Hcre Canllk ve Proliferasyon Testleri alma Yntemleri

Bio. Aya Aksoy Kocaeli niversitesi, Kk Hcre ve Gen Tedavileri Aratrma ve Uygulama Merkezi (KGEM)

Hcre Canllk Testleri

1. Grsel

2. Spektroskopik

3. Flow Sitometrik

Hcre Canllk Testleri

Tripan Mavisi FDA-PI CFSE BrdU

FDA/PI

BrdU

CFSE

Hcre Canllk Testleri

WST-1, XTT ve MTT BrdU CFSE

Mezenkimal Kk Hcre

Proliferasyon karlatrmas

Madde etkisi

Ko-kltr

Temel Prensip:
WST-1, XTT ve MTT solusyonlarnn canl
veya apoptozun erken evresindeki hcrelerin mitokondrileri araclyla ile oluturduu reaksiyonda, solusyonlarda bulunan tetrazolium halkas hcre mitokondrilerinde bulunan dehidrogenaz enzimlerince paralanarak renkli formazan kristalleri oluturur.

MTT, XTT, WST-1

1.GN

4. GN

7.GN

17, 21., 24., 27.,30. GN

11. GN 14.GN

1. GN

4. GN

7. GN

11. GN

14. GN

1. GN

4. GN

7. GN

Tripsinizasyon

11. GN

14. GN

1. GN

4. GN

7. GN

11. GN

14. GN

DENEYN UYGULANII
SF M M M M M M SF SF SF SF SF SF SF SF SF SF SF SF 1.Gn H K SF 1.Gn H K SF 1.Gn H K SF SF SF SF SF SF SF SF SF SF SF SF SF SF SF

SF : Serum fizyolojik M : Medyum (kr) K : Kontrol H : Hcre

DENEYN UYGULANII
SF M M M M M M SF SF K K K K K K SF SF K K K K K K SF SF H H H H H H SF SF H H H H H H SF SF H H H H H H SF SF H H H H H H SF SF H H H H H H SF SF H H H H H H SF SF H H H H H H SF SF H H H H H H SF SF SF SF SF SF SF SF SF

SF : Serum fizyolojik M : Medyum (kr) K : Kontrol H : Hcre

 MTT (570 nm) XTT (450-490 nm) WST-1 (420-480 nm)

MTT YNTEM
(3-(4,5-dimethylthiazole-2-yl-)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide)

MTT

yntemi (Mossmann,1983)

Kanser hcre linelarnda kemoterapik ilalarn etkisinin aratrlmas (Tada et al,1986, Carmichael et al., 1987; Vistica et al., 1991).
Test OD _____________ x100 Kontrol OD

% Canllk =

MTT Yntemi
(Millipore-CT01 MTT Cell Growth Kit-5000 T)

MTT (50 mg/vial) TOKSK! (Ik grmemeli) (%10 ekleniyor) 3,5 saat

0,04 N izopropanol/HCl (500 ml) (1:1 ekleniyor) 30 dk

XTT alma Yntemi

XTT: 2,3-bis(2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-5[(phenylamino)carbonyl]-2H- tetrazolium hydroxide XTT yntemi (Scudiero 1988) MTT ile kyaslandnda daha gvenilir (Scudiero 1988 ,Weislow et al., 1989; Roehm et al., 1991).

XTT Ynteminin Avantajlar

MTT kullanldnda znmeyen formazan kristalleri olumakta bunu lmek iin baz zcler kullanarak zmek gerekmektedir. XTT de ise direkt znen kristaller olumakta ve test daha ksa srede sonulanmaktadr. XTT radyoaktif izotoplar iermediinden MTT gibi toksik deildir ve daha gvenli bir testtir.

Metodun Prensibi
XTT ayracnda bulunan tetrazolium halkas canl hcre mitokondrilerinde bulunan dehidrogenaz enzimlerince paralanarak turuncu renkli formazan kristalleri oluturur.

Kit erii
1) XTT Ayrac (10x5 ml) XTT ayracn ieren steril bir solusyondur. Bu solusyon dondurularak saklanmal ve k grmemelidir. 2) Aktivasyon Solusyonu (2x0,5 ml) PBS ieren steril bir solusyondur. Bu solusyon dondurularak saklanmal ve k grmemelidir.

Prosedr
Kullanmdan hemen nce XTT ayrac ve aktivasyon solusyonu 370Clik su banyosunda zlr. Berrak solusyon oluana dek hafife kartrlr. K 100 l spernatant H 100 l hcre pipetlenir. Reaksiyon solusyonunu oluturmak iin 0,1 ml aktivasyon solusyonu + 5 ml XTT ayracna eklenir.(1/50,Taze hazrlanmaldr) K,H kuyucuklarna 50 l reaksiyon solusyonu eklenir ve inkbatrde 3-4 saat bekletilir.

Oluan turuncu renkli formazan kristallerinin absorbans mikroplate okuyucuda 450-500 nanometrede okunur.

WST-1 ( 4-(3-(4-lodophenyl )-2-(4-nitrophenyl)-2H-5tetrazolio)-1,3-benzene disulfonate (ROCHE)

*96 kuyucuklu playtlere 100 l hcre/kuyucuk olacak ekilde pipetlenir. *10l WST-1 /kuyucuk olacak ekilde hcre Proliferasyon Kiti hcre kuyucuklarna pipetlenir. *Hcreler 3-4 saat olacak ekilde (37Cde 5% CO2) inkbatrde inkbe edilir. *Oluturulan hcre spernatantlar kontrol olarak kullanlarak 480 nm.de okuma yaplr

sK-MKH (konvansiyonel)
2.5

sK-MKH (gradient)
2

Absorbans

1.5

0.5

7 Gnler

11

14

17

3.5

2.5

Absorbance

hDP
2 1.5

hPDL

0.5

11

14

17

21

24

Days

Di pulpas, (di z) diin i ksmndaki bolukta damar ve sinirden zengin zellemi bir ba dokusudur. Diin yumuak olan tek tabakasdr. Periodontal ligament, di kkn saran sementin alveol kemie tutunmasn salayan farkl ynde ve uzunlukta bir ok ligamentin ortak addr.

0,25

0,2

A b s o rb an s

T -hc re Uyarlm T Hc re

0,15

0,1

0,05

CFSE ( (5-(and-6)-carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester:CFDA-SE) (Hcre proliferasyon testi)

CFSE: DMSO ile dilue edilen bir stoplazmik floresan boyasdr ve younluu hcre blnmesiyle ters orantl

olarak azalmaktadr.

Boyann Asetat gruplar

Ester Gruplar+Aminler

H.ii Esteraz

Ester gruplar

FloresanKonjugatlar

Flow sitometride okunan Floresan konjugatlarn younluu her hcre blnmesinde orannda azalmaktadr.

CFSE

l Hcre

Canl Hcre Prolifere olan hcre

 Lenfosit

Lenfosit + MKH (ndirekt)

Lenfosit + MKH (Direkt)