva curva-padro; 6. Utilizando o mximo, construir a curva-padro para alaranjado de metila a partir do quadro 1.

UNIVERSIDADE FEDERAL DA BAHIA UFBA INSTITUTO MULTIDISCIPLINAR DE SADE IMS BIOQUMICA I

Quadro 1: Dados para construo das curvas-padro de alaranja de metila Tubo Alaranjado de gua (ml) Diluio metila (ml) (vezes) 1 2,0 2 0,5 2,0 3 1,0 1,5 4 1,5 1,0 5 2,0 0,5 6 2,0 -

Abs (nm) 0,000

Concentrao (mg/ml) 0,00

0,01

7. Com os dados do quadro, calcular quantas vezes cada tubo foi diludo utilizado a frmula: Diluio = volume final/volume da soluo-me 8. Calcular a concentrao das solues de alaranjado de metila diludas: [ ]alaranja de metila = [ ] soluo me/diluio
9. Colocar em grfico, as leituras de absorbncia (A) x concentrao (mg/ml); 10. Aplicar os dados regresso linear, encontrando a equao da reta e o coeficiente de regresso linear

(R2) AVALIAO Ser avaliada a participao dos alunos nas atividades propostas e a habilidade na elaborao do relatrio. QUESTES
1. Porque se utiliza um branco na dosagem espectrofotomtrica de uma substncia?

2. Qual a importncia de se utilizar uma curva-padro quando se deseja quantificar uma determinada amostra de concentrao desconhecida?