RESSONNCIA MAGNTICA

NUCLEAR: Gradus Primus*

PESQUISA
Cludia Jorge do Nascimento
Professora do Instituto de Qumica - UnB

Carlos Bloch Jr.

Professor do Instituto de Qumica - UnB Pesquisador da EMBRAPA Recursos Genticos e Bioctenologia cbloch@cenargen.embrapa.br

* Primeiros passos
INTRODUO Por quase meio sculo, a determinao de estrutura tridimensional (3D) de protenas vem sendo feita por mtodos de cristalografia e difrao de raio-X; inquestionvel a importncia e a contribuio que aplicaes dessa tcnica tm proporcionado Bioqumica. Entretanto, h mais ou menos vinte anos, a Ressonncia Magntica Nuclear (RMN), que j ocupava um local de destaque nos estudos estruturais de pequenas molculas, comeou a ser utilizada na determinao da estrutura tridimensional de peptdeos e protenas em soluo, independentemente de dados cristalogrficos. Para que isso fosse possvel, sensveis avanos na instrumentao e na metodologia dessa tcnica tiveram que ocorrer, incluindo-se, entre os mais importantes, o uso de campos magnticos homogneos de alta intensidade, novas tcnicas de pulso e a introduo de mtodos computacionais mais avanados para a produo e a interpretao dos dados de RMN de macromolculas. Atualmente, mais de duas mil estruturas 3D de protenas determinadas por RMN tm suas coordenadas atmicas depositadas no Brookhaven Protein Data Bank (http:// www.rcsb.org/pdb/) e esse nmero vem crescendo rapidamente. Verificaram-se tambm significativos progressos na determinao estrutural de outros biopolmeros por RMN, como o caso dos cidos nuclicos e dos oligossacardeos, antes obtidos
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Figura 1: A Radiao Eletromagntica

apenas por difrao de raio-X. Com a chegada da era ps-genmica, nunca se exigiu tanto dos mtodos para obteno de estruturas 3D de biomolculas. Tradicionalmente, esse trabalho tem sido efetuado com caractersticas quase artesanais devido alta complexidade da tarefa, ao tempo necessrio para a obteno de apenas uma estrutura (vrios meses) e aos elevados custos com infraestrutura e manuteno. Por essas e por outras razes que o uso da RMN em Bioqumica ainda se encontra restrito a poucos grupos de excelncia espalhados pelo mundo e que seus fundamentos tericos permanecem obscuros para a maioria daqueles que tm algum interesse nos mais recentes avanos dessa nova era de descobertas cientficas. O presente artigo tem como objetivo primordial oferecer a leitores que no sejam da rea de RMN, mas que possuam noes bsicas em fsica e em qumica, uma viso global dos fenmenos que fundamentam essa tcnica, e da maneira como tais fenmenos so utilizados no processo de determinao estrutural de substncias relativamente simples, permitindolhes dar os primeiros passos para uma melhor compreenso das metodologias desenvolvidas na obteno de estruturas 3D de moleculas bem mais complexas (peptdeos, protenas e cidos nuclicos) disponveis na literatura. importante ressaltar que a abordagem escolhida ser bastante simplificada, uma vez que para uma verdadeira compreenso do fenmeno que representa a Ressonncia Magntica Nuclear seria necessria uma descrio em termos de Mecnica Quntica, com a utilizao de operadores qunticos e matrizes de densidade, 1-4 o que est fora dos objetivos deste artigo.

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PRINCPIOS BSICOS DA ESPECTROSCOPIA DE RESSONNCIA MAGNTICA NUCLEAR A Espectroscopia o estudo da interao da radiao eletromagntica (REM) com a matria. Essa radiao pode ser vista como uma onda com duas componentes, uma eltrica e outra magntica, que oscilam perpendicularmente entre si, sendo ambas tambm perpendiculares direo de propagao da luz (Figura 1). A interao entre a radiao eletromagntica e a matria pode ocorrer de duas formas: pela sua componente eltrica ou pela sua componente magntica. Uma das diferenas fundamentais entre a RMN e as outras formas de espectroscopia reside no fato de que, na RMN, essa interao se d com o campo magntico da REM e no com o campo eltrico, como o caso, por exemplo, do infravermelho ou do ultravioleta. A REM de interesse em anlises qumicas vai desde os raios gama (alta energia) at as ondas de rdio (baixa energia). Para cada tipo de espectroscopia exigido um tipo de excitao e, para cada uma delas, existe uma quantidade definida de energia, ou seja, esses fenmenos so quantizados. Isso quer dizer que uma radiao de freqncia determinada e caracterstica absorvida para uma determinada transio. A RMN encontra-se na regio das ondas de rdio (radiofreqncias). Em princpio, pode-se dizer que a RMN uma outra forma de espectroscopia de absoro. Em um campo magntico, sob determinadas condies, uma amostra pode absorver REM na regio da radiofreqncia (rf), absoro essa governada por caractersticas da amostra. Essa absoro funo de determinados ncleos presentes na molcula, que so sensveis radiao aplicada e, por isso, esses ncleos so alvo de estudo para a compreenso da RMN. 1- A DEFINIO DE SPIN NUCLEAR

Tabela 1: Mostra a correlao existente entre o nmero atmico (Z) e o nmero de massa (A) com o nmero de spin (I) A Z Exemplos * I 1 mpar Par ou mpar H(1/2), 17O (5/2), 15N (1/2) Meio inteiro 2 Par mpar H (1), 14N (1), 10B (3) Inteiro 12 Par Par C (0), 16O (0), 32S (0) Zero * O nmero entre parnteses indica o nmero de spin I do ncleo exemplificado

A grandeza fsica envolvida em RMN o spin nuclear. O conceito de spin nuclear provm da Mecnica Quntica, no possuindo conceito equivalente na Mecnica Clssica. Esse conceito fundamental para a compreenso do fenmeno e pode ser compreendido como uma propriedade que determinados ncleos apresentam. Tais ncleos, devido sua configurao nuclear, assumem um comportamento caracterstico de momento angular, capaz de gerar um momento magntico (Figura 2), pois uma carga em movimento gera um campo magntico. O momento magntico gerado pode ser descrito em termos do nmero de spin I, cujos valores, calculados pela mecnica quntica5,6, podem ser 0, 1/2, 1, 3/2 etc. Como se sabe, ncleos que apresentam tanto massas atmicas quanto nmeros atmicos

pares no possuem spin, sendo, conseqentemente, o nmero de spin igual a zero. o caso do 12C, 16O, 32S etc. (Tabela 1). Esses ncleos no tm momento angular associado e, portanto, no exibem propriedades magnticas, o que implica a ausncia de sinais detectveis por RMN. Ncleos com spin I 0 so, em princpio, detectveis por RMN. A deteco desses ncleos est relacionada a condies experimentais especiais, que no sero aqui abordadas. Dentre os diferentes ncleos detectveis por RMN, ncleos com I = so bastante apropriados para uma compreenso mais simplificada da tcnica.

2- APLICAO DE UM CAMPO MAGNTICO: A ENERGIA E A FREQNCIA EM RMN Na ausncia de um campo magntico, os spins nucleares esto orientados randomicamente, no apresentando nenhuma orientao definida (Figura 3). Entretanto, quando uma amostra submetida a um campo magntico externo B0, de alta intensidade e homogneo, os spins nucleares tendem a assumir determinadas orientaes. Segundo a mecnica quntica, o nmero de spin I determina o nmero de orientaes que um ncleo pode assumir diante de um campo magntico externo pela relao7: nmero de orientaes possveis = 2I + 1 No caso de um ncleo com nmero de spin I = , apenas duas orientaes so possveis, quando h aplicao de um campo magntico: uma parcialmente alinhada com o campo magntico aplicado e outra parcialmente contra o campo magntico (Figura
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Figura 2: Momento magntico gerado a partir do momento angular

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Figura 3: Spins randomicamente orientados

4). O ngulo que define a orientao do vetor com relao a B0 tambm determinado pela mecnica quntica (seus valores aproximados so 55 e 125). As duas orientaes representam diferentes estados energticos. Isso acontece porque um ncleo com spin cria seu prprio campo magntico, como j mencionado. Quanto mais paralelo forem esses dois campos (o do ncleo e o campo magntico externo), menor ser a energia desse estado. Assim, o estado de menor energia aquele que se encontra parcialmente alinhado com o campo e denominado estado (ou +), e o estado de maior energia, o parcialmente contra, denominado estado (ou -) (Figura 5). As energias desses nveis podem ser descritas como E = - B0 e E = B0, o que equivale a dizer que a diferena de energia entre os dois nveis pode ser expressa por8: E = (E - E) = 2B0, desde que I = . A diferena de energia E que surge entre os dois nveis est relacionada com vrios fatores, dentre eles, segundo a equao anterior, a intensidade do campo magntico B0 aplicado: quanto maior for o campo magntico aplicado, maior ser a diferena de energia entre os dois nveis (Figura 6) e maior a diferena de populao associada a esses nveis. Isso significa que, para uma melhor resoluo de spins nucleares em ambientes qumicos semelhantes, so desejveis espectrmetros com campos cada vez mais intensos. interessante observar que a diferena entre nveis de energia inicialmente inexistente surge devido ao
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efeito do campo magntico externo B0 aplicado sobre o sistema de spins em estudo. Essa mais uma das diferenas bsicas entre a RMN e outros tipos de Espectroscopia: em infra-vermelho e ultra-violeta, por exemplo, j existem diferentes nveis energticos (vibracionais e eletrnicos, respectivamente), bastando a aplicao de uma radiao de freqncia apropriada para que uma transio (vibracional ou eletrnica) ocorra. No caso da RMN, os diferentes nveis energticos devem ser primeiramente criados pela aplicao de um campo magntico de alta intensidade (B0); s assim que se pode proceder Espectroscopia, aplicandose, ento, a radiao de freqncia apropriada para cada ncleo. O fenmeno da RMN ocorre na regio das radiofreqncias (MHz) e a

Figura 4: Direes quantizadas assumidas pelos spins sob ao de um campo magntico B0

interao da radiao eletromagntica com a matria d-se com a sua componente magntica. Portanto, para se proceder a RMN, deve ser aplicado um segundo campo magntico (chamado de B1), proveniente de uma fonte de radiofreqncia aplicada perpendicularmente ao campo B0. esse segundo campo magntico que permite a observao de absores em RMN. 3- O CONCEITO DE CONSTANTE GIROMAGNTICA - A EQUAO FUNDAMENTAL DA RMN Na ausncia do campo magntico externo B0, os estados e so degenerados, uma vez que no h distino de energia. Aplicando-se o campo B0,

entretanto, um estado mais estvel que o outro, devido a uma interao entre o campo e o momento magntico associado ao spin nuclear. A absoro em RMN , portanto, uma conseqncia das transies entre o nvel de menor energia e o de maior energia, possveis pela aplicao de um segundo campo magntico na regio da radiofreqncia. O momento angular L e o momento magntico podem ser representados por vetores e a proporcionalidade entre eles chamada de constante (ou razo) giromagntica. Essa constante, que determina a freqncia de ressonncia do ncleo, constitui um parmetro muito importante em RMN e representada por , apresentando um valor prprio para cada ncleo, podendo ser expressa pela relao: = 2 / hI onde h a constante de Plank (E = h). Se a constante giromagntica for positiva, como o caso dos ncleos de 1 H e 13C, o estado + representa um nvel de menor energia. Caso a constante giromagntica seja negativa, como, por exemplo, para o 15N, ocorre o oposto.9 Alm de ser responsvel pela freqncia de ressonncia de cada ncleo, a constante giromagntica influencia outros fenmenos importantes da Ressonncia Magntica Nuclear,10 como o caso do acoplamento de spins (que ser abordado mais adiante), da sensibilidade dos ncleos, em processos de polarizao cruzada, entre outros.

Figura 5: Nveis energticos criados pela ao do campo magntico B0

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Figura 6: Efeito do campo B0 na diferena de energia entre os estados e

Substituindo-se as equaes anteriores (E = h e = 2 / hI) , podese chegar a: = B0 /2 que a equao fundamental utilizada em RMN e que define a condio de ressonncia para um ncleo com spin I = . 4- A MAGNETIZAO LQUIDA Em um campo magntico externo, o momento magntico apresenta um ngulo com a direo do campo magntico B0 aplicado (Figura 4). Segundo a Mecnica Clssica, bastante til para a visualizao de muitos conceitos de RMN, a interao entre um ncleo com um momento magntico e o campo B0 faz com que o momento magntico precesse em torno daquele eixo (Figura 7). A freqncia desse movimento chamada freqncia de Larmor, e seu valor dado pela expresso anterior = B0 /2 em Hertz. Os dois estados energticos correspondem, ento, precesso de em torno do eixo, alinhado (menor energia, se for positiva) ou oposto ao campo magntico aplicado B0. Considerando que o campo B0 esteja aplicado na direo z, no equilbrio, os vetores dos momentos magnticos estaro distribudos em dois cones, em torno dos eixos +z e z (Figura 8).11 A populao dos dois diferentes estados energticos e (respectivamente n e n) pode ser obtida a partir da equao de Boltzmann:7

n/n = eE/kT onde k a constante de Boltzmann e T, a temperatura expressa em escala Kelvin. Pode-se deduzir que, temperatura ambiente, como a diferena de energia E muito menor que kT (E << kT), haver um pequeno excesso de populao de spins no estado menos energtico. Assim, para um valor positivo de , haver um ligeiro excesso de populao para o estado , ou seja, para os ncleos que esto alinhados com o campo magntico. Esse excesso

Figura 7: Precesso nuclear

de populao resulta em uma magnetizao lquida na direo +z, uma vez que no plano xy, a resultante nula (Figuras 9, 10). 5- O EFEITO DA APLICAO DE B1 SOBRE A MAGNETIZAO Em RMN, a aplicao do campo B1 feita perpendicular ao campo B0 aplicado (portanto, na direo x ou y). Assumindo que B1 seja aplicado na direo x, o campo oscilante nessa direo equivalente soma vetorial de dois vetores de igual amplitude, movendo-se em direes opostas no plano xy (Figura 11). A magnitude de cada uma dessas componentes corresponde metade do vetor B1 e somente uma delas tem efeito no vetor magnetizao. A outra pode, portanto, ser negligenciada.12,13 O campo B1 aplicado na forma de um pulso, ou seja, a fonte de r.f. permanece ligada por perodos con-

trolados da ordem de microssegundos (s) a milissegundos (ms). O pulso eletromagntico criado por manipulao da fonte de radiao eletromagntica, ligando-a ou desligando-a, e a durao do pulso (s a ms) o tempo para o qual a fonte de radiao se encontra ligada. No mtodo pulsado, os ncleos so excitados em uma regio de freqncias por um ou mais pulsos. Na ressonncia, o campo B1, aplicado na forma de um pulso, faz com que alguns ncleos que se encontravam em situao de equilbrio (magnetizao lquida em z), apenas sob influncia de B0 absorvam energia e seus momentos magnticos nucleares passem a precessar no plano xy (Figura 12).14 Ou seja, o campo B1 altera a direo de precesso da magnetizao, acarretando, portanto, uma perturbao do sistema, retirando-o do equilbrio. A nova componente gerada no plano xy pode ser observada com auxlio de um detector no mesmo plano de precesso. Para isso, a fonte de r.f. deve ser desligada. Quando isto ocorre, o sistema tende a retornar situao original de equilbrio. Este retorno conhecido por processo de relaxao, que faz com que os ncleos percam o excesso de energia e retornem s suas posies originais de equilbrio. O decaimento da magnetizao xy que d origem ao sinal de RMN para retornar sua posio de equilbrio exponencial e d origem ao chamado sinal FID (Free Induction Decay). Os

Figura 8: Cone de precesso nuclear

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Figura 9: Resultante no plano xy

sinais da FID (Figura 13) so detectados como uma funo do tempo, encontrando-se a todas as informaes sobre acoplamento e deslocamento qumico (fenmenos que sero vistos a seguir) contidos em um espectro de RMN. Como existem vrios ncleos em uma amostra, tambm so originados vrios sinais de FID que se superpem, de forma que se torna muito difcil a extrao das informaes desejadas (Figura 14). Para que as informaes se tornem acessveis ao usurio, ou

seja, para que a interpretao do espectro seja facilitada, os sinais da FID so convertidos para um domnio de freqncias de ressonncia, caractersticas de cada ncleo, atravs de uma operao matemtica chamada transformada de Fourier. A transformada de Fourier dos diferentes sinais de FID d origem ao espectro de RMN comumente analisado15 (Figura 15). Em outras palavras, um espectro de RMN consiste em uma srie de ressonncias em diferentes freqncias, denominadas deslocamentos qumicos. 6- O DESLOCAMENTO QUMICO Segundo a equao fundamental da RMN j apresentada ( = B0 /2), em um espectro de RMN, todas as absores devidas a um mesmo tipo de ncleo deveriam ocorrer a uma mesma freqncia, uma vez que, segundo essa equao, a freqncia depende apenas do campo B0 aplicado e da constante giromagntica de cada ncleo. O espectro obtido experimentalmente, no entanto, mostra que a situao no exatamente assim, poden-

Figura 10: Magnetizao lquida

Figura 11: Em vermelho esto mostradas as componentes de B1

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do ser observadas diferentes absores a diferentes freqncias (Figura 15). O fator que rege essa diferena de freqncias de absoro denominado blindagem. Esse fenmeno pode ser compreendido levando-se em conta a vizinhana (ncleos e eltrons) na qual se encontra o ncleo que est sendo objeto de anlise. Cada uma dessas partculas carregadas est sujeita influncia de campos magnticos. Tomando como exemplo um tomo de hidrognio em uma molcula, observa-se que, quando ela submetida a um campo magntico, o campo induz uma circulao dos eltrons em torno do hidrognio, em um plano perpendicular ao campo externo. Essa carga circulante gerada tal que o campo magntico gerado (chamado induzido) pode se opor ou no ao campo externo. No primeiro caso, diz-se que os eltrons produzem um efeito de blindagem sobre o hidrognio, no segundo, o efeito de desblindagem desse ncleo (Figura 16). Dessa forma, o ncleo fica sujeito a um campo magntico efetivo (Befet = B0 Binduzido), e o grau de blindagem ou desblindagem depender da densidade eletrnica prxima dele, ou seja, do ambiente qumico em que ele se encontra. Isso justifica diferentes absores para ncleos prximos a tomos eletronegativos, onde a desblindagem maior, uma vez que tomos eletronegativos diminuem a densidade eletrnica dos tomos de hidrognio que estejam em suas vizinhanas. Para o etanol (Figura 15), por exemplo, os tomos de hidrognio do grupo -CH2 encontram-se mais prximos do tomo de oxignio do que os do grupo CH3. Por isso, a densidade eletrnica na regio prxima ao grupo CH2 ser menor que na regio prxima ao grupo CH3, o que torna os primeiros mais desblindados com relao a esses ltimos. Conclui-se, ento, que ncleos em diferentes ambientes qumicos apresentaro diferentes freqncias de absoro devido a diferentes graus de blindagem ou desblindagem. A diferena entre essa freqncia de absor-

Figura 12: Influncia de B1 na magnetizao lquida

o com relao a um determinado ncleo-referncia (chamado padro) denominada deslocamento qumico. Assim, ncleos quimicamente equivalentes (em semelhantes ambientes eletrnicos) apresentam o mesmo deslocamento qumico. No etanol, todos os trs ncleos de hidrognio do grupo CH3 apresentam o mesmo deslocamento qumico, ocorrendo a mesma coisa com os dois ncleos de hidrognio do grupo CH2. Os valores de deslocamento qumico em unidades de freqncia so valores muito prximos. Por isso, muito usual a chamada escala delta (), dada pela relao: = amostra x 106 / espectrmetro onde amostra dada em Hertz e espectrem MHz. A escala , portanto, metro adimensional com valores expressos em ppm. Os ncleos mais blindados apresentam valores de menores, enquanto os mais desblindados apresentam valores de maiores. No espectro de RMN de hidrognio (RMN-1H) do etanol (Figura 15), podem ser observados dois valores de deslocamento qumico: um primeiro, prximo a 1 ppm, mais blindado em relao ao segundo, prximo a 3,5 ppm. Como os ncleos de hidrognio da CH3 so mais blindados que os do -CH2, os primeiros absorvem a 1 ppm e esses ltimos a 3,5 ppm. 7- ACOPLAMENTO SPIN-SPIN Observando-se um espectro de RMN, pode-se ver que os sinais originados das absores nem sempre aparecem como picos nicos ou singletos, mas podem aparecer tambm como dupletos, tripletos, quartetos etc. (Figura 15), o que est relacionado com o que se chama acoplamento spinspin. Esse fenmeno originado quando ncleos em diferentes ambientes eletrnicos esto prximos entre si (normalmente o efeito observado em at trs ligaes, exceto quando existirem duplas ou triplas ligaes). Basicamente, existem dois tipos de acoplamento spin-spin: o acoplamento homonuclear, quando o acoplamento ocorre entre o mesmo tipo de ncleos, como, por exemplo, quando hidrognios em diferentes ambientes qumicos acoplam entre si, e o acoplamento heteronuclear, que ocorre entre ncleos diferentes, como, por exem-

Figura 13: Decaimento exponencial do sinal de RMN

Figura 14: FID do etanol

plo, entre hidrognio e carbono. Por meio da Mecnica Quntica,7 sabe-se que o desdobramento de um sinal de singleto para dupleto, tripleto, etc. (chamado de multiplicidade) pode ser dado pela relao 2nI+1, onde n o nmero de ncleos vizinhos em diferentes ambientes qumicos e I o nmero de spin do ncleo que est sendo analisado. Para ncleos com spin I = , a multiplicidade ser dada simplesmente por (n+1). Assim, no espectro de hidrognio do etanol (Figura 15), desprezandose o hidrognio do grupo OH, devido ao processo de troca qumica, (no abordado aqui), sero observados dois sinais devidos a acoplamento homonuclear: um relativo aos hidrognios da metila e outro aos hidrognios do grupo CH2, uma vez que se encontram em diferentes ambientes eletrnicos e que, portanto, apresentaro diferentes deslocamentos qumicos. Esses sinais, entretanto, no aparecem como singletos (Figura 15). A multiplicidade dada por (n+1): os trs hidrognios da metila tm dois vizinhos (os dois hidrognios do grupo CH2); logo, o seu sinal aparecer no espectro como um tripleto (2 + 1 = 3), observado em torno de 1 ppm. Analogamente, os dois hidrognios do grupo CH2 tm como vizinhos os trs hidrognios da metila e seu sinal ser um quarteto (3 + 1 = 4), cuja absoro obervada em torno de 3,5 ppm. A intensidade dos picos de um multipleto no a mesma. Ela est associada ao nmero de transies naquela determinada freqncia de cada um dos picos observados. Para ncleos com I = , a intensidade dos picos do multipleto pode ser obtida a partir do tringulo de Pascal (Figura 17), dispensando o clculo dos nmeros de transies associadas a cada um dos picos. Assim, para um dupleto, por exemplo, a intensidade dos sinais ser de 1:1; para um tripleto, de 1:2:1; para um quarteto, de 1:3:3:1; e assim por diante, segundo os valores expressos no tringulo de Pascal. A distncia entre cada um dos picos de um multipleto chamada de constante de acoplamento J (Figura 18), e
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Figura 15: Espectro de hidrognio do etanol

indica o quanto um acoplamento entre ncleos efetivo: uma maior constante de acoplamento significa um acoplamento mais efetivo. Alm disso, a constante de acoplamento tambm pode servir para identificar diferentes acoplamentos no espectro. Essa identificao facilitada tendo-se em conta que, se um ncleo A acopla-se a um ncleo B com uma constante de acoplamento JAB, a constante de acoplamento de B com A (JBA) deve ser igual a JAB (JAB = JBA). Tabelas contendo diferentes valores de constantes de acoplamento para diferentes grupos funcionais e molculas podem ser encontradas na Literatura,7-10 o que facilita a interpretao dos sinais em um espectro de RMN de uma maneira inequvoca. Os valores das constantes de acoplamento J so dados em unidades de freqncia (Hz) e so chamadas 1 2 3 J, J, J,, nJ, dependendo do nmero de ligaes existentes entre os ncleos que acoplam (1, 2, 3, , n ligaes, respectivamente). A RESSONNCIA MAGNTICA NUCLEAR EM DUAS DIMENSES Nas ltimas quatro dcadas, a realizao de experimentos de RMN em vrias dimenses elevou sobremaneira a capacidade de resoluo dessa tcnica, ampliando, conseqentemente, os seus horizontes de aplicao. A RMN em duas dimenses (RMN-2D) foi proposta em 1971,16 e hoje representa uma
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poderosa tcnica para a elucidao estrutural de molculas orgnicas, inorgnicas e principalmente de biomolculas. Essas molculas apresentavam espectros de difcil interpretao devido, principalmente, superposio de sinais ao longo de toda a faixa espectral e/ou em uma dada regio de freqncia17 (Figura 19). A RMN-2D possibilitou a interpretao dos espectros dessas molculas, antes dificilmente identificadas pelos mtodos em uma dimenso. Para entender as razes disso e o que um espectro de RMN em duas dimenses, assim como o seu processamento, necessrio compreender conceitos como tempo de preparao,

tempo de evoluo e tempo de deteco. Tempo de preparao o perodo durante o qual um sistema de spins preparado para atingir o equilbrio trmico. Esse tempo pode incluir a aplicao de um ou mais pulsos ou, simplesmente, ser um perodo t 0; pode at mesmo nem existir, dependendo do experimento que est sendo realizado. O importante que o sistema de spins se encontre em equilbrio antes que o experimento seja iniciado. O tempo de evoluo (chamado t1) constitui o experimento de RMN propriamente dito, durante o qual o sistema de spins evolui fora da situao de equilbrio pela aplicao de um ou mais pulsos, dependendo da informao que se deseja obter. O tempo de deteco (ou tempo de aquisio, chamado t2) o perodo durante o qual se adquire o sinal do FID. Um experimento unidimensional pode apresentar esses trs tempos (Figura 20). O tempo de evoluo (t1) fixo e o sinal recebido apenas funo do tempo de deteco (t2), que varivel. Em um experimento convencional em uma dimenso, o tempo de evoluo t1 zero e a deteco realizada imediatamente aps o pulso de radiofreqncia (Figura 21). Os spins sofrem ao do campo B1 e o resultado , ento, detectado. O sinal

Figura 16: Blindagem e desblindagem de um ncleo

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Figura 17: Tringulo de Pascal mostrando a intensidade relativa dos picos para diferentes valores de multiplicidade (n+1): para um tripleto, n=2; para um quarteto, n=3; e assim por diante.

Figura 18: Constante de Acoplamento (J)

detectado no domnio temporal (FID) transformado para o domnio das freqncias mediante a transformada de Fourier e o espectro resultante um grfico de amplitude x freqncia, chamado unidimensional porque apenas um dos eixos corresponde a freqncias de absoro (Figura 15). Em um experimento bidimensional, vlido o mesmo diagrama temporal (Figura 20). A principal diferena que existem obrigatoriamente dois perodos variveis: o tempo de evoluo (t1, que em um experimento 1D pode ser zero) e o tempo de aquisio (t2). Fazendo-se uma srie de experimentos nos quais variem progressivamente os valores do tempo de evoluo, desde zero at t1, tem-se duas variaes no domnio temporal: uma devida a t1 e outra devida a t2. Se uma srie de FIDs for detectada a partir desses experimentos nos quais se variam os valores de t1, a transformada de Fourier ao longo de t2 dessas diferentes FIDs fornecer uma srie de espectros 1D. Se uma outra transformada de Fourier for realizada ao longo de t1, ento poderemos obter um espectro bidimensional, com sinais observados

ao longo de duas dimenses, F1 e F2.18 Dessa forma, informaes complexas, que antes apareciam em apenas uma dimenso (por exemplo, hidrognios em ambientes qumicos semelhantes que apresentam deslocamentos qumicos muito prximos, o que pode levar superposio de sinais), aparecem agora em duas dimenses, facilitando a interpretao do espectro para determinao da estrutura molecular. O espectro bidimensional resultante pode ser representado de duas formas: o grfico superposto (stacked), que mostra o espectro em trs dimenses (F1, F2 e intensidade); e o grfico de contorno, que representa um corte horizontal do grfico stacked. Esse corte selecionado pelo prprio usurio de acordo com a intensidade que se deseja obter. O corte leva a um grfico bidimensional F1 x F2 (Figuras 22, 23). Embora o grfico stacked seja mais fcil de ser visualizado, , entretanto, mais difcil de ser analisado, uma vez que interpretao em trs dimenses se torna mais complexa. Por isso, um corte transversal que gera um grfico

de contornos (Figuras 22, 23) muito mais utilizado, j que com ele se obtm um diagrama bastante claro, constitudo por linhas de contorno que so bem mais convenientes de ser analisadas. Existem hoje diferentes tipos de experimentos em RMN multidimensional (2D e 3D) que utilizam diferentes recursos tanto em termos de software como de hardware.13 Experimentos menos recentes tambm continuam sendo muito utilizados para elucidao estrutural. Os experimentos COSY (Correlated SpectroscopY) e HETCOR (HETeronuclear CORrelation) so exemplos disso. O espectro COSY fornece correlaes para o mesmo ncleo (por exemplo, 1H com 1H, Figura 22). O espectro de 1H aparece ao longo da diagonal. Os pontos fora dessa diagonal representam correlaes entre hidrognios no-equivalentes e so denominados cross-peaks. Os cross-peaks, como mostra a Figura 22, devem, obrigatoriamente, formar um tringulo retngulo com relao aos picos correspondentes na diagonal, em razo da simetria do espectro, dado de grande importncia na interpretao do espectro, pois uma garantia de que os picos realmente esto acoplando. Caso no seja formado um tringulo retngulo, pode-se garantir que os picos em anlise no esto acoplando. Alm disso, o experimento COSY apresenta tambm a vantagem de obter os valores das contantes de acoplamento J em unidades de freqncia Hz, o que representa mais uma garantia do acoplamento entre os picos que esto sendo analisados. No caso do espectro obtido pelo experimento HETCOR (Figura 23), o espectro no aparece na diagonal. Em uma dimenso, aparece o espectro do hidrognio, por exemplo, enquanto em outra dimenso aparece o espectro do outro ncleo (no caso do espectro da Figura 23, o outro ncleo o de carbono-13). O espectro bidimensional mostra as correlaes existentes entre os dois ncleos como em um grfico do tipo xy.
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Figura 19: Espectro de RMN-2D de uma protena (Bloch Jr. C., et al. 1998)

CONCLUSO Apesar de relativamente recente, a Ressonncia Magntica Nuclear j referncia mundial para a anlise de estruturas moleculares em diversas reas do conhecimento. Na Bioqumica moderna, essa tcnica permitiu, de forma indita, a investigao de estruturas tridimensionais de biomolculas em condies prximas do estado fisiolgico (solues aquosas). Tal fato pos-

sibilitou um considervel avano nos estudos de dinmica molecular que, antes da RMN, limitavam-se quase que exclusivamente a dados cristalogrficos. Mesmo com todo o avano tecnolgico registrado ultimamente nesse campo, a determinao da estrutura tridimensional de uma biomolcula ainda no pode ser considerada uma tarefa trivial. As limitaes e peculiaridades dessa tcnica, bem como a gigantesca demanda imposta pelos vri-

os projetos genomas concludos neste comeo de sculo, alm daqueles que ainda esto por vir, indicam as dimenses do trabalho que se tem pela frente. De fato, vrios grupos de pesquisa tm-se unido em consrcios (The Research Collaboratory for Structural Bioinformatics , http://www.rcsb.org/ index.html), assim como empresas de biotecnologia (Celera Genomics; http:/ /www.celera.com/), para atacar de for-

Figura 20: Tempos possveis em um experimento de RMN

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Figura 21: Experimento de RMN em uma dimenso

Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento - n 21 - julho/agosto 2001

Morales, pelos elaborao e arte de vrias figuras apresentadas neste artigo. REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS 1- Farrar, T.C. (1990), Concepts Magn. Res. 2, 1-12. 2- Farrar, T.C. (1990), Concepts Magn. Res. 2, 55-61. 3- Farrar, T.C. (1992), Concepts Magn. Res. 4, 1-33. 4- Srensen, O.W.; Eich, G.W.; Levitt, M.H.; Bodenhausen, G. and Ernst, R.R. (1983), Progress NMR Spect. 16, 163-192. 5- Strauss, H.L. Quantum Mechanics An Introduction Prentice-Hall, Inc., New Jersey, 1968. 6- Matthews, P.S.C. Quantum Chemistry of Atoms and Molecules Cambridge University Press, Cambridge, 1986. 7- Harris, R.K. Nuclear Magnetic Resonance A Physicochemical View Longman Scientific & Technical, England, 1986. 8- Martin, M.L., Delpuech, J-J., Martin, G. J. Practical NMR Spectroscopy Heyden & Son Ltd, London, 1980. 9- Sanders, J.K.M. and Hunter, B.K. Modern NMR Spectroscopy: A Guide for Chemists Oxford University Press, New York, 1993. 10- Derome, A.E. Modern NMR Techniques for Chemistry Research Pergamon Press, New York, 1995. 11- King, R.W. and Williams, K.R. (1989), J. Chem. Educ. 66 (9), A213A219. 12- Schwartz, Leslie J. (1988), J. Chem. Educ. 65 (11), 959-963. 13- Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 1988, 27, 490-536, Horst Kessler*, Mathias Gehrke, Christian Griesinger 14- Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 1989, 22, 350-380, Reinhard Benn* and Harald Gnhter* 15- J. Chem. Educ., 1989, 66(10), Roy W. King, Kathryn R. Williams 16- Concepts in Magnetic Resonance, 1989, 1, 7-13 , Daniel D. Traficante 17- Bloch Jr., C. et al. (1998), Proteins Struc. Func. Gen. 32 (3) 334-349. 18- Farrar, T.C. (1989) Analytical Chem. 59 (11), 749A-761A.
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Figura 22: Espectro COSY do etanol

Figura 23: Espectro HETCOR do etanol

ma mais eficiente a etapa considerada mais fascinante e desafiadora desses vrios projetos, que a determinao das estruturas tridimensionais de todas as protenas sintetizadas por um dado ser vivo, ao longo de todas as etapas metablicas de seu desenvolvimento. possvel que os prximos anos testemunhem iniciativas ousadas, a exemplo do projeto genoma humano, na rea de determinao estrutural de protenas, nos quais, tanto a cristolografia de raio-X quanto a RMN multidimensional devero ocupar papis decisivos na obteno de estruturas 3D em larga escala. Espera-se que o presente artigo possa dar uma contribuio, por menor que seja, nessa direo a partir da difuso dos fundamentos aqui apresentados e como introduo a uma prxima publicao dedicada exclusimente RMN de protenas. AGRADECIMENTOS Ao Professor Jos Daniel Figueroa Villar pelos espectros do etanol gentilmente fornecidos e a Rodrigo A.V.

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