Cara perhitungan kultur dan perhitungan E.

colli Alat Tabung reaksi Tabung durham Neraca Autoklaf Pipet mohr 10 mL Erlenmeyer Labu takar Botol contoh Kapas Pembakar spirtus Cawan petri Bahan Sampel air yang telah diklorinasi Lactose Broth Briliant Green Lactose Bile (BGLBB) Aquades DPD Free Chlorin EMB Agar (Eosin Metylen Blue)

Broth

Inkubator (37,5 C)

Cara Kerja Berikut ini adalah cara kerja dalam analisis mikrobiologi yaitu pembuatan media , sterilisasi alat dan media dan pemeriksaan Total coliform dan E. coli. Pembuatan Media a) Pembuatan Media Total coliform Ditimbang 1,3 gram Lactose Broth dimasukkan dalam wadah gelas piala dilarutkan dengan 100 mL aquades. Dipipet masing-masing 10mL ke dalam 10 tabung reaksi. Ditimbang 0.65 gram media Lactose Broth dimasukkan ke dalam wadah gelas piala dilarutkan dengan 25 mL aquades. Dipipet masing-masing 5 mL ke dalam 5 tabung reaksi. Ditimbang 6 gram media BGLBB ( Brilliant Green Lactose Bile Broth ) dimasukkan dalam gelas piala yang dilarutkan dengan 150 mL aquades. Dipipet masing-masing 10 mL ke dalam 15 tabung reaksi. Dimasukkan 1 tabung durham secara terbalik ke dalam tiap tabung. Ditutup mulut tabung reaksi dengan disumbat kapas, dan sumbat tersebut harus sedemikian kuat sehingga dapat dicabut dari tabungnya dengan menggunakan kelingking. Dimasukkan tabung-tabung tersebut ke dalam beaker glass, ditutup bagian atasnya dengan kertas kemudian diikat erat-erat dengan karet. Media siap untuk disterelisasi.

b) Pembuatan Media E. coli Ditimbang 3,75 gram media agar EMB (Eosin Metylen Blue) dimasukkan dalam wadah Erlenmeyer dilarutkan dengan 100 mL aquades. Ditutup mulut Erlenmeyer dengan disumbat kapas, dan ssumbat tersebut harus sedemikian kuat sehingga dapat dicabut dari tabungnya dengan menggunakan kelingking. Ditutup bagian atas erlenmeyer dengan kertas kemudian diikat erat-erat dengan karet. Media siap untuk disterilisasi. Srelisasi a) Sterisasi Alat Alat-alat yang akan disterisasi dibersihkan dan dikeringkan Lalu dibungkus dengan kertas (untuk pipet dan pinggan petri) Dimasukan dalam autoklaf dan diatur suhunya sampai mencapai 121C selama 20 menit b) Sterelisasi Media Media yang akan disterelisasi dimasukan kedalam autoklaf Suhu diatur hingga 121Cselam 60 menit Autoklaf dimatikan dan dibiarkan manomater sampai menunjukan angka nol, autoklaf dibuka dan dibiarkan hingga dingin. Pemerikasaan Total coliform dan E. coli a) Uji Pendugaan Pengerjaan contoh dilakukan secara aseptik, dengan cara didekatkan dengan api. Dipipet contoh masing-masing 10 mL ke dalam tabung medium. Dipipet contoh masing-masing 1 mL ke dalam tabung medium. Dipipet contoh masing-masing 0,1 mL ke dalam tabung medium. Tabung digoyang-goyangkan sehingga contoh tercampur dengan medium secara merata. Diinkubasi semua tabung pada suhu 35C selama 24 jam. Dicatat tabung-tabung yang menujukkan reaksi positif , yaitu terbentuk asam dan gelembung gas.

 Tabung-tabung yang belum menunjukkan adanya gelembung gas diinkubasikan kembali pada suhu 35C selama 24 jam. b) Uji Penegasan Pengerjaan inokulasi dilakukan secara aseptis, dengan cara di dekatkan dengan api. Digoyang-goyangkan tabung dari hasil uji pendugaan yang menunjukkan reaksi positif. Dari tabung-tabung tersebut, diinokulasikan sebanyak 1 mL ke dalam tabung reaksi medium BGLBB (Brilliant Green Lactose Bile Broth) untuk uji Total coliform. Tabung-tabung tersebut diinkubasikan pada suhu 35C selama 48 jam. Adanya gelembung gas menunjukkan Total coliform positif. Dihitung jumlah Total coliform per 100 mL contoh dengan menggunakkan daftar Pumlah Perkiraan Terdekat (JPT) Apabila hasil tabung tidak terdapat pada kombinasi tabung yang positif pada tabel JPT, maka jumlah bakteri per 100 mL harus dihitung dengan menggunakkan rumus :

Keterangan :

A : Jumlah tabung yang positif B : Jumlah (mL) contoh dalam tabung negatif

C : Volume (mL) contoh dalam semua tabung Apabila volume semua contoh tidak sesuai dngan ketentuan tabel JPT, maka jumlah bakteri per 100 mL dihitung dengan rumus :

Keterangan : Z : jumlah bakteri dari tabel JPT Y : Volume (mL) contoh terbesar c) Uji E. coli Menyiapkan alat dan bahan yang akan di gunakan. Menimbang media EMB dan agar sesuai dengan kebutuhan.

 Melakukan pemanasan untuk sterilisasi media EMB dengan menggunakan autoklaf dengan suhu 1210C dan waktu 50 menit. Melakukan penyemprotan tangan dengan menggunakan alkohol dan menyalakan lampu spirtus. Melakukan inokulasi dengan memasukan sampel air ke dalam cawan petri dengan memipet 1 mL sampel dengan teknik penanaman goresan sinambung (Streak). Dituangkan media EMB ke dalam cawan petri yang sudah terdapat sampel. Melakukan inkubasi selama 24-48 jam dengan suhu 350C. Melakukan pengamatan yaitu dengan cara melihat warna yang di timbulkan oleh bakteri tersebut.jika berwarna hijau metalik berarti positif keberadaan bakteri E. coli terdapat dalam sampel air. Prinsip a) Total coliform Untuk menghitung bakteri Coliform ( Total Colifrom) dapat digunakan metode MPN. Perhitungan MPN berdasarkan pada jumlah tabung reaksi yang positif, yakni yang ditumbuhi oleh mikroba setelah diinkubasi pada suhu dan waktu tertentu. Pengamatan tabung yang positif dapat dilihat dengan mengamati timbulnya kekruhan atau terbentuknya gas di dalam tabung kecil (tabung durham) yang diletakan terbalik, yaitu jasad renik yang membentuk gas (Waluyo, 2008). Untuk menguji sifat itu diperlukan beberapa tahap pengujian yaitu: Uji Pendugaan Uji pendugaan adalah uji khas bakteri coliform dengan menggunakan media laktosa, di mana bakteri mampu menggunakan laktosa sebagai sumber karbon ditandai dengan terbentuknya asam dan gas yang dapat dideteksi dengan indikator tertentu, sedangkan untuk mendeteksi adanya gas digunakan tabung durham terbalik, hasil positif yang ditandai dengan terbentuknya asam dan gas lalu dilanjutkan ke uji penegasan. Uji Penegasan Uji penegasan merupakan uji lanjuta dari uji pendugaan adanya bakteri coloform secara pasti, uji ini menggunakan media BGLBB yang berisi tebung durham terbalik, dimana media ini digunakan dengan tujian untuk menghambat pertumbuhan bakteri gram positif dan mengiatkan pertumbuhan bakteri gram negati, hasil yang

positif ditandai dengan adanya gas dalam tabung durham, nilai ini ditunjukan sebagai angka rujukan pada daftar JPT.

b) E. coli Metode hitungan cawan adalah salah satu metode yang dapat digunakan untuk menguji kualitas air minum. Metode hitungan cawan merupakan metode yang paling sensitif untuk menentukan jasad renik, dengan prinsip jika sel jasad renik yang masih hidup ditumbuhkan pada medium agar maka sel jasad renik tersebut akan berkembang biak dan membentuk koloni yang dapat dilihat langsung dan dihitung tanpa menggunakan mikroskop (Fardiaz, 1992). Pada mengidentifikasi E. coli digunakan media agar EMB (Eosin Metylen Blue), media agar EMB bila terdapat bakteri E. coli jika positif akan terbentuk warna hijau terang pada media agar EMB. Salmonella-shigella Alat Kaca arloji Kassa asbes Gelas kimia Pembakar Bunsen Neraca Pipet tetes Batang pengaduk Spatula Incubator Tabung reaksi Cawan Petri Bahan

Larutan peptone 0,1% Tetrationate broth Brilian green agar S.S Agar

Prosedur Gerus 50 gram bahan makanan dalam blender, encerkan dengan 100 ml larutan peptone 0,1%. Inokulasi 50 ml larutan bahan makanan tersebut dalam 50 ml tetrationat broth. Inkubasi pada suhu 37C selama 24 jam Gesekan suspensi pada permukaan brilian green agar dan S.S agar dalam cawan petri.

 Inkubasi pada suhu 37C selama 24 jam untuk S.S agar dan selama 48 jam untuk brilian green agar. Amati, lakukan perwarnaan gram untuk koloni yang memperlihatkan hasil positif. Hasil positif bila pada : S.S agar, koloni berubah warna menjadi kuning transparan. BGA, koloni berwarna rose Jamur Teknik pengambilan sampel Pengambilan sampel dilakukan dengan cara mengambil bulu ayam DOC lalu dimasukkan kedalam tabung yang berisi Pepton. Pepton dimasukkan ke dalam termos yang berisi es. Selanjutnya sampel dibawa ke Laboratorium Mikrobiologi Fakultas Kedokteran Hewan Universitas Syiah Kuala. Teknik pembiakan jamur Untuk media pertumbuhannya dipakai SDA dengan Gentamycin sebagai penghambat pertumbuhan bakteri dengan demikian diharapkan hanya jamur yang tumbuh pada media tersebut. Sampel yang di koleksi dari pepton diulaskan secara merata pada permukaan SDA dengan menggunakan swab steril. Kemudian dibungkus dengan plastic guna menghindari kntaminasi dari mikroorganisme lainnya. Diamati pertumbuhannya selama tujuh hari. Teknik pembuatan slide culture Disiapkan sebuh Petridis, dipotong sebanyak dua buah pipet yang sama panjangnya. Setelah itu letakkan objek glass diatas kedua potongan pipet dan kemudian diletakkan potong agar sebesar 1 cm dan ditutup dengan cover glass diatas potongan agar tersebut. Diambil koloni jamur melalui ose lalu digoreskan pada sisi potongan agar. Diletakkan dalam Petridis kapas yang telah dibasahi dengan air. Dieramkan pada suhu kamar selama 48 jam. Pemeriksaan Biakan Diamati koloni fungi dengan melihat penampilan, warna koloni, tampak atas, tampak bawah. Diamati culture slide dibawah mikroskop Pada Sabourauds Dextrose Agar yang ditempatkan pada suhu kamar.