1 Introduo Bactrias so um domnio de micro-organismos unicelulares, procariontes (desprovidos de envoltrio nuclear e organelas membranosas), segundo o sistema taxonmico constituam

o reino Moneras, juntamente com as chamadas "algas azuis" ou "cianofceas" - hoje mais corretamente chamadas cianobactrias, As bactrias podem ser encontradas na forma isolada ou em colnias. Podem viver na presena de ar (aerbias), na ausncia de ar (anaerbias) ou, ainda, ser anaerbias facultativas. As bactrias classificam-se morfologicamente de acordo com a forma da clula e com o grau de agregao. Quanto a forma Coco : De forma esfrica ou subesfrica. Bacilo : Em forma de bastonete (do gnero Bacillus) Vibrio : Em forma de vrgula (do gnero Vibrio) Espirilo : de forma espiral/ondulada (do gnero Spirillum) Espiroqueta : Em forma acentuada de espiral. Quanto ao grau de agregao Apenas os Bacilos e os cocos formam colnias. Diplococo : De forma esfrica ou subesfrica e agrupadas aos pares. Estreptococos : Formam cadeia semelhante a um "colar". Estafilococos : Uma forma desorganizada de agrupamento, formando cachos. Sarcina : De forma cbica, formado por 4 ou 8 cocos simetricamente postos. Diplobacilos : Bacilos reunidos dois a dois. Estreptobacilos : Bacilos alinhados em cadeia. 2 Estruturas da clula procariota A clula bacteriana, por ser procaritica, no possui organelos membranares nem DNA organizado em verdadeiros cromossomas, como os das clulas eucariotas. Os pili so microfibrilas proteicas que se estendem da parede celular em muitas espcies Gram-negativas. Tm funes de ancoramento da bactria ao seu meio e so importantes na patognese. Um tipo especial de pilus o pilus sexual, estrutura oca que serve para ligar duas bactrias, de modo a trocarem plasmdeos. Os plasmdeos so pequenas molculas de DNA circular que coexistem com o nucleide. So comumente trocados na conjugao bacteriana. Os plasmdeos tm genes, incluindo frequentemente aqueles que protegem a clula contra os antibiticos. H cerca de 20 mil ribossomos em um citoplasma bacteriano. Os ribossomos procariotas so diferentes dos eucariotas e essas diferenas foram usadas para desenvolver antibiticos que s afetam os ribossomos bacterianos. O citoplasma preenchido pelo hialoplasma, um lquido com consistncia de gel, semelhante ao dos eucariotas, com sais, glicose e outros acares, RNA, protenas funcionais e vrias outras molculas orgnicas. A membrana celular uma dupla camada de fosfolpidos, com protenas imersas. A parede celular bacteriana uma estrutura rgida que recobre a membrana citoplasmtica e confere forma s bactrias. uma estrutura complexa composta por peptidoglicanos - polmeros de carboidratos ligados a protenas. Algumas espcies de bactrias tm uma camada de polissacardeos que protege contra desidratao, fagocitose e ataque de bacterifagos, chamada de cpsula. O nucleide consiste em uma nica grande molcula de DNA com protenas associadas, sem delimitao por membrana - portanto, no um verdadeiro ncleo. O seu tamanho varia de espcie para espcie.

O flagelo uma estrutura proteica que roda como uma hlice. Muitas espcies de bactrias movem-se com o auxlio de flagelos. Os flagelos bacterianos so completamente diferentes dos flagelos dos eucariotas. 3 Classificao das bactrias Hans Christian Gram, um bacteriologista dinamarqus, estudou e definiu a tcnica para corar bactrias, a colorao Gram, em 1884. Nesta ocasio, experimentalmente, corou lminas com esfregaos com violeta de genciana e percebeu que se as bactrias existentes nestes esfregaos uma vez coradas no desbotavam com lcool, se previamente fossem tratadas com iodo, avanando e aprimorando o mtodo, ele adicionou ainda outros corantes denominados contra-corantes, tais como safranina e fucsina bsica. A forma da bactrias pode ser observada atravs de colorao de Gram que divide as bactrias em dois grupos: Gram-positivas e Gram-negativas, isto depender da parede celular da bactria. A parede da clula Gram-negativa constituda por estruturas de mltiplas camadas bastante complexas, que no retm o corante. J a parede da clula Gram-positiva consiste de nica camada que retm o corante aplicado, no adquirindo a colorao do segundo corante. Componente Peptdeoglicano cido teicico Lipopolissacardeo Gram Positivas Espesso, muitas camadas Sim No Gram negativas Fina, camada nica No Sim

Observe melhor na figura abaixo:

4 Componentes da parede celular 4.1 Peptdeoglicano formado por dois tipos de acares (o cido N-acetilmurmico e a Nacetilglucosamina) e alguns aminocidos. O peptidoglicano a estrutura que confere rigidez parede celular de bactrias, determina a forma da bactria e a protege da lise osmtica, quando em meio hipotnico. O cido N-acetilmurmico e a Nacetilglucosamina esto ligados entre si por uma ligao glicosdica denominada (14). Por sua vez, oligopptidos ligam molculas de cido N- acetilmurmico entre si. Estes oligopptidos possuem tanto L- como D-aminocidos. Em consequncia das ligaes que ocorrem entre as cadeias de glicano e de aminocidos, a molcula do peptidoglicano possui a forma de uma rede.

4.2 Lipopolissacardeos Lipopolissacardeo (LPS) uma molcula de grandes dimenses constituda de um lpido e um polissacardeo (carboidrato) ligados por uma ligao covalente. LPS um dos componentes principais da membrana exterior de bactrias gram-negativas, contribuindo muito para a integridade estrutural da bactria, protegendo a membrana de certos tipos de ataque qumico. O LPS uma endotoxina, provocando uma forte resposta por parte de sistemas imunitrios 4.3 cido teicico Estes polmeros de glicerolfosfato ou ribitolfosfato esto localizados na camada externa da parede celular de bactrias Gram-positivas e estendem-se pela parede. 5 Bactrias lcool cido Resistentes As bactrias cido-lcool resistentes no podem ser classificadas segundo o Gram, a qual a tcnica mais comum na microbiologia contempornea, entretanto podem ser tingidas com alguns corantes concentrados combinados com calor. Uma vez tingida tem a capacidade de resistir a decolorao de uma combinao de lcool-cido, o qual o descolorante mais comum nos protocolos de colorao de bactrias, de onde vem o nome lcool-cido resistente.

A alta concentrao de cido miclico na parede celular, como as bactrias do gnero Mycobacterium, a causa da baixa absoro e alta reteno da colorao (fucsina). A forma mais comum para poder identificar este tipo de bactrias atravs da tcnica de colorao de Ziehl-Neelsen, onde a bactria fica tingida em vermelho e se agrega uma colorao de contraste de azul de metileno a qual permite apreciar de melhor forma a bactria contra um fundo azul. Outra tcnica o mtodo Kinyoun na qual a bactria colorida de vermelho claro e colocada contra um fundo verde. Bactrias cido-lcool resistentes podem ser visualizadas por microscopia de fluorescncia usando corantes fluorescentes especficos (corante auramina-rodamina, por exemplo). Algumas bactrias podem tambm ser parcialmente cido-lcool resistentes. 6 Crescimento e Metabolismo As bactrias se reproduzem por fisso binria, processo no qual uma clula parental se divide para formar duas clulas-filhas. Devido a esse fato, dizemos que as bactrias possuem crescimento exponencial (crescimento logaritmo), o tempo de duplicao varia de 20 minutos para um E.coli e de 24hs para M. Tuberculosis. O ciclo de crescimento das bactrias apresenta 4 fases. Lag: perodo varivel, onde ainda no h um aumento significativo da populao. Ao contrrio, um perodo onde o nmero de organismos permanece praticamente inalterado. Esta fase apenas observada quando o inculo inicial proveniente de culturas mais antigas. A fase lag ocorre porque as clulas de fase estacionria encontram-se em falta de vrias coenzimas essenciais e/ou outros constituintes celulares necessrios absoro dos nutrientes presentes no meio. A fase lag tambm observada quando as clulas sofrem traumas fsicos (choque trmico, radiaes) ou qumicos (produtos txicos), ou quando so transferidas de um meio rico para outro de composio mais pobre, devido a necessidade de sntese de vrias enzimas. Assim, durante este perodo observa-se um aumento na quantidade de protenas, no peso seco e no tamanho celular. Log ou exponencial: nesta etapa, as clulas esto plenamente adaptadas, absorvendo os nutrientes, sintetizando seus constituintes, crescendo e se duplicando. Deve ser levado em conta tambm que neste momento, a quantidade de produtos finais de metabolismo ainda pequena. A taxa de crescimento exponencial varivel, de acordo com o tempo de gerao do organismo em questo. Geralmente, procariotos crescem mais rapidamente que eucariotos. Nesta fase so realizadas as medidas de tempo de gerao. Geralmente, ao final da fase log, as bactrias passam a apresentar fentipos novos, decorrentes do processo de comunicao denominado "quorum sensing". Estacionria: Nesta fase, os nutrientes esto escasseando e os produtos txicos esto tornando-se mais abundantes. Nesta etapa no h um crescimento lquido da populao, ou seja, o nmero de clulas que se divide equivalente ao nmero de clulas que morrem. Na fase estacionria que so sintetizados vrios metablitos secundrios, que incluem antibiticos e algumas enzimas. Nesta etapa ocorre tambm a esporulao das bactrias. Foram detectados alguns genes (sur) que so necessrios sobrevivncia das clulas na fase estacionria. Alm destes, existem outros genes (fatores s alternativos da RNA polimerase, protenas protetoras contra dano oxidativo). Declnio: A maioria das clulas est em processo de morte, embora outras ainda estejam se dividindo. A contagem total permanece relativamente constante, enquanto a de viveis cai lentamente. Em alguns casos h a lise celular. Culturas descontnuas tendem a sofrer mutaes que podem repercutir na populao como um todo. As

prprias condies ambientais tendem a promover variaes de carter fenotpico (reversvel) nas culturas.

O metabolismo um conjunto de eventos altamente regulado. A vida s possvel se h um alto nvel de regulao controlando cada evento celular. Tal nvel de regulao possvel pela propriedade das enzimas reconhecerem seus substratos de forma especfica. Com base nesta propriedade, as enzimas obedecem a rotas prprogramadas: as vias biossintticas (anabolismo) e as vias catablicas (catabolismo). A absoro e utilizao de compostos orgnicos ou inorgnicos requeridos para o crescimento e manuteno das funes celulares, a capacidade de sobrevivncia, funcionamento, replicao de clulas bacterianas e os processos qumicos envolvidos nesses eventos constituem o metabolismo bacteriano. Metabolismo Hetreotrfico - sntese de ATP a partir da energia liberada pela oxidao de compostos orgnicos, transformando-os em molculas mais simples e utilizadas como fonte de carbono; Metabolismo Autotrfico so capazes de utilizar CO2 como principal fonte de carbono, obter energia pela sntese de ATP pela oxidao de compostos inorgnicos ou captao de energia luminosa. O modo pelo qual as bactria fazem esta transformao de energia define seu processo metablico. As bactrias que oxidam compostos qumicos empregam os processos de respirao aerbica, anaerbica ou fermentao, enquanto as que utilizam luz como fonte de energia fazem fotossntese. Para maioria dos organismos o oxignio aumenta o metabolismo e o crescimento, pois atua como aceptor de hidrognio nos passos finais de produo de energia. Devido ao fato do oxignio gerar duas molculas txicas, o perxido de hidrognio e o radical livre superxido, as bactrias necessitam de pelo menos duas enzimas para utiliz-lo, a superxido dismutase e a catalase. A capacidade de crescer na presena ou na ausncia de oxignio divide as bactrias em cinco grupos Aerbicas estritas: Bactrias aerbicas estritas crescem apenas onde h disponibilidade de oxignio, como por exemplo, as bactrias do gnero Pseudomonas. Microaerfilas: Bactrias microaerfilas requerem uma quantidade reduzida de oxignio; altas concentraes de oxignio lhes so txicas. As bactrias microaerfilas sobrevivem em ambientes com alta concentrao de dixido de carbono e baixas concentraes de oxignio, como por exemplo, as bactrias do gnero Campylobacter. Anaerbicas facultativas: Bactrias anaerbicas facultativas utilizam oxignio em seu metabolismo energtico, mas tambm podem crescer na ausncia de oxignio. As bactrias Escherichia coli e espcies de Staphylococcus so encontradas no trato intestinal e urinrio onde h pouca disponibilidade de oxignio. Todas as bactrias pertencentes famlia Enterobacteriaceae so anaerbicas facultativas.

Anaerbicas aerotolerantes: Bactrias anaerbicas aerotolerantes suportam a presena de oxignio, sem utiliz-lo em seu metabolismo. Por exemplo, a bactria Lactobacillus acidophillus. Anaerbicas estritas: Bactrias anaerbicas estritas no crescem na presena de oxignio que lhes txico. A maioria das espcies anaerbicas estritas encontrada no solo ou em micro-ambientes em organismos animais que tenham se tornado anaerbico, como ferimentos profundos ou ajuno das gengivas com os dentes. So exemplos de organismos anaerbicos estritos as bactrias do solo Clostridium tetani (causadora do ttano), Clostridium botulinum (causadora do botulismo) e as bactrias associadas com doenas periodontais, como Porphiromonas gengivallis e Prevotella intermedia. A grande maioria das bactrias associadas aos intestinos de animais so anaerbicas estritas. Para o crescimento de bactrias anaerbicas estritas em laboratrio so requeridos procedimentos especiais de cultivo, tais como a excluso total do oxignio do meio e do ambiente de crescimento atravs do uso de agentes redutores que reajam com o oxignio gasoso. Na presena de oxignio, o radical superxido (O2-) e perxido de hidrognio (H2O2) so formados como subprodutos das atividades das enzimas oxidativas que participam da sntese de ATP. Nas bactrias aerbicas estritas e na maioria das anaerbicas facultativas, o radical superxido convertido em oxignio molecular (O2) e em perxido de hidrognio (H2O2) pela enzima superxido dismutase. O perxido de hidrognio convertido em oxignio molecular e gua pela enzima catalase (algumas espcies de bactrias anaerbias facultativas e de aerotolerantes no possuem a catalase). As bactrias anaerbicas estritas no sintetizam nem a catalase nem a superxido dismutase e so mortas pelos efeitos txicos do superxido e do perxido de hidrognio. Metabolismo dos fungos Os fungos so microrganismos heterotrficos e, em sua maioria, aerbios obrigatrios. No entanto, certas leveduras fermentadoras, aerbias facultativas, se desenvolvem em ambientes com pouco oxignio ou mesmo na ausncia deste elemento. Os fungos podem germinar, ainda que lentamente, em atmosfera de reduzida quantidade de oxignio. O crescimento vegetativo e a reproduo assexuada ocorrem nessas condies, enquanto a reproduo sexuada se efetua apenas em atmosfera rica em oxignio Os fungos produzem enzimas como lipases, invertases, lactases, proteinases, amilases etc., que hidrolisam o substrato tornando-o assimilvel. Alguns substratos podem induzir a formao de enzimas degradativas; h fungos que hidrolisam substncias orgnicas mais complexas (quitina, osso, couro, inclusive materiais plsticos). Muitas espcies fngicas podem se desenvolver em meios mnimos, contendo amnia ou nitritos, como fontes de nitrognio. As substncias orgnicas, de preferncia, so carboidratos simples como D-glicose e sais minerais como sulfatos e fosfatos. Oligoelementos (ferro, zinco, mangans, cobre, molibdnio e clcio) so exigidos em pequenas quantidades. Alguns fungos requerem fatores de crescimento, que no conseguem sintetizar, em especial, vitaminas (tiamina, biotina, riboflavina, cido pantotnico, etc). 7 Cultura e isolamento de microorganismos Entre os principais componentes de um meio de cultura esto s fontes de carbono e energia como os acares, as fontes de nitrognio, fsforo e sais minerais. Outros componentes mais especficos podem ser encontrados em um meio especifico para um determinado organismo (meio seletivo), estes so os fatores de Crescimento como as vitaminas, aminocidos, e outros mais. Por outro lado podemos ter num meio agentes/constituintes que inibam o crescimento de determinados microrganismos, sendo estes tambm considerados meios seletivos.

Alm de meios seletivos existem tambm meios que permitem diferenciar microrganismos (meios diferenciadores ou diferenciais), o exemplo mais simples a existncia de um indicador de pH que permite verificar se, por exemplo, um acar presente no meio metabolisado pois, ao ser, implica a produo de metablitos que acidificam o meio alterando o seu pH e consequentemente a alteram a cor do indicador de pH. Os meios de cultura so classificados quanto ao estado fsico em slidos, quando contm agentes solidificantes, principalmente gar (cerca de 1 a 2,0 %). Os semislidos, quando a quantidade de gar e ou gelatina de 0,075 a 0,5 %, dando uma consistncia intermediria, de modo a permitir o crescimento de microrganismos em tenses variadas de oxignio ou a verificao da motilidade e tambm para conservao de culturas. Os lquidos, sem agentes solidificantes, apresentam-se como um caldo, utilizados para ativao das culturas, repiques de microrganismos, provas bioqumicas, e dentre outros. Os meios de cultura podem ainda ser classificados quanto composio qumica podem ser simples (meios bsicos) ou complexos Bsicos so aqueles que permitem o crescimento bacteriano, sem satisfazer contudo nenhuma exigncia em especial (Ex. caldo e gar simples), e complexos quando cumprem com as exigncias vitais de determinados microrganismos, como meio de infuso de crebro e corao, gar suco de tomate, gar sangue, meio de Loeffler (com soro bovino), gar chocolate (gar simples fundido, adicionado de sangue e aquecido a 80 C), etc. De acordo com a finalidade bacteriolgica ou micolgica os meios especiais podem ser classificados em: Meios de Enriquecimento - quando proporcionam nutrientes adequados ao crescimento de microrganismos presentes usualmente em baixos nmeros ou de crescimento lento, bem como microrganismos exigentes e fastidiosos. Esses meios tm a propriedade de estimular o crescimento de determinados microrganismos, mas existem alguns que tambm podem inibir o crescimento de outros. Ex. Caldo Tetrationato e Selenito-Cistina para cultivo de Salmonelas (lquidos), Caldo Tioglicolato para Clostridium perfringens. Diferenciais - quando contm substncias que permitem estabelecer diferenas entre microrganismos muito parecidos, tais como meio de Teague ou Eosina Azul de Metileno (diferencial para coliformes), gar MacConkey para a diferenciao de enterobactrias, gar sangue, gar Baird-Parker para isolamento e diferenciao de cocos Gram positivos (slidos). Seletivos - os que contm substncias que inibem o desenvolvimento de determinados grupos de microrganismos, permitindo o crescimento de outros. Exemplo: meios com telurito de potssio (para isolamento de Corynebacterium diphtheriae), gar Salmonella-Shigella (SS) e gar MacConkey, meios com sais biliares e verde brilhante para isolamento seletivo de Salmonella, meios com 7,5% de cloreto de sdio, meio Baird-Parker, para isolamento de Staphylococcus aureus, meios com antibiticos para isolamento de diversos microrganismos (TSC, SFP, meio de Blaser, meio de Skirrow, etc.). A maioria deles tambm diferencial, permitindo diferenciar as colnias (slidos) dos microrganismos. Meios de triagem - meios que avaliam determinadas atividades metablicas permitindo caracterizao e identificao perfunctria ou presuntiva de muitos microrganismos (gar trplice acar e ferro, meio Instituto Adolfo Lutz, uria, etc.); Identificao - prestam-se para a realizao de provas bioqumicas e verificao de funes fisiolgicas de organismos submetidos a identificao (meios Oxidao/Fermentao, gar Citrato, Caldo nitrato, meio semi-slido, caldo triptofano, meio de Sulfito Indol Motilidade, etc.; Dosagem - empregados nas determinaes de vitaminas, antibiticos e aminocidos; Contagem - empregados para a determinao quantitativa da populao microbiana (Agar de Contagem em Placas, TSC, Agar Batata Dextrose, gar Baird-Parker, etc.);

Estocagem ou manuteno - utilizados para conservao de microrganismos no laboratrio, i.e. garantem a viabilidade de microrganismos (gar Sabouraud, Meios com leite, gar suco de tomate, gar sangue, gar Simples, meio semi-slido, etc.) 8 Mtodos de estocagem e preservao O armazenamento inadequado de culturas por longos perodos afim de utilizar em pesquisa e/ou produo pode resultar contaminao, perda de viabilidade e mutao (perda das caractersticas fisiolgicas), para isso, necessita de mtodos eficazes que garantam a preservao das caractersticas determinantes do microorganismo a longo prazo, que favorece a diminuio do crescimento e das atividades metablicas ou mesmo o crescimento em meio mnimo de resduos metablicos, pois estes podem comprometer a viabilidade da cultura. - curto prazo :repique contnuo - mdio prazo: preservao em leo mineral, preservao em gua, congelamento a 20C, secagem em slica, solo e papel de filtro - longo-termo: liofilizao, congelamento a -80C, criopreservao em nitrognio lquido. Repique contnuo - diminuio do metabolismo (meios mnimos como Agar simples e baixa temperatura); - temperatura de estocagem: temperatura ambiente de 2-3 meses; geladeira (4 a 7 C) de 4-6 meses - freqncia entre as transferncias: determinao emprica - minimizar o n de repiques evitar a seleo de mutantes - examinar a pureza em cada transferncia - conservar em duplicata Vantagens: baixo custo, no requer equipamentos especializados, o manuseio simples. Desvantagens: riscos de contaminao e possvel perda da linhagem, perda de caractersticas morfolgicas, fisiolgicas ou patogenicidade, seleo de clulas atpicas (variantes ou mutantes), superviso especializada, mo-de-obra, espao relativamente grande para a armazenamento. Preservao em leo mineral Vantagens: menor custo de equipamento, evita contaminao por caros Desvantagens: necessidade de mais transferncias at que a cultura revigore, requer espao para armazenamento. Preservao em gua (Castellani) Vantagens: boa taxa de viabilidade, evita contaminao por caros Desvantagens: limitado a organismos que aderem ao gar (Castellani), dificuldade da retirada dos cubos na reativao, crescimento durante a estocagem, requer espao p/ armazenamento, riscos de contaminao. Secagem em slica, solo e papel de filtro Vantagens: simples e de baixo custo, no requer equipamento especial, estabilidade elevada, caros no sobrevivem. Desvantagens: mtodos limitados a bactrias e fungos filamentosos esporulados, risco de contaminao devido ao manuseio sucessivo, papel: poucos dados sobre o sucesso do mtodo. Liofilizao

Vantagens: vedao total da amostra, longa viabilidade, estabilidade elevada em muitas espcies, produo em larga escala, no requer armazenamento especial (somente ao abrigo da luz), fcil distribuio e transporte. Desvantagens: muitas espcies no sobrevivem ao processo, viabilidade ocasionalmente insatisfatria, mo-de-obra especializada, requer equipamentos sofisticados. Congelamento e criopreservao em nitrognio lquido Vantagens: condies estveis por longos perodos, vedao completa, evitando contaminao, utilizao para esporulados e no esporulados. Desvantagens: viabilidade ocasionalmente insatisfatria, requer equipamento sofisticado, suprimento contnuo de N2, boa infra-estrutura caso de acidentes de vazamento. 9 Mtodos de esterilizao, desinfeco e assepsia Esterilizao: o processo pelo qual todos os microrganismos viveis so eliminados ou destrudos, inclusiva os esporos de bactrias, a forma de vida mais resistente. Desinfeco: A desinfeco envolve a destruio de microrganismos patognicos associados a objetos inanimados, geralmente por meio fsico ou qumico. Todos os desinfetantes so efetivos contra as formas vegetativas dos microrganismos, mas no necessariamente contra seus esporos. Assepsia: A assepsia envolve a inativao ou destruio por meio qumico dos microrganismos associados ao animal. Antisspticos podem ser bactericidas ou bacteriostticos; o estado formador irreversvel, mas o ltimo reversvel. Para propsitos ordinrios, os termos desinfetantes e antisspticos so usados como sinnimos. 9.1 Esterilizao por calor mido - Autoclavagem Faz-se atravs da autoclave cujo funcionamento idntico ao da panela de presso sendo a temperatura necessria para esterilizaao de 121C, e o tempo de esterilizao de cerca de 15 minutos. Este tempo de esterilizao dever ser aumentado quando se enche bastante a autoclave com meios para esterilizar - Tindalizao Este mtodo consiste numa esterilizao fraccionada em que o meio sofre 3 aquecimentos em 3 dias consecutivos, para destruio de formas vegetativas bacterianas que evoluem de esporos. Utiliza temperaturas inferiores a 100C, e faz-se em banho-maria, onde se mergulham os frascos de meio a esterilizar hermticamente fechados, durante cerca de 1h, repetindo-se o tratamento em 3 dias consecutivos. - Pasteurizao: Esterilizao utilizando uma temperatura inferior a 100 C, geralmente 57 a 60 C em banho-maria. Ocorre eliminao de microrganismos sensveis ao calor, entre estes, estirpes patognicas, sem adulterao das qualidades do produto a pasteurizar. 9.2 Esterilizao por calor seco Colocar o material por um periodo prolongado numa estufa a 180C, no mnimo 2 horas. Este tipo de esterilizao utilizado para material de vidro, para material de disseco, mas no muito efetivo contra aquelas bactrias e fungos que produzem esporos resistentes secura.

9.3 Irradiao Outro modo no qual a energia serve como um agente antimicrobiano o uso da radiao. Radiao definida como energia emitida da atividade de um tomo e dispersa a uma alta velocidade atravs da massa ou espao. caracterizada por um faixa de comprimento de ondas conhecida como espectro eletromagntico. Embora existam outras formas de radiao, a mais simples de conseguir e manipular: a radiao ultravioleta. Na prtica cotidiana a fonte de raios ultravioleta a lmpada germicida, que gera radiao a 254 nm. A radiao ultravioleta no to penetrante quanto a radiao ionizante. Isso porque a radiao ultravioleta passa livremente pelo ar, relativamente pela gua, e muito pouco por slidos, ento os objetos a serem desinfetados necessitam estar diretamente expostos para ao completa. Como a radiao UV passa entre a clula, e inicialmente absorvida pelo DNA. Danos especficos moleculares ocorrem nas bases pirimidnicas (Tiamina e Citosina) que forma ligaes anormais. Como resultado a clula para de crescer e morre. Alm das mutaes genticas a radiao UV tambm gera substncias txicas fotoqumicas conhecidas como radicais livres. eficiente: destruio de clulas e esporos de e fungos, formas vegetativas de bactrias, protozorios e vrus. Desvantagens e precaues: Alm da baixa penetrao em materiais slidos como vidro, tecidos, massas, meios difusos, objetos densos, os materiais precisam ser espalhados de forma que a maior quantidade de luz possvel incida sobre eles. Outro ponto negativo que a radiao UV prejudicial nos tecidos humanos, como tambm causa queimaduras, danos na retina, cncer e rugas na pele (envelhecimento celular). Uso: Desinfeco do ar, ambientes, alguns lquidos, reduo de microrganismos do ar, desinfeco de alimentos e gua. 9.4 Filtrao A filtrao envolve a remoo de microrganismos de solues lquidas ou de gases atravs do atravessamento de membranas filtrantes. Estas podem ser de vrios materiais (mais vulgarmente, acetato de celulose ou de policarbonato) e tm dimetros de poro muito pequenos (usualmente 0,2 m) onde as clulas microbianas ficam retidas. 9.5 Esterilizao Qumica Com substncias volteis, lcool etlico a 70%, com sais metlicos ou compostos orgnicos de metais (mertiolato e mercurocromo), com halogneos (cloro sob a forma de hipoclorito de clcio e o iodo), os cidos e lcalis aumentam a concentrao hidrogeninica do meio e aceleram a taxa de mortalidade dos microorganismos. Os compostos de amnio quaternrios so atxicos e extremamente enrgicos sobre bactrias e vrus. - Formaldedo: Como desinfetante mais utilizado a formalina, soluo em gua a 10% ou em lcool a 8%, sendo bactericida aps exposio de 30 minutos e esporicida aps 18 horas. No pode ser utilizado como agente de assepsia, pois corrosivo, txico, irritante de vias areas, pele e olhos. - Iodo: Alm do uso como antissptico pode ser usado na desinfeco de vidros, ampolas, metais resistentes oxidao e bancadas. A formulao pode ser de lcool iodado, contendo 0,5 e 1,0 % de iodo livre em lcool etlico de 77% (v/v), que corresponde a 70% em peso. O (PVPI) Iodopovidona pode ser utilizado na assepsia das mos, regies para injeo, campos cirrgicos etc. No se recomenda o uso em mucosas (ex. boca, olhos, nus etc.). - Cloro: O hipoclorito est indicado para desinfeco e descontaminao de superfcies e de artigos plsticos e borracha. Tambm utilizado em superfcies de reas como lavanderia, lactrio, copa, cozinha, balces de laboratrio, banco de

sangue, pisos etc. um agente desinfetante de amplo espectro, barato, no txico dentro de suas especificaes (utilizar equipamento de proteo individual como mscara, culos, luvas e aventais). - lcool: O lcool amplamente usado como desinfetante, tanto o lcool etlico, 70% (p/v), como o isoproplico, 92% (p/v), por terem atividade germicida, menor custo e pouca toxicidade, sendo que o lcool etlico tem propriedades germicidas superiores ao isoproplico. O seu uso restrito pela falta de atividade esporicida, rpida evaporao e inabilidade em penetrar na matria proteica. recomendvel para desinfeco de nvel mdio, com tempo de exposio de 10 minutos, sendo recomendveis trs aplicaes intercaladas pela secagem natural. A concentrao ideal da faixa de 60% a 90%. O mecanismo de ao do lcool depende de sua concentrao. Diferentemente de outros desinfetantes o lcool mais concentrado ou absoluto no exerce maior poder de desinfeco. Em concentraes de lcool superiores a 50%-70% eles dissolvem membranas lipdicas, desestabiliza a tenso da superfcie celular, comprometendo a integridade da membrana levando as clulas a lise. J as concentraes 60% a 70% lcool entra no nucleoplasma (meio que contorna o material gentico) desnatura protenas atravs de coagulao, outro fato importante que o lcool 70% possui maior tempo de ao (evapora mais devagar). A gua necessria para a coagulao das protenas, e, portanto a concentrao ideal para a atividade microbicida de 70% lcool. O lcool no esporicida a temperatura ambiente. No entanto, eficaz contra formas vegetativas de muitas bactrias e esporos de fungos. - Clorexidina: O composto clorexidina (Hibiclens, Hibitane) um complexo orgnico contendo cloro e anis fenlicos. Seu mecanismo de ao ocorre nas duas membranas celulares pela diminuio da tenso superficial e da estrutura proteica atravs de desnaturao. Em concentraes moderado-altas um bactericida para bactrias tanto gram-positivas quanto gram-negativas, porm ineficaz contra esporos. Sua ao em fungos e vrus varivel. A clorexidina tem vantagens sobre outros antisspticos devido seu carter suave/benigno, baixa toxicidade, ao rpida e baixa absoro tecidual. o antissptico mais utilizado no controle de Staphylococcus MRSA (cepas bacterianas resistentes a antibiticos) em hospitais. Dentre as suas principais aplicaes, destacam-se: degermao das mos e antebrao da equipe; preparo da pele (pr-operatrio e procedimentos invasivos);lavagem simples das mos. - Triclosan: Apresenta ao contra bactrias Gram positivas e a maioria das Gramnegativas, exceto para a Pseudomonas aeruginosa, e apresenta pouca ao contra fungos. O triclosan pode ser absorvido atravs da pele ntegra, mas sem consequncias sistmicas relevantes. A sua ao antimicrobiana se faz num perodo intermedirio e tem uma excelente ao residual. Sua atividade minimamente afetada pela presena de matria orgnica. O triclosan encontrado em formulaes de sabonetes em barra e lquidos, e um dos agentes utilizados na degermao de mdicos cirurgies em muitos hospitais. 10 Anlise microbiolgica De acordo com as Boas Prticas em Farmcia, os produtos farmacuticos devem possuir qualidade compatvel com especificaes determinadas por cdigos oficiais, visando assegurar seu uso. A qualidade microbiolgica das matrias-primas empregadas nas formulaes de medicamentos e cosmticos fator primordial para se alcanar eficincia e segurana. A Farmcia Magistral representa um importante segmento do mercado farmacutico brasileiro. A Anvisa, por meio da Resoluo 33/2000, instituiu as Boas Prticas de Fabricao em Farmcia, buscando estabelecer rgidos parmetros de qualidade em todas as etapas de fabricao de um produto manipulado de forma magistral. Produtos no estreis so aqueles nos quais se admite a presena de carga microbiana, embora limitada. O objetivo imediato de uma

anlise microbiolgica comprovar a ausncia de microrganismos patognicos e determinar o nmero de microrganismos viveis, em funo dos tipos de utilizao do produto, por exemplo para uso tpico ou oral. Cargas microbianas elevadas podem comprometer a estabilidade do produto, conseqentemente, pode haver perda da eficcia teraputica, por degradao do princpio ativo, por alterao de parmetro fsico fundamental para a sua atividade, como pH . Uma matria-prima que merece especial ateno devido ao amplo uso em formulaes farmacuticas e cosmticas a gua, a qual tambm utilizada em diferentes tipos de limpeza e operaes unitrias nas farmcias. Pode receber tratamento de purificao distinto conforme a aplicao que se deseja, sendo os mtodos mais utilizados, destilao e deionizao. Deionizao tem sido muito usado, principalmente frente economia nos gastos com gua e energia em relao destilao. A pureza da gua est relacionada ausncia de patgenos e a uma carga mnima de microrganismos no patognicos, estabelecidos pela UNITED STATES PHARMACOPEIA (2000); BRITISH PHARMACOPOEA (2000); AMERICAN PUBLIC HEALTH ASSOCIATION (1995). Na anlise microbiolgica da gua para fins farmacuticos, tem-se como limites de aceitao em termos de contagem padro em placas de bactrias heterotrficas, no mais que 102 UFC /mL (UNITED STATES PHARMACOPEIA, 2000), coliformes totais: <1,1 NMP / 100 mL e ausncia de coliformes termotolerantes (AMERICAN PUBLIC HEALTH ASSOCIATION, 1995); ausncia de E. coli, P. aeruginosa e de S. aureus (BRITISH PHARMACOPOEA, 2000). Em relao aos produtos naturais, como produtos de origem marinha (algas e ostra), produtos no bioativos de origem vegetal (amido) e produtos de origem animal (gelatina e lactose), as especificaes estabelecidas determinam que medicamentos para administrao por via oral contendo matrias-primas de origem natural tenham como limite de aceitao, em termos de microrganismos aerbios viveis totais, no mais que 104 UFC de bactrias aerbias e no mais que 102 UFC de fungos / g ou mL; ausncia de Salmonella, de E. coli e de S. aureus (FARMACOPIA BRASILEIRA, 1988). A anlise microbiolgica de preparaes cosmticas para uso tpico, amplamente elaboradas nas farmcias magistrais, visa assegurar o uso destes produtos. Uma formulao magistral pode veicular microrganismos indesejveis provenientes da gua empregada, de outras matrias-primas presentes na mesma, dos manipuladores, do ambiente, da embalagem, dentre outros. Cosmticos tm como limites de aceitao, em termos de microrganismos aerbios viveis totais, no mais que 102 UFC / g ou mL, ausncia de P. aeruginosa, S. aureus e coliformes totais e fecais. 11 Tcnicas de biologia molecular aplicadas microbiologia O conhecimento destes mecanismos fundamental para o desenvolvimento de novas drogas antimicrobianas. Alm disso, a caracterizao da aquisio, da evoluo e da disseminao dos genes de resistncia so importantes para a implementao de medidas eficientes de controle. Com a utilizao de tcnicas de biologia molecular possvel identificar aqueles determinantes de resistncia previamente descritos na literatura, bem como caracterizar novos mecanismos a partir de isolados clnicos fenotipicamente resistentes. - Deteco de genes que codificam as -lactamases, tais como ESBL, AmpC, oxacilinases e metalo--lactamases. Avaliao das propriedades proticas das -lactamases, tais como determinao do ponto isoeltrico, construo de plasmdeos para hiper-expresso, purificao enzimtica, determinao e avaliao das propriedades cinticas (Km, kcat). - Deteco de genes que codificam resistncia aminoglicosdeos. - Avaliao da permeabilidade bacteriana aos carbapenens.

- Deteco de mecanismos envolvidos na resistncia quinolonas em bacilos Gramnegativos e cocos Gram-positivos - Deteco da resistncia a glicopeptdeos em cocos Gram-positivos. 12 Mecanismos de resistncia bacteriana Ao discutirmos a resistncia bacteriana conveniente considerar tanto os mecanismos de ao dos antimicrobianos quanto as propriedades necessrias para a sua eficcia. Os antimicrobianos devem ser capazes de: 1. alcanar os alvos moleculares, que so primariamente intracelulares. Para isso, o antimicrobiano, em quantidades suficientes, precisa ultrapassar a membrana celular bacteriana; 2. interagir com uma molcula-alvo de modo a desencadear a morte da bactria; 3. evitar a ao das bombas de efluxo que jogam os antimicrobianos para fora da clula bacteriana; 4. evitar a inativao por enzimas capazes de modificar o frmaco no ambiente extracelular ou no interior da clula bacteriana. Com freqncia bactrias utilizam mais de uma estratgia para evitar a ao dos antimicrobianos; assim, a ao conjunta de mltiplos mecanismos pode produzir um acentuado aumento da resistncia aos antimicrobianos. A resistncia a determinado antimicrobiano pode constituir uma propriedade intrnseca de uma espcie bacteriana ou uma capacidade adquirida. Para adquirir resistncia, a bactria deve alterar seu DNA, material gentico, que ocorre de duas formas: 1. induo de mutao no DNA nativo; 2. introduo de um DNA estranho - genes de resistncia - que podem ser transferidos entre gneros ou espcies diferentes de bactrias. Os genes de resistncia quase sempre fazem parte do DNA de plasmdeos extracromossmicos, que podem ser transferidos entre microrganismos. Alguns genes de resistncia fazem parte de unidades de DNA denominadas transposons que se movem entre cromossomos e plasmdeos transmissveis. O DNA estranho pode ser adquirido mediante transformao, resultando em trocas de DNA cromossmico entre espcies, com subseqente recombinao interespcies. Alterao de permeabilidade A permeabilidade limitada constitui uma propriedade da membrana celular externa de lipopolissacardeo das bactrias Gram-negativas. A permeabilidade dessa membrana reside na presena de protenas especiais, as porinas, que estabelecem canais especficos pelos quais as substncias podem passar para o espao periplasmtico e, em seguida, para o interior da clula. A permeabilidade limitada responsvel pela resistncia intrnseca dos bacilos Gram-negativos penicilina, eritromicina, clindamicina e vancomicina e pela resistncia de Pseudomonas aeruginosa ao trimetoprim. As bactrias utilizam esta estratgia na aquisio de resistncia. Assim, uma alterao na porina especfica da membrana celular externa de P. aeruginosa, pela qual o imipenem geralmente se difunde, pode excluir o antimicrobiano de seu alvo, tornando P. aeruginosa resistente ao imipenem.

Alterao do stio de ao do antimicrobiano A alterao do local-alvo onde atua determinado antimicrobiano, de modo a impedir a ocorrncia de qualquer efeito inibitrio ou bactericida, constitui um dos mais importantes mecanismos de resistncia. As bactrias podem adquirir um gene que codifica um novo produto resistente ao antibitico, substituindo o alvo original. Staphylococcus aureus resistente oxacilina e estafilococos coagulase-negativos adquiriram o gene cromossmico Mec A e produzem uma protena de ligao da penicilina (PBP ou PLP) resistente aos -lactmicos, denominada 2a ou 2', que suficiente para manter a integridade da parede celular durante o crescimento, quando outras PBPs essenciais so inativadas por antibimicrobianos -lactmicos. Alternativamente, um gene recm-adquirido pode atuar para modificar um alvo, tomando-o menos vulnervel a determinado antimicrobiano. Assim, um gene transportado por plasmdeo ou por transposon codifica uma enzima que inativa os alvos ou altera a ligao dos antimicrobianos como ocorre com eritromicina e clindamicina.

Bomba de efluxo O bombeamento ativo de antimicrobianos do meio intracelular para o extracelular, isto , o seu efluxo ativo, produz resistncia bacteriana a determinados antimicrobianos. A resistncia s tetraciclinas codificada por plasmdeos em Escherichia coli resulta deste efluxo ativo.

Mecanismo enzimtico O mecanismo de resistncia bacteriano mais importante e freqente a degradao do antimicrobiano por enzimas. As -lactamases hidrolisam a ligao amida do anel beta-lactmico, destruindo, assim, o local onde os antimicrobianos -lactmicos ligamse s PBPs bacterianas e atravs do qual exercem seu efeito antibacteriano. Foram descritas numerosas -lactamases diferentes. Essas enzimas so codificadas em cromossomos ou stios extracromossmicos atravs de plasmdeos ou transposons, podendo ser produzidas de modo constitutivo ou ser induzido. A resistncia quase universal de S. aureus penicilina mediada por uma -lactamase induzvel, codificada por plasmdeo. Foram desenvolvidos -lactmicos capazes de se ligarem irreversivelmente s -lactamases, inibindo-as. Esses compostos (cido clavulnico, sulbactam, tazobactam) foram combinados com as penicilinas para restaurar sua atividade, a despeito da presena de -lactamases em estafilococos e hemfilos. Nas bactrias Gram-negativas, o papel das -lactamases na resistncia bacteriana complexo e extenso. Verifica-se a presena de quantidades abundantes de enzimas; muitas delas inativam vrios antimicrobianos -lactmicos, e os genes que codificam essas -lactamases esto sujeitos a mutaes que expandem a atividade enzimtica e que so transferidos de modo relativamente fcil. Alm disso, as -lactamases de bactrias Gram-negativas so secretadas no espao periplasmtico, onde atuam em conjunto com a barreira de permeabilidade da parede celular externa, produzindo resistncia clinicamente significativa a antimicrobianos. As - lactamases de espectro astendido (ESBL), mediadas por plasmdeos, inativam as cefalosporinas de terceira gerao e os monobactmicos como ocorre em cepas de Klebsiella pneumoniae. As -lactamases mediadas por cromossomos so produzidas em baixos nveis por P. aeruginosa, Enterobacter cloacae, Serratia marcescens e outros bacilos Gramnegativos; quando esses microrganismos so expostos a antimicrobianos lactmicos, so induzidos altos nveis de -lactamases, produzindo resistncia s cefalosporinas de terceira gerao, cefamicinas e combinaes de -lactmicos/cido clavulnico ou sulbactam. O uso indiscriminado de antimicrobianos exerce uma enorme presso seletiva para a manuteno e ampliao da resistncia bacteriana. O uso extenso de antimicrobianos seguido de frequncia aumentada de bactrias resistentes que passam a se disseminar em conseqncia de medidas insuficientes de preveno de infeces. Embora no se possa eliminar o uso de antimicrobianos, a administrao racional desses agentes no apenas exige uma seleo criteriosa do antimicrobiano e da durao da terapia, como tambm sua indicao apropriada.

12.1 Gram-positivos - resistncia aos antimicrobianos Staphylococcus aureus O Stahylococcus aureus considerado um patgeno humano oportunista e freqentemente est associado a infeces adquiridas na comunidade e no ambiente hospitalar. As infeces mais comuns envolvem a pele (celulite, impetigo) e feridas em stios diversos. Algumas infeces por S. aureus so agudas e podem disseminar para diferentes tecidos e provocar focos metastticos. Episdios mais graves, como bacteremia, pneumonia, osteomielite, endocardite, miocardite, pericardite e meningite, tambm podem ocorrer. Formas de resistncia :A resistncia penicilina foi detectada logo aps o incio de seu uso na dcada de 40. Essa resistncia era mediada pela aquisio de genes que codificavam enzimas, inicialmente conhecidas como penicilinases, e agora chamadas -lactamases. Na dcada de 1950, a produo de penicilinases pelos S. aureus passou a predominar nas cepas isoladas de pacientes hospitalizados. Em 1960, a meticilina foi lanada no mercado como alternativa teraputica para cepas produtoras de penicilinase, uma vez que essa droga no sofre ao dessa enzima. Porm, j em 1961, relatos de cepas tambm resistentes meticilina passaram a ser descritos e foram identificados os denominados Staphylococcus aureus resistentes meticilina (MRSA).

Enterococcus spp. Enterococcus so bactrias gram-positivas, normalmente encontradas no intestino e no trato genital feminino. Existem 14 espcies descritas de Enterococcus spp., sendo o E. faecalis e o E. faecium as duas que normalmente promovem colonizao e infeces em humanos. E. faecalis= constituem 85 a 90% dos Enterococcus spp. identificados, sendo essa espcie a menos propensa ao desenvolvimento de resistncia. E. faecium= o menos prevalente, de 5 a 10%, mas apresenta maior propenso ao desenvolvimento de resistncia. A emergncia desse patgeno nas ltimas duas dcadas, entre muitos fatores, se deve em parte sua resistncia intrnseca aos antimicrobianos comumente utilizados, como: aminoglicosdeos, aztreonam, cefalosporinas, clindamicina, oxacilina. E. faecium menos sensvel aos antimicrobianos beta-lactmicos do que E. faecalis devido baixa afinidade das PBPs (protenas de ligao da penicilina) a esses compostos.

Streptococcus pneumoniae Streptococcus pneumoniae o principal agente etiolgico de infeces respiratrias adquiridas da comunidade (otites, sinusites e pneumonias). As pneumonias podem ser acompanhadas de bacteremias, principalmente em pessoas idosas ou muito jovens. Outras infeces graves como meningite, endocardite, peritonites, osteomielite, artrite sptica so tambm associadas a esse agente.

No Brasil, estudo publicado por Brandileone e colaboradores em 2006, com cepas invasivas de Streptococcus pneumoniae que faziam parte do programa nacional de vigilncia epidemiolgica nacional revelaram dados interessantes. Foram testadas 6470 cepas de Streptococcus pneumoniae colecionadas no Brasil no perodo de 1993 a 2004. O nmero de cepas resistentes penicilina variou de 10.2 a 27.9%. Em 1993 havia 9.1% de cepas com resistncia intermediria e 1.1% de cepas resistentes e em 2004 estas taxas subiram para 22.0% e 5.9% respectivamente. A maioria destes isolados era de pacientes menores que cinco anos e pertenciam ao sorotipo 14 que faz parte da vacina conjugada, 7-valente. De 2000 a 2004 os Streptococcus pneumoniae isolados de meningite mostraram resistncias mais altas para cefotaxima (2,6%) comparadas s de no meningite (0,7%). Outras taxas de resistncia foram apontadas no trabalho: sulfametoxazoltrimetroprim (65%), tetraciclinas (4,6%), eritromicina (6,2%), cloranfenicol (1,3%) e rifampicina (0,7%), sendo que nenhuma destas cepas apresentou resistncia levofloxacina. Em outro estudo, os dados para meningites por Streptococcus pneumoniae, relacionados sensibilidade penicilina e ceftriaxone no Brasil, fornecidos pelo Laboratrio de Referncia Nacional - IAL, ao SINAN Sistema de Informao Nacional de Agravo de Notificao apontam em 2005 para uma populao de 270 isolados estudados uma taxa de 26% de resistncia intermediria penicilina e de 17% de alta resistncia a esta droga acompanhada de uma taxa de 4,2% de alta resistncia ceftriaxone. 12.2 Gram-negativos - resistncia aos antimicrobianos Aminoglicosdeos A modificao enzimtica o mecanismo mais comum de resistncia aos aminoglicosdeos. Este tipo de mecanismo pode resultar em alto grau de resistncia a estes agentes antimicrobianos. Os genes responsveis por esta resistncia encontram-se geralmente em plasmdios ou transposons. Atualmente, mais de 50 enzimas modificadoras de aminoglicosdeos j foram descritas e classificadas como: N-acetiltransferases; O-adeniltransferases; O-fosfotransferases. Os aminoglicosdeos contm em sua estrutura grupos amino ou hidroxila, os quais podem ser modificados pelas enzimas acima, produzidas por isolados bacterianos. Os aminoglicosdeos modificados nestes grupamentos perdem a habilidade de se ligar ao ribossomo e, consequentemente, de inibir a sntese protica bacteriana. Outros mecanismos de resistncia aos aminoglicosdeos como alterao no stio de ao (subunidade 30S do RNA ribossomal) e alteraes na permeabilidade da membrana celular externa tambm so descritos. Quinolonas A resistncia s quinolonas est associada a alguns mecanismos de resistncia, como: Alterao de permeabilidade e hiperexpresso de bombas de efluxo; Alteraes do stio de ao (topoisomerases); Resistncia mediada por plasmdeos; Alterao enzimtica da molcula do antimicrobiano. A alterao de permeabilidade e efluxo so comuns a outras classes antimicrobianas e sero discutidos em tpicos subseqentes. Mutaes das Topoisomerases Bacterianas As quinolonas inibem a ao da DNA girase e topoisomerase IV, impedindo a replicao do DNA bacteriano. A resistncia a estes antimicrobianos adquirida por

mutaes espontneas em genes cromossmicos, levando a alteraes no stio de ao (topoisomerases). Esta resistncia ocorre gradualmente e de maneira acumulativa, ou seja, mutaes simples no stio principal de ao da droga so associadas a moderados graus de resistncia, enquanto mutaes adicionais no stio primrio e/ou secundrio levam a alto grau de resistncia. Em E. coli e P. aeruginosa, a maioria das mutaes ocorre em uma pequena poro do principal alvo de ao das quinolonas, o gene gyrA. Essa parte do gene denominada regio determinante de resistncia s quinolonas (Quinolone Resistance Determinant Region QRDR) -lactmicos Trs mecanismos bsicos de resistncia aos -lactmicos tm sido descritos: Alterao do stio de ligao, que no caso seriam as protenas ligadoras de penicilina (PBPs); Alterao da permeabilidade da membrana externa bacteriana e Degradao da droga atravs da produo de b-lactamases. Alterao do stio de ao A alterao de PBPs o principal mecanismo de resistncia bacteriana aos lactmicos nos cocos Gram-positivos e em algumas bactrias fastidiosas Gramnegativas, como a Neisseria gonorrhoeae. Apesar de j ter sido demonstrado em amostras de Haemophilus influenzae e P. aeruginosa, esse mecanismo raro em bacilos Gram-negativos. Alterao da permeabilidade da membrana externa bacteriana A dificuldade de penetrar pela membrana externa um dos poucos mecanismos de resistncia bacteriana no qual uma alterao estrutural pode conferir resistncia a diversas classes de antimicrobianos. A impermeabilidade da membrana externa ocorre quando bactrias mutantes passam a no produzir os habituais canais da membrana externa bacteriana (porinas), locais por onde penetram os -lactmicos. Este mecanismo de resistncia mais comumente observado entre amostras de P. aeruginosa. Carbapenens A resistncia aos carbapenens em microrganismos Gram-negativos pode ser decorrente de: Diminuio da permeabilidade da membrana externa aos antimicrobianos, pela perda ou expresso reduzida de protenas de membrana externa; Hiperexpresso de bombas de efluxo, que reduzem a concentrao de antimicrobiano no interior das clulas; Produo de enzimas (-lactamases) que degradam os carbapenems. 13 Microbiologia clnica dos principais patgenos causadores de infeces hospitalares Infeco comunitria x hospitalar Publicaes do Ministrio da Sade-MS (1998) e da Agncia Nacional de Vigilncia Sanitria-ANVISA (2006) conceituam infeco comunitria como aquela constatada ou em incubao no ato de admisso do paciente, desde que no relacionada com internao anterior no mesmo hospital. Pode, tambm, ser considerada aquela que est associada a uma complicao ou extenso da infeco j presente na admisso (a menos que haja troca de microrganismos ou sinais ou sintomas fortemente sugestivos da aquisio de nova infeco) e a infeco em recm-nascido, cuja aquisio por via transplacentria conhecida ou foi comprovada e que se tornou

evidente logo aps o nascimento (exemplo: herpes simples, toxoplasmose, rubola, citomegalovirose, sfilis e AIDS). O Ministrio da Sade, 2006, definiu infeces hospitalares (IH), como aquelas desenvolvidas pelos pacientes aps a admisso no hospital, desde que relacionadas internao ou a procedimentos hospitalares. Pacientes mais debilitados, como recm nascidos prematuros, esto mais sujeitos a essas infeces e com maior potencial de gravidade. A IH manifestada durante a internao do paciente ou aps a alta e decorre do contato com o ambiente hospitalar ou em virtude de procedimentos invasivos, como cirurgias e perfuraes por agulhas de soros e cateteres. Trata-se de um problema registrado em todo o mundo. Estudos realizados pelo Centro para Controle de Doenas de Atlanta (Centers for Diseases Control and Prevention, USA) mostram que a infeco hospitalar prolonga a permanncia de um paciente no hospital por, pelo menos, quatro dias, ao custo adicional de 1.800 dlares, o que equivale a R$ 3,6 mil (Ministrio da Sade, 2007; Sociedade Brasileira de Infectologia, 2007; COSEMS/MG, 2008). O diagnstico de infeces hospitalares dever valorizar informaes oriundas de evidncias clnicas, derivadas da observao direta do paciente ou da anlise de seu pronturio; resultados de exames de laboratrio, ressaltando-se os exames microbiolgicos, a pesquisa de antgenos e anticorpos; evidncias de estudos com mtodos de imagem; endoscopia; bipsia e outros. (Ministrio da Sade, 1998; ANVISA, 2006). Pacientes admitidos em Unidade de Terapia Intensiva (UTI), esto sujeitos a riscos de 5 a 10 vezes maiores de adquirir infeco que aqueles de outras unidades de internao do hospital, alm de mais vulnerveis intrinsecamente infeco, so freqentemente expostos aos fatores de risco tais como: procedimentos invasivos, cirurgias complexas, drogas imunossupressoras, antimicrobianas e as interaes com a equipe de sade e os fmites (COUTO & NOGUEIRA, 1997). Simples aes, como higienizao das mos, e at cuidados mais sofisticados relacionados esterilizao de equipamentos e ao uso de produtos especialmente desenvolvidos para evitar infeces podem minimizar o impacto desse importante problema de sade pblica na populao de crianas submetidas assistncia sade (Ministrio da Sade, 2006). Microrganismos Relevantes em Infeco Hospitalar A infeco hospitalar (IH) considerada um grave problema clnico, crescente tanto em incidncia quanto em complexidade, com implicaes sociais e econmicas diversas. Dentre os microrganismos relevantes em IH esto vrios gneros e espcies de cocos Gram positivos, bastonetes Gram negativos e alguns fungos leveduriformes. Cocos Gram positivos Staphylococcus aureus um coco Gram positivo, considerado patgeno humano oportunista, freqentemente associado s infeces hospitalares. De acordo com o National Nosocomial Infections Surveillance do Center for Disease Control and Prenvention (CDC), desde 1999, a proporo de S. aureus resistentes meticilina (S. aureus meticilinaresistentes - MRSA) ultrapassa 50% entre os pacientes internados em Unidade de Terapia Intensiva (UTI). No Brasil, o nmero de infeces hospitalares causadas por S. aureus resistentes meticilina, tambm elevado, correspondendo de 40% a 80%, principalmente nas UTIs. Pesquisas recentes mostraram altos ndices de mortalidade em pacientes que desenvolveram bacteremia por MRSA (49% a 55%), ndices esses maiores que aqueles envolvendo S. aureus sensveis meticilina (MSSA), 20% a 32%. O gnero Enterococcus inclui bactrias Gram positivas, catalase negativa, bileesculina positiva, que crescem em meio hipertnico (caldo 6,5% NaCl). Espcies do gnero que apresentam resistncia vancomicina (VRE) so reconhecidas como um dos principais patgenos causadores de infeces hospitalares, sendo, atualmente,

notvel sua presena em infeces urinrias, infeces de stio cirrgico e bacteremias. Bastonetes Gram negativos no fermentadores da glicose Bastonetes ou cocobacilos Gram negativos (BGN), aerbios, no fermentadores de glicose, so bactrias aerbias, no esporuladas, incapazes de fermentar glicose como fonte de energia pela via fermentativa. So microrganismos oportunistas de vegetais e animais, exibem mnimas exigncias nutricionais e toleram grandes variaes de temperatura. Dentre outros, so includos neste grupo os gneros Pseudomonas, Burkholderia, Acintobacter, Stenotrophomonas e Sphingomonas. O gnero Pseudomonas, representado por BGN finos, aerbios da famlia Pseudomoneacea, responsvel pela maioria das infeces por no fermentadores (NF), sendo a glicose utilizada somente atravs da via oxidativa. Bactrias do grupo so patgenos de plantas e somente algumas espcies esto associadas a doenas nos seres humanos. A patognese dos processos, que podem ocorrer em diferentes stios, deve ser discutida no contexto de uma infeco oportunista, sendo necessria a quebra de barreiras, ou a presena de defeitos especficos de alguns dos mecanismos de defesa imune. Essas bactrias so capazes de formar biofilmes, o que contribui para sua sobrevivncia e replicao em tecidos humanos e dispositivos mdicos. As manifestaes clnicas mais prevalentes so pneumonias, infeces associadas a cateter vascular central, infeces do trato urinrio, dentre outras. Enterobactrias A famlia Enterobacteriaceae constitui um grande grupo heterogneo de bastonetes Gram negativos (mais de 20 gneros e mais de 100 espcies). Como caractersticas gerais, os membros dessa famlia so bacilos Gram negativos, fermentadores de glicose, comumente oxidase negativa, anaerbios facultativos, reduzem nitrato a nitrito, no formam esporos. Podem ser moveis ou imveis e capsulados ou no. Fazem parte da microbiota indgena do intestino e infectam qualquer stio, desde que haja condies favorveis. Como mencionado, E. coli responsvel pela maioria das ITUs, nas quais tambm se destacam os gneros: Klebsiella, Proteus e Enterobacter. Nas infeces nosocomiais, bactrias do gnero Klebsiella esto entre os mais prevalentes. Fungos A incidncia de infeces hospitalares por fungos tem aumentado substancialmente nas ltimas dcadas, acarretando altos ndices de mortalidade, que atingem at 60% dos bitos por IHs. Espcies do gnero Candida tm sido os agentes mais freqentemente isolados, correspondendo, aproximadamente, a 80% das infeces fngicas de origem hospitalar, e quarta causa de infeco da corrente sangunea, conduzindo ao bito em torno de 25 a 38% dos pacientes que desenvolvem candidemia. At alguns anos atrs Candida albicans era a espcie de maior interesse clnico. Contudo, paralelamente ao aumento geral das candidemias, observou-se aumento das infeces da corrente sangnea por espcies de Candida no-albicans, como: C. parapsilosis, C. tropicalis, C. glabrata, C. krusei, C. guilhermondii e C. lusitaniae. Em geral, as leveduras envolvidas em colonizao de mos de profissionais da rea de sade e cateteres podem ser virulentas e oferecer riscos de infeco. 14 Imunoterapia passiva e ativa: Vacinas para patgenos causadores de infeces hospitalares

Doenas bacterianas podem ser prevenidas pelo uso de imunizaes que induzem uma imunidade ativa ou passiva. A imunidade ativa induzida por vacinas preparadas de bactrias ou de seus produtos, j a imunidade passiva dada pela administrao de anticorpo pr-formado em preparaes denominadas imunoglobulinas. 14.1 Imunidade ativa A vacina contra pneumococos constituda de polissacardeos purificados de Streptococcus pneumoniae dos seguintes sorotipos: 1, 2, 3, 4, 5, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15B, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F e 33F. uma vacina polivalente, preparada a partir de polissacardeos capsulares bacterianos purificados, no contendo nenhum componente vivel. Ela indicada como agente imunizante contra infeces pneumoccicas causadas por qualquer dos 23 sorotipos de Streptococus pneumoniae includos na vacina, os quais so responsveis por cerca de 80 a 90% das doenas pneumoccicas graves, tais como pneumonias, meningites, bacteremias e septicemias. aplicada pela via intramuscular ou subcutnea, em dose nica de 0,5 ml. Indicada para crianas acima dos dois anos de idade pertencentes aos grupos de risco de contrair infeco pneumoccica. So eles: doentes com anemia falciforme, asplenia anatmica ou funcional, esplenectomizados, sndrome nefrtica e doena de Hodgkin. Em adultos indicada nas seguintes situaes: doena cardiopulmonar crnica, doena renal ou heptica e mesmo nos indivduos sadios acima de 65 anos. Nos doentes que iro se submeter a esplenectomia eletiva, a vacina deve ser administrada 14 dias antes da cirurgia. A proteo conferida s crianas menores de dois anos no das melhores e no est bem estabelecida. Neste caso a vacinao no est indicada, devido s reaes colaterais, embora nos doentes falcmicos e asplnicos devam ser pesados os riscos e benefcios advindos da vacinao. A vacina antimeningoccica produzida a partir de polissacrides capsulares de Neisseria meningitidis. Esta bactria, com base em seu polissacride, pode ser classificada em 13 sorogrupos, sendo os mais importantes: A, B, C, D, X, Y, Z, 29-E e W-135. Atualmente existem vacinas monovalentes contra os meningococos A e C, vacinas bivalentes (associando-se A e C) e uma vacina tetravalente, contendo antgenos contra os meningococos A, C, Y e W-135. A vacina aplicada pela via subcutnea, na dose de 0,5 ml. Tem boa eficcia em adultos (90%), porm com resposta limitada nas crianas. Nos menores de dois anos a vacinao contra o meningococo A requer a aplicao de uma segunda dose, trs a quatro meses aps a primeira, e a vacinao contra o meningococo C no tem se mostrado eficaz. As vacinas com antgenos W-135 e Y tm se mostrado antignicas em crianas acima de dois anos. O uso destas vacinas deve-se restringir apenas s situaes epidmicas. A vacina contra Haemophilus influenzae do tipo B uma vacina indicada para a imunizao de rotina, de crianas entre 2 meses e 5 anos de idade, contra as doenas causadas por esta bactrias. A vacina preparada com o polissacardeo capsular purificado do Haemophilus influenzae tipo B, ou seja, um polmero de ribose, ribitol e fosfato poliribosil, conjugado com a protena tetnica (PRP-T). Esta bactria revestida com uma cpsula polissacardica que a torna resistente ao ataque dos leuccitos. Neste caso a vacina estimula a produo de anticorpos anti-capsulares, promovendo uma imunidade ativa contra a bactria. A aplicao deve ser feita pela via subcutnea ou intramuscular na dose de 0,5 ml de acordo com as especificaes do fabricante. Est indicada para imunizao de rotina em crianas de 2 meses a 5 anos de idade, contra doenas invasivas causadas por Haemophilus influenzae tipo B (meningite, epiglotite, septicemia, celulite, artrite, pneumonia).A vacina est contra-indicada para

crianas abaixo de 2 meses de idade, gestantes, indivduos com hipersensibilidade a qualquer componente da vacina, especialmente protena tetnica e estado febril e infeco aguda, uma vez que estes sintomas podem ser confundidos com eventuais efeitos colaterais da vacina. A vacina antitetnica, tambm denominada toxide tetnico (TT), de aplicao intramuscular, contm 10 a 20 UI do toxide, adsorvido em hidrxido de alumnio.Est indicada para indivduos com idade acima de sete anos. A vacina antitetnica (TT) s deve ser utilizada na falta da vacina dupla do tipo adulto (dT). A imunizao bsica consiste na aplicao de trs doses, com intervalo de dois meses entre a primeira e a segunda; a terceira dose seis a doze meses aps a segunda. A vacina dupla contm os toxides diftrico e tetnico, de aplicao intramuscular, sendo apresentada nas formas infantil (DT) e adulto (dT). A forma infantil (DT) constituda de 30 UI de toxide diftrico e 10 a 20 UI do toxide tetnico. A vacina do tipo adulto (dT) compe-se de 2 a 4 UI de toxide diftrico e 10 a 20 UI de toxide tetnico. Salienta-se que a vacina dupla infantil (DT) contm a mesma quantidade de toxides tetnico e diftrico que a vacina trplice (DTP). J a dupla tipo adulto (dT) contm menor quantidade de toxide diftrico. A vacina trplice (DTP) constituda de antgenos protetores contra a difteria, a coqueluche e o ttano. Os antgenos incluem suspenso de 32.000.000 de Bordetella pertussis (4UI), 30UI (unidades internacionais) de toxide diftrico e 10 a 20 UI de toxide tetnico. Os toxides possuem elevado poder imunognico, principalmente quando associados aos adjuvantes minerais, entre eles o hidrxido de alumnio. O desempenho imunognico da vacina anti-pertussis no to eficiente quanto o dos toxides, porm sua eficcia bem estabelecida, diminuindo a freqncia e a gravidade da coqueluche em propores considerveis. A aplicao da vacina deve ser feita pela via intramuscular, nas dosagens de 0,5 a 1,0 ml, de acordo com a procedncia do produto. A aplicao intramuscular deve ser profunda, na regio gltea ou no msculo vasto lateral da coxa. Em crianas acima de dois anos, pode ser usada a regio deltide. A vacinao bsica consiste na aplicao de trs doses, a partir dos dois meses de idade, com intervalos de dois meses entre as doses. O primeiro reforo deve ser aplicado 12 meses aps a ltima dose da vacinao bsica e o segundo reforo aps 18 meses do primeiro reforo. A vacina contra tuberculose, denominada BCG, produzida a partir de cepas atenuadas do Mycobacterium bovis. A produo no Brasil na forma liofilizada, devendo ser mantida em geladeira, entre +2 e +8C, e ao abrigo da luz solar direta, pois inativada pelos raios solares. As crianas podem e devem ser vacinadas a partir do nascimento, de preferncia no berrio, por via intradrmica, no brao direito, na altura da insero inferior do msculo deltide, com seringa e agulha apropriadas e descartveis. Quando o local da aplicao estiver sujo, deve-se lavar com gua e sabo. A dose preconizada para todas as idades de 0,1 ml de uma s vez, sendo a populao prioritria os menores de um ano de idade. Havendo condies operacionais, indica-se a realizao da reao de Mantoux (PPD) prvia, em crianas com mais de trs meses. Sendo negativa, aplicamos o BCG intradrmico. O BCG bem aplicado leva viragem do PPD em cerca de 75% a 80% dos casos e isto pode ser confirmado realizando-se a reao de Mantoux aps seis meses da aplicao do BCG. Nos casos que se mostram negativos, o reforo deve ser realizado apenas se a primeira aplicao foi tecnicamente incorreta, ou se no houve reao no local da aplicao. Aps a aplicao da vacina, os sintomas mais freqentes so o aparecimento de ndulo no local da aplicao, que evolui para lcera e crosta, com durao mdia de

oito a 10 semanas. Nos casos de aplicao profunda, dose maior ou resposta imune exagerada, a cicatrizao pode ser retardada. As complicaes so bastante raras, porm podem ocorrer linfadenites simples ou supuradas, lceras necrticas, abscessos locais ou distncia, erupo maculosa, reao lupide, eritema nodoso e polimorfo, lpus vulgar e ostete de localizaes diversas. Do deve ser aplicado em crianas com peso inferior a 2.000 g e com afeces dermatolgicas extensas e em atividade. Como no h dados disponveis sobre os efeitos do BCG em adultos infectados pelo vrus da imunodeficincia humana (HIV), sintomticos ou no, a vacinao no deve ser recomendada para esses casos. A aplicao precoce do BCG visa reduzir a incidncia da tuberculose, especialmente as formas graves da doena, tais como a tuberculose menngea e a tuberculose miliar, que aparecem com maior freqncia at os quarto anos de idade. 14.2 Imunidade passiva Antitoxina do ttano: usada tanto para o tratamento quanto para preveno do ttano. No tratamento, o objetivo neutralizar qualquer toxina livre para evitar o progresso da doena e, sendo assim, administrada imediantamente. Na preveno, administrada em pessoas que esto inadequadamente imunizadas e que apresentam feridas contaminadas. Antitoxina botulnica: usada no tratamento de botulismo, pois neutraliza a toxina livre, evitando que a doena progrida. Contm anticorpos contra as toxinas botulnicas A, B e E, que so os tipos de ocorrncia mais comum. Antitoxina diftrica: usada no tratamento da difteria, pois neutraliza a toxina livre, evitando que a doena progrida.