ANALISA AKTIVITAS ENZIME LIGNINOLITIK

Documented by: Isroi http://isroi.wordpress.com http://isroi.com

A. Ekstrasi Enzyme Ekstraksi Enzym dengan metode sentrifugasi (Gassara, Brar et al. 2010): 1. Satu gram sample dicampur dengan buffer phosphate 50mM pH 6,5 dengan perbandingan 10/1 (v/w). 2. Kemudian dishaker pada kecepatan 150 rpm selama 1 jam. 3. Setelah itu sampel disentrifugasi pada kecepatan 7000xg selama 20 menit. 4. Supernatan cair dipisahkan dan digunakan untuk analisa aktivitas enzyme. Metode ini bisa dimodifikasi, langkah ke-2 diganti dengan digerus pada kondisi dingin. Pengerusan dilakukan dengan mortar dan letakan es disekitar mortar tersebut.Hasil gerusan kemudian disaring dan filtratnya disentrifugasi seperti cara di atas. B. Pengukuran Aktivitas Enzyme B.1. Laccase (Lac) Pada cuvet masukkan: - 0,5 buffer asetat pH5 0,5 M - 0,1 ml ABTS 1 mM - 0,4 ml filtrate enzim Volume total 1 ml. Tabung/cuvet dikocok perlahan agar semua bahan tercampur. Reaksi aktvitas enzyme dilakukan pada suhu 201 oC. Absorbansi diukur pada waktu 0 dan 30 menit pada panjang gelombang 420 nm. Rumus perhitungan: Aktivitas enzyme (U/ml) = (OD420 x Vtot (ml) x 109)/(max x d x Vol enzyme (ml) x t)

maks = absorpsivitas molar ABTS

(36000 M-1 cm-1)

B.2. Manganese peroxidase (MnP) (Yoshida, Yonehara et al. 1996) (A) Pengukuran pada penambahan Mn: Pada tube 2 ml. masukkan: - 0,1 buffer lactate pH4,5 50 M - 0,1 ml guaiakol 4mM - 0,2 ml MnSO4 1mM Analisis Enzyme Ligninolitik - isroi | 1

- 0,3 ml aquades - 0,1 ml H2O2 1 mM - 0,2 ml filtrate enzim Volume total 1 ml. Tabung/cuvet dikocok perlahan agar semua bahan tercampur. Reaksi aktvitas enzyme dilakukan pada suhu 201 oC. Absorbansi diukur pada waktu 0 dan 30 menit pada panjang gelombang 465 nm (B) Pengukuran tanpa penambahan Mn: Pada tube 2 ml. masukkan: - 0,1 buffer lactate pH4,5 50 M - 0,1 ml guaiakol 4mM - 0,5 ml aquades - 0,1 ml H2O2 1 mM - 0,2 ml filtrate enzim Volume total 1 ml. Tabung/cuvet dikocok perlahan agar semua bahan tercampur. Reaksi aktvitas enzyme dilakukan pada suhu 201 oC. Absorbansi diukur pada waktu 0 dan 30 menit pada panjang gelombang 465 nm Rumus perhitungan: Aktivitas enzyme (U/ml) = (OD465 x Vtot (ml) x 109)/(max x d x Vol enzyme (ml) x t)

maks = absorpsivitas molar Guaiakol

(12100 M-1 cm-1)

Aktivitas MnP adalah aktivitas pada penambahan Mn dikurangi aktivitas enzyme tanpa penambahan Mn. Alternatif metode pengukuran enzyme MnP (Fujian, Hongzhang et al. 2001): Pada tube/cuvet 2 ml dimasukkan: - 1.70 ml sodium tartrate buffer pH 3.0 (0.24 mol/L) - 0.2 ml filtrat enzyme - 0.05 ml H2O2 (0.016 mol/l) - 0.05 mL MnSO4 (0.40 mol/l) Volume total 2 ml. Tabung/cuvet dikocok perlahan agar semua bahan tercampur. Absorbansi diukur pada waktu 0 dan 30 menit pada panjang gelombang 240 nm. Satu unit aktivitas enzyme MnP didefinisikan sebagai penambahan 0.1 dari OD240nm per menit. MnP juga bisa diukur dengan menggunakan Phenol Red sebagai substrat (Kachlishvili, Penninckx et al. 2005). B.3. Pengukuran Aktivitas Lignin Peroksidase (LiP) Pada tube 2 ml. masukkan: - 0,1 ml veratil alcohol 8mM Analisis Enzyme Ligninolitik - isroi | 2

- 0,2 ml buffer asetat 50 mM pH3 - 0,45 ml aquades - 0,05 ml H2O2 5 mM - 0,2 ml filtrate enzim Volume total 1 ml. Tabung/cuvet dikocok perlahan agar semua bahan tercampur. Reaksi aktvitas enzyme dilakukan pada suhu 201 oC. Absorbansi diukur pada waktu 0 dan 30 menit pada panjang gelombang 310 nm. Aktivitas enzyme (U/ml) = (OD310 x Vtot (ml) x 109)/(max x d x Vol enzyme (ml) x t) max : absorpsivitas molar Veratril alkohol (9300 M-1 cm-1) Referensi Fujian, X., C. Hongzhang, et al. (2001). "Solid-state production of lignin peroxidase (LiP) and manganese peroxidase (MnP) by Phanerochaete chrysosporium using steam-exploded straw as substrate." Bioresour Technol 80(2): 149-151. Gassara, F., S. K. Brar, et al. (2010). "Screening of agro-industrial wastes to produce ligninolytic enzymes by Phanerochaete chrysosporium." Biochemical Engineering Journal 49: 7. Kachlishvili, E., M. J. Penninckx, et al. (2005). "Effect of nitrogen source on lignocellulolytic enzyme production by white-rot basidiomycetes under solid-state cultivation." World Journal of Microbiology and Biotechnology 22(4): 391-397. Yoshida, S., S. Yonehara, et al. (1996). "Production and characterization of ligninolytic enzymes of Bjerkandera adusta grown on wood meal/wheat bran culture and production of these enzymes using a rotary-solid fermenter." Mycoscience 37: 9.

Analisis Enzyme Ligninolitik - isroi | 3