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UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA Facultad de medicina DEPARTAMENTO DE TOXICOLOGA

LNEA DE PROFUNDIZACIN TOXICOLOGA ANALTICA GUAS ACADMICAS

DOCENTE. NANCY PATIO REYES

INTRODUCCIN. La toxicologa de urgencias requiere la identificacin rpida y confiable de las sustancias txicas que causan un cuadro clnico en estudio, presentado por un paciente recibido en este servicio. El examen fsico y una historia clnica completa determinan el nmero y tipo de las pruebas analticas que se deben solicitar. No se justifica el uso de un perfil analtico amplio para el diagnstico o valoracin global, sino que los exmenes deben ser ordenados en forma lgica y racional segn las condiciones individuales de cada paciente. Con ello se logra una reduccin de los costos de la atencin mdica y se aumenta la eficiencia y la efectividad del servicio de urgencias. Es por esto que el objetivo general de esta lnea es Capacitar al estudiante en el anlisis qumico Toxicolgico de las diferentes reas y en la interpretacin de resultados en el campo analtico, igualmente para lograrlo es indispensable reconocer un laboratorio de Anlisis Instrumental y su Aplicacin a la Toxicologa Clnica, Ambiental Ocupacional y Forense.
OBJETIVOS ESPECFICOS:

Capacitar al Medico para diferenciar el anlisis Qumico Toxicolgico de otros anlisis paraclinicos, y desarrollar un criterio de diagnstico frente a un resultado positivo en urgencias Toxicologicas. Preparar al estudiante para analizar los diferentes mtodos que se utilizan en diagnostico de la Toxicologa clnica, Ocupacional, Ambiental y toxicologa de la frmacodependencia. y la confiabilidad de las pruebas. Preparar a los estudiantes para ampliar su visin hacia los anlisis toxicolgicos ocupacional y ambiental y su impacto en la salud. Capacitar al estudiante para analizar los resultados en exmenes Toxicolgicos de niveles de medicamentos, para uso teraputico.

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GUA ACADMICA No 1
Mediante consultas organizadas usando diferentes medios realizaremos un recuento de la toxicologa a travs de los tiempos, esto nos permitir en una mesa redonda enriquecer nuestra informacin acerca de la toxicologa y su importancia. HISTORIA DE LA TOXICOLOGA. Podramos decir que la historia de la Toxicologa se remonta a la misma aparicin del hombre sobre la tierra. En efecto l debi discriminar tempranamente que alimentos de la naturaleza servan para nutrirlo de cuales podan envenenarlo: de esta distincin dependa su vida. El hombre fue aprendiendo de la naturaleza y utiliz de ella tanto para los tratamientos con bases empricas, como para agredir a otros. La historia recuerda que los proveedores de venenos los ofrecan distinguiendo aquellos de accin rpida, de aquellos de accin retardada y otros de accin acumulativa. As aparecen los primeros modelos experimentales los probadores de alimentos de los reyes, primero hombres y luego perros. As fue creciendo el conocimiento.
www.msal.gov.ar/redartox

La realidad es que la toxicologa, como tantas otras ramas de las ciencias biolgicas, pas por sucesivas etapas de empirismo y misticismo antes de que se le llegara a reconocer como ciencia. La experiencia ha enseado al hombre lo benfico o perjudicial de ciertas sustancias. El hombre primitivo se auxili de algunas de ellas para cazar; posteriormente las utiliz con propsitos estimulantes, teraputicos o criminales. Es muy probable que los primeros txicos fueran de origen vegetal. Con frecuencia se ha reiterado que el conocimiento de los venenos es tan antiguo como el hombre mismo; de igual manera, la prctica del envenenamiento se pierde en la antigedad. Entre los papiros ms antiguos del milenario Egipto se encuentran anotaciones que demuestran que en esa poca ya exista conocimiento de los venenos, pues los sacerdotes egipcios con pcimas preparadas con semillas de melocotn a la gente que revelaba secretos religiosos. El cido cianhdrico contenido en las bebidas causaba la muerte de quien lo ingera. La Biblia revela que los hebreos ya tenan conocimiento de uvas y bayas venenosas, de la hiel mortal de las serpientes y de la baba fatal de los reptiles. En investigaciones arqueolgicas de G. Saint-Hilare y Parrot, se ha descubierto que el hombre del Paleoltico usaba txicos que impregnaba en las puntas de sus lanzas o flechas. Alrededor del 2800 a. C., el emperador chino Shin-Nong cultiv varias plantas medicinales y describi sus propiedades medicinales y txicas. Su obra, que se titul Pen Tsia Kang Mu, constituye un voluminoso tratado que fue publicado en el siglo XVI; cuenta con 52 volmenes y describe alrededor de dos mil medicamentos. En Grecia, en el siglo V a. C., los venenos adquirieron una importancia social y poltica: Scrates fue ajusticiado mediante la administracin de un brebaje txico. En el clebre juramento de Hipcrates, el sabio de Cos, a quien se le considera justamente el padre de la medicina, se expresa claramente: A nadie dar una droga mortal aun cuando me sea solicitada, ni dar consejo con este fin. Teofrasto de Efeso, discpulo de Aristteles, fue un gran botnico que estudi varios venenos de accin lenta; Nicandro de Colofn escribi una importante obra sobre los venenos animales, vegetales y minerales; Cratevas, mdico privado del rey Mitridates VI de Ponto, proporcion a su amo la manera de protegerse de ciertos txicos, tales como arsnico, mediante la ingestin de
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dosis progresivas y ascendentes. El tipo de resistencia adquirida se denominaba mitriadismo; Pedanio Dioscrides de Anazarbo, quien vivi en el siglo I, en su clebre De Universa Medicina, tiene un captulo dedicado a los venenos, ya que en la corte del emperador exista un envenenador oficial; es el caso de Locuesta, esclava que fue condenada por asesinato, quien al ser indultada se convirti en experta envenenadora que actuaba por iniciativa propia o cuando el estado requera sus servicios. En las excavaciones de Pompeya se han encontrado sortijas con cavidades para contener venenos y con punzones disimulados para su inoculacin. Asimismo, en el siglo V Olimpioduro dio una detallada descripcin del mtodo para preparar venenos con arsnico. Arnoldo de Villanova, filsofo y alquimista, describi la semitica de muchos envenenamientos; Aurelus Theofrastus Bombastus, llamado Paracelso, dio excelentes descripciones sobre las propiedades del arsnico blanco, del sublimado corrosivo y de otros txicos. Durante esa poca la semitica toxicolgica avanz poco, ya que la deteccin de los envenenamientos era difcil porque los signos eran semejantes en varios casos de envenenamiento. La nica operacin analtica toxicolgica consista en dar de comer a un animal los restos del alimento sospechoso. Por ello la nica forma de descubrir al envenenador era atraparlo en el momento de contaminar el alimento. En Italia, Francia, Holanda e Inglaterra, los envenenamientos llegaron a constituir una seria amenaza pblica; puede encontrarse una detallada relacin de estos hechos en Poisons and Poisoners, de C. J. S. Thompson. Por el mismo tiempo apareci otro famoso veneno, conocido como acquetta de Peruzzia, que se preparaba espolvoreando arsnico a vsceras de cerdo; los lquidos obtenidos de la putrefaccin disolvan el arsnico. A partir del siglo XV encontramos una intencin de aproximacin cientfica. El clebre alquimista Arnoldo de Villanueva escribi Tractus de arte cognoscendi venena cum quis timet sibi ea administrare; Santos de Arnodis aport Opus de veneis, en Venecia; la obra de Matthioli de Siena aludi a los polvos del archiduque de Austria como antdoto del arsnico; Zachias, en su Medicina legal, discute el valor de la cantidad de txico que se encuentra en los cadveres, las vas de penetracin y de la absorcin por las mucosas, afirmando que si el veneno es absorbido no produce ningn efecto aunque se introduzca al organismo; asimismo, Courten realiz experimentos toxicolgicos en animales; y Antonio Trilla public en Toledo su Tratado general de todas las tres especies de venenos, como son minerales, Plantas y animales. En el siglo XVIII se encontr un creciente nmero de autores que estudiaron cada vez ms la toxicologa. De igual manera, Mead, Sindor y Neuman aplicaron a la doctrina de los venenos, la iatromatemtica. En ese tiempo apareci un libro de Stenezel, que parece fue el primero de los que se titularon Toxicologa patolgica mdica. Nebel relacion signos de la intoxicacin; Sprohuel experiment con animales; Gmeli estudi medicamentos que pueden ser venenos. An ms fecundo en autores se present el siglo XIX. Apareci el Manual de toxicologa, de Duval; Orfila, en la primera edicin de Toxicologa general, relacion la fisiologa, patologa y medicina general, al igual que Armand de Montgarny y Bernard. Adems de stos y otros autores que compilaron los esparcidos conocimientos, hay otros muchos que se especializaron en sustancias especficas, como estricnina, clquico, belladona, venenos de serpientes y animales ponzoosos, entre muchos otros. Ms prximo a la poca actual se encuentran Galtier con Toxicologa general y su tratado de Toxicologa mdica, qumica y legal, y Pedro mata con su Compendio de toxicologa. En este contexto, Briaud y Chaudi publicaron Qumica legal, texto que, adems del anlisis qumico de los venenos, relaciona los procedimientos analticos para manchas de sangre, esperma y materia cerebral, entre otros aspectos. En esa poca dejaron de emplearse, en parte, los venenos tradicionales, dando razn a Tardieu, quien pugnaba que deba evitarse la profusin de los conocimientos toxicolgicos. Sin embargo, aparecieron una serie de descubrimientos que tuvieron como fundamento la experimentacin fisiolgica en la identificacin de venenos, que
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resultaron trascendentales para la toxicologa. Claudio Bernard afirmaba que toda sustancia introducida al organismo era extraa a la constitucin qumica de la sangre y que representaba un medicamento o veneno. Sin embargo, ha quedado bien comprendida la teora de Paracelso respecto de que la toxicidad es, en el fondo, una cuestin de dosis. Se requera, entonces, del aporte de farmaclogos y fisilogos. Haba que saber primero cmo penetran los txicos al organismo, y a travs de qu tipo de vas, adems conocer los procesos de difusin en el medio interno. Por su parte, Ariens, Goodman y Gilman mostraron los esquemas de transporte, activacin y desactivacin de los frmacos. En ese sentido, era importante conocer la relacin de dosis efecto, para lo cual aparecieron los conceptos de dosis txica, dosis letal, dosis letal media (Trevan), dosis letal mnima (Luchelli) y los importantes trabajos de Schackell, Carpenter, Powers y tantos otros que trataban de llevar a frmulas matemticas y grficas los conocimientos farmacolgicos aplicndolos a la toxicologa. Todo este esfuerzo para profundizar la toxicologa fue dirigido fundamentalmente a la prevencin y el tratamiento de las intoxicaciones. En la actualidad comits internacionales de expertos se ocupan de la evaluacin toxicolgica de las drogas, las acciones teratognicos, la relacin con los trastornos metablicos, las interrelaciones entre medicamentos, etctera. Fuhner, en 1956, reconoci la obra de Zangger, Intoxicaciones, que trata de los errores ms frecuentes en su tiempo acerca del diagnstico y la teraputica de las intoxicaciones. Deca Zangger que los mdicos diagnostican la cuarta parte de las intoxicaciones, este lamentable hecho nicamente puede remediarse enseando mejorar la toxicologa. www.fmvz.unam.mx BIBLIOGRAFA 1. www.msal.gov.ar/redartox 2. www.fmvz.unam.mx

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GUA No 2 MUESTRAS PARA ANLISIS TOXICOLGICO


Una Muestra es toda aquella sustancia o materia representativa de la estructura qumica a ser analizada, no se pueden establecer reglas fijas para elegir una muestra, ya que esta operacin depende de la naturaleza del material y la cantidad del mismo que debe tomarse. Mientras sea posible el material recibido estar en condiciones ptimas para anlisis. En el caso de anlisis Qumico Toxicolgico existen 2 fuentes de obtencin de muestra: a) Oficiales o Legales: generalmente tomadas bajo circunstancias que conllevan a investigacin y posiblemente a una sancin ya sea por manejo del producto, del ambiente, o causa de muerte de una o varias personas u organismos vivos. Donde su anlisis no es urgente pero sirve de apoyo para tomar medidas preventivas y legales a los entes de salud o policiales. b) Las urgentes cuyo nico fin es ayudar generalmente al personal medico o paramdico debido a que est implicada la vida de una o muchas personas. Muestra Biolgica: sangre orina o contenido Gstrico, lo ms importante es conocer la toxicocinetica de la sustancia y su tiempo de accin ya que de estos parmetros depende el tipo de muestra. Dado que en intoxicaciones humanas y animales agudas la muestra es nica en el espacio y el tiempo. La muestra debe ser tomada directamente por el medico o enfermera de la institucin de salud, marcarla y sellarla correctamente y refrigerarla cuando no puede ser remitida inmediatamente por un tiempo no mayor a 3 das, en caso de quedar guardada debe considerarse la posibilidad de cadena de custodia cuando se requiera debe ser enviada al laboratorio con una solicitud de anlisis que mnimo indique: Fecha, nombre y edad de la persona, clase de ocupacin, institucin o localidad que remite, clase de sustancia a analizar, cuando se desconoce esto, se debe anexar un resumen de historia clnica para orientar el anlisis. Muestra No biolgica: lquidos, slidos, alimentos, bebidas, suelo, agua, aire. A menos que sea el causante de una intoxicacin aguda y sobre esta muestra repose la mayor evidencia de posible causa de intoxicacin, en cada caso se deben seguir las recomendaciones que se harn dependiendo del grupo qumico que se va a analizar Para muestras no biolgicas debe tomarse y guardarse en frascos o bolsas nuevas o limpias, debidamente selladas, y marcadas, junto con el acta de toma de muestra que nos indique fecha, hora, procedencia, asegurarse de su envo inmediato al laboratorio, algunas veces cuando esta toma es causada por quejas, debe tomarse una contramuestra.

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GUA No 3 ALCOHOL ETLICO- METILICO


OBJETIVO: Conocer las tcnicas analticas ms apropiadas para identificar Alcohol Etlico y Metilico en sangre por ser la sustancia qumica de mayor impacto en la salud publica desde el punto de vista Toxicolgico en la ciudad de Bogota FUNDAMENTO TERICO: Dentro de los txicos voltiles, los alcoholes Etanol, Metanol son sustancias de importancia toxicolgica dada su accin farmacolgica depresora del Sistema Nervioso Central. El abuso creciente del consumo de bebidas alcohlicas representa importancia medico-social, debido a que los individuos alcoholizados pueden ser causa de trastornos y accidentes, independientemente de la clase de bebida (cerveza, vino, licores), los principales componentes de sta son alcohol y agua. El grupo funcional OH, se conoce como hidroxi y puede estar sustituyendo a un H, de una cadena hidrocarbonada, o al H del benceno. Para la comprobacin de la presencia de alcohol en sangre se han desarrollado varias tcnicas analticas ya sea para identificacin directa del alcohol pruebas indirectas que desde el punto de vista enzimtico nos permite conocer un dato aproximado del nivel de alcohol presente en el organismo. PRUEBAS RPIDAS PARA LA DETERMINACIN DE ALCOHOLEMIA El etanol es una sustancia de amplio uso industrial, que fundamentalmente produce patologa por su consumo en bebidas y en menor grado por ingestin de productos cosmticos o medicamentos que lo contienen. DETERMINACIN POR EL MTODO DE WINNICK FUNDAMENTO El mtodo de Winnick permite la determinacin de etanol en muestras biolgicas como sangre, suero, plasma, etc. El mtodo se basa en la reaccin de oxido-reduccin del etanol con el dicromato de potasio en medio cido, el producto final de la reaccin es un compuesto coloreado el cual puede ser determinado espectrofotometricamente o por titulacin con tiosulfato de sodio y almidn como indicador. La liberacin del etanol de la muestra biolgica se basa en la volatilidad del etanol a la temperatura del ensayo y la reaccin con el dicromato de potasio, lo cual ocurre en la cmara de difusin de Conway. La cuantificacin se hace con base en la curva de calibracin realizada con un estndar certificado de etanol o utilizando los factores descritos en el mtodo. MUESTRAS Sangre venosa recolectada con sistema de vaco o con jeringa desechable. Se debe tener la precaucin de NO LIMPIAR LA ZONA DE LA TOMA DE LA MUESTRA CON UN DESINFECTANTE QUE CONTENGA ALCOHOL. La sangre, 5 a 7 ml, se recolecta en tubo de ensayo de vidrio o polipropileno, con fluoruro de sodio como agente conservante y oxalato de potasio como anticoagulante, tubo tapa gris por convencin internacional. Almacenar las muestras en nevera a temperatura de refrigeracin mientras se analiza. Es conveniente recolectar bajo las mismas condiciones una contramuestra para los fines legales pertinentes. Las muestras deben mantener en todo momento la cadena de custodia.
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EQUIPOS Estufa de calentamiento programable hasta 240C Balanza analtica Bureta o microbureta, Clase A, de 10 a 25 ml de capacidad Otros elementos de laboratorio para la realizacin del anlisis comprende: cmaras de difusin de Conway, micropipetas, balones y otros elementos de uso rutinario en el laboratorio. REACTIVOS DICROMATO DE POTASIO (0,4 N), EN H2SO4 (10 N): Se puede utilizar ampolleta de titrisol de dicromato de potasio 1/10 N(1/60 mol/L), la cual se transfiere cuantitativamente a un baln de 250 ml, se enjuaga varias veces con cido sulfrico 10N permitiendo que los enjuagues sean recibidos en el mismo baln y se completa a volumen con el cido, en todo momento se deben seguir las recomendaciones del fabricante descritas en el instructivo que acompaa al producto. En caso de no contar con ampolleta de titrisol, pesar 19,614 g de dicromato de potasio RA K2Cr2O7, previamente pulverizado y secado en estufa a 100C, durante 4 a 6 horas y enfriado en desecador, disolver con cido sulfrico 10 N en un baln aforado de 1000 ml y completar a volumen con el cido. ACIDO SULFURICO 10N: Medir 490 ml de cido sulfrico concentrado, de densidad 1,835 g/ml y pureza del 96%, completar a 1000 ml agua hervida, y fra; agregar el H2SO4 lentamente y refrigerando, luego completar a volumen con H2O hervida y fra. ADVERTENCIA: Se debe tener cuidado en la preparacin de la solucin de cido sulfrico debido a que esta reaccin es exotrmica y produce desprendimiento de calor, el cido se debe agregar al agua lentamente (Nunca al contrario). Se recomienda colocar el baln en el que se realiza la dilucin en un bao de hielo o enfriar bajo chorro de agua. Se debe tener en cuenta que al enfriarse la solucin se produce una contraccin del volumen, por lo que una vez fra la solucin se completa a volumen con agua destilada. TIOSULFATO DE SODIO 0.1 N: Se puede utilizar ampolleta de titrisol de tiosulfato de sodio 1/10 N (0,1 mol/L), la cual se transfiere cuantitativamente a un baln de 1000 ml, se enjuaga varias veces con agua destilada permitiendo que los enjuagues sean recibidos en el mismo baln y se completa a volumen con agua destilada, en todo momento se deben seguir las recomendaciones del fabricante descritas en el instructivo que acompaa al producto. En caso de no contar con titrisol, pesar 28,818 g de tiosulfato de sodio pentahidratado RA y completar a volumen con agua destilada hervida y fra. ALMIDON S.R. Pesar 1 g de almidn soluble, triturar con 10 ml de agua destilada y fra y verter lentamente con agitacin constante en 200 ml de agua destilada em ebullicin hasta obtener un lquido translcido y ligero. Dejar decantar y emplear nicamente el lquido sobrenadante. Esta solucin debe ser recin preparada. Se puede almacenar en recipiente limpio, tipo frasco gotero, en refrigeracin hasta por dos meses, en estos casos debe verificarse que no se presenta crecimiento de hongos, en cuyo caso debe ser desechado. CARBONATO DE POTASIO O DE SODIO AL 20% Pesar 20 g de carbonato de potasio RA, disolver en agua destilada y completar a 100 ml. IODURO DE POTASIO 3N: Pesar 49,8 g de yoduro de potasio RA, disolver en agua y completar a 100 ml. Almacenar en frasco color mbar, no utilizar el reactivo si ha cambiado su color original.
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PROCEDIMIENTO Medir 0,5 ml de dicromato de potasio 0,4 N preparado en cido sulfrico y colocarlo en el compartimiento interno de la celda de Conway. Medir 1 ml de carbonato de potasio al 20% y colocarlo en el compartimiento exterior de la celda. Medir 1 ml de sangre y colocarla en el compartimiento exterior, en donde est el carbonato. Tapar la celda, agregndole vaselina u otra sustancia en el borde dela tapa para que quede hermticamente cerrada y evitar la evaporacin del etanol. Mezclar por rotacin suave para que se reparta la sangre en el carbonato de potasio y colocar la celda en estufa a 50 C durante dos horas o a temperatura ambiente durante 24 horas. El alcohol etlico se volatiliza y es atrapado por el dicromato de potasio. Observar el color de la solucin del compartimiento interno; si la prueba es positiva el dicromato cambia de color, pasa de amarillo a verdoso, y luego a azul por oxidacin; si la prueba es negativa no se produce cambio del color amarillo del dicromato. Cuando se presenta color azul, se repite el ensayo con 0,5 ml de sangre, se titula y se duplica el resultado. Antes de la titulacin se aplica 0.5 mL de Yoduro de potasio 3 N y 1 gota de Almidn hidrosoluble al 1%. Para los clculos, se halla la diferencia entre la titulacin del blanco y el problema, y se multiplica por el factor 1,15 para obtener en forma directa la concentracin de etanol en mg / 100 ml. Tambin se puede calcular la cantidad de etanol en la muestra utilizando la siguiente ecuacin: Etanol (mg/100ml) = N * (Vb Vm) / volumen de muestra * 11,51 *100 Donde: N = normalidad del tiosulfato Vb: volumen de tiosulfato consumidos en la titulacin del blanco Vm: volumen de tiosulfato consumidos en la titulacin de la muestra 11,51: PM del etanol / 4 (reaccin Redox) La cuantificacin se puede realizar preparando una solucin stock de etanol y a partir de ella preparar soluciones en el rango de 25 a 250 mg / 100 ml. Procesar siempre bajo las mismas condiciones un blanco negativo y al menos un control positivo, de concentracin cercana al lmite de deteccin, con cada lote de muestras. Tiempo de duracin del anlisis: 3 horas CARACTERSTICAS DEL MTODO El rango de trabajo de es 20 a 225 mg %. La menor concentracin de etanol que puede ser determinado con confiabilidad depende de la capacidad de la bureta, generalmente no es conveniente reportar valores menores al 20 mg%. La precisin es menor al 10 % y la exactitud se encuentra entre el 90 al 110% en el rango estudiado. El mtodo no es especfico para etanol, responde a sustancias oxidantes bajo las condiciones del ensayo, es decir otros alcoholes como metanol, 2- propanol, acetaldehdo, formaldehdo, propanaldehido, alcohol amlico, octanol, ter etlico y en general cualquier sustancia voltil que pueda reducir el dicromato en las condiciones de ensayo produce resultados falsos positivos. El cloroformo, benceno, tetracloruro de carbono, tricloroetileno no son falsos positivos. Otros parmetros del mtodo de Winnick, se describen en la Tabla 1. Tabla 1 Parmetros de desempeo de los mtodos de cromatografa de gases y de Winnick para la determinacin de alcoholemia.
PARMETROS DE LOS MTODOS DE DETERMINACIN DE ALCOHOLEMIA: CROMATOGRAFA DE GASES/HS/FID Y WINNICK
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MTODOS PARMETROS EXACTITUD: PRECISIN: REPETITIVIDAD REPRODUCIBILIDAD LMITE DE DETECCIN LMITE DE CUANTIFICACIN SENSIBILIDAD LINEALIDAD (RANGO) PUNTO DE CORTE SENSIBILIDAD DE LA PRUEBA ESPECIFICIDAD DE LA PRUEBA mg/dl mg/dl % % % % mg/dl mg/dl 6 8 0,05731 8 - 396 15 100,8 106,6 85 80 11,5 23 5,75 23 - 224 24 100 100 UNIDAD % CROMAT. GASES 99, 86 105,6 WINNICK 60 - 80

BIBLIOGRAFA
Winnick T. Determination of Ethyl Alcohol by Microdiffusion. Ind. Eng. Chem. Anal. Ed.; 1942; 14(6) pp 523 525. Vanzetti G. BG. Winnick method of determination of alcohol in the blood and the problem of so-called physiological alcoholemia. Minerva Med. 1954 Apr 28;45(34):1185-91. Forero M. Determinacin de Alcoholes Etlico y Metlico en material biolgico. Instituto de Medicina Legal. Bogot. 1975 Instituto Nacional de Medicina Legal y Ciencias Forenses. Laboratorio de Toxicologa, Regional Bogot Manual de Tcnicas de Laboratorio: Marcha Analtica para Determinacin de Alcohol Etlico en Muestras de Sangre, Mtodo de Winnick, Santaf de Bogot 1994. McBay A. Handbook of Analytical Toxicology. CRC Press. 1989. pp. 145- 146. Sunshine I. Ed. Metodology for Analytical Toxicology CRC Press. Vol- 1. 1987. pp- 145-149 Besson R. Technic for determination of blood alcohol by means of Conway cell. Rev. Fr. Estud. Clin. Biol. 1956. 1(10):1150-1.

DETERMINACIN DE ALCOHOL ETILICO INMUNOFLUORESCENCIA POLARIZADA (FPIA)

(ETANOL),

POR

Este mtodo de screening, automatizado, permite determinar alcoholemia o etanol en sangre total y etanol en suero o plasma en forma cuantitativa. Se utiliza en los laboratorios de toxicologa de urgencias. Es un mtodo registrado por la casa comercial Abbot, trae incorporado los reactivos, calibradores, controles y buffer de dilucin, se realiza en un equipo TDx. La determinacin del etanol se basa en la reaccin de oxidoreduccin entre el etanol y la enzima NAD (nicotinadenin dinucletido) y la diaforasa, La concentracin del etanol se mide a travs de la intensidad de la fluorescencia por la tcnica REA (Atenuacin de energa radiante), y se cuantifica en la curva de calibracin generada con los calibradores. Para la realizacin del ensayo se debe seguir los lineamientos dados por la casa fabricante. La curva de calibracin se realiza en el rango de 25 a 300 mg/dl. La sensibilidad es de 10,0 mg/dl. La precisin es menor al 6% y la exactitud reportada es de 100,3 2,7% para el rango estudiado. Puede presentar reactividad cruzada menor al 1% con acetona, etilenglicol, isopropanol, metanol y propilenglicol en concentraciones de 1000 mg/dl. Con el propanol presenta una reactividad cruzada del 36% a 100 mg/dl y con n-butanol de 10,7 % para 1000 mg/dl. 1 Guas ACADMICAS Lnea de Profundizacin Toxicologa Analtica 10
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El tiempo de duracin del anlisis es de 30 minutos, se pueden correr desde 1 hasta 20 muestras simultneamente. Las ventajas de este mtodo es su rapidez y la facilidad de manejo.

BIBLIOGRAFIA
1. Abbott Diagnostics. Assays Manual. TDx/ TDxFlx. 1993. Etanol 45125-111 2. Taller de Alcohol Metlico y Etlico. Secretaria Distrital de salud de Bogot. Noviembre de 2004 PRUEBAS PARA LA DETERMINACIN DE METANOL METANOL El metanol es el principal componente del destilado en seco, de la madera. Es uno de los disolventes ms universales y encuentra aplicacin, tanto en el campo industrial como en diversos productos de uso domstico. Dentro de los productos que lo pueden contener se encuentra el denominado alcohol de quemar constituido por alcoholes metlico y etlico, solvente en barnices, tintura de zapatos, limpiavidrios, lquido anticongelante, solvente para lacas etc. Adems, los combustibles slidos envasados tambin contienen metanol. Se reportan en la literatura diversos mtodos basados en tcnicas diferentes para el anlisis de metanol en muestras biolgicas. Entre ellos el de cromatografa de gases con detector de ionizacin de llama y automuestreador de voltiles (head-space), en urgencias de toxicologa se utilizan otras pruebas de rutina siendo la ms empleada la del cido cromotrpico, la cual est descrita para anlisis cualitativo o cuantitativo por medio espectrofotomtrico. La separacin del metanol de las muestras biolgicas se puede realizar por destilacin, microdifusin o en el caso de la sangre por precipitacin de protenas. DETERMINACIN DE METANOL POR CIDO CROMOTRPICO FUNDAMENTO Este mtodo se basa en la oxidacin de metanol a formaldehdo, con formacin posterior de un complejo coloreado con cido cromotrpico, el cual se determina espectrofotometricamente. MUESTRAS Sangre venosa recolectada con sistema de vaco o con jeringa desechable. Se debe tener la precaucin de NO limpiar la piel con un desinfectante que contenga alcohol. La sangre, 5 a 7 ml, en tubo seco o tapa roja, sin anticoagulante, y realizar la prueba en esta muestra. Despus de ser procesada y purificada, puede ser utilizada para hacer anlisis por cromatografa de gases. Almacenar las muestras en nevera a temperatura de refrigeracin mientras se analiza. Es conveniente recolectar bajo las mismas condiciones, una contramuestra para los fines legales pertinentes. Las muestras deben mantener en todo momento la cadena de custodia. EQUIPO Espectrofotmetro UV/Vis Balanza analtica
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Tubos de ensayo, balones volumtricos, vasos de precipitados, pipetas, embudo, papel de filtro, agitadores de vidrio. REACTIVOS, ESTNDARES Y PREPARACIN DE REACTIVOS Estndar de metanol certificado Acido tricloroactico al 20% (p/v). Bisulfito de sodio (solucin saturada) o preferiblemente reactivo slido. cido cromo trpico R.A. Permanganato de Potasio 7% Acido Sulfrico concentrado. R.A.

PREPARACIN DE LA SOLUCIN ESTNDAR DE METANOL Solucin stock de metanol: Medir 0,25 ml del estndar de metanol en un baln de 100 ml y completar con agua destilada. La concentracin de esta solucin es de 200 mg/100 ml. Solucin intermedia: Realizar una dilucin 1/10 de la solucin stock para obtener una concentracin de 20 mg/100 ml.
Tabla 2. Curva de calibracin para metanol Nivel de la curva 2 3 4 5 Alcuota de la solucin de 20 mg/100 ml de metanol 2,5 5,0 7,5 10 Volumen final en ml 10 10 10 10 Concentracin de la solucin en mg / 100 ml 5 10 15 20

PREPARACIN DE REACTIVOS Permanganato de potasio acidificado: Pesar 7g, disolver en 15 ml de cido ortofosfrico al 85% en agua. Completar a 100 ml con agua destilada. Conservar en frasco mbar. cido tricloroactico al 20%:Pesar 20 g del cido, disolver en agua destilada y completar a 100 ml. Utilizar guantes para la preparacin de esta solucin. Solucin saturada de bisulfito de sodio: Pesar aproximadamente 5 g de sodio bisulfito y diluir a 10 ml, agitar y verificar un exceso de slido en la solucin. Solucin de cido cromotrpico: Pesar 50 mg de cido cromotrpico y diluir en 10 ml de agua destilada. Preparar la solucin cada vez que se vaya a realizar la prueba. PROCEDIMIENTO Tomar la muestra de sangre total (coagulada) y agregar 4 ml de cido tricloroactico al 20% para desproteinizar, mezclar hasta completa destruccin del coagulo. Filtrar, tomar dos alcuotas de 1 ml del sobrenadante y colocar en tubos diferentes.

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A la primera alcuota, agregar 5 gotas de la solucin de permanganato de potasio, si es necesario agregar las gotas necesarias hasta que el color violeta permanezca por 3 minutos, con el fin de oxidar el metanol a formaldehdo. La segunda alcuota no se oxida y queda lista para continuar la reaccin. Pasados los 3 minutos de oxidacin de la primera alcuota, agregar gota a gota la solucin saturada de bisulfito de sodio, o porciones del bisulfito en polvo, hasta obtener la completa decoloracin de la solucin. Tomar los tubos que contienen la primera y segunda alcuota y adicionar aproximadamente 0,01 g (pizca) de cido cromotrpico, o 0,2 ml de cido cromotrpico al 0,5 % en agua, mezclar. Colocar los tubos en un bao de hielo Adicionar a los tubos lentamente por las paredes, con precaucin (campana de extraccin y uso de careta o gafas protectoras), 2 a 3 ml de H2SO4 concentrado. Un anillo de separacin prpura entre las fases indica la presencia de metanol. NO MEZCLAR la solucin en este punto. Observar el color del anillo o la interfase. La aparicin de un anillo color violeta en la interfase indica la presencia de Metanol. Un color pardo indica negativo para Metanol. La Tabla 3 presenta una gua para la interpretacin del resultado del ensayo. Procesar siempre bajo las mismas condiciones un blanco negativo y al menos un control positivo, de concentracin cercana al lmite de deteccin, con cada lote de muestras. El control negativo se prepara con sangre normal y el control positivo con sangre adicionada de metanol en concentracin de 10 a 30 mg%. Para la determinacin cuantitativa de metanol, preparar estndares en el rango de 5 a 20 mg % en sangre libre de metanol, aplicar el procedimiento, completando las soluciones de los tubos de ensayo a 5 ml y leer la absorbancia de las soluciones de los estndares y de las muestras a 580 nm. Leer de igual manera un blanco de reactivos y restar la absorbancia debida a esta solucin. Realizar una curva de calibracin ajustada por mnimos cuadrados y cuantificar las muestras. Leer al menos dos soluciones control positivas en el nivel mnimo e intermedio del rango de cuantificacin.

Nota: Para mejorar la observacin del anillo llevar el tubo de ensayo al bao Maria a aproximadamente 60C durante 3 a 5 minutos. Tabla 3. Interpretacin del resultado de metanol por la prueba del cido cromotrpico MUESTRA
ALCOHOL METILICO + + FORMALDEHIDO

BLANCO

PATRON

(NEGATIVO POSITIVO INTERPRETACIN )


+ + + Hay presencia de metanol y formaldehdo Hay metanol pero no alcanz a metabolizar a formaldehdo Ya no hay metanol porque todo se metabolizo a formaldehdo (paciente grave) Negativo para metanol y formaldehdo

+ +

CARACTERSTICAS DE LA PRUEBA El rango para la determinacin cuantitativa est entre 10 a 80 mg%.


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El ensayo del cido cromotrpico no es especfico para metanol, debido a que es una reaccin de oxidacin y formacin de color con el cido cromotrpico, otras sustancias similares como el formaldehdo puede dar reaccin positiva. El gliceraldehido, arabinosa, fructosa y sacarosa producen un anillo amarillo, mientras que concentraciones elevadas de furfural producen un anillo de color rojizo. El lmite de deteccin es de 0,5 mg%. BIBLIOGRAFA: Vallejo R. MC. Toxicologa analtica. 2. Edicin. Editorial Diario del Sur. Pasto. 1984. Toxicologa y Qumica Lega. Gua de seminarios. http://www.biol.un.edu.ar/toxicologia/seminarios/guiasm.html. Consultado abril 2006.

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GUIA ACADEMICA No 4
ANLISIS DE SUSTANCIAS PSICOACTIVAS (SPA)

OBJETIVO: Conocer las tcnicas analticas ms apropiadas para identificar Sustancias Psicoactivas mas consumidas en la ciudad de Bogot. FUNDAMENTO TEORICO: Desde el punto de vista de la ciencia, frmaco o droga es toda sustancia qumica de origen natural o sinttico que afecta las funciones de los organismos vivos. Los frmacos que afectan especficamente las funciones del Sistema Nervioso Central (SNC), compuesto por el cerebro y la mdula espinal, se denominan psicoactivos. Estas sustancias son capaces de inhibir el dolor, modificar el estado anmico o alterar las percepciones, por ejemplo.
Cules pueden ser las vas de administracin de una droga?

Para que un frmaco logre actuar, en primer lugar debe ser introducido al organismo y en segundo lugar, debe llegar al sitio de accin. En el caso de los psicofrmacos, este sitio de accin est localizado en alguna parte del Sistema Nervioso Central, un sistema al que es difcil acceder porque cuenta con una proteccin conocida como la barrera hemoencefaltica. Gracias a ella, no todo lo que entra a la sangre puede pasar hacia el cerebro y la mdula espinal. Para lograrlo, las drogas psicoactivas deben ser liposolubles, ya que los lpidos (grasas) pueden atravesar fcilmente las membranas de la barrera. Para introducir un psicofrmaco al organismo existen bsicamente tres vas de administracin: oral (la ingestin de pastillas, grageas, tabletas, gotas, plantas, bebidas o alimentos que contengan alcaloides psicoactivos), pulmonar (a travs del acto de fumar, por la aspiracin de polvos o la inhalacin de vapores) y parenteral (por medio de una inyeccin que puede ser intravenosa, subcutnea o intramuscular).
Cmo se determina la toxicidad?

Lo txico de una droga no es la droga en s misma sino las concentraciones de sta en proporcin a cierta medida, que en el ser humano es el kilo de peso. Existe una estrecha relacin entre la concentracin de una droga en el organismo y la cantidad de complejos que se forman. El efecto de una droga vara con esa concentracin hasta alcanzar un valor mximo, pasado el cual ningn incremento en la concentracin resulta ms efectivo. La dosis activa media es definida como aquella que produce el 50% del mximo efecto obtenible en un grupo de personas o animales sometido a estudio, mientras la dosis letal media es aquella que causa mortalidad en el 50% de los miembros del grupo estudiado. La toxicidad o el margen de seguridad de una droga est determinado por la proporcin entre la dosis activa y la dosis letal. En la Aspirina, por ejemplo, ese margen de seguridad es de 1/20, mientras que en la herona es de 1/30 y en el LSD es de 1/650. Categoras en cuanto al uso de drogas
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1- Uso - consumo propiamente de la droga 2- Abuso - Situacin que se caracteriza por continuar el uso aun cuando el mismo le genera al usuario problemas personales (fsicos, psicolgicos) y problemas sociales (trato con las personas, trabajo, etc.) 3- Dependencia - Situacin en la que el uniusuario ha perdido totalmente el control respecto al uso de la droga. La urgente necesidad por el consumo le lleva a organizar su vida cotidiana alrededor del mismo (como adquirir la droga, cuando ingerirla, etc.). En trminos de los efectos la persona se ve en la situacin de tener que consumir la droga para evitar el conjunto de malestares que le provoca la ausencia de la misma. Otros conceptos relacionados 1- Sndrome de abstinencia o retiro - Conjunto de malestares fsico (ej: nerviosidad, palpitaciones, presin alta, nauseas, mareos) y psicolgicos (preocupacin, ansiedad, falta de concentracin, pesimismo, tristeza, depresin) que experimenta el usuario cuando han pasado los efectos de una droga. En la fase de dependencia estos efectos son ms severos y persistentes. El usuario busca evitar a travs del consumo que estos sntomas aparezcan. En ocasiones sucede que cada vez resulta ms difcil su eliminacin. 2- Tolerancia - Efecto de una droga sobre el organismo que consiste en la necesidad de aumentar la cantidad consumida para producir el mismo efecto inicial. La tolerancia agrava el consumo y puede ser un factor precipitante hacia la dependencia. Reacciones de coloracin y precipitacin: Para la comprobacin de la presencia de alcaloides se han desarrollado un gran nmero de reactivos de coloracin y precipitacin. Algunos de ellos son considerados de aplicacin general. Mientras otros son ms especficos y pueden servir para clasificaciones parciales de sustancias; generalmente se considera que hay presencia de alcaloides si dan reaccin positiva a por lo menos cuatro de estos reactivos. Los anlisis pueden realizarse de variadas formas, en los mtodos ms corrientes se utiliza una placa de gotas, la muestra se coloca en una cavidad de la placa y se trata con los reactivos adecuados; esta placa suele ser blanca a fin de facilitar la percepcin del color obtenido en el anlisis. Los anlisis a desarrollar en la prctica son: 1.- Anlisis de Morfina, Herona, Codena, Cocana, Anfetaminas Preparacin de Reactivos. Reactivo de Marquis: Mezclar 1 ml de Acido Sulfurico y 3 gotas de Formaldehdo. Se utiliza 2 gotas Acido Nitrico: Se utiliza Puro 1 gota
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Tiocianato de Cobalto: Se utiliza 2 a 3 gotas Cloruro de Cobalto 1 g Tiocianato de Potasio 1,5 g Acido acetico: 10 ml Agua: 90 ml Reactivo de Simon Adicionar 2 gotas de carbonato de sodio diluido a Nitropruiato de Sodio al 1%. Depositar 2 gotas de esta solucin en contacto con la anfetamina ANALISIS E INTERPRETACION DEL COLOR Sustancia Tiocianato de Cobalto o Scott AZUL DE PRUSIA AZUL DE PRUSIA Acido Ntrico Reactivo de MARQUIS Prueba de Simn

Cocana Herona Anfetaminas

INCOLORO Pasa de amarillo a verde MORADO O VIOLETA Verde Amarillento

Morado

2.- Anlisis de Cannabinoides: El Cannabis normal contiene habitualmente entre 0,5 a 5% de THC dependiendo de las diferentes tcnicas de cultivo (desde el cultivo en huerta, pasando por el cultivo en macetas (luz natural o artificial) hasta el cultivo hidropnico). Las variedades desarrolladas por los bancos de semillas tienen un nivel de THC ms alto, llegando las variedades ms potentes al 24% de THC. El contenido en THC depende de la gentica de la planta y de las condiciones ambientales en las que se desarrolla, siendo los polihbridos comerciales los que alcanzan mayores concentraciones de alcaloides. Prueba de FAST BLUE B AZUL SLIDO B: 1. Prepare el reactivo usando la sal FAST BLUE B marca sigma al 0,2 % en solucin de Hidrxido de Sodio 1N como el reactivo es poco estable preprela solo en el momento de realizar la Prueba. 2. Extraer la muestra con alcohol, ter, cloroformo, o cualquier solvente orgnico. 3. Colocar una gota del extracto sobre un papel de filtro y dejar secar. 4. Sobre la muestra o al lado colocar una gota del reactivo y dejar correr hasta que hagan contacto reactivo y muestra. 5. Aparece un color Rojo- violceo o Rojo morado si es positivo. 6. Hacer un control negativo con picadura o de cigarrillo.

Duquenois + Levine: .- Vainillina 2 gramos + Formaldehdo 3 mL en Etanol, 100 mL. .- Cloroformo.


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Tratamiento de la Muestra: 200 mg. de la muestra con 25 ml. de ter de petrleo, filtrar y evaporar a sequedad en bao de mara, luego agregar 2 ml. de reactivo de Duquenosis. Agregar 2 ml. de HCL y dejar en reposo por 10 minutos. Adicionar Cloroformo 2 mL. Observar el color generado.

Procedimiento: .- Colocar la muestra o extracto de muestra (Eter de petroleo) 2 mL. .- Adicionar 0.5 mL de reactivo Duquenois, a la muestra. .- Adicionar 0.5 mL de Acido Clorhdrico (10 M) y agitar suavemente. Observar el color. .- Adicionar Cloroformo y notar si el color aparece. (azul verdoso). Interpretacin: Cambio de color de Gris ---- Azul ----violeta. = Cannabinoides.

BIBLIOGRAFIA: 1. .- http://www.tuotromedico.com/temas/drogas_cannabis.htm 2. .- http://es.wikipedia.org/wiki/Cannabis_%28drogas 3. .- Clarkes Isolatin and identificatin of drugs The farrmaceutical Pres. London 1999, pag 113

3.- Anlisis de cocana: Prueba del Tiocianato de Cobalto: (Prueba de Scott) Color azul = positivo para alcaloide Confirmar adicionando acido ntrico a la misma sustancia incoloro Positivo para Cocaina

4. ANFETAMINAS La molcula de la anfetamina est emparentada estructuralmente con el alcaloide vegetal efedrina. Fue precisamente la efedrina, el sustrato usado inicialmente como reactivo para la obtencin del nuevo compuesto. Como la efedrina, la anfetamina es tambin un agente con propiedades para mimetizar la accin de la hormona adrenalina y activar el sistema nervioso simptico, es decir, se trata de una amina simpaticomimtica. Sin embargo, la segunda molcula logra atravesar mucho ms eficazmente la barrera hematoenceflica, lo que explica su capacidad distintiva de estimular el sistema nervioso central. Esto ltimo habilita su clasificacin como amina simpaticomimtica de accin central PRUEBAS INDIRECTAS : Porcentaje de error 25%

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MATERIAL: Tira reactiva para determinar marihuana y cocana MATERIAL BIOLGICO: Orina TCNICA: 1.- Abra el sobre metalizado e inmediatamente escriba el nombre del paciente en la zona de identificacin ID y fecha. 2.- Abra el cassette dejando al descubierto las partes inferiores de las tirillas. 3.- Sumerja en la muestra de orina los cojines de absorcin a fin de que cada tirilla pueda absorber durante por lo menos 10 segundos suficiente muestra. Si as lo prefieres, puede mantener la prueba en contacto con la muestra hasta el final del proceso (mximo 5 minutos). RESULTADOS: Muestra de orina: Positiva para Cocana Negativa para Marihuana ESQUEMAS:

CONCLUSIONES: Se trata de un examen para evaluar el tipo y la cantidad aproximada de drogas legales e ilegales que una persona ha consumido. Este examen puede emplearse para evaluar posibles sobredosis o intoxicacin accidental o intencional, como cuando existe la necesidad de evaluar el tipo y cantidad de droga legal o ilegal utilizada por una persona. Este examen puede emplearse para determinar la causa de toxicidad aguda por drogas, para vigilar la frmacodependencia y para determinar la presencia de sustancias en el cuerpo (para propsitos mdicos y/o legales). La presencia de drogas ilegales o drogas no recetadas es indicio de drogadiccin. Este Procedimiento debe Confirmarse por otro mtodo Dadas las inteferencias que presenta. Bibliografa: http://www.telemedik.com/articulos.php?id=120 http://es.wikipedia.org/wiki/Cannabis_sativa
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