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Marcadores moleculares
El concepto de marcador surge con los trabajos de Mendel: utiliz los colores de las flores como marcadores que le permitieron estudiar los patrones de la herencia
Jardn del monasterio donde Mendel realizaba sus experimentos con las arvejas
Tomado de An Introduction to Genetic Analysis, Griffiths A.J.F y col. (2000). W.H. Freeman, New York.
Permiten establecer diferencias (polimorfismos) entre dos individuos diferentes (genotipos) pertenecientes a la misma especie (o a especies emparentadas) Su herencia suele responder a las leyes de Mendel Los primeros marcadores utilizados fueron los de tipo morfolgico (fenotpicos), por ejemplo, color de la flor. Permiten la confeccin de mapas genticos o de ligamiento Son puntos de referencia ubicados en los cromosomas
Los polimorfismos de los genes se detectan a travs de sus productos -Morfolgicos -Bioqumicos: isoenzimas y protenas de reserva Base molecular Mutaciones de distinto tipo (puntuales, deleciones, etc.)
Fenotpicos
Los polimorfismos de genes u otras secuencias no codificantes se detectan a nivel de ADN -Restriccin + hibridacin molecular (ej., RFLP) -Amplificacin por PCR (ej., RAPD y microsatlites) -Restriccin + PCR: (ej., AFLP) -Conformacin del DNA (ej., SSCP) -Secuenciacin directa Base molecular Mutaciones puntuales o estructurales: inserciones, deleciones, variaciones en el nmero de motivos repetidos en tndem
Genotpicos o moleculares
Marcadores morfolgicos
Marcadores moleculares
Influencia del ambiente Bajo nmero Baja cobertura del genoma Bajo nivel de polimorfismo Menos informativos (dominantes o recesivos) Caracteres de madurez Entrenamiento y subjetividad
Sin influencia ambiental y neutros Cantidad ilimitada Amplia cobertura del genoma Alto nivel de polimorfismo Ms informativos (en general codominantes) Anlisis en fases tempranas Sencillos, rpidos y objetivos
Isoenzimas
Grupo de mltiples formas moleculares de una misma enzima presente en una misma especie, como resultado de la presencia de uno o ms genes que codifican cada una de estas formas.
Las que son relevantes como marcadores genticos son las aloenzimas (o alozimas) que son variantes allicas del mismo gen (o locus) y que presentan una migracin electrofortica diferencial.
Extraccin
- Mtodos no agresivos. Sin desnaturalizacin. - Procesos sencillos, rpidos y poco limpios.
Electroforesis
- Se detectan diferencias en la carga neta de las isoenzimas en geles de almidn o acrilamida. Duracin del ensayo de 4 a 8 horas Tincin: Se realiza una reaccin enzimtica que permite obtener un producto visualizable por empleo de un cromgeno (banda visualizable en el gel).
La interpretacin de los geles puede ser difcil porque los patrones de bandas suelen ser complejos
Adaptado de Ferreira M.E. & Grattapaglia D. Introduo ao uso de marcadores moleculares em anlise gentica (1995)
La enzima puede ser multimrica: sus subunidades pueden tener un control gentico complejo. Puede ser a travs de alelos del mismo locus (alozimas) o estar situados en diferentes loci (isozimas). Expresin codominante.
El mtodo es reproducible. La herencia es mendeliana y codominante. Los patrones estn poco influenciados por el ambiente, aunque muestran especificidad tisular. El procedimiento es rpido y simple. El costo es bajo.
El nmero de isoenzimas disponible es limitado (<30 loci). Baja cobertura del genoma. El material hereditario no se analiza directamente. Slo se pueden detectar las mutaciones que se traducen en cambios en la secuencia de aminocidos. Estos cambios modifican la carga neta (movilidad electrofortica) de las isoenzimas. Se analizan nicamente genes estructurales que codifican protenas solubles con actividad enzimtica (no es una muestra representativa de todo el genoma). La actividad enzimtica est influida por las condiciones ambientales, los estados del desarrollo, y las modificaciones postraduccionales. La interpretacin de los patrones es dificultosa.
Se extraen mediante procedimientos sencillos a partir de las semillas. Se separan mediante electroforesis en geles de poliacrilamida en condiciones desnaturalizantes (con detergentes) No se requiere detectar actividad enzimtica. Se visualizan por tincin con Azul de Coomassie.
Ventajas:
- Presentan las mismas ventajas generales que las isoenzimas. - Permiten evaluar varios loci en forma simultnea en el mismo gel. - Presentan altos niveles de polimorfismo. - El procedimiento es rpido y simple. - El costo del ensayo es bajo.
Desventajas:
- Proveen baja cobertura del genoma. - Debido a que muchos de los genes codificantes estn estrechamente ligados (familias multignicas), no se puede asumir independencia entre los loci.
Identificacin de individuos/cultivares Estudios de gentica de poblaciones Construccin de mapas genticos Programas de mejoramiento Establecimiento de filogenias
RFLP
Anlisis mediante RFLP de los bulks resistente (R) y susceptble (S) al virus PVX de Solanum commersonii empleando las enzimas de restriccin HinfI, DdeI, HindIII, DraI, EcoRI, XbaI y StyI (1 al 7). Autoradiografa de los perfiles de RFLP obtenidos con la sonda s1+A/as1+T(584) marcada radiactivamente. Gentileza M.C.Martnez.
Mutaciones puntuales: Ocurren en sitios de restriccin. Mutaciones estructurales: Ocurren mediante inserciones, deleciones y rearreglos.
Comprenden un nmero potencialmente ilimitado de loci (alta cobertura genmica). Son codominantes, por lo tanto ms informativos. Permiten una mayor cobertura del genoma que las isoenzimas. Son altamente reproducibles intra- e interlaboratorios. Permiten homologar mapas de ligamiento diferentes. Se pueden usar las mismas sondas en especies relacionadas (sondas heterlogas). Al igual que todos los marcadores moleculares, tienen mayor grado de polimorfismo que las isoenzimas, no son influidos por el ambiente y son selectivamente neutros.
Obtener el material vegetal. Extraer y purificar el DNA. PCR + electroforesis (agarosa o poliacrilamida). Mtodos de separacin/deteccin:
- Agarosa / bromuro de etidio o SYBR green II - Poliacrilamida / nitrato de plata o fluorescencia
RAPD A B
A B
Se genera producto de amplificacin No se genera producto de amplificacin
Consiste en la amplificacin mediante PCR de ADN annimo, utilizando para ello un nico iniciador de secuencia arbitraria. Los oligonucletidos iniciadores (primers) se disean sin tener en cuenta informacin de la secuencia genmica de la especie a analizar. Normalmente se usa un slo iniciador, de 10 nucletidos de longitud (ms corto que el de una PCR comn) y con un contenido alto en G+C. -Ejemplo: OP-A01
CAGGCCTC
RAPD
Correspondencia entre los fragmentos amplificados y las bandas de un gel
Puede deberse a: inserciones (2), deleciones (3), mutaciones de punto: que impiden la unin del iniciador (4) o crean un nuevo sitio de unin del iniciador (5).
Perfiles de RAPD obtenidos con 12 primers (N01 a N12) y los bulks B2R (R) y B2S (S) de una poblacin segregante para resistencia a PVX MS de Solanum commersonii. Productos de PCR corridos en un gel de agarosa (1,5%, TBE 1x) teido con bromuro de etidio. Gentileza Lic. M.C. Martnez.
IS B2 F1
F2
Segregacin de un marcador RAPD. DNAs de IS, B2, F1 y 20 individuos F2 amplificados con el primer OP H02. Productos de PCR corridos en un gel de agarosa (1,5 %, TBE 1x) teido con EtBr. Gentileza Dr. D.C. Lijavetzky.
Problemas de subjetividad: - qu bandas se incluyen en el anlisis y cules no? Problemas de la co-migracin: - Una banda no contiene necesariamente un nico fragmento de DNA. - Una banda del mismo tamao en dos individuos no representa necesariamente el mismo fragmento de DNA.
La herencia es dominante (menor informacin genotpica). Poseen problemas de reproducibilidad. La interpretacin de bandas presenta dificultades. Son difciles de transferir a otros laboratorios. A medida que la distancia filogentica aumenta, tambin aumenta la probabilidad de que 2 fragmentos de ADN diferentes comigren y se cometan errores de cmputo (no son confiables para comparacin entre especies distintas)
Estudios de diversidad gentica. Estudios taxonmicos (relaciones fenticas). Establecimiento de genealogas (paternidad). Determinacin de pureza hbrida. Elaboracin de mapas genticos saturados. Mapeo de genes. Identificacin de material vegetal.
Mse I
R R
Anlisis de los segregantes de la poblacin 78 y los bulks B3R(R) y B3S(S) con la combinacin de iniciadores E38M42. La banda de inters se indica con una flecha. R: Individuos resistentes, S: Individuos susceptibles, *: Individuos recombinantes. Perfiles de AFLP resueltos e geles de poliacrilamida, visualizados mediante tincin con nitrato de plata. Gentileza Lic. M.C. Martnez
Bajo contenido de informacin gentica por locus. Medianamente laborioso. Costo medio.
Estudios de diversidad gentica. Estudios taxonmicos (relaciones fenticas). Establecimiento de genealogas (paternidad). Determinacin de pureza hbrida. Elaboracin de mapas genticos saturados Mapeo de genes. Identificacin de material vegetal.
Referencias
-Moss, D.W. Isoenzymes. Capman & Hall, London & New York. 1982. -Botstein D., White R.L., Skolnick M. & Davis R. W. Construction of a genetic linkage map in man using restriction fragment length polymorphisms. Am. J. Hum. Genet. 32:314-331. 1980. -Williams J.G., Kubelik A.R., Livak K.J., Rafalski L.A. & Tingey S.D. DNA polymorphism amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers. Nucleic Acids Res. 18:6531-6535. 1990. -Welsh J. & McClelland M. Fingerprinting genomes using PCR with arbitrary primers. Nucleic Acids Res. 18:7213-7218. 1990. -Caetano-Anlles G., Bassam B.J. & Gresshoff P.M. High resolution DNA amplification fingerprinting using very short arbitrary oligonucleotide preimers. Bio/Technology 9:553557. 1991. -Caetano-Anlles G., Bassam B.J. & Gresshoff P.M. DNA Amplification Fingerprinting: a strategy for genome analysis. Plant Mol. Biol. Rep. 4:294-307. 1991. -Caetano-Anlles G. A versatil and universal tool for genome analysis. Plant Mol. Biol. Rep. 25:1011-1023. 1994. -Vos P., Hogers M., Bleeker M., Rijans M., Van de Lee T., Hornes M., Frijters A., Pot J., Peleman J., Kuiper M. & Zabeau M. AFLP: A new technique for DNA fingerprinting. Nucleic Acids Res. 23:4407-4414. 1995.