IX CICLO

Universidad Alas Peruanas

Elaborado por:
Pichilingue Cruz Milagros Reyes Rojas Yuriko Gutirrez Ambrosio Dasly Romero Sols Pedro Meneses Fukuda Rudy

INTRODUCCIN
Existen diversos mtodos para cuantificar el nmero de microorganismos presentes en muestras lquidas y slidas. Dentro de las tcnicas ms comunes se encuentra el recuento directo por microscopia de fluorescencia, as como los procedimientos basados en diluciones en serie, haciendo crecer microorganismos en medios de cultivo sintticos slidos o lquidos, como el recuento en placa de Unidades Formadoras de Colonias (UFC) o la estimacin por el mtodo del Nmero Ms Probable (NMP), la cual emplearemos en esta practica. El mtodo del nmero ms probable fue descrito por McCrady en 1915 y actualmente sigue siendo ampliamente utilizado. En un principio este mtodo fue empleado para estimar el nmero de microorganismos en muestras de alimentos y aguas. Sin embargo, se ha demostrado que tambin puede ser aplicado para la determinacin de microorganismos aerobios y anaerobios en lodos, sedimentos marinos y suelos contaminados, por tanto este mtodo es aplicable para estimar el nmero de microorganismos en muestras de suelo y agua, tanto para bacterias aerobias como anaerobias. Dentro de los organismos patgenos se encuentran los coliformes que es un grupo que comprende todos los bacilos gramnegativos aerobios o anaerobios facultativos, no esporulados que fermentan la lactosa con produccin de gas en un lapso mximo de 48 horas a 35 C. El grupo coliforme est formado por los siguientes gneros: 1. Escherichia. 2. Klebsiella. 3. Enterobacter. 4. Citrobacter

OBJETIVO
Familiarizarse con los mtodos NMP. Detectar bacterias coliformes totales . Detectar si la muestra trada es apta para el consumo humano.

MUESTRAS Leche fresca (sin refrigerar )

MATERIALES Agua Destilada Tubos de ensayo tapa rosca Pipetas de 1ml Probetas Incubadora Asa de siembra Gradilla Mecheros Esptulas campana Durham

Caldo bilis verde brillante

Campana Durham

MEDIO DE CULTIVO
Caldo bilis verde brillante

Cultivo Usados en la practica Caldo bilis verde brillante

CALDO BILIS VERDE BRILLANTE AL 2%

Este medio est recomendado para el recuento de coliformes totales, por la tcnica del nmero ms probable.
Formula (gramos por litro)
En el medio de cultivo, la peptona aporta los nutrientes necesarios para el adecuado desarrollo bacteriano, la bilis y el verde brillante son los agentes selectivos que inhiben el desarrollo de bacterias Gram positivas y Gram negativas a excepcin de coliformes, y la lactosa es el hidrato de carbono fermentable.
Es una propiedad del grupo coliforme, la fermentacin de la lactosa con produccin de cido y gas.

FORMULA

Bilis de buey desidratada 20.0 Lactosa .10.0 Peptona ..10.0 Verde brillante.0.0133 ph final: 7.2 +- 0.2

TOMA DE MUESTRA TOMA DE MUESTRA DE LA LECHE: Aadir la muestra directamente en un frasco con tapa, se debe analizar al instante o en un periodo de tiempo que no exceda la media hora ya que puede contaminarse con otras sustancias.(no refrigerar) EN ESTE MTODO SE PUEDE UTILIZAR DIFERENTES MUESTRAS COMO: TOMA DE AGUA ESTANCADA: Introducir el frasco destapado con la boca hacia abajo sostenindolo por la base. Girar el frasco e impulsarlo suavemente hacia arriba de tal manera que al salir a la superficie se haya llenado partes de su volumen. Tapar el frasco. AGUA EMBOTELLADA: Tomar varios envases de agua , de preferencia poco despus de haber sido embotellada.

AGUA CORRIENTE: Se efectuara la maniobra ejecutando el desplazamiento del frasco en direccin opuesta a la corriente.
TOMAR DE MUESTRA DE LLAVES, FILTRO, ETC. : Limpiar perfectamente la salida del agua , hasta que no haya suciedad u oxido . Abrir la llave y dejar correr el agua durante un minuto .Disminuir la velocidad de salida y llenar el frasco 2/3 partes de su capacidad. Al destapar el frasco y durante toda la practica se debe evitar contaminar la boca del frasco ni el interior del tapn . Marcar el frasco con los datos de identificacin fecha y hora de muestreo y se debe conservar a una temperatura de 4 a 10 C

MTODO
En esta practica empleamos el mtodo del numero mas probable (NMP). La cual tiene una base estadstica para expresar cuantitativamente la densidad de microorganismos en una muestra.

La prueba consiste en inocular unas series de tubos que contienen un medio de cultivo que permita manifestar un microorganismo o grupo de ellos en particular.
Esta estimacin estadstica se basa en el hecho de que cuanto mayor sea el nmero de bacterias en una muestra mayor ser la disolucin necesaria para reducir la densidad hasta el punto en cual no se desarrolle ninguna bacteria en los tubos de una serie de disoluciones. El mtodo es el mas til cuando se utiliza el crecimiento en un medio liquido diferencial para identificar el microorganismos (como el caso de las bacterias coliformes, que fermentan selectivamente la lactosa con produccin de acido) El Nmero mas Probable, es solo un informe de que existe un 95% de probabilidades de que la poblacin bacteriana disminuya dentro de ciertos limites y de que numero mas probable es el numero estadsticamente ms probable.

FUNDAMENTO
La produccin de leche se hace con la expresa intencin de proporcionar un alimento de alto valor nutritivo para el ser humano. Cada da se reconocen ms las cualidades de este producto en la alimentacin de nios, adultos y personas de la tercera edad. Pero para que la leche cumpla con esas expectativas nutricionales debe reunir una serie de requisitos que definen su calidad: su composicin fsicoqumica, cualidades organolpticas y nmero de microorganismos presentes. Despus que la leche sale de la vaca ya no se puede cambiar su composicin fisicoqumica a no ser en algunos ajustes permitidos para mejorar su aspecto (Homogenizar), disminuir algunos de sus componentes para hacerla ms atractiva para algn consumidor especial (deslactosar, desgrasar), todo ello mediante tecnologas permitidas y declaradas. Pero en la cadena de produccin de este preciado producto desde la finca lechera hasta la planta procesadora es necesario cuidar todos aquellos factores que si no se manejan adecuadamente van a provocar deterioro del mismo con prdidas para el productor y disminucin de volmenes hbiles para la industria. La leche por ser un producto altamente perecedero debe ser manejado correctamente desde su obtencin. La planta procesadora es responsable de la calidad desde la recepcin en las receptoras o centros de acopio hasta que el producto llegue al consumidor final. En este informe emplearemos el mtodo del numero mas probable (NMP), para detectar organismos patgenos llamados coliformes totales, en muestras de leche fresca, la cual son obtenidas directamente de establos ganaderos que abastecen a empresas dedicadas en la produccin de lcteos, para el consumo humano.

PROCEDIMIENTO
Nota: Cada medio de cultivo, trae en su envase, las cantidades determinas, para poder prepararlas en el laboratorio. Suspender 40 g del cultivo en 1 litro de agua destilada, en un Erlenmeyer de 1,5 L de capacidad, agitando frecuentemente para disolverlo por completo

agregamos 10 ml del medio de cultivo a 6 tubos de ensayos con su respectiva campana Durham. Bacterias que crecen en este medio Crecimiento Escherichia coli Muy buena Gas + + 5

Esterilizar en autoclave a 121C (15 lbs de presin) durante 15minutos

3

Dejamos reposar y procedemos a realizar la inoculacin

Enterobacter aerogenes Buena Escherichia coli / Muy buena Staphylococcus aureus Inhibido Inhibido

Enterococcus faecalis

DILUCIN

Volumen de la muestra problema, para cada conjunto de 2 tubos

Dilucin

A B

Tubos con 10mL de medio nutritivo (conjunto de 2 tubos)

101

1ml

Como se ve en la imagen dividimos tres conjuntos de la cual cada conjunto esta conformado por 2 tubos de ensayo, previamente preparada .

10

1ml

En cada tubo del primer conjunto recibe 10-1 del la muestra problema + agua destilada En cada tubo del segundo conjunto recibe 1 ml de la dilucin anterior + 9 ml de agua destilada. Y en cada tubo del tercer conjunto recibe 1ml de la dilucin anterior + 9 ml agua destilada y procedemos a realizar la inoculacin Incubar las tres series a una temperatura entre 30 y 37C haciendo lecturas a las 24 y 48h.

10

1ml

En el primer conjunto haba suficientes bacterias en la muestra de modo que los 2 tubos demostraron crecimiento bacteriano y se registraron como positivo. El segundo conjunto, en el que los tubos recibieron la decima parte de la muestra problema, los 2 tubos fueron positivos. El tercer conjunto, en el que los tubos recibieron la centsima parte de la muestra problema, los 2 resulto positivo.

TABLA NMERO MS PROBABLE PARA COMBINACIONES DE 2 TUBOS

RESULTADOS DE LAS DILUCIONES 10-1 (A) + 2 10-2(B) + 10-2 (A) + 2 10-2(B) + 10-3(A) + 2 10-3(B) +

La muestra trada por nuestro grupo fue de leche cruda. Al hacer un comparativo de nuestros resultados vemos, por ejemplo, que La Norma para Lcteos da como valores lmites los sgtes. valores:

Interpretacin de los Resultados

Por lo tanto, se puede decir que el resultado del nmero ms probable de la serie de : 222, ubicadas en la tabla de NMP con un lmite de confianza de 95% para la prueba. nos da un valor de >1100 bacterias/mL de leche. Ahora, Al hacer un comparativo de nuestros resultados, con La Norma para Lcteos establecida da como lmites los sgtes. Valores para coliformes totales:

El lmite dado para Coliformes Totales en leche cruda est dada en UFC/ml (unidad formadora de colonias/mililitro), mayores a 5.000, esto quiere decir que estamos ante una leche de tercera ya que supera las cantidades totales de coliformes presente en dicha muestra.

DISCUSIN observamos que la muestra en este caso la leche fresca presento coliforme s(totales), >1100 bacterias/mL de leche. lo cual nos indica que no hay una buena limpieza y desinfeccin del rea de trabajo, como la mala higiene tanto del manipulador y del almacenamiento la cual conllev a la contaminacin con estos microorganismos.

CONCLUSIONES Aprendimos a realizar pruebas con mtodo de recuento de nmero ms probable y que aspectos nos indican que hay presencia de coliformes totales.

La calidad higinica de la leche ocupa en estos momentos un papel preponderante , en los criterios de aceptacin y pago de la leche por parte de a industria procesadora.
La informacin oportuna al productor, se hace cada da ms necesaria para el logro un solo objetivo: leche de alta calidad, para un consumidor ms conocedor y exigente.

BIBLIOGRAFIA Introduccion a la microbiologia/ Microbiology: An Introduction Escrito por Gerard J. Tortora,Berdell R. Funke,Christine L. Case (capitulo 6, pagina 179)

Microbiologa Alimentaria: Metodologa Analtica para Alimentos y Bebidas Escrito por Mara del Rosario Pascual Anderson,Vicente Caldern y Pascual (pagina 110)
http://www.britanialab.com.ar/esp/productos/b02/verdebribilis.htm
http://ocw.um.es/cc.-de-la-salud/higiene-inspeccion-y-control-alimentario/practicas-1/practica-1-microorganismosmarcadores-recuento http://es.scribd.com/doc/105162815/Caldo-Bilis-Verde-Brillante http://es.scribd.com/doc/130628171/Manual-de-Practicas-Microbiologias-2013