2013

Valoracin de tabletas de Naproxeno Sdico de 550mg

Equipo: 3 CANALES ZARAGOZA EVA ITZEL CUAUTLA VARGAS OLGA LIDIA LPEZ VALDEZ ENRIQUE MONTESINOS CASARREAL KARINA TLLEZ ESCRCEGA LUZ DEL CARMEN Doctora: MARIA LUISA MARGARITA VAZQUEZ RAMIREZ Doctora: LILIANA SCHIFTER ACEVES

INTRODUCCION Mxico es un pas latinoamericano en vas de desarrollo, cuyos habitantes no cuentan con la capacidad econmica de adquirir medicamentos originales o fabricados bajo patente, quienes se ven en la necesidad de buscar formas ms accesibles para superar sus problemas de salud. Una de stas es la compra de medicamentos denominados como genricos intercambiables, etiquetados con el nombre del principio activo o con un nombre de marca, pero sin ser una copia fiel de la formula avalada por el laboratorio del medicamento de patente, los cuales generalmente son de menor costo, es por ello que juegan un papel primordial en el apoyo para poder solventar la necesidad de medicamentos que requiere la poblacin. La calidad del medicamento genrico no depende nicamente de la presencia del principio activo en la forma farmacutica, sino que depende de la forma de liberacin as como tambin de la forma de absorcin del principio activo; siendo entonces muy importante la bioequivalencia que el medicamento tenga con respecto al medicamento original o de patente conocindose como intercambiabilidad. El procedimiento a utilizar es mediante un procedimiento in vitro como lo es el perfil de disolucin de un medicamento en donde se comparan la liberacin del principio activo de las distintas marcas genricas mediante varias lecturas a distintos lapsos de tiempo. Determinando la intercambiabilidad de los genricos por medio del clculo del factor de diferiencia (f1) y el factor de similitud (f2) de cada marca. Este procedimiento es sumamente importante para medicamentos en los que la concentracin y la liberacin del principio activo influyen de gran forma en la efectividad del frmaco, Para esto, las muestras de las marcas genricas, fueron trabajadas en un disolutor de seis vasos, tomando alcuotas y analizndolas en un espectrofotmetro ultravioleta-visible, pudiendo as cuantificar la cantidad de Naproxeno sdico disuelta en cada alcuota y a cada intervalo de tiempo, realizando con estos valores una curva de disolucin y pudiendo calcular el factor de similitud entre las marcas genricas. La validacin del mtodo analtico es parte integral del sistema de control de calidad, puesto que confiere fiabilidad a los resultados analticos obtenidos en un laboratorio de anlisis, a fin de asegurar que un medicamento cumpla los parmetros de calidad establecidos. En este trabajo presentamos la validacin de un mtodo analtico de valoracin de principio activo Naproxeno utilizando los parmetros de la Farmacopea Britnica. Los parmetros estadsticos empleados en la validacin son: La linealidad; que mide la capacidad del mtodo analtico para producir

resultados que son proporcionales a la concentracin del analito. La exactitud mide la proximidad de los resultados obtenidos por este mtodo y el valor real. La precisin del mtodo analtico es el grado de concordancia o de dispersin de los resultados de la prueba. Los valores de RSD obtenidos, (0.17% para repetibilidad y 0.16% para precisin intermedia), nos demuestran la precisin del mtodo analtico donde el valor mximo permitido es un RSD = 2.0%. El control de calidad y la garanta de calidad juegan un papel central para asegurar la fiabilidad y reproducibilidad del mtodo analtico utilizado en su obtencin y esta demostracin debe estar debidamente documentada con el detalle de la preparacin de las muestras efectuadas y datos obtenidos. Este tema ha sido objeto de diversos estudios desde hace aos y es recomendado por diferentes organismos de carcter oficial; desde la Federal Drug Administration (FDA) en 1976 con su primer concepto en la revisin de las normas correctas de fabricacin al considerar los procesos de esterilizacin. Siete aos despus, esta misma entidad establece directrices de tipo informativo, que orientan hacia la validacin de procesos en un sentido ms amplio. Consiste de la importancia del tema, otras entidades como la OMS la OAC y la ICH, adems la Farmacopea Europea y la USP 23 consignan la ineludible necesidad de la validacin en los procesos analticos. La validacin, por lo tanto, forma parte importante en un programa de aseguramiento de la calidad y es fundamental para una eficiente operacin de produccin.

MARCO TEORICO.

-NAPROXENO (NAP).
Naproxeno
cido (S)-2-(6metoxi-2naftil)propanoico

Formula qumica Peso molecular Vida media Biodisponibilidad Metabolismo Punto de fusin Solubilidad en Agua

C14H14O3 230.26 12 horas 100% Heptico Propiedades fsicas 153 C Insoluble (pH<4), Soluble (pH>6)

Es un antiinflamatorio de la familia de los AINE's, que adems posee actividad analgsica y antipirtica, a diferencia de los analgsicos opiceos, no posee capacidad significativa para producir adiccin. El NAP es ampliamente empleado en nuestro medio y es administrado generalmente por la va oral (en tabletas, cpsulas y suspensin), por lo cual despus de ser liberado de su sistema de entrega, es absorbido a nivel de las membranas del tracto gastrointestinal para pasar a la circulacin sangunea y posteriormente dirigirse hacia el sitio blanco para ejercer su accin. Adems, se presenta en formas farmacuticas de uso tpico (gel), y como solucin inyectable para administracin por va intramuscular, lo cual involucra en el primer caso, el hecho de atravesar varias barreras de la piel, y en el segundo caso, la creacin de un depsito en los tejidos, desde el cual el NAP debe difundir para producir su efecto farmacolgico. De esta manera, durante su recorrido el frmaco debe pasar por una sucesin de fases acuosas y lipdicas que se encuentran en el organismo. Procesos en los cuales el coeficiente de reparto es una propiedad fisicoqumica de gran relevancia.

-NAPROXENO SDICO (NAPS). FORMULA ESTRUCTURAL ESQUEMA N1

Nombre qumico : (S) -6-Metoxi-alfa-metil-2-Naftalenacetato(-)-Sdico Frmula molecular : C14H13NaO3 Peso molecular : 252,24 g/mol. Rotacin especfica : -15,3 - -17,0 Punto de fusin : 255C con descomposicin Caractersticas : El Naproxeno Sdico es un polvo cristalino blanco a ligeramente cremoso, soluble en agua y metanol, ligeramente soluble en alcohol y ligeramente soluble en acetona y prcticamente insoluble en cloroformo y tolueno. El Naproxeno Sdico es un frmaco sinttico, miembro de la familia de los AINES con un grupo cido arilactico, acta inhibiendo la sntesis de prostaglandinas, pero su mecanismo exacto de actuacin es desconocido. Por ser muy soluble en agua, es rpida y completamente absorbido en el tracto gastrointestinal luego de su administracin oral y por ello se obtienen niveles plasmticos adecuados que permiten iniciar el alivio del dolor dentro de 20 minutos de su administracin oral. Los niveles plasmticos se obtienen dentro de 1 a 2 horas dependiendo de su administracin con alimentos. Se une muy bien a la albmina por lo tanto tiene una vida media ms larga en sangre que otros analgsicos, llegando hasta 12 horas por dosis, la mxima concentracin en la sangre tiene lugar el tratamiento a las 2-4 horas tras la ingestin. El Naproxeno Sdico no deprime el sistema nervioso central, por no ser narctico ni inductor del metabolismo enzimtico. Es empleado en el dolor suave a moderado, la fiebre, la inflamacin y rigidez provocado por afecciones como la osteoartritis, artritis rematoidea, artritis psoritica,

espondilitis anquilosante, lesiones, calambres menstruales, tendinitis , bursitis y en el tratamiento de la disminorrea primaria. El Naproxeno Sdico se metaboliza completamente en el hgado a 6O dimetilnaproxeno, se elimina aproximadamente el 95 % de la dosis de Naproxeno por la orina como Naproxeno inactivado. La excrecin renal tiene correlacin estrecha con la disminucin de las concentraciones plasmticas. Con las heces se excreta tan solo el 3 % o menos. Las reacciones adversas con incidencia mayor del 1% pueden clasificarse como: gastrointestinales (4-16%) (p. ej. nuseas, dolor epigstrico, pirosis, diarrea, malestar abdominal, vmitos, indigestin, constipacin y clicos o dolores abdominales), del SNC [p. ej., mareos ( del 3 al 9%), cefaleas, nerviosismo y tinnitus], dermatolgicos [ p.ej. rash ( del 3 al 9%) y prurito], y metablicos ( p.ej., disminucin del apetito, edema y retencin de lquidos). Los efectos adversos con una incidencia menor del 1 % son: gastrointestinales (lcera gstrica o duodenal con hemorragia o perforacin), dermatolgicos (erupciones vesiculobullosas, urticaria y eritema multiforme), del SNC (depresin o insomnio), sentidos especiales [ambliopa (visin borrosa o disminuida, escotomas u otros cambios visuales)], hematolgicos (leucopenia y disminucin de la hemoglobina y el hematocrito); y cardiovasculares (insuficiencia cardiaca congestiva en pacientes con funcin cardiaca inestable y aumento de la presin arterial). se han informado otras reacciones, pero en circunstancias en las cuales no pudo establecerse una relacin causal.

VALIDACIN Mtodo analtico por el cual se establece, por medio de estudio de laboratorio, que las caractersticas de desempeo del mtodo renen los requisitos para las aplicaciones analticas concebidas. Las caractersticas de desempeo se expresan en funcin de los parmetros analticos que sern descritos ms adelante. Nos interesa mantener un mtodo que sea estable. Un mtodo validado nos da la seguridad de ello, dado que estas caractersticas son esenciales para mantener altos niveles de calidad en los resultados del anlisis. - Validando aseguramos que se cumpla con los requerimientos preestablecidos, confirmando su precisin y exactitud. - Tambin validando aseguramos que las modificaciones de las condiciones normales de ensayo y medio ambiente operacional no afecten negativamente el resultado final.

-Obtenemos un control de los puntos crticos del ensayo y poder as prevenir y evitar resultados errneos que afecten la calidad de anlisis.

-PARMETROS DE VALIDACIN DE MTODOS ANALTICOS Las caractersticas de desempeo de un mtodo analtico se expresan en funcin de los parmetros analticos. Estos parmetros analticos considerados en la validacin son los siguientes: - Precisin - Exactitud - Lmite de Deteccin - Lmite de Cuantificacin - Especificidad - Selectividad - Sensibilidad - Linealidad - Rango -PRECISIN Cuando un mtodo analtico es exacto y lineal, la variabilidad de un resultado analtico se debe a factores aleatorios, como la incertidumbre de las mediciones debidas a : la balanza analtica, material graduado material volumtrico, instrumento de medicin de la respuesta analtica, corridas analticas, analistas laboratorios, lotes de reactivos etc. Estos factores se pueden clasificar en factores aleatorios intramtodo se mide en trminos de repetibilidad, la reproducibilidad intralaboratorio se mide en trminos de la precisin intermedia, la reproducibilidad intralaboratorios se mide en trminos de estudios colaborativos. La precisin de un mtodo analtico es el grado de concordancia relativa entre los resultados obtenidos al aplicar el mtodo analtico, bajo las mismas condiciones analticas (repetibilidad) o bajo diferentes condiciones analticas (reproducibilidad), utilizando una muestra homognea. La precisin de un mtodo analtico generalmente se expresa como la desviacin estndar o como el coeficiente de variacin (desviacin estndar relativa). -EXACTITUD. La exactitud del mtodo debe ser determinada a todos los mtodos de carcter cuantitativo.

La exactitud de un mtodo analtico, es la concordancia absoluta entre el resultado obtenido con el mtodo y la cantidad verdadera del analito presente en la muestra a una cantidad fija. Determinacin de la exactitud en los mtodos analticos comprendidos en la categora I. En el estudio de laboratorio la exactitud, puede determinarse por la aplicacin del mtodo, a placebos o muestras adicionales preparados de manera independiente al menos por sextuplicado obtenidas de acuerdo a un conocimiento especfico, dichas muestras deben contener todos los componentes del proyecto y adems adicionar la concentracin del analito que represente el 100%. si no es posible obtener muestras que contengan todos los componentes del producto, la exactitud puede determinarse por comparacin de los resultados obtenidos aplicando el mtodo en estudio, con los resultados obtenidos al aplicar un segundo mtodo que haya sido bien caracterizado y cuya exactitud o definida con muestras que sean representativas del 100% del analito.

En el anlisis cuantitativo de impurezas la exactitud debe ser evaluada en muestras , al menos por sextuplicado, del principio activo (frmaco) o del producto farmacutico a las que se les han adicionado cantidades conocidas y fijas de impurezas de acuerdo a la especificacin. Cuando no es posible obtener muestras de ciertas impurezas o de los productos de degradacin, los resultados deben ser comparados con los obtenidos por un mtodo independiente. Anlisis de datos. La exactitud se evala mediante el porcentaje de recobro (cociente porcentual de la concentracin recuperada entre la concentracin adicionada) considerando los resultados del anlisis de las muestras. La diferencia entre el valor de la medida aritmtica del porcentaje de recobro y el valor verdadero aceptado.

-LINEAILIDAD. La linealidad del sistema es la verificacin de que la respuesta analtica y la concentracin del analito (puede ser una sustancia de referencia) se ajustan al modelo matemtico, en un intervalo de concentraciones pertinentes a la aplicacin analito.

CALIDAD BIOFARMACEUTICA. La biodisponibilidad sistmica de un frmaco depende de la fraccin absorbida y del metabolismo intestinal o heptico que pueda darse . Esta fraccin absorbida corresponde a la cantidad de frmaco que pasa del lumen intestinal al torrente sanguneo y que puede ser obtenida a partir de las concentraciones plasmticas por diferentes mtodos matemticos como los de Wagner-Nelson, Loo-Riegelman y de deconvolucin o estimadas a partir de valores de permeabilidad . Este paso del frmaco del sitio de administracin a la sangre involucra su absorcin, definida a su vez por los procesos de disolucin y permeacin del mismo. Existen muchos factores del tracto gastrointestinal (TGI) que limitan tanto la velocidad de disolucin de un frmaco como su velocidad de permeacin. Esto es especialmente crtico para frmacos poco solubles en agua, para los cuales la solubilidad puede verse influida por variables como el volumen de los fluidos gastrointestinales, el pH y la presencia de sales biliares y alimentos. Incluso el vaciado gstrico y el trnsito gastrointestinal son aspectos importantes que se han de considerar al hablar de la absorcin de frmacos. Tratando de simplificar el ambiente complejo que constituye el TGI, Amidon y cols. realizaron estudios que soportan su anlisis en uno de los pilares bsicos de este sistema que es la Primera Ley de Fick : Jw =Peff *Cw En la que: Jw: Transporte de masa a travs de la pared intestinal (masa / rea * tiempo). Peff: Permeabilidad efectiva (distancia / tiempo). Cw: Concentracin del frmaco en la membrana (masa / volumen). Esta ley refleja la velocidad de absorcin de un frmaco en cada punto de la membrana intestinal, en condiciones de sink (de no saturabilidad). Considerando la superficie total gastrointestinal:

(E2)

En la cual: A = rea superficial. La doble integral representa la superficie total gastrointestinal. Expresndolo en trminos de cantidad absorbida (M) a tiempo t: ( )

(E 3)

A partir de las Ecuaciones 1 y 2 se puede establecer el siguiente principio de biodisponibilidad: Si dos medicamentos, contienen el mismo frmaco y el mismo perfil de concentracin a lo largo del tiempo, en la superficie de la membrana intestinal, se podr decir que presentarn la misma velocidad de absorcin y de cantidad de frmaco absorbido. El cual, adems, implica que: Si dos medicamentos tienen el mismo perfil de disolucin in vivo, en todas las condiciones luminales, ellos presentarn la misma velocidad y cantidad de frmaco absorbido. Estos principios generales suponen que no hay otros componentes en la formulacin que afecten la permeabilidad de la membrana o el trnsito intestinal, o ambos.

-SISTEMA DE CLASIFICACIN BIOFARMACUTICA (SCB) De acuerdo con el SCB, los frmacos se pueden clasificar en cuatro categoras, basados en su solubilidad y permeabilidad, como se presenta en la Tabla 2. Tabla 2. Clasificacin de los frmacos de acuerdo con el SCB. CLASE I II III IV SOLUBILIDAD ALTA BAJA ALTA BAJA PERMEABILIDAD ALTA ALTA BAJA BAJA

Segn sea la solubilidad o la permeabilidad del frmaco el factor limitante, se define cul de ellas determina el proceso de absorcin, lo cual permite relacionar la clasificacin del frmaco con la posibilidad de establecer correlaciones in vitro-in vivo (CIVIV). Al momento de realizar la clasificacin se deben conocer los lmites a los que se hace referencia en cada uno de los casos, tanto para la solubilidad como para la permeabilidad y que se encuentran establecidos en las guas de la FDA y en el anexo 7 del informe 40 de la OMS: - Solubilidad: se considera de alta solubilidad, cuando el frmaco en su mayor dosis (recomendada por la OMS o disponible en el mercado como forma slida oral) es soluble en 250 mL o menos de medio acuoso en un rango de pH de 1,2 - 7,5, segn la FDA, y de 1,2 - 6,8, segn la OMS. - Permeabilidad: se clasifica como altamente permeable, si la cantidad absorbida en humanos es mayor al 85%, segn la OMS, y 90%, segn la FDA. Al igual que los otros AINE's, el naproxeno es uno de los frmacos ms utilizado y de acuerdo a sus propiedades fisicoqumicas, sus caracteristicas farmacologicas y su aplicacin terapeutica, el naproxeno se encuentra en la clase , es decir, se considera que tiene baja solubilidad y alta permeabilidad.

MEDICAMENTOS GENERICOS (INTERCAMBIABILIDAD) La Norma Oficial Mexicana NOM-177-SSA1-1998, que establece las pruebas y procedimientos para demostrar que un medicamento es intercambiable. En ella se indican los criterios y requisitos para la evaluacin de perfiles de disolucin de formas farmacuticas orales de liberacin inmediata el cual se puede realizar de manera in vitro, los criterios y requisitos para realizar las pruebas de bioequivalencia en humanos y, tambin los criterios y requisitos para el anlisis de muestras biolgicas de una prueba de bioequivalencia estos dos ltimos se realizan de manera in vivo. En lo que se refiere al perfil de disolucin, los criterios en nuestro pas son los siguientes:

a) En el estudio se deber realizar con 12 unidades, tanto del medicamento de prueba como del de referencia, en las mismas condiciones experimentales. b) Se debe registrar por escrito el mtodo de evaluacin del perfil de disolucin, incluyendo: condiciones experimentales (medio de disolucin, aparato utilizado, velocidad de agitacin, mtodo de anlisis, tiempo de muestreo y frmula de clculo). c) Las condiciones experimentales para realizar la comparacin del perfil de disolucin deben ser las establecidas por la FEUM. d) deben seleccionarse por lo menos cinco tiempos de muestreo (excepto el tiempo cero). e) El volumen extrado puede o no reemplazarse. Cuando no se reemplace el volumen, no se debe extraer ms del 10% del medio de disolucin. Evaluacin de perfiles de disolucin. a) El porcentaje disuelto debe calcularse con respecto a la dosis nominal del frmaco. b) Se deben reportar los porcentajes disueltos a cada tiempo de muestreo en cada unidad de dosificacin, as como los porcentajes disueltos promedio, los coeficientes de variacin y los valores mximo y mnimo. c) Se deben graficar los porcentajes disueltos promedio y los de cada unidad de dosificacin contra el tiempo. d) Si el coeficiente de variacin del porcentaje disuelto es menor o igual que el 20% para el primer tiempo de muestreo y menor o igual que el 10% para los tiempos subsecuentes, se comparan los perfiles de disolucin usando el factor de similitud (f2) definido en la siguiente ecuacin: f2 = 50 Log { [1 + (1/n) S (Rt Pt)2]-0.5 x 100 Para comparar los perfiles de disolucin, se utiliza un factor de diferencia (f1) y un factor de similitud (f2). El factor de diferencia calcula la diferencia porcentual (%) entre las dos curvas en cada punto temporal y es una medida de error relativo entre las dos curvas: f1 = *, )- , -+( ) (

DISOLUCIN. La prueba de disolucin aparente, tambin denominada de disolucin, es un mtodo para medir la liberacin de un principio activo, a partir de la forma de dosificacin que lo contiene y la disolucin de ste, en el medio de prueba. La prueba de disolucin, implica una serie de variables de origen diverso que afectan el patrn de flujo hidrodinmico en la interfaz slidolquido, el cual a su vez, es determinante en la velocidad de disolucin y en la obtencin de resultados reproducibles de la prueba. Por lo anterior, es de suma importancia la calificacin o evidencia documentada, de la calibracin mecnica del aparato realizada por personal capacitado y entrenado para ello y con una serie de herramientas e instrumentos cuya calibracin y funcionamiento sean trazables a un patrn de referencia sea nacional o internacional, mediante un certificado de calidad, o en su caso, la documentacin pertinente de un laboratorio acreditado. Este MGA se emplea para determinar el cumplimiento de los requisitos de disolucin en estas tabletas. Se uso el aparato 2 descrito en la monografa el cual corresponde al equipo Hanson Research modelo sr6 de paletas, consta de 6 vasos cilndricos de plstico con tapa, seis ejes transmitores, un regulador de velocidad de rotacin y seis paletas. Llamado tambin "mtodo de la paleta", emplea el mismo equipo, a excepcin del canastillo el cual es reemplazado por una paleta de 4 mm 1 mm de espesor y una altura de 19 mm 0.5 mm, recubierta por un polmero fluorocarbonado para impedir el contacto del metal con el lquido de disolucin. La paleta va sumergida en el lquido de disolucin y las especificaciones indican que la parte inferior de stas debe quedar a 2,5 cm del fondo del vaso. Segn la FEUM, para realizar el ensayo en Naproxeno Sdico, debe utilizarse SA de fosfatos y llevarlo a una temperatura de 37C + 0,5C. Se coloca un comprimido en el vaso, teniendo cuidado de evitar la formacin de burbujas de aire en la superficie de la forma farmacutica y operar inmediatamente a la velocidad de 50 rpm. A tiempos preestablecidos se saca una alcuota en una zona intermedia entre la superficie del lquido de disolucin y la parte superior del canastillo o de la paleta y a no menos de 1 cm de la pared del vaso. A menos que se especifique otra cosa, debe agregarse igual volumen de medio de disolucin que la muestra retirada. Las muestras de lquido se analizan para determinar la cantidad disuelta. Este ensayo debe ser conducido sobre 6 comprimidos.

UNIFORMIDAD DE PESO Y CONTENIDO Los requerimientos de las farmacopeas en lo que se refiere a la variacin de peso se especifican con el porcentaje de desviacin del peso medio terico de una muestra de comprimidos. Los lmites de tolerancia estn asociados con unos mrgenes preestablecidos de pesos. As, de acuerdo a la Farmacopea Europea, se pesan un total de 20 comprimidos y se establece unos valores lmites de aceptacin: PESO DEL COMPRIMIDO 80 mg 80 -250 mg 250 mg DESVIACIN MXIMA PARA 18 COMPRIMIDOS 10% 7.5% 5% DESVIACIN MXIMA PARA 20 COMPRIMIDOS 20% 15% 10%

La uniformidad de peso no siempre supone una uniformidad en el contenido de principio activo, en especial cuando ste constituye una parte minorista de la formulacin. Cuando un comprimido contiene aproximadamente el 90% del principio activo, se establece una buena correlacin lineal entre peso del comprimido y contenido del frmaco. Sin embargo, cuando el contenido de principio activo es bajo, por ejemplo, de solo un 23% del peso del comprimido, la relacin es mucho menos significativa. Por ello, excepto cuando dicho contenido sea superior al 90%, segn la USP XX-XF XV, deben realizarse sobre los comprimidos ensayos que verifiquen la uniformidad de contenido de principio activo. Esta prueba exige el anlisis individual de 10 comprimidos, previa pulverizacin, que debern contener el 85-115% de frmaco declarado. Si uno de ellos sale fuera de este margen, pero se mantiene en los lmites de 75-125%, el ensayo se continuar con 20 comprimidos ms, todos los cuales debern quedar dentro del intervalo de tolerancia del 85-115% para que el lote sea aceptado. Para algunos frmacos concretos, las farmacopeas establecen lmites especficos en sus monografas. Segn la FEUM en el MGA 0299. El mtodo de uniformidad de contenido se basa en la determinacin cuantitativa del contenido individual del principio activo en un cierto nmero de unidades de formas farmacuticas dosis nica, para determinar si la variacin de los contenidos individuales est dentro de los lmites establecidos. Procedimiento para la uniformidad de contenido.

Se analizaron individualmente 5 unidades de dosis. (En la valoracin se utilizaron 5 tabletas por lo cual son las mismas unidades que se utilizaron en esta prueba). Se calcul el contenido de principio activo equivalente a una unidad de dosis promedio y se calcul la desviacin estndar. Expresin de resultados Se cumplen con los requisitos de uniformidad de dosis si el valor de aceptacin que L1%. Si el valor de aceptacin es mayor que L1%, analizar las siguientes 20 unidades y calcular el valor de aceptacin final de las 30 unidades de dosificacin es menor o igual que L1%, y si el contenido individual de ninguna unidad de dosificacin es menor que (1-L2 * 0.01) M; ni mayor que (1+L2% * 0.01) M como se especifica el Clculo del Valor de Aceptacin en Uniformidad de contenido o en Variacin de masa. A menos que se indique otra cosa en la monografa individual, L1=15.0 y L=25.0.

OBJETIVO GENERAL. Evaluar la calidad de dos productos genricos puestos ya a la venta, demostrar que estos cumplen con la cantidad de principio activo que indica el marbete y los requerimientos de acuerdo a la monografa.

OBJETIVO PARTICULAR. - Desarrollar un esquema para la validacin, con exigencias de linealidad, exactitud y precisin. - Demostrar la validez de la metodologa y verificar los parmetros de aceptabilidad para validar la tcnica en funcin de los criterios de la BP, estableciendo un protocolo de validacin por espectrofotometra UV/visible. - Cuantificar por diferentes mtodos la calidad, eficacia y seguridad de los dos medicamentos genricos.

HIPOTESIS. - Verificar que lo establecido en el marbete de los dos medicamentos genricos se cumpla con las especificaciones segn lo que marca la FEUM y la BP y que los mtodos ocupados cumplan con los parmetros de linealidad, precisin y exactitud.

METODOLOGIA: -VALIDACIN. -Muestra del principio activo de Naproxeno en el sistema. La preparacin de la muestra se realiz utilizando los parmetros de la Farmacopea Britnica. 1.-Se realiz el clculo de la concentracin del estndar y se hicieron diluciones para la linealidad, un punto arriba y un punto debajo de la concentracin correspondiente al estndar.

2.-Para preparar el estndar, se pesaron 12.5 mg de principio activo de Naproxeno y se traspas a un matraz volumtrico de 25mL, se disolvi y se llev al aforo con metanol. 3.-A partir de la concentracin del estndar se hicieron los clculos correspondientes para tomar las alcuotas de las diluciones y llevarlas al aforo de 10 mL con metanol.

4.- Para realizar la curva de calibracin se realizaron las diluciones por triplicado. 5.- Para la precisin se realiz 6 veces la dilucin del estndar. 6.-Se ley en el espectrofotmetro a 331 nm. -Muestra de Naproxeno (p.a. y tabletas 500mg) 1.- Se pesaron 6.25 mg de p.a. y 7.79 mg de polvo (tabletas de Naproxeno) que es el equivalente a 6.25 mg del p.a. ( )( )

2.- Se vertieron en un matraz volumtrico de 25 mL y se aforaron con metanol. 3.- Para realizar la curva de calibracin y la precisin se repite el mismo procedimiento, disolviendo con las mismas alcuotas y al mismo aforo.

-VALORACION:

-Estandar. 1.-Se peso 25 mg de p.a. Naproxeno Sdico. 2.-En un matraz volumtrico de 50 mL se verti el polvo y se le agregaron 35 mL de metanol, se puso en agitacin durante 30 minutos para disolver y se llev a volumen con Metanol. 3.-Se tom una alcuota de 1 mL de esta solucin y se trasvaso a un matraz volumtrico de 10 mL llevando a aforo con Metanol. Esta disolucin se realiz por duplicado y se ley en el espectrofotmetro a 331 nm.

-Muestras. 1.-Se pesaron 5 tabletas de Naproxeno sdico (2 marcas de genricos distintos), se trituraron y se tom el equivalente a 25 mg de principio activo.

Naproxeno Sdico

Bixen

PESO DE TABLETAS (mg) Naproxeno sdico 765.2 764.2 754.2 758.3 764.3 Promedio 761.2 Bixen 741.9 735.2 729.4 744.0 741.8 Promedio 738.46

2.-En un matraz volumtrico de 50 mL se verti el polvo y se le agregaron 35 mL de metanol, se puso en agitacin durante 30 minutos para disolver y se llev a volumen con Metanol. 3.-Se tom una alcuota de 1 mL de esta solucin y se trasvaso a un matraz volumtrico de 10 mL llevando a aforo con metanol. Esta disolucin se realiz por duplicado y se ley en el espectrofotmetro a 331 nm. -DISOLUCIN. -SA de Fosfatos 0.1 M pH 7.0

1.-Se pesaron 2.62 g de fosfato monobsico de sodio y 11.5 g de fosfato dibsico de sodio anhidro, pasar a un matraz volumtrico de 1 L, disolver y aforar con agua desionizada. 2.-Se prepararon 12 L de esta solucin amortiguadora. -Estndar. 1.-Se pesaron 10 mg de p.a. Naproxeno Sdico y se verti en un matraz volumtrico de 25 mL llevando a aforo con SA de fosfatos, obteniendo una concentracin de 400 g/mL.
. /( )

2.-Se tom una alcuota de 1.25 mL y se llevo a aforo de 10 mL con SA para obtener una concentracin de 50 g/mL.
. /( )

-Muestras. 1.-Se colocaron 900 mL de SA de fosfatos en cada vaso del disolutor y se llevo a una temperatura de 37C. 2.-Una vez llegada a esa temperatura en cada vaso se coloco una tableta de Naproxeno Sdico 550 mg y se acciono el equipo a 50 rpm durante 45 min en intervalos de 15 min. 3.-Cada 15 min se extrajo 4 mL de muestra filtrada. 4.-Se tomo una alcuota de 1 mL de la muestra extrada y se llevo a aforo de 10 mL con SA de fosfatos. 5.-Se determino la absorbancia de la SRef y la preparacin de la muestra a una longitud de onda de 331 nm ajustando con un blanco (SA de fosfatos) * Este procedimiento se realizo nuevamente con las tabletas de Naproxeno Sdico de 550 mg Bixen. -UNIFORMIDAD DE CONTENIDO. -Estndar. 1.-Se peso 12.5 mg de p.a. Naproxeno Sdico y se llevo a aforo de 25 mL.

2.-Se tomo una alcuota de 1 mL y se aforo a 10 mL, obteniendo una concentracin de 50 mg/mL. -Muestras. 1.-Se pesaron individualmente 5 tabletas de Naproxeno Sdico y Bixen. 2.-Cada tableta se coloco en un matraz volumtrico de 50 mL, aadiendo metanol para disolverla. 3.-Una vez disuelta se aforo con este mismo disolvente. 4.-Se filtro desechando los primeros mililitros y se tomo una alcuota de 1 mL llevando a aforo de 25 mL. 5.-De esta disolucin se tomo 1.2 mL y se aforo a 10 mL realizando este ltimo paso por duplicado. Las 10 disoluciones se leyeron en Espectrofotometra UV/visible a 331 nm con blanco de metanol.

RESULTADOS. - VALIDACIN. Resultados obtenidos para el sistema.

[Naproxeno] 0.04 0.05 0.06

Curva 1 0.3672 0.4496 0.6093

Curva 2 0.3619 0.4155 0.5381

Curva3 0.3623 0.4309 0.5551

Con los datos de la curva se obtiene una curva promedio que se muestra a continuacin.

Curva de calibracion del sistema

Absorbancia promedio. 0.6 0.55 0.5 0.45 0.4 0.35 0.3 0.03 y = 10.185x - 0.0548 R = 0.9649

0.05 [Naproxeno g/mL]

0.07

[Naproxeno] 0.04 0.05 0.06

Con los datos de la curva se obtienen los datos para determinar la prueba de t para la pendiente y el intercepto.

Curva promedio 0.3638 0.4320 0.5675

A B R x y x^2 y^2 xy^2

-0.0548 10.185 0.9649 0.1500 1.3633 0.0077 0.6410 0.0702

Prueba de t para el intercepto y pendiente. Ho: Ha: =0 0 Ho: Ha:

=0
0

T tablas =0 T tablas 0

0.05,1 12.706

t = b-/ pendiente.

t = a-/ intercepto

Sc Total= Sc Regresin= Sc Residual=

0.02150 0.02075 0.00075

(CME)s2(y/x)= S(y/x)=

pendiente=
intercepto=

0.00075 0.02748 1.94278 0.09843 t pendiente= t intercepto= 5.242477704 -0.556933634

Obteniendo as que la pendiente cae en la zona de no rechazo y el intercepto cae en la zona de no rechazo. Se realiza la ANDEVA obteniendo as:
ANDEVA SC CM 0.02074685 0.02074685 0.00075488 0.00075488 0.02150173 0.02150173

F.V. Regresin Error(residual) Total

GL. 1 1 1

FC 27.4835725

F 1/1. 0.05 t= 161.4

La F de tablas obtenida es de 161.4 y la F calculada es de 27.4835 que cae en la zona de no rechazo.

Se determin la precisin con la repeticin de 6 muestras y se obtuvo el promedio, la desviacin estndar y es coeficiente de variacin, y se obtuvieron los siguientes datos:
Precisin del sistema Absorbancias 0.4194 0.4456 0.4192 0.4182 0.4071 0.4212

PROMEDIO DES ESTANDAR C.V.

0.42178333 0.01271510 3.01460371

Resultados obtenidos para el Mtodo.

[Naproxeno] Curva 1 Curva 2 Curva 3 0.04 0.3701 0.3756 0.3846 0.05 0.4538 0.4631 0.4324 0.06 0.5908 0.5983 0.5919

Con los datos de la curva se obtiene una curva promedio y con base en la curva obtenida en el sistema se obtiene la concentracin por dos mtodos, por la ecuacin de la recta y por regla de tres.
y= mx + b Concentracin 0.0424 0.0495 0.0637 Por regla de 3 Concentracin 0.0414 0.0521 0.0628

[Naproxeno] Curva promedio 0.04 0.37677 0.05 0.44977 0.06 0.59367

Ya que la recta presenta variaciones se toman los datos obtenidos con la regla de tres para tener mejores resultados y se obtiene los mg recuperados.
mg = [conc]*afor

[Naproxeno] 0.4 = 0.5 = 0.6 =

Mg Recuperados

0.4143 0.5206 0.6267

As se determina los mg totales y lo que se adiciono de muestra de tabletas y de principio activo. Y con estos datos se obtiene la curva del mtodo.

Curva de calibracion del sistema

0.7000 0.6000 0.5000 0.4000 0.3000 0.2000 0.1000 0.0000 0.3000 Mg adicionados

y = 1.067x - 0.0127 R = 1 0.5000 Mg totales 0.7000

Mg adicionados 0.4000 0.5000 0.6000

Mg recuperados 0.4143 0.5206 0.6277

a b R x y x^2 y^2 xy^2

-0.01269 1.06704 1.00000 1.5000 1.5625 0.7700 0.8366 0.8026

Sc Total= Sc Regresin= Sc Residual= (CME)s2(y/x)= S(y/x)=

pendiente=
intercepto=

2.2772E-02 2.2772E-02 1.0549E-07 1.0549E-07 3.2479E-04 2.2966E-03 1.1635E-03

Prueba de t para el intercepto y pendiente. Ho: =1 Ho: Ha: =0 T tablas = 0.05,1 12.706

Ha: 1 t = b-/ pendiente.

0 T tablas = t = a-/ intercepto

Se realiza la ANDEVA obteniendo as: ANDEVA

F.V. Regresin Error(residual) Total

GL. 1 1 2

SC 2.2772E-02 1.0549E-07 2.2772E-02

CM 0.022771547 1.05489E-07 0.011385826

FC 215865.875

F 1/1. 0.05 t= 161.4

Se determin la precisin con la repeticin de 6 muestras se obtuvo los mg presentes y se clculos el porcentaje de recuperacin con estos datos se obtuvo el promedio, la desviacin estndar y es coeficiente de variacin, y se obtuvieron los siguientes datos:
Absorbancia 0.4488 0.4489 0.4501 0.4585 0.4416 0.4560 mg recuperados 0.05194 0.05196 0.05209 0.05307 0.05111 0.05278 % recuperado 10.3889 10.3912 10.4190 10.6134 10.2222 10.5556 PROMEDIO = DES. ESTANDAR= CV = 10.43171 0.13848 1.32747

-DISOLUCIN.

min 15 30 45

Vaso 1 Cantidad disuelta g 322388.06 600644.78 631817.48

mg 322.39 600.64 631.82

% disuelto 58.616 109.208 114.876

min 15 30 45

Vaso 2 Cantidad disuelta g 293411.514 549635.821 607282.729

mg 293.4115 549.6358 607.2827

% disuelto 53.34755 99.93379 110.41504

min 15 30 45

Vaso 3 Cantidad Disuelta g 266929.6375 522889.5522 615270.7889

mg 266.9296 522.8896 615.2708

% disuelto 48.5327 95.0708 111.8674

min 15 30 45

Vaso 4 Cantidad disuelta g mg 319893.3902 319.89339 489456.7164 489.456716 648744.5629 648.744563

% disuelto 58.1624 88.9921 117.9536

min 15 30 45

Vaso 5 Cantidad disuelta g

mg

486460.5544 486.460554 531677.6119 531.677612 622878.4648 622.878465

% disuelto 88.447 96.669 113.251

min 15 30 45

Vaso 6 Cantidad disuelta g mg 332942.4307 332.942431 520597.0149 520.597015 662248.1876 662.248188

% disuelto 60.535 94.654 120.409

min 15 30 45

Vaso 1 Cantidad disuelta g 226439.23 565874.63 624590.19

mg 226.44 565.87 624.59

% disuelto 41.171 102.886 113.562

min 15 30 45

Vaso 2 Cantidad disuelta g 364605.544 590328.358 623829.424

mg 364.6055 590.3284 623.8294

% disuelto 66.29192 107.33243 113.42353

min 15 30 45

Vaso 3 Cantidad disuelta g 243710.0213 529385.0746 584649.8934

mg 243.7100 529.3851 584.6499

% disuelto 44.3109 96.2518 106.3000

min 15 30 45

Vaso 4 Cantidad disuelta g mg % disuelto 219339.0192 219.339019 39.8798217 569313.4328 569.313433 103.511533 585791.0448 585.791045 106.507463

min 15 30 45

Vaso 5 Cantidad disuelta g

mg

186140.7249 186.140725 598925.3731 598.925373 614700.2132 614.700213

% disuelto 33.844 108.896 111.764

min 15 30 45

Vaso 6 Cantidad disuelta g mg 174434.968 174.434968 552310.4478 552.310448 565440.5117 565.440512

% disuelto 31.715 100.420 102.807

Cinticas de disolucin para tabletas de Naproxeno marca Bixen .

Promedio min 15 30 45

% disuelto 42.161 67.034 78.989 R2

% no disuelto 57.84 32.97 21.01 Orden 0 Orden 1

ln 4.05765 3.49547 3.04504 0.9606 0.9960

Cinticas de disolucin para tabletas de Naproxeno Sdico GI.

Promedio min 15 30 45

% disuelto 25.321 71.126 75.153 R2

% no disuelto 74.679 28.874 24.847 0rden 0 0rden 1

Ln 4.313203 3.362937 3.212719 0.81019 0.85021

Se toma un promedio de los seis vasos para determinar el factor de similitud y diferencia. Obteniendo as:

F2= F1= Bixen Promedio min 15 30 45

49.365017 15.1880 Naproxeno Sodico Promedio Naproxeno. (Tt) min % disuelto 15 25.321 30 71.126 45 75.153

Naproxeno. (Rt) % disuelto 42.16149168 67.03428653 78.98908095

VALOR

ACIN DE NAPROXENO SDICO DE LAS DISTINTAS MARCAS. Se realiz un estndar con una concentracin de 50 g/ml.
Absorbancia 0.3408 [mg/ml] 0.05

Estndar

Con base en el estndar se determin la cantidad de principio y se realiz por duplicado.

Teniendo as:
[Cmuestra] Cantidad de Naproxeno sdico Porcentaje de Naproxeno sdico % 98.67957746 100.9096244

Bixen 1 2

Absorbancia 0.3363 0.3439

mg/ml 0.04934 0.05045

mg 24.6699 25.2274

[Cmuestra]

Cantidad de Naproxeno Sdico Mg 33.6414 34.1843

Naproxeno Sdico 1 2

Absorbancia 0.4586 0.466

mg/ml 0.06728 0.06837

Porcentaje de Naproxeno sdico % 134.5657277 136.7370892

-UNIFORMIDAD DE CONTENIDO:
Absorbancia 0.3408 [mg/ml] 0.05

Estndar

Bixen

[Cmuestra] Absorbancia mg/ml

1 2 3 4 5

0.4035 0.4015 0.3937 0.4263 0.4633

0.059199 0.058906 0.057761 0.062544 0.067972

Cantidad de Naproxeno Sdico.(mg) 616.6557 613.5991 601.6786 651.5001 708.0460 Promedio

Porcentaje De Naproxeno Sdico(%) 112.1192115 111.5634781 109.3961179 118.4545721 128.7356398 116.053804

Des. Es CV

7.851138 6.765084673

Repeticin

[Cmuestra]

Cantidad de Naproxeno Sdico.(mg) 615.12740 593.27318 615.73870 635.60617 632.39681 Promedio Des.Es CV

Bixen 1 2 3 4 5

Absorbancia 0.4025 0.3882 0.4029 0.4159 0.4138

mg/ml 0.059052 0.056954 0.059111 0.061018 0.060710

Porcentaje De Naproxeno Sdico(%) % 111.84134 107.86785 111.95249 115.56476 114.98124 112.44154 3.07094 2.73114

[Cmuestra]

Naproxeno Sdico 1 2 3 4 5

Absorbancia 0.3473 0.3236 0.3575 0.3487 0.3382

mg/ml 0.0510 0.0475 0.0525 0.0512 0.0496

Cantidad Porcentaje de De Naproxeno Naproxeno Sdico.(mg) Sdico(%) cantidad % 530.767 494.547 546.355 532.907 516.860 Promedio Des. Es CV 96.503 89.918 99.337 96.892 93.975 95.325 3.571 3.746

Repeticin

[Cmuestra]

Naproxeno Sdico 1 2 3 4

Absorbancia 0.3302 0.3262 0.3578 0.3462

mg/ml 0.0484 0.0479 0.0525 0.0508

Cantidad Porcentaje de De Naproxeno Naproxeno Sdico.(mg) Sdico. (%) cantidad % 504.6337 498.5206 546.8139 529.0860 91.7516 90.6401 99.4207 96.1974

0.3433

0.0504

524.6540 Promedio Des. Es CV

95.3916 94.6803 3.5419 3.7409

CONCLUSIN. De la Validacin, en el caso del sistema se concluye que tanto el valor del intercepto como la pendiente caen en la zona de no rechazo, por lo tanto, se acepta la Hiptesis Nula, tanto la pendiente como el intercepto son iguales a cero. Posteriormente con el Anlisis de Varianzas y la consecuente comparacin entre la F calculada de valor 27.4835 y la F de tablas de valor 161.4, que nos demuestra que el valor obtenido experimentalmente cae en la zona de no rechazo, con lo cual se acepta la Hiptesis Nula y concluimos que el sistema no representa la variacin de los datos, por lo tanto, no es lineal. Por otro lado se realizo la prueba para determinar la precisin del sistema mediante el Coeficiente de Variacin obteniendo un valor experimental de 3. 01460371% que es >1.5% requerido para cualquier mtodo analtico, con lo cual concluimos que el sistema no es preciso. De la Validacin, en el caso del mtodo se concluye que tanto el valor del intercepto como el de la pendiente caen en la zona de rechazo, por lo tanto, se rechaza la Hiptesis Nula y se acepta la Hiptesis Alterna, la pendiente es diferente de 1 y el intercepto es diferente de cero. Posteriormente con el Anlisis de Varianzas y la consecuente comparacin entre la F calculada de valor 215865.875 y la F de tablas de valor 161.4, que nos demuestra que el valor obtenido experimentalmente cae en la zona de rechazo, con lo cual se rechaza la Hiptesis Nula y se acepta la Hiptesis Alterna y concluimos que el mtodo es significativo, por lo tanto, es lineal. Por otro lado se realizo la prueba para determinar la precisin del mtodo mediante el Coeficiente de Variacin obteniendo un valor experimental de 1.32747% que es <3% requerido en el caso de mtodos espectrofotomtricos, con lo cual concluimos que el sistema es preciso. De la prueba de Disolucin, se presentan las cinticas de disolucin para ambas marcas de tabletas, es decir tanto para las tabletas de Naproxeno sdico marca Bixen, como para las tabletas de Naproxeno Sdico denominadas como G.I; y se observa que ambos perfiles obedecen a una cintica de primer orden, y que en el caso de las tabletas de marca Bixen el valor obtenido de la regresin lineal (0.9960) es mas cercano a la unidad. Por lo cual y con la comparacin entre los valores obtenidos de los Factores de Diferencia (F1= 15.1880) y el Factor de Similitud (F2= 49.365017) que nos permite apreciar que existe una diferencia porcentual entre las dos curvas en cada punto temporal y que adems se presenta error relativo entre las dos curvas y de acuerno a los criterios comprendidos en la NOM-177-SSA1-1998, concluimos que ambos medicamentos no son intercambiables. De la Valoracin del contenido de principio activo presente en ambas marcas de tabletas, se concluye que Bixen (con contenido de principio activo calculado entre 98.67% y 100.90%) y de

acuerdo al criterio establecido en la Farmacopea de los Estados Unidos Mexicanos (FEUM), si cae dentro del intervalo propuesto, siendo para este medicamento, tal y como lo indica la monografa no menor al 90.0% y no mayor al 110% de la cantidad de C14H13NaO3, indicada en el marbete. Mientras que para las tabletas de Naproxeno sdico G.I. el contenido de principio activo se calculo de entre 134.56% a 136.73%, saliendo definitivamente del parmetro establecido por la FEUM.

-BIBLIOGRAFIA. "Rev. Col. Cienc. Qum. Farm." Vol. 35 (1), 81-105 "www.farmacia.unal.edu.co 81" "Validacin de una metodologa analtica para la cuantificacin de Naproxeno espectrofotometra ultravioleta" Carolina P. Mora, Myriam E. Tello y Fleming Martnez. Departamento de Farmacia, Universidad Nacional de Colombia, A.A. 14490, Bogot. "Bertran G.katzung, farmacologa bsica y clnica" editorial el manual moderno S.A; 8 edicin; pg. 682-684; Mxico DF 2002. "Benito del Castillo; Tcnicas instrumentales en farmacia y ciencias de la salud" 4 edicin, editorial Piros; Barcelona 1998. "BP 2004 British pharmaceutical"; London, 2004. "Efecto de Naproxeno microencapsulado en microesferas de cido poli (Lctico-co-gliclico) sobre edema plantar inducido por carragenina en ratas"; Diana M. Aragn N., Nadezdha E. Vergel B.; Revista de la Facultad de Qumica Farmacutica 2010, pag.60

ANEXOS.

CUANTIFICACIN DE NAPROXENO SDICO EN TABLETAS DE 550 mg POR CLAR.

-FASE MVIL (ACN:H2O:AcAc) Se filtraron por separado 60 mL de Acetonitrilo y 50 mL de Agua (HPLC) en un equipo millipore.

Se tomo 50 mL de Acetonitrilo, 49 mL de Agua y 1 mL de Acido Actico Glacial obteniendo un volumen final de 100 mL. Se mezclaron perfectamente bien los disolventes y se desgacifico por 10 min.

-MEZCLA DE DISOLVENTES. Se preparo un porcin de 90:10 de Acetonitrilo y agua desionizada obteniendo un volumen final de 50 mL de esta mezcla.

-SOLUCIN ESTNDAR Se pesaron 2 mg de Naproxeno Sdico (p.a.) y se colocaron en un matraz aforado de 50 mL y se llev a la marca del aforo con mezcla de disolventes. La concentracin final de la solucin es de 40 g/mL.
( )( )

Tomar alcuotas de la solucin anteriormente preparada para hacer diluciones a 10 g/mL, 20 g/mL, 30 g/mL aforar a 25 mL.

-DILUCIONES: 10 g/mL
. . /( / )

20 g/mL

. .

/( /

30 g/mL
. . /( / )

-PREPARACIN DE LA MUESTRA POR TRIPLICADO. Se pesaron 5 tabletas individualmente de Naproxeno Sdico marca Bixen* y se obtuvo el peso promedio (los pesos individuales se muestran en la siguiente tabla) se trituraron hasta obtener un polvo fino y se tomo el equivalente a 27.5 mg de principio activo.
MUESTRA (TABLETAS) Peso (mg) 723.8 7324 726.4 722.9 720.5 Peso promedio: 725.2

)(

Se pesaron 36.26 mg del polvo de Naproxeno Sdico y se colocaron en un matraz de 10 mL y se adiciono 1 mL de mezcla de disolventes. Se coloco a ultrasonido durante 5 minutos y se dejo enfriar a temperatura ambiente. Se aadi 8 mL de Acetonitrilo, agitando unos segundos. Posteriormente se llevo al aforo. Se filtro. Se tomo una alcuota de 0.1 mL, colocacin en un matraz de 10 mL y aforar con Fase movil. -CURVA DE CALIBRACIN Se inyecto al cromatgrafo cada punto de la curva a volmenes iguales de 40 L y se observaron los cromatogramas. De la misma forma se inyectaron las muestras.

Con base a los resultados se determina Tiempo de retencin, Nmeros de platos tericos, Factor de capacidad y Concentracin presente en las muestras.