LAS CEPAS ATCC Herramienta indispensable en el Control de Calidad Interno en Microbiologa.

MARIA ISABEL MONTOYA ROMERO Especialista en Microbiologa Clnica

Directora Tcnica Coordinadora de Calidad

Instituto Colombiano de Medicina Tropical

TEMAS DE INTERES

Definicin y Generalidades Cepas ATCC Historia ATCC MicroBiologics Clasificacin Reconstitucin y Almacenamiento Registro y control Usos en el control de Calidad interno Ventajas de ingresar a un programa de licencia derivada.

Que son las Cepas Referencia Cepas Certificadas: es un material biolgico de referencia certificado. La coleccin certifica que se suministra una determinada cepa, que es un cultivo puro, y que se han observado las convenientes pruebas morfolgicas, bioqumicas y moleculares correspondientes.

Adquisicin de las Cepas de Referencia

Obtencin directa a partir de una coleccin nacional e internacional reconocida, con su respectivo Registro y Certificado. CEPAS NCTC: National Collection of type Cultures. Londres. CNCM: Colection Nationale de Cultures of Microorganismes. Paris,
Francia.

ATCC: American Type Culture Collection. Rockville, EU CCTM: Collection Nationale de Cultures de Microorganismes. Institut
Pasteur

NCYC: National Collection of Yeast Cultures. Norwik UK. NCIBM: National Collections of industrial and Marine Bacteria. CECT: Coleccin espaola de cultivos tipos.

Generalidades de la ATCC
La coleccin que almacena la ATCC se inici en 1925, sobre una coleccin de bacteriologa iniciada en 1911. Es una organizacin en la que participan actualmente 21 sociedades cientficas. En la actualidad mantiene colecciones de Bacteriologa, Cultivos celulares, Plsmidos, cidos nucleicos y Genotecas, Micologa y Botnica, Protistologa y Virologa.

Quien es

El primer fabricante de productos Biologicos (microorganismos liofilizados) para el control de calidad, con licencia aprobada por ATCC Patente de distribucin ATCC desde el ao 2004 35 Aos en el Mercado - Laboratorio Comercial (1971) - Fabricante de Medios de Cultivo Preparados (1975) - Microorganismos para el Control de Calidad (1982) - 100% Devocin a los Productos para el Control de Calidad Microbiolgico (1996).

PRINCIPIO DEL SISTEMA DE LIOFILIZACIN Gelatina: medio transporte Leche descremada,acido ascrbico, dextrosa y carbn activado: Agentes Crioprotectores (preservan pared celular, evitan deshidratacin por congelacin). Carbn Vegetal: Neutraliza sustancias toxicas generadas por la liofilizacin

El Certif icado es entregado personalmente por LABCARE a los Usuarios Finales de MicroBioLogics para que el laboratorio lo presente como soporte mientras las Cepas estn siendo utilizadas exclusiv amente en los procedimientos del Control de Calidad. El Certif icado v alida la trazabilidad y autenticidad de las metodologas y controles hechos por los Usuarios Finales clnicos e industriales ante la ATCC y organismos de v erif icacin. Si el prov eedor de microorganismos no puede entregar un CERTIFICADO DE CONFORMIDAD, estos materiales no son autnticos

ATCC.

CLASIFICACION CEPAS ATCC

Cepas de Referencia. Cepas de Reserva. Cepas de Trabajo.

CEPAS DE REFERENCIA
A fin de demostrar la trazabilidad : las cepas de referencia deben obtenerse directamente de una coleccin con la resea nacional o internacional de cultivo de referencia reconocido. "ISO 11133-1:2000", son: microorganismos definidos, por lo menos a nivel de gnero y especie, catalogados , caracterizados y de origen conocido

CEPAS DE REFERENCIA
Son distribuidas y presentadas comercialmente liofilizadas; los organismos de acreditacin son los encargados de considerar vlida la fuente de procedencia de la cepa a fin de que se cumpla con el requisito de prevenir mutaciones, deterioro o alteracin de las caractersticas tpicas de las cepas. El nmero de repiques a partir de la cepa de referencia a de ser limitado, aceptndose hasta cuatro pases como mximo a partir de la cepa o semilla original de referencia.

PRESENTACION

KWIK-STIK

LYFO DISK KWIK-STIK Plus

CEPAREO
Reconstitucion:
Las Cepas de referencia son almacenadas entre 2-8 C hasta su uso. En la reconstitucin y siembra de la Cepas de referencia, se utilizan medios de cultivo de enriquecimiento, las condiciones de incubacin y el procedimiento de almacenamiento varia para cada tipo de microorganismo. Boletin de informacion tecnica TIB.081 Recommended Growth Requirements

CEPAREO
www.microbiologics.com Requerimientos:Hidratacion,Medios de cultivo,Incubacion(atmosferas y Tiempo). Las Cepas de referencia sern sometidas a un control de calidad de pureza y viabilidad, as se le dar registroCepas ATCC\kwik.pdf. Cepas ATCC\lyfodisk.pdf

CEPAS DE RESERVA
Son cepas idnticas logradas mediante un nico subcultivo de una cepa de referencia. Son preparadas y conservadas en el laboratorio, dentro del cual se destina un lugar para su almacenaje, se trata de cepas potencialmente peligrosas y cuya manipulacin queda exclusivamente restringida al personal autorizado. Cada Vial debe estar perfectamente identificado con el nombre de la cepa, procedencia y fecha de congelacin

CEPAS DE RESERVA
Las Cepas de Reserva una vez descongeladas no deben volver a Congelarse. Los mtodos para la preservacin y mantenimiento de cepas de reserva son la LIOFILIZACIN y la CONGELACIN A BAJAS TEMPERATURAS. Se da el uso de agentes Crioprotectores

CEPA DE TRABAJO
Se obtienen por subcultivo de las Cepas de Reserva Se subcultivan en medios slidos de enriquecimiento apropiados para C/microorganismo Se debe Verificar la calidad, pureza y morfologa tpica del subcultivo Nunca subcultivarlas para sustituir a las cepas de Reserva

Cepas de Referencia
Sub cultiv ada una sola v ez

No permitido

Cepa de Reserv a
(Liofilizacin, nitrgeno liquido, ultra congelacin rpida etc.) Especificar tiempo y condiciones de Almacenamiento

Mantener en las condiciones especf icas

Descongelacin / Reconstitucin Subcultiv ar una sola v ez Cepa de Trabajo

Especificar tiempo y condiciones de almacenamiento

Maximo 8 Pases USO RUTINARIO

Cepa Ref erencia 4 Pasajes

Pase de Reconstitucin 5 Pasaje

6 Pasaje

7Pasaje

8Pasaje

AlmacenamientoCepas Reserv a en 6 Pasaje

Registro y Control de Cepas ATCC

Identificacin de la cepa. Gnero y especie del microorganismo TIPO y N de coleccin. N de lote. Fecha de recepcin. Fiche de reconstitucion. Control de calidad de la cepa de referencia Conforme (SI/NO). Fecha de caducidad de la cepa. Personal responsable. Control de calidad de pureza y viabilidad: Se realiza a diferentes niveles del proceso cada vez que se realiza un replique. El objetivo: asegurarse que las cepas conservan su viabilidad y sus caracteres bioqumicos.

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HOJA DE REGISTRO CEPAREO

UTILIDAD DE LOS CULTIVOS DE REFERENCIA ATCC EN EL QC INTERNO 1.Evaluar la calidad de los medios de cultivo. 2.Asegurar la calidad de los resultados de ensayos de laboratorio (coloraciones y desempeo de reactivos) 3.Validar mtodos microbiolgicos.(Pruebas de Sensibilidad)

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El Control de la Calidad en la preparacin y evaluacin de los Medios de Cultivo

Una esencial y buena prctica de laboratorio, necesaria para mantener el nivel y la ejecucin de cualquier tcnica microbiolgica. Es un proceso continuo que se extiende desde las materias primas, a travs del productor hasta el producto final utilizado en el laboratorio. Por esta razn, se le confiere una gran importancia y est considerado como uno de los puntos crticos de control en el anlisis microbiolgico, del cual depende la seguridad de los resultados que emiten los laboratorios de ensayo.

EVALUACIN DE EFICIENCIA DE LOS MEDIOS DE CULTIVO

Cada lote preparado de medio de cultivo se prueba antes de su uso rutinario, por eficiencia o calidad, mediante la inoculacin de microorganismos cuyo comportamiento conocemos, tanto para reacciones positivas como negativas. Si los medios de cultivo son suministrados por empresas fabricantes hay que solicitar Certificado de Calidad. Es de prioritario cumplimiento evaluar el desempeo de:

Agar Chocolate Agar Thayer Martn Agar Sangre Agares suplementados con Antibioticos Agares Cromogenicos

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PROTOCOLO DE CONTROL DE CALIDAD DE MEDIOS DE CULTIVO

1. ASPECTO FISICO: NIVEL, VOLUMEN, SUPERFICIE, COLOR, EMPAQUE 2. CONTROL DE ESTERILIDAD: 5% DE LA PRODUCCIN TOTAL Y SE INCUBA DURANTE 72 HORAS (CUARENTENA). - Se ACEPTA lotes negativ os. - Se descarta todo el lote preparado si hay crecimiento Microbiano. 4. CONTROL DE PH 3. CALIDAD MICROBIOLOGICA: Mtodo ECOMETRICO Prueba de PRODUCTIVIDAD y SELECTIVIDAD: Medios Slidos y Lquidos. CEPAS DE REFERENCIA ATCC - Cada v ez que se prepare un Lote nuev o de un Medio de Cultiv o. - Cada v ez que ingrese un Medio de Cultiv o Nuev o al Laboratorio. - Cada v ez que un medio de cultiv o supere su f echa de caducidad

METODO ECOMETRICO
Es una tcnica simple que permite Recuperar, Comparar y Cuantificar el crecimiento de microorganismos ATCC con cargas de UFC definidas en diferentes medios de Cultivo con el fin de evaluar su MANUFACTURA.
TECNICA ECOMETRICA DE MOSSEL (RADIAL) MTODO ECOMETRICO MODIFICADO de MILES y MISRA

A. PRUEBA DE PRODUCTIVIDAD Y SELECTIVIDAD PARA MEDIOS DE CULTIVO SLIDOS. B. PRUEBA DE PRODUCTIVIDAD Y SELECTIVIDAD PARA MEDIOS DE CULTIVO LIQUIDOS .

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PRODUCTIVIDAD
Determina el Rendimiento, Recuperacin y crecimiento de microorganismos que habitualmente se desarrollan en un medio de cultivo.

SELECTIVIDAD
Evala la supresin del crecimiento del microorganismo, que se espera sea inhibido en el medio.

PRUEBA DE PRODUCTIVIDAD Y SELECTIVIDAD PARA MEDIOS DE CULTIVO SLIDOS

METODO CUANTIT ATIVO: MODELO DE MILES Y MISRA.

Para medios muy exigentes o para comparar Medios

50uL 50uL 50uL

CEPA REFERENCIA EN BHI 1818- 24. ANTES

450 uL s.s

-1

-2

-3

-4

-5

-6

1000000 a 10 U F C

Control positivo en una Agar Nutritivo: Agar chocolate

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METODO CUANTITATIVO: MILES Y MISRA IR: RA ZON DE PRODUCTIVIDAD Y RA ZON DE SELECTIVIDAD

Incubar : 37C x 18 Horas
10 uL -6 -1

Contar el numero de colonias presente en cada una de las diluciones Calcular IR RP: 70% a 80% RS: 0.1% a 0% IR: N de colonias presentes x Factor dilucin
N de colonias Control x Factor dilucin

-5

-2

-4

-3

Interpretacin Metodo Ecometrico

PRODUCTIVIDAD Crecimientos por encima de la 5 dilucin.(100 UFC) SELECTIVIDAD Inhibicion completa y/o crecimiento unicamente en la 1 dilucin.(1000.000 UFC)

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Control de calidad en determinacin de sensibilidad a antimicrobianos

Obligatoriamente se debe probar cada lote nuevo de Mueller-Hinton y cada lote de sensidiscos. Realizar el control cada semana. En caso de fallas en los halos de inhibicin se debe realizar diario hasta encontrar la causa..Agar, T , McFarlan, Discos etc. En caso de Galeras Automatizadas, el QC interno es de acuerdo a la casa Comercial, pero no inferior a una vez cada mes. MATERIALES Y PROCEDIMIENTO Discos de Antimicrobianos Tubos con Sln Salina estril o caldo nutritivo Placas de MH, MH con sangre de cordero 5%, MH-chocolate, Escala de McFarland

AGAR MUELLER HINTON

pH de 7.2- 7.4

21 22 ml

McFarland DO

0.5% 625 nm

Absorbancia de 0.08 0.1 1.5 x 10 (8) UFC

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CONTROL DE CALIDAD ANTIBIOGRAMA

Control de difusin de antibioticos Cepas ATCC

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Valores Referencia: dimetro de las zonas de inhibicin en mm segn la OMS

T est Discos

E.coli ATCC 25922 15-20 mm 18-25 mm 19-26 mm 26-32 mm 12-16 mm 24 - 32 mm

S. aureus ATCC 25923 24-35 mm 19-27 mm 19-27 mm --7 -13 mm 24 -32 mm

Pseudomona aeuriginosa ATCC 27853 ----16-21 mm 20-28 mm -----

Enterococcus feacalis ATCC 29212 ----------16 -23 mm

Ampicilina 10 ug Tetraciclina 30 ug Gentamicina 10 ug Imipenem 10 ug Polimixina B 300 IU Sulfamethoxazole 1.25 ug T rimehoprim 23.75 ug

OT ROS..\NORMAS NCCLS M2 A7 Doc.doc

Control de Calidad en determinacin de sensibilidad a Antimicrobianos

McFarland 0.5

Cepa ATCC

S.S

Suspensin de Cepa ATCC hasta 0.5 McFacland. Agitado en VOrtex

Sembrado homogneo con torunda, por estra con rotacin por tres veces

Colocar sensidiscos con dispensador o pinzas flameadas y fras. < 15.

Encubar por 18 horas a 35 + 2 C. En estafilococos y estreptococos por 24 horas completas. Leer con regla y establecer que estn dentro de los rangos de la tabla de ref erencia para cada cepa analizada.

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Nota: Las normas LSCCI/NCCLS sugieren un control de calidad diario y semanal. De no tener las facilidades, se sugiere un control de calidad mensual, debiendo incrementar la frecuencia del mismo de acuerdo a las posibilidades del laboratorio. Pero, se debe realizar por lo menos un control de calidad quincenal para los siguientes antibiticos: Oxacilina, imipenen, meropenem y beta-lactamasa.

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Control de Calidad Interno de los Reactivos Empleados

Las Cepas Utilizadas para control deben ser SIEMPRE cepas Referencia Los Controles deben efectuarse con Cultivos Frescos En general se deben usar dos Tipos de Cepa para probar cada Reactivo o Reaccin,idealmente para probar reacciones dbiles y Fuertes y variaciones en el tiempo de los reactivos. Las Coloraciones deben siempre controlarse con controles Positivos y Negativos, Tanto las de rutina como las especiales Las Tinciones especiales deben controlarse en cada Tanda o serie de trabajo, las de Rutina una vez por semana y en cada lote nuevo de colorantes.

Control de Calidad Interno de los Reactivos Empleados

Frecuencia de Control Reactivos Discos y Tiras
CADA NUEVO LOTE O VIAL Y CADA DIA DE USO Catalasa Oxidasa Coagulasa - Sondas de ADN
CADA NUEVO LOTE Y CADA SEMANA DE USO

Bacitracina - Optoquina - ONPG - Factores X-V-XV Betalactamasa - Indol - PYR - CAMP

CADA NUEVO LOTE Y CADA MES

Antisueros - Kits Comerciales de Identificacin Patron Mcfarland

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QUE ES EL PROGRAMA ATCC DE DERIVADO LICENCIADO?

Es un programa amplio de distribucin comercial que asegura la autenticidad de los Materiales Biolgicos de ATCC, que son distribuidos por compaas elegidas por sus credenciales de Sistemas de Calidad, cuidadosas auditorias, investigacin y evaluacin continua de los productos por parte de ATCC.

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PROPOSITO DEL ATCC LICENSED DERIVATIVE PROGRAM

Incrementar los requerimientos de Control de Calidad de los laboratorios clnicos e industriales. Proporcionar los productos derivados de Cultivo de Referencia a costos accesibles. Crear, a travs de las compaas comerciales, las tecnologas que permiten ahorrar tiempo bajar los costos del Control de Calidad. Beneficiar el Usuario Final con las validaciones de los fabricantes autorizados el final de los cultivos in-house.

TRAZABILIDAD SEGURA
El Programa asegura la trazabilidad de los Materiales Biolgicos desde su origen en ATCC, a travs de los procesos de manufactura de la compaa, el almacenamiento fsico, el manejo y envo del producto desde el fabricante, pasando por los canales de distribucin hasta llegar al Usuario Final. Los acuerdos contractuales unen a todas las partes de este proceso en una cadena de custodia y cadena de responsabilidad adecundose a nuestro mundo actual.

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QUE SIGNIFICA EL LDP PARA EL

LABORATORIO DEL USUARIO FINAL? Acceso fcil y econmico a las fuentes de Materiales Biolgicos de ATCC Autenticidad y trazabilidad a los Cultivos de Referencia de ATCC Avance tecnolgico en productos de Materiales Biolgicos para satisfacer las demandas del Control de Calidad Confianza en un Sistema Mundial de proveedores legalmente autorizados y licenciados de Microorganismos para Control de Calidad

EN QUIENES PODEMOS CONFIAR?

En los proveedores comerciales de Materiales Biolgicos cuyos nmeros de referencia ATCC estn aprobados, autorizados y licenciados. Cualquier compaa comercial, instituto o coleccin de cultivos que no est licenciada o autorizada para comercializar los Materiales Biolgicos de ATCC est operando fuera de los Acuerdos de Transferencia de Material (MTA) y del aseguramiento de autenticidad de ATCC Los Usuarios Finales no tienen ninguna garanta acerca de la validez y exactitud de datos generados al usar productos de proveedores no licenciados

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Slo es posible avanzar cuando se

mira lejos. Solo cabe progresar cuando se piensa en grande.

Jos Ortega y Gasset

www.microbiologics.com

mimontoya@ces.edu.co
TEL: (4) 305 35 00 EXT 312

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