Profa. Dra. Luciane C. Alberici Ieda Maria R.

Prado

Fgado recm extrado Fragmentar com tesoura Lavar com Meio de homogeneizao gelado + meio de homogeneizao

Homogeneizar com3 ciclos

Centrifugar 600 g/5 min.

Sobrenadante Centrifugar 2000 g/10 min.

Precipitado desprezar

Centrifugar 1800 g/15 min.

Precipitado + 10 mL de meio de lavagem

Sobrenadante desprezar

Sobrenadante desprezar

Precipitado + 1 mL de meio de ressuspenso

Determinao de protena OXGRAFO

Rato wistar de aproximadamente 120g

Fgado

Abre-se o ventre do animal expondo o fgado que ser removido rapidamente com tesoura

O fgado mergulhado em meio gelado, tamponado, com osmolaridade controlada (Sacarose) e alta [quelante de Ca2+](EGTA).

Em seguida, o fgado finamente picotado

O fgado deve ser picotado rapidamente neste meio gelado tamponado

O meio contendo sangue deve ser desprezado; um novo meio adicionado.

Resultado aps picotar e trocar o meio

Potter

Os pedaos de fgado em meio gelado so colocados no potter para serem homogeneizados Pistilo
Potter

O pistilo acoplado ao homogeneizador e o potter mantido em gelo durante o processo

Aps vrios pulsos, obtm-se um homogenato de fgado.

O homogenato transferido para um tubo de centrfuga

Os tubos devem ser equilibrados antes de serem centrifugados

Primeira centrifugao: 600 xg, 5 minutos.

A mitocndria est presente no sobrenadante. No pellet temos os restos celulares e fragmentos de tecido heptico e sangue

O sobrenadante transferido para outro tubo de centrfuga

Segunda centrifugao: 2000 xg, 10 minutos.

O sobrenadante desprezado

Uma fina camada lipdica que ficou aderida ao tubo de centrfuga retirada com auxlio de algodo

A mitocndria presente no pellet delicadamente dispersa com ajuda de um pincel de cerdas macias

Adiciona-se meio gelado tamponado (sacarose, tampo e baixa [EGTA]) para lavagem.

Terceira centrifugao: 1800 xg, 15 minutos.

O sobrenadante desprezado

A mitocndria presente no pellet novamente dispersa com ajuda de um pincel de cerdas macias

Adio de meio gelado tamponado (sacarose e tampo) para a ressuspenso do pellet mitocondrial.

Quantificao de protena mitocondrial pelo mtodo do Biureto

Avaliao da qualidade da preparao mitocondrial atravs da medida de respirao mitocondrial.

Resultados