NOVAS PERSPECTIVAS EM VACINAS VIRAIS

SCHATZMAYR, H. G.: Novas perspectivas em vacinas virais. Histria, Cincias, Sade Manguinhos, vol. 10 (suplemento 2): 655-69, 2003. Com base nas pesquisas moleculares sobre o genoma e protenas, novas vacinas virais devero ser utilizadas de forma rotineira nas prximas dcadas. Por outro lado, espera-se que cada vez mais sejam associados diferentes antgenos imunizantes em uma mesma dose, visando a reduzir o nmero de aplicaes de vacinas nas populaes a serem imunizadas. Pela importncia de sua estrutura cientfica e tecnolgica, o Brasil deve aumentar a participao nos processos de desenvolvimento de novas vacinas e na avaliao de sua eficcia, envolvendo maior nmero de pesquisadores e tecnologistas, com o incremento de investimento nessas atividades. PALAVRAS-CHAVE: vacinas virais, antgenos imunizantes, Brasil. SCHATZMAYR, H. G.: New perspectives in viral vaccines. Histria, Cincias, Sade Manguinhos, vol. 10 (supplement 2): 655-69, 2003. New viral vaccines, based on molecular research into genomes and proteins, should come into routine use in the coming decades. At the same time, use of different immunizing antigens within a single dose is also expected to grow more common, with the purpose of reducing the number of vaccinations administered to target populations. Given Brazils scientific and technological importance, the country should enhance its participation in the development of new vaccines and in the evaluation of their efficacy by involving a larger number of researchers and technologists and boosting investment in these activities. KEYWORDS: viral vaccines, immunizing antigens, Brazil.

Novas perspectivas em vacinas virais New perspectives in viral vaccines

Hermann G. Schatzmayr
Pesquisador do Departamento de Virologia Instituto Oswaldo Cruz/Fundao Oswaldo Cruz Av. Brasil 4365 21045-900 Rio de Janeiro RJ Brasil hermann@ioc.fiocruz.br

10 (suplemento 2):655-69, 2003 vol. 10 (suplemento 2):655-69, vol. 2003

655

HERMANN G. SCHATZMAYR

Introduo

uso de vacinas de forma mais ampla foi introduzido a partir do incio do sculo passado e contribuiu de forma inequvoca para a reduo da incidncia das doenas infecciosas. Nas ltimas duas dcadas o rpido progresso das pesquisas, em particular nas reas da imunologia e da biologia molecular, lanou as bases de um desenvolvimento sem precedentes para a implementao de novas vacinas e de novas estratgias de vacinao em todo mundo. Assim, em 1981, a Organizao Mundial de Sade (OMS), com apoio do Unicef, lanou o Programa Expandido de Imunizao, com a finalidade de imunizar 80% das crianas do mundo com as cinco vacinas bsicas (poliomielite, difteria, sarampo, pertussis e ttano). Um esforo iniciado nas Amricas e denominado Iniciativa para a Vacinao Infantil (CVI) contribuiu igualmente para a expanso das discusses sobre vacinas e estratgias de vacinao. Em janeiro de 2000 foi criada a chamada Aliana Global para Vacinas e Imunizao (Gavi), com o Fundo para Vacinas, e ambos tm levantado recursos substanciais em nvel internacional para aplicao nesse campo. O principal problema do desenvolvimento e da produo de novas vacinas tem sido o relativo baixo interesse das indstrias farmacuticas, pois as vacinas representam apenas 2% do mercado mundial dessa indstria (Greco, 2002). Alm disso, a labilidade dos produtos, o risco da responsabilidade por reaes adversas, o alto custo de desenvolvimento das novas vacinas e os preos no atrativos, em especial pela limitada capacidade de compra pelos pases em desenvolvimento, que seriam os maiores mercados de uma srie de vacinas virais de grande interesse nas regies tropicais, tm limitado os investimentos na rea. Apesar de todos esses problemas globais, reconhecido que poucas aes de sade pblica apresentam uma relao custo-benefcio to favorvel como a utilizao de vacinas em uma populao. Para avaliar o valor dessa relao seria suficiente compararmos, por exemplo, o custo de uma imunizao completa de trs doses para a hepatite B com o custo do tratamento, ao longo de vrios anos, de um caso clnico da doena que venha evoluir ao estado crnico. Ao longo dos anos o pas adquiriu uma forte compreenso do valor das vacinas e hoje somos um exemplo mundial da capacidade de organizar campanhas de imunizao em nvel nacional, com a participao de grandes segmentos populacionais, alm da existncia de uma capacidade instalada de produo de vacinas de qualidade. Com isto torna-se importante avaliar alguns aspectos atuais das vacinas e do que se espera para o setor em um futuro prximo.

656

Histria, Cincias, Sade Manguinhos, Rio de Janeiro

NOVAS PERSPECTIVAS EM VACINAS VIRAIS

Bases imunolgicas na produo de vacinas O desenvolvimento de vacinas depende fundamentalmente do conhecimento dos mecanismos imunolgicos envolvidos em resposta s infeces, bem como dos mecanismos de patognese das infeces. A primeira interao entre o patgeno e o hospedeiro ocorre ao nvel das mucosas, que representam a barreira mecnica entre os meios externo e interno, dificultando ou impedindo a adeso dos vrus superfcie das clulas epiteliais de revestimento (Baraschi et al., 2003). Estas clulas expressam diferentes receptores, que reconhecem e ligam patgenos, dando incio ao processo de ativao celular, sintetizando e secretando novos peptdeos dirigidos principalmente para bactrias (Philpott et al., 2001). A ativao das clulas epiteliais induz a formao de fatores de atrao de clulas imunes, como neutrfilos, macrfagos, clulas killer e linfcitos, alm de clulas fagocitrias como macrfagos. Gera-se ainda uma resposta inflamatria local, com seus diversos componentes, inclusive o sistema do complemento. As chamadas clulas dendrticas so hoje reconhecidas como as mais importantes apresentadoras de antgenos para a induo de resposta imune tanto para as clulas CD8+ (citotxicas e capazes de destruir clulas infectadas com vrus) como para as clulas CD4+ T-helper, constituindo essas duas a base da imunidade celular. As clulas dendrticas distribudas ao longo da pele e principalmente das mucosas so capazes de capturar e processar antgenos, carreando-os para ndulos linfticos (Banchereau e Steinman, 1998). Esses conhecimentos e o sucesso da vacina oral contra a poliomielite levaram criao de novas propostas de vacinao atravs da aplicao de vacinas diretamente na pele e mucosas, como as vacinas experimentais contra a influenza e o sarampo por via nasal, a utilizao da via vaginal na imunizao contra o herpes simplex e a via oral para a hepatite E (Holmgreen et al., 2003). Alm da resposta celular, a resistncia s infeces virais depende da formao, pelo organismo, de resposta imune humoral (globulinas) aos antgenos presentes na superfcie dos vrus ou na superfcie das clulas por eles infectadas. Essas respostas impedem que os vrus penetrem nas clulas do organismo ou conduzam destruio de clulas j infectadas, sendo importante assinalar o papel da imunoglobulina A, que participa no processo de imunidade de mucosas, alm da imunoglobulina M, de formao mais precoce, e a G, mais duradoura e responsvel pela proteo do indivduo ao longo dos anos. Os antgenos virais que no se situam na superfcie da partcula tm, aparentemente, um papel secundrio na resistncia infeco. Com isso se apresentam duas linhas de defesa, relacionadas entre si, que levam destruio das clulas infectadas e tambm
vol. 10 (suplemento 2):655-69, 2003

657

HERMANN G. SCHATZMAYR

geram uma resposta duradoura, prevenindo a reinfeco pelos mesmos vrus ao longo dos anos. Essa imunidade duradoura se apia na formao das clulas de memria, que, ao serem estimuladas por esses antgenos, mesmo aps vrios anos, so capazes de formar globulinas especficas para aqueles antgenos. Essa possibilidade de atuao dos anticorpos preexistentes sobre infeces virais constitui a base da aplicao de gamaglobulina especfica para controlar infees virais, como no caso da globulina contra a raiva, aplicada em indivduos recentemente infectados pelo vrus, e na hepatite virai, em que se aplica o produto em recm-nascidos de mes portadoras do vrus da hepatite B, para evitar a passagem do vrus da me para a criana. Objetivos das imunizaes Os objetivos principais das imunizaes so prevenir o desenvolvimento do quadro clnico no indivduo e, ao se alcanar um nvel de imunidade elevado em grandes segmentos da populao, se obter o controle ou mesmo a eliminao de determinada virose. Essa eliminao foi alcanada nas Amricas com a varola, com a poliomielite pelo vrus selvagem e espera-se que o mesmo ocorra, em breve, com relao ao sarampo. Alm da imunizao bsica realizada na primeira infncia, vacinas virais podem ser utilizadas em outras fases da vida, como a vacinao anti-rbica, que realizada quando h suspeita de que o indivduo atacado por animal possa ter se infectado pelo vrus. No caso da hepatite B, alm da imunizao dos indivduos vivendo em reas de risco ou apresentando maior possibilidade de infeco por suas atividades profissionais, busca-se evitar a passagem do vrus da me portadora de hepatite B para o recm-nascido, o que obtido pela aplicao da vacina o mais cedo possvel aps o nascimento. A adoo desse esquema de forma organizada e persistente, o que ainda no ocorreu em nosso pas, reduziu de forma drstica as infeces em muitos pases da sia, como o Japo, que teve em relao hepatite B a mais importante infeco viral do pas. No que diz respeito rubola, que produz um quadro benigno, muito raramente evoluindo com complicaes importantes, o alvo primrio da vacinao so as mulheres em idade frtil, de forma a induzir uma imunidade que previna a multiplicao dos vrus selvagens nos tecidos embrionrios. Uma vacinao extensa de crianas tambm utilizada em muitos pases desenvolvidos e dever ser introduzida em nosso pas. A vacina contra a febre amarela utilizada para prevenir a doena nas reas endmicas e eventualmente em reas no-endmicas, quando se suspeita da presena de indivduos que se infectaram em reas endmicas e que possam, atravs do vetor Aedes aegypti, gerar um surto urbano da doena. 658
Histria, Cincias, Sade Manguinhos, Rio de Janeiro

NOVAS PERSPECTIVAS EM VACINAS VIRAIS

No que diz respeito influenza, a vacina utilizada principalmente na chamada terceira idade, que inclui os grupos de maior risco de desenvolverem quadros clnicos mais graves de infeco pulmonar. Essa vacinao oferecida em muitos pases, inclusive o Brasil, e levou a uma significativa queda da mortalidade por doena respiratria aguda nos pases em que se conseguiu analisar com preciso os dados de morbidade e mortalidade desse grupo etrio. No Brasil a imunizao bsica para as viroses inclui a poliomielite, o sarampo, a caxumba e a rubola, alm da hepatite B e da febre amarela em regies endmicas, sendo possvel incluir em breve tambm as vacinaes contra a hepatite A e a varicela no pas, alm da vacina contra a influenza, utilizada em segmentos de idade mais avanada. Cada estado possui ainda um centro para vacinaes especiais, visando atender a necessidades especficas, como a vacina contra a poliomielite em crianas imunodeprimidas, que no podem receber vacinas do tipo oral e devem ser vacinadas com vacinas inativadas. Tipos de vacina utilizados As vacinas virais so classificadas como vacinas vivas, que contm vrus vivo e atenuado em laboratrio, e vacinas mortas, que contm vrus ou suas subunidades submetidos a agentes fsicos ou qumicos que os inativam, isto , eliminam a capacidade de eles se multiplicarem no hospedeiro A) Vacinas vivas atenuadas As vacinas virais com partculas capazes de se multiplicar nos vacinados tiveram como trabalho pioneiro aquele desenvolvido por Jenner, em torno do final do sculo XVIII, quando utilizou material obtido de leses de pele de animais para imunizar contra a varola. Jenner baseou-se no fato de que ordenhadores apresentavam com freqncia leses vesiculosas nas mos, por contgio com bovinos com leses semelhantes, causadas por vrus do mesmo grupo da varola. Ao contrrio do restante da populao, aquelas pessoas raramente apresentavam essa doena, de larga disseminao naquela ocasio na Europa. Na Antiguidade, especialmente na China, descreveram-se prticas de expor pessoas sadias a material coletado de vesculas, bem como de crostas obtidas de pacientes de varola. Essa pratica atravessou os sculos, embora ocorressem tambm formas graves da doena em vacinados. Inicialmente se utilizou o cultivo dos vrus em animais, tcnica usada por Pasteur para criar sua vacina anti-rbica, atravs da passagem do vrus em crebro de coelho e posterior tratamento por mtodos qumicos. O ovo embrionado de galinha, introduzido na dcada de 1930, permitiu o cultivo de alguns vrus, como o grupo varola vacnia e o vrus da influenza, cujas vacinas so at hoje preparadas nesse sistema.
vol. 10 (suplemento 2):655-69, 2003

659

HERMANN G. SCHATZMAYR

Com o desenvolvimento das tcnicas de cultura de tecidos, a partir tambm da dcada de 1930, quando a vacina da febre amarela foi desenvolvida, utilizando o cultivo do vrus em fragmentos de embrio de galinha em suspenso, e especialmente a partir da dcada de 1950, um grande nmero de vrus comeou a ser cultivado nesses sistemas. A cultura de tecidos passou a permitir o cultivo em condies controladas de vrios vrus usados para vacina, sendo o primeiro deles o agente da poliomielite. Inicialmente com este vrus, cultivado em clulas renais de macaco, se obteve, com Jonas Salk, uma vacina inativada, tratando-se os vrus com formol. Mais tarde Sabin desenvolveu, no mesmo sistema de cultivo, uma vacina viva, de uso oral, que acabou por se tornar uma extraordinria ferramenta para eliminar a poliomielite das Amricas e, espera-se, em breve futuro tambm do mundo. As vacinas vivas apresentam algumas vantagens importantes sobre as vacinas inativadas. A principal delas o envolvimento de todos os componentes do sistema imune no desenvolvimento da imunidade contra a partcula vacinal ntegra e que se multiplica no organismo do vacinado. Com isso a resposta imune completa e mantm-se por longos perodos, reproduzindo muito proximamente a resposta infeco natural. As vacinas vivas, em geral, apresentam menor custo de produo, o que possibilita a sua utilizao em grande escala, como foi o caso das vacinaes contra a varola e poliomielite, ambas com a finalidade de erradicar estas doenas do mundo. Entre as desvantagens das vacinas vivas destaca-se a possibilidade de efeitos adversos que surgem quando da multiplicao no hospedeiro, seja por fatores individuais, seja por uma reverso gentica da amostra vacinal, tornando-a mais virulenta. Esses fenmenos foram amplamente estudados na vacina oral contra a poliomielite, quando se observam casos clnicos de doena paraltica aps a vacina, com uma tendncia das amostras eliminadas pelas fezes apresentarem alguns caracteres genticos das amostras selvagens das quais derivaram. Outro problema observado a vacinao inadvertida de crianas imunodeficientes, nas quais os vrus vacinais passam a ser eliminados por longos perodos de tempo. Efeitos adversos foram observados na vacina contra a varola, algumas vezes graves, e mais recentemente tambm foram identificados nas vacinas contra a caxumba e a febre amarela. Outro problema que ocorre com as vacinas vivas a possibilidade de sua deteriorao durante o processo de transporte e armazenagem, exigindo, para aquelas que no podem ser liofilizadas, a montagem de uma extensa rede de refrigerao, para permitir que o produto chegue ao receptor em perfeitas condies de uso.

660

Histria, Cincias, Sade Manguinhos, Rio de Janeiro

NOVAS PERSPECTIVAS EM VACINAS VIRAIS

Novas tecnologias para o preparo de vacinas vivas Os processos de atenuao de virulncia tradicionalmente utilizados para a obteno de vacinas vivas se baseiam em passagens dos vrus em clulas de hospedeiros diversos e em diferentes condies e temperaturas, levando ao surgimento de mutantes menos virulentos, sendo freqentemente difcil definir com clareza os mecanismos dessa atenuao. Assim, por exemplo, nunca foi possvel reproduzir as mutaes que geraram a vacina contra a febre amarela, apesar de serem utilizadas as mesmas condies experimentais. O avano da biologia molecular permitiu reconhecer algumas mutaes envolvidas com a modificao de virulncia de alguns vrus, como o da poliomielite, sendo este o mais bem estudado desse ponto de vista. O contnuo progresso da biologia molecular dever permitir o desenvolvimento de partculas virais com modificaes dirigidas que levem criao de partculas atenuadas e estveis, em condies de serem aplicadas como imunizantes. Entre estas tcnicas se destacam as seguintes: Delees As delees representam a retirada da partcula viral de segmentos genmicos, com a eliminao de uma ou mais protenas, conduzindo a atenuao da amostra para o hospedeiro. Essas protenas podem ser responsveis pela virulncia da amostra ou por um mecanismo de fuga ao sistema imunolgico. Como muitas dessas delees so de difcil restaurao pelos vrus, considera-se que constituem um mecanismo seguro de se obter mutantes ainda imunizantes, porm de mais baixa virulncia. As delees tm sido mais facilmente obtidas em vrus maiores, nos quais ocorrem regies no-essenciais para a replicao. A retirada de genes especficos tem reduzido, por exemplo, a infeco de neurnios e diminudo a neurovirulncia de amostras do vrus herpes simplex, para o qual no se dispe ainda de uma vacina eficaz. Inseres Ao contrrio das delees, neste caso, fragmentos genmicos so inseridos nas partculas virais, visando reduo de sua virulncia. Utilizam-se genes que codificam protenas com atividade antiviral, como o interferon, fator de necrose tumoral e interleucinas. Nessas condies a replicao viral limitada, mas poder ser suficiente para produzir anticorpos no hospedeiro. Exemplo notvel o vrus respiratrio sincicial, agente de um quadro respiratrio grave em crianas e no qual a insero do gene do interferon gama levou a uma atenuao da amostra, mantendo-se uma excelente resposta humoral. Embora os resultados obtidos tenham sido pontualmente excelentes, quando da insero de um ou mais fatores em partculas virais, no
vol. 10 (suplemento 2):655-69, 2003

661

HERMANN G. SCHATZMAYR

se sabe como se comportaro essas amostras modificadas ao longo do processo de preparo de vacinas, principalmente no organismo humano. Quimeras virais Denominam-se quimeras virais as partculas no existentes na natureza e que so obtidas por introduo de fragmentos de um vrus em outro, em geral, mas no necessariamente, da mesma famlia. Exemplos dessa tecnologia, que vem se expandindo fortemente, so numerosos, como a utilizao do vrus vacinal da febre amarela para expressar fragmentos de outros flavivrus, como dengue e encefalite japonesa B. No caso do dengue, partculas do tipo 4 foram utilizadas para a construo de quimeras contendo os demais tipos. Uma vacina em estudos contra o rotavrus, importante agente de diarrias virais, contm trs quimeras virais com base no rotavrus smio. Quimeras do vrus da influenza contendo a neuraminidase e a hemaglutinina mais atuais foram desenvolvidas, embora ainda no tenham sido utilizadas na imunizao humana. Essa tecnologia tem sido usada largamente, utilizando-se vrus do grupo pox, os quais, por sua estrutura e tamanho, tm permitido a expresso de inmeros antgenos de outros grupos de vrus. Assim, por exemplo, uma quimera vacnia-raiva est sendo usada na Europa para imunizar raposas na natureza. Uma amostra do vrus vacnia denominada Ancara, obtida por sucessivas passagens em embrio de galinha, mostrou-se de muito baixa virulncia e tem grande potencial para ser utilizado como vetor de vrus, como o vrus do sarampo. Alm do vrus vacnia, so utilizados poxvrus de aves, como o canaripox, que replicam pobremente em clulas humanas e, assim, podem ser utilizados at mesmo em indivduos com deficincias imunolgicas. Vacinas de ADN viral Um novo mtodo de se obter imunidade foi desenvolvido atravs da inoculao, diretamente no indivduo, de fragmentos genmicos de clulas contendo ADN viral do vrus contra o qual se quer imunizar, juntamente com fatores promotores de sua multiplicao. Esses fragmentos so capazes de se multiplicar em clulas como os micitos do hospedeiro e formar as protenas imunizantes no vacinado. Vrus respiratrios, em especial o da influenza, apresentaram uma resposta adequada nos experimentos iniciais, expandidos posteriormente a outros vrus. Essa tecnologia tem a grande vantagem de as glicoprotenas imunizantes serem formadas ao nvel da superfcie das clulas e, portanto, apresentadas ao sistema imune em sua forma nativa, sem qualquer processo de manipulao que possa causar modificaes nos antgenos. A resposta imunolgica, porm, tende a ser baixa. Vrias propostas de melhor-las foram apresentadas, como a utilizao de promotores de 662
Histria, Cincias, Sade Manguinhos, Rio de Janeiro

NOVAS PERSPECTIVAS EM VACINAS VIRAIS

replicao mais potentes e capazes de induzir a multiplicao em grande variedade de clulas do hospedeiro. A adio de outros genes dos vrus em anlise foi igualmente sugerida e espera-se, em um futuro prximo, o amplo desenvolvimento dessa tecnologia, embora seja, por vezes, apontado o risco terico da introduo no organismo de um cido nuclico viral capaz de, eventualmente, se integrar ao genoma do vacinado, com resultados imprevisveis. Vacinas inativadas As vacinas inativadas so utilizadas rotineiramente na preveno de inmeras doenas, como a influenza, poliomielite (vacina tipo Salk), raiva e hepatite A. Os vrus so inativados por vrios mtodos qumicos, em particular o formol ou detergentes, como na influenza. No caso da hepatite B, uma vacina foi desenvolvida a partir dos vrus contidos no sangue de portadores crnicos de hepatite. Por processos de purificao e concentrao a partir do plasma de portadores crnicos do vrus, so separadas as partculas esfricas do vrus, com cerca de 22nm de dimetro, as quais so submetidas ao formol, para inativao. Essa vacina, ainda usada em alguns pases asiticos, sofreu grandes restries com o surgimento do vrus HIV, pela possibilidade terica da presena deste vrus no produto final, embora isto nunca tenha sido demonstrado. Com isto optou-se, no caso da hepatite B, pela vacina obtida por expresso do antgeno imunizante do vrus em leveduras, que se constituiu na primeira vacina utilizada em larga escala obtida por tcnicas de recombinao gentica. Essa vacina inativada se tornou tambm a primeira vacina anticncer desenvolvida, uma vez que expressiva poro dos portadores crnicos de hepatite B evolui para o carcinoma primrio do fgado. As vacinas inativadas oferecem como grande vantagem mais segurana, pois no h multiplicao do agente no organismo do vacinado, porm, tendem a induzir uma imunidade menos duradoura e a exigir, com isso, a aplicao de mais de uma dose no esquema de imunizao, bem como a repetio das imunizaes ao longo dos anos. Exemplo tpico so as vacinas inativadas contra a influenza, que devem ser aplicadas a cada ano. Este fato significa um custo mais alto na utilizao desses produtos. Novas tecnologias para o preparo de vacinas inativadas Entre as novas tecnologias que tm colaborado para o desenvolvimento de vacinas inativadas destaca-se o uso da tecnologia do DNA recombinante para o preparo de antgenos protetores em mais larga escala, como no caso da hepatite B.
vol. 10 (suplemento 2):655-69, 2003

663

HERMANN G. SCHATZMAYR

So empregadas principalmente clulas de leveduras, de insetos e de mamferos. Os procedimentos para a expresso desses antgenos incluem vrias fases. De incio devem ser identificados com preciso os antgenos produtores da imunidade a serem produzidos pelas clulas ao nvel laboratorial. Esses antgenos devem ser induzidos de forma que as quantidades obtidas sejam elevadas e sua purificao tecnologicamente vivel. No caso de clulas de mamferos, o cuidado maior a eliminao de potenciais fatores oncognicos originrios das clulas que servem de substrato, considerando a possibilidade de os mesmos serem eventualmente mantidos nas vacinas e introduzidos nos vacinados. Os exemplos mais notveis desse tipo de vacina, como assinalado, so aquelas desenvolvidas para a hepatite B, inicialmente em Sacharomyces cerevisiae e mais tarde em outras leveduras com maior capacidade de produo. Essas vacinas so muito usadas hoje no mundo, inclusive no Brasil. Outro exemplo em fase experimental a produo de antgenos do vrus rbico e do papiloma humano, igualmente em leveduras. O uso de baculovrus, que so vrus de insetos, tem se mostrado igualmente um sistema eficiente de produo de antgenos protetores para as hepatites A e E. Apesar do maior risco terico presente nas clulas de mamferos, a formao das protenas virais em seu interior idntica ou muito prxima da que ocorre na doena natural no homem. Com isso se observa uma alta identidade entre essas protenas, gerando, conseqentemente, uma resposta imunolgica mais prxima da infeco natural. A obteno de protenas virais animais em clulas vegetais apontada como um caminho promissor. possvel, por exemplo, obter protenas da doena hemorrgica do coelho e do vrus da hepatite B em plantas de batata e, igualmente, antgenos de hepatite B e raiva em plantas do tabaco (Koprowski e Yusibov, 2001; Schatzmayr, 2002). O uso simultneo de vegetais modificados para alimentao e para vacinao tem sido apresentado como uma possibilidade real, como a produo de protenas do vrus da aftosa por plantas de alfafa transgnica. Para se obter a formao de protenas animais em vegetais h dois caminhos principais: a introduo no genoma da planta do fragmento do vrus animal a ser produzido ou a infeco da planta com vrus vegetal modificado geneticamente para gerar, durante a sua replicao, as protenas virais desejadas. Em realidade demonstrou-se que as clulas vegetais e animais geram protenas por sistemas praticamente idnticos, diferentemente das bactrias, por exemplo, que raramente produzem protenas virais completas. Apesar disso, alguns exemplos bem-sucedidos do uso de bactrias para obter protenas virais destinadas imunizao so a expresso do vrus do papiloma em Escherichia coli e do vrus do papiloma humano 664
Histria, Cincias, Sade Manguinhos, Rio de Janeiro

NOVAS PERSPECTIVAS EM VACINAS VIRAIS

tipo 16 em Salmonella typhimurium. Este ltimo um agente reconhecido de cncer de trato genital na mulher. No caso dos vrus papiloma foram obtidas protenas dos principais tipos associadas ao cncer cervical e foram induzidos anticorpos em animais de experimentao em diversos sistemas testados. Em um deles, bactrias transformadas, contendo protenas do capsdeo viral, induziram anticorpos demonstrveis tanto no soro como nas secrees de mucosa. Outra forma de preparar antgenos virais para a imunizao a gerao de peptdeos sintticos no laboratrio, a partir do conhecimento da estrutura das protenas virais. Essa linha de trabalho comeou em vrus de bactrias e se expandiu para vrus animais. A avaliao global dos resultados obtidos indica, no entanto, que a resposta imune obtida em modelos animais , em regra, baixa e no se espera que a situao se modifique substancialmente, embora os estudos sobre protenas virais estejam em grande expanso. Vacinologia reversa A mais moderna tecnologia aplicada na produo de vacinas a denominada vacinologia reversa, desenvolvida nos ltimos trs anos. feito o seqenciamento do genoma do agente, a anlise de suas protenas, previstas atravs da bioinformtica e com base nas caractersticas hidrofbicas ou hidroflicas, determinando-se a posio provvel das protenas dentro do microorganismo. Finalmente avaliada sua capacidade terica de produzir resposta imune. Os peptdeos selecionados podem, ento, ser sintetizados ou expressos em vetores para a comprovao de sua real capacidade de induzir imunidade em animais (Adu-Bobie et all., 2003). Essa tecnologia tende a substituir os mtodos tradicionais de preparo de vacinas, em especial para bactrias nessa primeira fase, podendo ser aplicada tambm a vrus. Atravs dela elimina-se a necessidade de que os agentes sejam inicialmente cultivados e modificados em suas caractersticas de virulncia ou os fragmentos do vrus e bactrias sejam isolados e purificados previamente, antes de serem inoculados para a anlise de sua resposta imune. Outros aspectos importantes Adjuvantes Adjuvantes so substncias adicionadas vacina em sua formulao final, com a finalidade de aumentar a resposta imunolgica do receptor. Os nicos adjuvantes licenciados para uso humano em larga escala so os sais de alumnio, hidrxido ou fosfato. As protenas vacinais se unem ionicamente com os sais de alumnio e formam uma suspenso
vol. 10 (suplemento 2):655-69, 2003

665

HERMANN G. SCHATZMAYR

microscpica, da qual os vrus so liberados lentamente no organismo, aumentando a resposta humoral de anticorpos. Esses adjuvantes tm pouca ao sobre a formao da imunidade celular. Um outro adjuvante, denominado MF59, baseado na formao de uma emulso gua em leo, foi licenciado recentemente para a influenza. Uma srie de novos adjuvantes tem sido estudada com resultados variveis, sendo possvel que novos produtos sejam introduzidos em futuro prximo. Vacinas para neoplasias Numerosos modelos animais tm demonstrado que as clulas T CD8+ e CD4+ tm papel importante na erradicao de tumores. As clulas CD8+ lisam clulas tumorais e as clulas CD4+ agem atravs da secreo de citocinas e no estmulo a uma forte resposta inflamatria na rea do tumor. A base do desenvolvimento da imunoterapia para o cncer, com vrios tipos associados a vrus, a existncia de protenas especficas formadas pelo tumor e que so reconhecidas pelas clulas T. Essas protenas no so expressas pela clula normal e esto sendo identificadas em larga variedade de tumores, como melanomas e tumores de mama, prstata, clon, ovrio, pncreas, leucemias, entre outros. Essas protenas podem ser obtidas por expresso em vetores e administradas aos pacientes, visando a estimular a resposta imune contra as clulas tumorais. Os principais problemas encontrados no tratamento tm sido a descoberta das protenas que causam a melhor resposta imune em cada tipo de tumor e a dificuldade em introduzir no hospedeiro as protenas preparadas em laboratrio, de maneira a induzir uma forte resposta imunolgica. Vrios sistemas de administrar essas protenas tm sido propostos, como a via venosa, a vacinao intradrmica, o uso da via oral, incluindo-se as protenas em cpsulas para lenta liberao e a adio de adjuvantes orgnicos obtidos, por exemplo, a partir de membranas bacterianas. Os melhores resultados clnicos tm sido obtidos com melanomas e espera-se, em futuro breve, que novos resultados favorveis sejam descritos (Kalos, 2003). Vacinas virais ainda no desenvolvidas Apesar do sucesso no preparo de diversas vacinas virais importantes, marcante que muitas infeces ainda caream de um agente imunizante, sendo exemplos claros a Aids, o herpes simplex e o dengue. No caso da Aids, o agente etiolgico vrus HIV apresenta uma grande capacidade de se modificar ao longo do ciclo replicativo dentro da clula. Isso ocorre principalmente porque o vrus, que ARN, 666
Histria, Cincias, Sade Manguinhos, Rio de Janeiro

NOVAS PERSPECTIVAS EM VACINAS VIRAIS

contendo portanto cido ribonucleico em seu genoma, modifica-se, por ao de sua enzima transcriptase reversa, para vrus ADN (cADN), forma pela qual ser capaz de se ligar ao genoma da clula de forma estvel. Nessa transformao ocorrem muitos erros e se formam partculas de variada estrutura genmica, as quais vm a ser liberadas pela clula no organismo. Assim, no indivduo infectado surgem vrios clones virais, que so eventualmente transmitidos a outras pessoas, no sendo possvel preparar vacinas capazes de imunizar todos os clones que se formam. O vrus do herpes simplex capaz de permanecer em clulas nervosas do indivduo, causando recidivas eventuais por fatores variados, como estresse e ciclo menstrual. Uma forte imunidade celular e uma imunidade duradoura ao nvel de mucosas, em particular a genital, seriam essenciais para a proteo, mas esses objetivos ainda no foram alcanados. O dengue causado por quatro tipos de vrus, os quais devem estar todos presentes na futura vacina, uma vez que, aps uma infeco por um tipo de dengue, as infeces sucessivas pelos outros tipos tendem a ser de maior gravidade. Vacinas para o dengue preparadas por mtodos tradicionais de reduo de virulncia por sucessivas passagens em vrios hospedeiros esto em estudos clnicos e vacinas experimentais, com a expresso de fragmentos do vrus em vrios sistemas, esto em estgio pr-clnico, no sendo possvel prever quando estaro disponveis para uso em larga escala. Muitos outros exemplos poderiam ser discutidos, considerando que centenas de vrus so capazes de infectar o homem, inclusive vrus novos, alguns de alta letalidade e que tm surgido nas ltimas dcadas. Entre estes destacam-se Ebola, Sabi, Lassa e outros agentes de febres hemorrgicas, alm dos hantavrus e do novo coronavrus encontrado na sia, causadores de quadro respiratrio agudo, e de dezenas de vrus, transmitidos por mosquitos e carrapatos, presentes nas reas tropicais do mundo. Certamente os mtodos tradicionais de preparo de vacinas no sero capazes de responder a toda essa demanda e os novos mtodos moleculares sero essenciais para uma mudana desse panorama. A produo de vacinas no pas O Brasil, desde os trabalhos pioneiros de Oswaldo Cruz e Vital Brasil, seguidos por vrios outros ao longo do sculo XX, foi capaz de produzir grande parte dos imunobiolgicos que necessitava para a sua populao. A partir da dcada de 1980 um plano nacional de investimentos em instalaes e equipamentos nos produtores estatais resultou em uma grande revitalizao da rea, sendo atingida grande parte das metas propostas dentro das tecnologias ento disponveis. Esse plano nacional no s permitiu o financiamento dos laboratrios produtores, como o Instituto Butant (SP) e Biovol. 10 (suplemento 2):655-69, 2003

667

HERMANN G. SCHATZMAYR

Manguinhos (RJ), como ainda estabeleceu metas e definiu o que caberia a cada grupo, evitando a superposio de atividades e estimulando a realizao de pesquisas de desenvolvimento em comum de novos produtos. Entretanto, nesse campo tecnolgico, em que os novos desenvolvimentos ocorrem com grande rapidez, necessrio manter as pesquisas de boa qualidade, sem o que no se consegue avanar de modo efetivo. Estrategicamente, a par das aplicaes em instalaes, faltaram no pas investimentos mais substanciais das agncias financiadoras nas pesquisas bsica e tecnolgica aplicadas a vacinas e imunobiolgicos em geral. Assinale-se que nas ltimas dcadas ocorreu um grande crescimento do interesse no campo do desenvolvimento e da utilizao de vacinas, bem como um grande aumento das taxas de cobertura vacinal no mundo. Isso foi acompanhado por um maior investimento no desenvolvimento de vacinas para uso humano e em suas tcnicas de preparo em maiores volumes e de aplicao nas populaes. Um esforo deve ser realizado para que maior nmero de pesquisadores e tecnlogos atue na rea de vacinas no pas, reduzindo a dependncia de tecnologia externa, em especial naquelas vacinas em que h mais interesse em sua obteno pelos pases em desenvolvimento. Atualmente so preparadas no pas as vacinas virais humanas contra a febre amarela, o sarampo, a raiva, a poliomielite e a hepatite B, estando em fase de avaliao ou desenvolvimento, diretamente ou atravs de parcerias internacionais, a implantao do preparo das vacinas contra a rubola, a caxumba, a varicela e a hepatite A, alm do aperfeioamento das atuais vacinas para a febre amarela e a raiva. Concluso O desenvolvimento de novas vacinas constitui um investimento elevado e exige a participao de equipes multidisciplinares, desde os nveis de bancada avaliao no campo. Freqentes so as associaes de grupos de mais de uma instituio, e mesmo de mais de um pas, potencializando conhecimentos para que sejam obtidos resultados mais rpidos, e nosso pas no deve ficar margem desse processo. As tcnicas de biologia molecular, por outro lado, devero se expandir e permitir, ao longo dos prximos anos, o desenvolvimento de novas vacinas atravs da manipulao gentica, retirando segmentos do vrus ligados sua virulncia, criando novas partculas com a presena de segmentos de mais de um vrus, e a modelagem das protenas atravs da bioinformtica. Devem ser desenvolvidos igualmente sistemas de cultivo de vrus e obteno de antgenos protetores em maior escala, reduzindo-se o custo dos produtos. 668
Histria, Cincias, Sade Manguinhos, Rio de Janeiro

NOVAS PERSPECTIVAS EM VACINAS VIRAIS

Sistemas de encapsulamento de antgenos, de modo que sejam liberados mais lentamente no organismo, e com isso atingir maior nmero de clulas alvo do sistema imune, vm sendo desenvolvidos, e novas vias de inoculao vm sendo estudadas, em particular a introduo atravs da pele e em mucosas, stios primrios da infeco do organismo pela grande maioria dos vrus. A possibilidade de associao do maior nmero possvel de antgenos a serem aplicados em uma nica dose vem sendo avaliada por todos os grandes produtores de vacina. O crescimento demogrfico e a dificuldade de se repetirem vacinaes sucessivas nos mesmos segmentos populacionais tm levado a diversas propostas com o grande objetivo de se chegar a uma vacina multivalente, incorporando na mesma dose todos os antgenos protetores utilizados na imunizao bsica.
REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS Ada, Gordon L. et al. 1997 Ada, Gordon L. 1994 Adu-Bobie, Janette et al. 2003 Baraschi, Diana et al. 2003 Bauchereau, J. et al. 1998 Doherty, Peter C. et al. 1997 Ellis, Ronald 2001 Greco, M. 2002 Holmgreen, Jan et al. 2003 Koprowski, Hillary et al. 2001 Murphy, Brian R. et al. 2001 Philpott, D. J. et al. 2001 Schatzmayr, Hermann 2002 Vaccines, vaccination and the immune response. John Curtin School of Medical Research. Lippincott-Raven, pp. 1-236. The development of new vaccines. Em Vaccination and human health London School of Hygiene & Tropical Medicine, Wiley, pp. 67-80. Two years in reverse vaccinology. Vaccine, vol. 21, pp. 605-10. INNAMORA, an European workshop focused on the mechanisms of innate immunity in pathogen-hostinteraction and their exploitation in novel mucosal immunization strategies. Vaccine, vol. 21(2), pp. 1-11. Dentritic cells and the control of immunity. Nature, 293, pp. 245-52. Immune response to viral infection. Em Viral Pathogenesis. Lippincott-Raven, pp. 143-62. Technologies for the design, discovery, formulation and administration of vaccines. Vaccine, vol. 19, pp. 2.681-7. The future of vaccines: an industrial perspective. Vaccine, vol. 20, pp. 101-3. Mucosal immunization and adjuvants: a brief overview of recent advances and challenges. Vaccine, vol. 21(2), pp. 89-95. The green revolution: plants as heterologous expression factors. Vaccine, vol. 19, pp. 2.735-41. Immunization against viral diseases. Em Virology. 4 ed., Lippincott-Raven, pp. 435-67. Innate immune responses of the epithelial cells following infections with bacterial pathogens. Current Opinion in Immunology, vol. 13, pp. 410-6. Use of plants as vectors for production of biomedical products. Virus Reviews & Research, vol. 7, pp. 21-7. Recebido para publicao em outubro de 2002. Aprovado para publicao em julho de 2003.
vol. 10 (suplemento 2):655-69, 2003

669