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Reações Antígeno - Anticorpo

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INTERAÇÕES ANTÍGENO-ANTICORPO

Detecção, quantificação e caracterização dos anticorpos e seu uso como ferramenta para pesquisa e diagnóstico

RESPOSTA DE ANTICORPOS
lEspecificidade Habilidade do Ac distinguir seu imunógeno de outros Ag. lQuantidade N° de células B x taxa de síntese do Ac x persistência após sua produção. lIsotipo Determina a persistência (meia vida in vivo diferente). A composição determina a função dos Ac e os locais onde são encontrados. lAfinidade Força de ligação do Ag com o Ac, em um único sítio. Quanto maior a afinidade entre Ac e Ag, menos Ac será necessário. lAvidez: força total de ligação, nos dois sítios.

Avidez x Afinidade

INTERAÇÕES
lReações reversíveis. reversíveis lLigações não covalentes:

Pontes de hidrogênio Interações hidrofóbicas Interações de Van der Waals Ligações iônicas

MÉTODOS
1) Reagentes não marcados • Reação de precipitação • Reação de aglutinação 2) Reagentes marcados • RIA • ELISA • Imunofluorescência • Western Blotting

MÉTODOS
l PRECIPITAÇÃO
- Imunodifusão dupla - Imunodifusão radial - Imunoeletroforese

APLICAÇÕES
- Pesquisa - Diagnóstico - Soroepidemiologia

l AGLUTINAÇÃO

- Aglutinação direta e indireta - Inibição da aglutinação - Teste de Coombs

l IMUNOENSAIOS

- RIA - ELISA - Imunofluorescência e Citometria de Fluxo - Western Blotting

PRECIPITAÇÃO X AGLUTINAÇÃO
lPrecipitação: Formação de complexos Ag/Ac. lAglutinação: É o agrupamento de partículas, usualmente por moléculas de Ac que se ligam a Ag na superfície de partículas adjacentes.
lAs

reações de precipitação e de aglutinação decorrem, respectivamente da ligação entre o Ac e Ag solúvel e particulado.

REAÇÕES DE PRECIPITAÇÃO
l l l l

Interação entre Ac e Ag solúvel Ac precisa ser bivalente Ag precisa ser bi ou polivalente A reação pode ser afetada pelo n° de sítios de ligação que cada Ac possui para seu Ag VALÊNCIA

PRECIPITADO

É importante levar-se em conta como ocorre a ligação Ag-Ac em diferentes concentrações dos mesmos. Observe abaixo:

Anticorpo livre Antígeno livre 100%-Percentual de complexo imune precipitado

+ -

-

+

Zona de Zona de excesso equivalência de anticorpo

Zona de excesso de antígeno

Quantidade de antígeno adicionado

TÉCNICAS DE PRECIPITAÇÃO EM GEL
IMUNODIFUSÃO
Imunodifusão Dupla: •Coloca-se agarose sobre uma lâmina:

•Faz-se em seguida, pequenos orifícios no gel e são adicionadas as soluções testes de Ag e Ac, como por exemplo, é mostrado abaixo:

Ac

l

IMUNODIFUSÃO DUPLA

l

As soluções sofrem difusão e, quando o Ag e o Ac se encontram em zona de equivalência, se observa a reação pela formação de uma linha de precipitação: Pode ser visualizada pós lavagem do gel , para remoção das proteínas solúveis, por coloração dos arcos de precipitação com corante
Utilização: muito usada em pesquisa e diagnóstico de algumas doenças, como cisticercose

Ag

Ag

Ac Ag Ag

Ag

Ag

Ac

Ac

IMUNODIFUSÃO RADIAL
l l

Permite a quantificação do antígeno ou do anticorpo. O processo continua até ser atingida a zona de equivalência, com os complexos precipitandose em um anel (halo) em torno do orifício.

Utilização: dosagem de IgG, IgA e IgM e proteínas séricas. Agarose contendo anticorpos anti-IgG humana

Poços onde são colocados padrões e amostras a serem dosados Halo de precipitação IgG – antiIgG

IMUNOELETROFORES E
Pode-se fazer comparação de misturas complexas de Ag que são separados em gel de agarose, pela aplicação de uma corrente elétrica. l As moléculas migram para o pólo negativo, distribuindo-se no gel de acordo com os seus PM e cargas elétricas. l Uma canaleta é recortada entre os poços e preenchida com Ac, que se difunde. l Ag e Ac formam arcos de precipitação.
l
1- Separação de antígenos
Ag

2- Anti-soro na coluna canaleta
canaleta

+
Ag

-

3- Difusão e precipitação

REAÇÕES DE AGLUTINAÇÃO
Ac + Ag multivalente particulado l Título:maior diluição que ainda causa aglutinação (semi-quantitativo) l Pó-zona: excesso de Ac l Potencial Zeta: alguns Ag podem apresentar carga elétrica (repulsão) l Agregação visível de partículas = Eritrócitos, bactérias, fungos e látex
l

AGLUTINAÇÃO DIRETA
Células ou partículas insolúveis + Ac = Aglutinação Exemplo: tipagem sanguínea em lâminas (sistema ABO)
1) Amostra de sangue na placa teste:

2) Reagente (anticorpo anti A, B):

AGLUTINAÇÃO DIRETA
4) Mistura-se:

3) Controle negativo:

AGLUTINAÇÃO DIRETA
5) Leitura do resultado:

negativo

positivo

Um resultado positivo é indicado por uma aglutinação visível

(aglomeração dos eritrócitos na placa teste), como ilustrado acima.

AGLUTINAÇÃO INDIRETA (PASSIVA)
Ag solúveis associados a outras superfícies (Partículas de látex ou superfície de hemácias) Exemplo: Hemaglutinação Passiva para a Doença de Chagas: •As hemácias são revestidas com Ag do T. cruzi (ligação covalente) e então distribuídas nos poços da placa. •O soro teste e os controles positivos e negativos, devidamente diluídos, são adicionados aos poços da referida placa. •Se houver Ac específico contra o Ag, as hemácias se aglutiname formam uma camada no fundo do poço. Quando não existe Ac específico, as células formam um botão no fundo do poço. Aglutinação Positiva Negativa

INIBIÇÃO DA AGLUTINAÇÃO
Exemplo: presença de hCG na urina (gravidez)

+
Urina Soro anti - hCG Adicionam-se São incubados e colocados numa placa Partículas revestidas com hCG

Resultado positivo:
(presença de hCG na urina): não ocorre aglutinação.

Resultado negativo: (ausência de hCG na urina). Ocorre aglutinação, pois os anticorpos anti-hCG não são bloqueados na incubação inicial, porque não havia o hormônio na urina. Livres, podem aglutinar as partículas revestidas de hCG.

Ac se ligaram no hCG da urina, (ficando bloqueados), na incubação inicial

TESTE DE COOMBS
Ac antiimunoglobulinas (Robert Coombs); DHRN – mãe produz IgG anti-Rh; Não aglutinam os eritrócitos; Direto: Ac ligados aos eritrócitos fetais; Indireto: Ac anti-Rh não aglutinantes no soro materno. Permite detectar incompatibilidades Rh, prevenindo contra DHRN.

IMUNOENSAIOS
l Reagentes

marcados (enzimas, fluorocromos, isótopos) l Tipos:
RIA ELISA IFA / CITOMETRIA DE FLUXO WESTERN BLOTTING

IMUNOFLUORESCÊNCIA (IFA)
Princípio da técnica: Anticorpos ou antígenos são conjugados (ligados de modo covalente) a uma substância (fluorocromo), que, quando excitada por radiações UV, emite luz no espectro visível. l Assim, como a ligação Ag-Ac é específica, um anticorpo conjugado pode ser usado para detectar um determinado antígeno e vice-versa. l A reação é feita em lâminas de microscopia (um pouco mais finas que as comuns) e a observação tem lugar num microcópio com luz UV (microscópio de fluorescência).
l l

Principais fluorocromos: fluoresceína (isotiocianato de fluoresceína – FITC) e rodamina(isotiocianato de tetrametil rodamina – TRICT). Tipos: direta, indireta ou saduíche.

Microscópio de fluorescência com epiluminação

luz UV atinge o material examinado

fluorescência emitida chega ao observador

TIPOS DE IMUNOFLUORESCÊNCIA

APLICAÇÃO DA TÉCNICA
IFA direta: lDetecção direta de microrganismos em secreções, na urina, nas fezes, em cortes de tecidos etc. Também é utilizada na fenotipagem de células tumorais. IFA indireta: lDiagnóstico sorológico de várias doenças infecciosas como a Doença de Chagas, a SIDA/AIDS, as hepatites e complexos em doenças autoimunes.

uma técnica onde se consegue alta sensibilidade (fluorescência é mais intensa) e especificidade.

IMAGENS

CITOMETRIA DE FLUXO
Ferramenta que detecta e quantifica células individuais passando em uma corrente através de um feixe de Laser. Separa as células por fluorescência ativada. Cada anticorpo pode ser marcado com um fluorocromo diferente. É um teste qualitativo e quantitativo. APLICAÇÕES Tipo de linfócitos; Quantidade, tamanho, granulosidade; Isolamento de populações celulares; HIV

Ensaio Imunoadsorvente Ligado à Enzima - ELISA
O teste identifica e quantifica Ag ou Ac, utilizando um dos dois conjugados com enzimas.
Fosfatase alcalina Peroxidase B-galactosidase

O produto final corado surge por ação da enzima que converte um substrato incolor em um produto colorido (ou o substrato alterado pela enzima induz mudança de cor de uma substância indicadora). A quantidade de Ag ou Ac produto final corado, através de leitura em fotocolorímetro. Principais tipos de ELISA: indireto, sanduíche, competição e captura.

TIPOS DE ELISA: Direto e Indireto

INDIRETO

DIRETO OU SANDUÍCHE

PLACA UTILIZADA

ELISA Indireto

ELISA Direto ou Sanduíche

ELISA Competitivo

ØAplicações do ELISA: §Testes de rotina em Laboratórios Clínicos e de Pesquisa ØVantagens: §Teste de alta sensibilidade §Permite quantificar Ag ou Ac das amostras §Seguros e de baixo custo

RADIOIMUNOENSAIO - RIA
Marcações: l I125: emite raios gama l H3: raios beta Ø Reprodutibilidade, especificidade e sensibilidade (em torno de 10-12g) Ø Desvantagem a manipulação de isótopo radioativo. Ø Aplicações: Triagem vírus da hepatite B em doadores de sangue, Hormônios, proteínas séricas, drogas, vitaminas e Ac. Pesquisa
Ø

WESTERN BLOTTING
l Eletroforese

proteínas. l Identifica antígenos ou anticorpos.

de

WESTERN BLOTTING

WESTERN BLOTTING

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