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BIOQUÍMICA

AULA PRÁTICA: Eletroforese

OBJETIVO: Realizar eletroforese com soro sanguíneo humano (proteína Albumina)

INTRODUÇÃO TEÓRICA

Eletroforese em gel é uma técnica de separação de moléculas que envolve a


migração de partículas em um determinado gel durante a aplicação de uma diferença de
potencial. As moléculas são separadas de acordo com o seu tamanho, pois as de menor
massa irão migrar mais rapidamente que as de maior massa. Em alguns casos, o formato
da moléculas também influi, pois algumas terão maior facilidade para migrar pelo gel.A
eletroforese normalmente é utilizada para separar proteínas e moléculas de DNA e
RNA. Foi introduzida cientificamente em 1939 por A.Tiselius e A.E. Kabat com o
objetivo de separar partículas orgânicas.
A utilização de eletroforese no uso da rotina laboratorial tem sido importante para
determinar hemoglobinopatias e talassemias, auxílio diagnóstico para doenças
específicas, por ex.: mieloma múltiplo, além de aplicação em lipidogramas, biologia
molecular e enzimopatias.
Técnicas mais sensíveis, como é o caso da focalização isoelétrica permitem a separação
de frações com excelente resolução.

Eletroforese em gel de agarose

Nesse caso, a agarose é utilizada como gel para a eletroforese. A agarose é um


polissacarídeo, e forma uma rede que segura as moléculas durante a migração.
Dependendo da concentração de agarose, têm-se uma diferença no gradiente de
separação. Para preparar um gel de agarose, simplesmente faz-se a mistura entre o pó de
agarose e solução tampão (TBE). Após fundir, coloca-se brometo de etidio, que fará o
DNA ou RNA "brilhar" quando exposto ao UV. Quando a mistura esfriar o gel estará
duro. Esse endurecimento é feito em um local apropriado, o mesmo local onde será feita
a corrida da amostra. Um detalhe importante é a colocação do pente no gel durante o
endurecimento. O pente cria poços que serão utilizados para a colocação das amostras.
A eletroforese em gel é um dos métodos mais utilizados para analisar misturas de
proteínas ou outras macromoléculas. Os géis utilizados como suportes são de agarose e
poliacrilamida, podem ser preparados com porosidade variável, propiciando separação
das moléculas segundo o seu tamanho, alem da sua carga. Proteínas menores migram
mais rápido que as maiores, formando uma serie de bandas definidas, que podem ser
visualizadas com por coloração especifica.
Uma variante desta técnica, conhecida pela sigla SDS-PAGE, emprega um gel de
poliacrilamida, em presença do detergente dodecil sulfato de sódio (SDS). O SDS liga-

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se a radicais hidrofóbicos das proteínas, causando sua desnaturação. Esta associação,
com a maioria das proteínas, segue o mesmo padrão: uma molécula de SDS a cada dois
resíduos de aminoácidos. Alem disso, cada molécula de detergente ligada atribui uma
carga negativa a proteína desnaturada, mascarando a carga intrínseca da molécula
nativa. O resultado, qualquer que seja a proteína, é a formação de um complexo com
forma alongada, com a densidade de cargas negativas proporcional ao comprimento da
cadeia polipeptídica. Este método, portanto separa proteínas segundo o seu peso
molecular. Se a proteína apresentar estrutura quaternária, suas subunidades serão
desnaturadas e dissociadas por SDS e a eletroforese determinara o peso molecular de
cada uma delas o emprego da eletroforese em gel, ao longo das diferentes etapas de um
processo de purificação de proteínas, alem de permitir a sua separação, fornece
informações adicionais, tais como: o numero de proteínas presentes na preparação, o
seu peso molecular e de quantas subunidades são formadas.

Imagem do equipamento utilizado para eletroforese em gel

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MATERIAS

• Cuba de eletroforese
• Placa de petri

• Becker

• Capilares (com soro sanguíneo humano)

• Papel filtro

• Pinça

• Secador de cabelo

• Gel de agarose

REAGENTES

• Solução tampão tris (9,5) mantém o pH do gel de agarose


• Ácido acético 5%

• Negro de amido

• Soro sanguíneo humano

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METODOLOGIA

1- Coloca-se 110 mL de solução tampão na cuba.

2- Separa-se o gel de agarose da placa de acrílico.

3- Aplica-se o soro no gel de agarose com microcapilar.

4- Coloca-se o gel de agarose na cuba, voltado para baixo, coincidindo o lado (+) do
gel com (+) da cuba e (-) do gel com (-) da cuba.

5- Tampa-se a cuba, liga-se, verifica-se se há formação de bolhas nos cantos (indicam


passagem da corrente elétrica) e deixar por 30 minutos.

6- Desliga-se a cuba.

7- Retira-se o gel de agarose da cuba, eliminando o excesso de tampão das bordas com
papel de filtro.

8- Mergulha-se o gel, voltado para cima, em 100 mL de corante (negro de amido) por
15 minutos (sem agitação).

9- Retira-se o gel de agarose do corante e coloca-se, sempre voltado para cima, em 100
mL de ácido acético a 5% (descorante) COM AGITAÇÃO por 1 minuto.

10- Retira-se o excesso de descorante do gel de agarose e coloca-se a 60°C (usar estufa
ou jato de ar), até que a mesmo fique completamente SECO.

11- Colocar o gel de agarose em banhos sucessivos de descolorante (ácido acético 5%),
COM AGITAÇÃO e após secar com o uso de secador de cabelo até o fundo ficar
transparente novamente.

12- Proceder à análise qualitativa.

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RESULTADO

*Imagem da Aula prática: *Imagem internet “eletroforese Albumina”.

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OBSERVAÇÕES

• As proteínas apresentam agrupamentos de cargas positivas e negativas, provenientes


dos aminoácidos que as constituem.
• As cargas são resultadas da ligação ou perda de prótons
• Os prótons (H+) são íons com carga positiva. Alguns grupos são neutros e ao
receberem um próton, tornam-se positivos (é o caso do grupo -NH2, que, ligando-se
a prótons, é convertido a -NH3+). Outros grupos são neutros, mas, ao perderem um
próton, tornam-se negativos (é o caso do grupo-COOH, que se converte em -COO- ).
Estas perdas e adições dependem do pH do meio em que a proteína se encontra.
• Uma propriedade das cargas elétricas em solução é que quando uma diferença de
potencial é aplicada à solução - ou seja, quando os pólos de uma bateria são
conectados à solução – as cargas positivas são atraídas pelo pólo negativo e as
cargas negativas, pelo pólo positivo, deslocando-se em direção a eles.
• A principal motriz para o movimento das cargas em solução é a diferença de
potencial. Conseqüentemente, quanto maior a intensidade da voltagem aplicada,
maior será a velocidade com que as cargas se dirigem ao pólo de sinal oposto.
• Dessa forma, quanto maior for a carga da macromolécula, maior será a sua
velocidade de migração eletroforética.
• O tamanho da macromolécula também influi decisivamente na sua velocidade de
migração. Isso porque existe um componente friccional entre a macromolécula, o
solvente, o suporte e os demais íons em solução que faz com que quanto maior a
macromolécula, menor a sua velocidade de migração em direção ao pólo de sinal
oposto.

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CONCLUSÃO

A aula foi satisfatória, pois conseguimos realizar a atividade proposta e conclui-se


que:
Os métodos de eletroforese convencionais são baseados na habilidade de um gel
separar moléculas, com base no tamanho, sob a influência de um campo elétrico
unidirecional. Em contraste, utilizam-se sucessivos campos elétricos alternados que
forçam as moléculas a mudarem continuamente a direção de migração.
A separação é baseada, provavelmente no fato que as moléculas maiores mudam de
direção mais lentamente que as menores. Entretanto, o mecanismo preciso da separação
ainda não é totalmente conhecido, embora seja objeto de numerosos estudos.

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REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

• http://pt.wikipedia.org/wiki/Eletroforese_em_gel
• http://www.ciencianews.com.br/eletroforeses.htm
• Marzzoco, Anita e Torres, Bayardo Baptista, Bioquímica Básica, 2ª edição, Rio
de Janeiro, 1999, Editora Guanabara Koogan S.A.
• http://www.unitau.br/scripts/prppg/biocienc/downloads/comparatecmolec-N2-
2002.pdf

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