RESUMEN La micela de casena constituye un sistema coloidal muy estable en la leche.

Este hecho tiene implicaciones relacionadas con la formacin de los geles de casena, as como con la estabilidad de los productos lcteos durante su tratamiento trmico, concentracin y almacenamiento. Por este motivo, la microestructura de la micela de casena ha sido intensamente estudiada durante las ltimas cinco dcadas. A pesar de ello, existen todava muchas lagunas sobre su estructura y estabilidad, como se refleja en los resultados derivados de recientes investigaciones basadas en el empleo de novedosas tcnicas analticas. INTRODUCCIN En el interior del aparato de Golgi de las clulas del epitelio mamario, durante la lactacin, se inicia la agregacin y asociacin de las distintas casenas en partculas esfricas coloidales conocidas como micelas de casena que le confieren la opalescencia caracterstica a la leche. Las micelas de casena (-CN) son estructuras slidas y esponjosas dispersas en un medio acuoso y que presentan un dimetro medio de 160 nm. Segn Farrell et al. la funcin principal de la micelas es fluidificar las molculas de casena y solubilizar el fosfato clcico. Dalgleish define las micelas de casena nativa como el coloide de asociacin de la leche fresca. Las micelas de casena estn formadas por un 92% de casena y un 8% de sales (principalmente fosfato clcico coloidal, CCP) y contienen el 80% de la protena total de la leche. Estudios (cromatografa, electroforesis, filtracin y ultracentrifugacin) han puesto de manifiesto que la micela de casena se compone de cuatro tipos principales de casenas individuales: S1-, S2-, - y -CN. Los distintos tipos de casena se encuentran en todas las especies mamferas estudiadas hasta el momento, aunque su proporcin vara ampliamente segn la especie, como se observa en el Cuadro 1. Sin embargo, a nivel ultraestructural, las micelas de casena son similares en la mayora de las especies.

Las micelas exhiben estructura porosa, muy voluminosa, fuertemente hidratada. La mayora de los modelos estructurales indican que la -CN se halla localizada mayoritariamente en la superficie de la micela, jugando un papel esencial en la regulacin del tamao micelar y en el mantenimiento de la suspensin de las casenas en la leche. La proporcin de -CN vara en relacin inversa con el tamao de la micela, mientras que la de -CN lo hace en forma directa. Interacciones y caractersticas morfofuncionales de las casenas La formacin de las micelas de casena depende de los fenmenos de interaccin que se establecen entre ellas, en presencia del ion calcio. De acuerdo con Brule y Lenoir, la composicin y estructura primaria de las casenas les confieren importantes propiedades fisico-qumicas de inters funcional como: a) marcado carcter aninico en medio neutro por la presencia de radicales fosfoserina y/o cido glutmico; b) insolubilidad en agua a pHi (pH = 46 para la casena entera o bruta) por la ele vada proporcin de radicales apolares y c) agregacin en medio clcico de las casenas S1, S2 y por disminucin de su carga elctrica negativa y de su hidrofilia, como consecuencia de la complejacin del Ca2+ por parte de los radicales fosfoserina presentes en la estructura de dichas casenas. Este comportamiento corresponde a las casenas consideradas de forma aislada, pero en presencia de -CN en proporcin suficiente, cercana al 10%, las dems casenas son solubles en presencia de calcio. El poder estabilizante de la -CN se relaciona directamente con la marcada tendencia asociativa tpica de todas las casenas. En soluciones puras, a pH neutro y en ausencia de calcio las casenas presentan una tendencia a polimerizarse en grados variables segn el tipo de casena de que se trate, mayor en el caso de las casenas y , en las que la reparticin desigual de las cargas les confiere caractersticas detergentes. En medio acuoso se asocian a travs de enlaces hidrofbicos, lo que se traduce en repulsin de las zonashidroflicas hacia el exterior de los polmeros casenicos. La asociacin de las casenas S parece que se produce principalmente por enlaces electrostticos, al presentar stas un reparto ms homogneo de las cargas. Cuando se mezclan los diferentes tipos de casena, su carcter anfiflico y su fosforilacin facilita las interacciones entre ellas y con el fosfato clcico para formar complejos. En ausencia de calcio las asociaciones se establecen a partir de las zonas hidrofbicas y de las cargadas elctricamente, pero en presencia de calcio intervienen enlaces entre los radicales fosfoserina de las casenas y los iones Ca2+, y el

grado de asociacin aumenta considerablemente. Entre 0 y 4C slo las casenas y son solubles a una concentracin 0.03 M de calcio. Sin embargo a esa misma concentracin y a temperatura entre 20 y 25C slo es soluble la -CN. Por su baja solubilidad en presencia de calcio, las casenas S1, S2 y se conocen como casenas sensibles al calcio. La -CN, insensible al calcio, la -CN en lugar de las agrupaciones aninicas de fosfoserilo caractersticas de las casenas sensibles al calcio en el dominio polar contiene residuos serilo y treonilo. Puesto que la CN no contiene agrupaciones fosfoserilo, no liga Ca2+ como las casenas sensibles a ste. Como consecuencia de sus caractersticas estructurales diferenciales, existe una serie de propiedades reservadas a la -CN, que condicionan sus interacciones y su funcionalidad: 1. Interaccin con las casenas sensibles al calcio para formar micelas, ya que acta estabilizndolas frente al Ca2+. 2. Presenta estructura anfiptica, pero con un dominio polar inerte que no precipita en presencia de Ca2+. 3. Presencia de una secuencia de reconocimiento especfica para la proteolisis limitada por la enzima quimosina, que permite la eliminacin selectiva del dominio polar, induciendo la coagulacin de las micelas. Estas tres caractersticas morfofuncionales son la base que permite la formacin de las micelas de casena nativa por interaccin de las casenas en presencia de calcio, regulando la estabilidad micelar en funcin de determinados factores desestabilizantes, que determinan el estado sol/gel de la leche. Modelos estructurales de la micela de casena La multitud de modelos diferentes que han sido propuestos sobre la estructura de la micela de casena constituyen una evidencia clara de la ausencia de conocimientos slidos. La mayora de los modelos propuestos para la micela de casena se clasifican en tres categoras: de ncleo y corteza, de subunidades y de estructura interna Modelos de ncleo y corteza (coat-core) La mayora de los modelos propuestos dentro de la categora de ncleo y corteza se basan en estudios fisicoqumicos y consideran que la micela de casena es una partcula esfrica y lifila constituida por un centro interno e hidrofbico de protenas (ncleo) rodeadas por una cobertura anfiflica (corteza), cuyas protenas son diferentes a las que constituyen el centro. El primero de los modelos de ncleo y corteza fue sugerido por Noble y Waugh en 1965 (Figura 1A) y se basa en estudios sobre la sensibilidad de las casenas al Ca 2+. Este modelo describe la formacin de complejos de bajo peso molecular de s1- y -CN. La Figura 1A muestra monmeros de s1- o -CN con la espiral cargada conteniendo fosfato (Figura 1A-1), que comienzan a gregarse (Figura 1A-2) hasta un tamao lmite que da origen al ncleo de caseinato (Figura 1A-3). Este proceso de crecimiento se detiene cuando se forma una monocapa superficial de -CN que da lugar a la formacin del complejo s1--CN de bajo peso molecular (Figura 1-inferior). El tamao final de la micela depender de la cantidad de -CN disponible. El modelo de Waugh explica la naturaleza lioflica de estos complejos proteicos coloidales as como la accesibilidad de la micela a la accin de la quimosina. El segundo de los modelos propuestos enesta categora es el de Payens (1966), basado en el estudio de las propiedades asociativas de las casena. En la Figura 1B se aprecia en detalle el ncleo de la micela de casena constituido por una zona densa formada por molculas de s1-CN adheridas a una red laxa de -CN. Como en el modelo de Noble y Waugh (1965), la superficie micelar esta cubierta por -CN, si bien, el modelo de Payens (1966) contempla la presencia de CCP tanto en la superficie como en el interior de la micela. En 1969, Parry y Carroll emplean anticuerpos especficos para la -CN marcados con ferritina y observan, mediante microscopia electrnica, muy bajas concentraciones de dicha casena en la superficie micelar. Como consecuencia, deducen que la -CN se concentra en el interior de la micela tal y como se muestra en la Figura 1C. En los modelos de ncleo y corteza, la corteza jugara un papel protector frente al proceso de agregacin micelar, de acuerdo con el conocido efecto estabilizador de la capa pilosa de -CN, excepto en el modelo de Parry y Carroll (1969), que por el contrario sostienen que la -CN forma parte del ncleo. Con la excepcin de este ltimo modelo, los modelos ncleo ycorteza explican la demostrada accesibilidad de la quimosina a la -CN y la relacin existente entre el contenido de CN de la micela y su tamao.

Modelos de subunidades Estos modelos consideran que la micela de casena est dividida en subunidades individuales denominadas submicelas que pueden tener una composicin idntica o variable entre s (Figura 2). La existencia de submicelas se ha fundamentado ampliamente en base a mtodos fsico-qumicos como la disociacin de las micelas en submicelas o el anlisis de submicelas de caseinato sdico y su sucesivo crecimiento por adicin de calcio. La estructura submicelar tambin ha sido defendida mediante observacin con microscopa electrnica y estudio con dispersin de neutrones. El primer modelo, introducido por Morr en 1967 (Figura 2A), fue modificado gracias a las contribuciones de Slattery y Evard en1973 (Figura 2B), y Schmidt en 1982 (Figura 2C) dando lugar a uno de los modelos ms ampliamente aceptado, el modelo de Walstra y Jenness de1984 (Figura 2D). Este modelo clsico considera que las micelas de casena son partculas esfricas groseras con una superficie rugosa, constituida por pequeas submicelas con un dimetro entre 12-15 nm. Las submicelas contendran aproximadamente 20-25 molculas de casena con una composicin variable. Tambin,se describe en las submicelas centros hidrofbicos y superficies hidroflicas. Podemos diferenciar dos tipos de submicelas, unas que contienen s- y -CN y otras formadas por s- y -CN, estas ltimas ms hidroflicas debido a los residuos glucdicos de la -CN. Las distintas submicelas se encuentran unidas mediante CCP. Las molculas de -CN se encontraran orientadas hacia el exterior de la micela con la parte hidroflica del grupo carboxilo terminal sobresaliendo de la superficie micelar en forma de vellosidad, constituyendo una capa pilosa que previene la agregacin de la micela mediante un mecanismo de estabilizacin estrica y electrosttica. Estudios realizados mediante dispersin de rayos X sobre micelas de casena y de caseinato sdico determinan dentro de las mismas una zona interior con una mayor densidad electrnica formada por cadenas hidrofbicas mientras que hacia el exterior las reas son hidroflicas, con una menor densidad electrnica y con protrusiones de -CN hacia el exterior. Recientemente, Povey et al. (1999) emplean una tcnica de espectroscopa de ultrasonidos que permite determinar un tamao submicelar de 20 nm. La eliminacin de calcio en la leche conduce a la desintegracin de las micelas en partculas de apariencia submicelar. La estructura interna de la submicela se mantendra principalmente mediante las interacciones hidrofbicas que se establecen entre las molculas de casena individuales mientras que las submicelas interactuaran por incorporacin de los agrupamientos de fosfoserilo aninicos a la estructura del CCP. La naturaleza de las uniones entre unas submicelas y otras es an mal conocida, habindose tambin apuntado la participacin de uniones hidrofbicas y de otras fuerzas, adems de la existencia de los puentes salinos de CCP. Gracias a la distribucin de los diferentes tipos de casena en el interior de las submicelas, y a la organizacin de los diferentes tipos de submicelas entre s, se forma una estructura micelar en la que segn Swaisgood (1996) la -CN tambin se localiza predominantemente en superficie mientras que las casenas S- y - se agrupan en el interior. Sin embargo, la distribucin no es excluyente porque las protenas sensibles al calcio tambin estn accesibles en la superficie. Cuando el dominio polar de la -CN, que no puede interaccionar con el calcio, ocupa una proporcin suficiente de la superficie micelar, sta deja de crecer por lo que cuanto mayor sea el nmero de submicelas ricas en la -CN tanto menor ser el tamao micelar. Esta distribucin de casenas contribuye a explicar porque la cantidad de -CN de la micela aumenta linealmente con la relacin superficie/volumen, mientras que la cantidad de -CN disminuye linealmente. Puesto que los componentes del suero se equilibran lentamente con los de la micela, la adicin de -CN reduce el tamao micelar y la adicin de -CN produce el efecto contrario. Recientemente, algunos resultados obtenidos introducen dudas que cuestionan la existencia de las submicelas, as como la localizacin y papel que juega el CCP dentro de las micelas. Horne (2006) seala que el modelo submicelar genera ciertas dudas al no explicar el mecanismo de segregacin de la -CN. Varios modelos submicelares, como los propuestos por Slattery y Evard en 1973 y por Walstra y Jenness en 1984, contemplan la segregacin de la -CN para formar reas ricas en -CN llamadas parches (patches) que se observan en aquellas subunidades situadas en la zona superficial de la micela de casena. Sin embargo, dichos modelos no explican

el motivo por el cual a pesar de la fuerte tendencia de la -CN a asociarse entre s, sta es capaz de asociarse tambin con otras casenas para constituir submicelas mixtas que contienen todos los tipos de casena. Dicho autor considera adems que los resultados de McMahon y McManus (1998) y de Dalgleish et al. (2004), obtenidos mediante microscopia electrnica, descartan la existencia de subunidades en las micelas de casena. Modelos de estructura interna Estos modelos consideran la micela de casena como una red proteica, tridimensional, porosa y mineralizada. Estas observaciones se sustentan en las propiedades e interaccionesque muestran cada uno de los distintos tipos de casena de forma separada y que conducen a la formacin de la estructura interna de la micela. Las evidencias que respaldan este tipo de modelos provienen fundamentalmente de anlisis qumicos y de microscopa electrnica. El primer modelo de estructura interna fue propuesto por Rose (1969) (Figura 3A). Este modelo est basado en la polimerizacin endotrmica de la -CN, donde los monmeros se asocian entre s generando polmeros a los que posteriormente se unen molculas de s1-CN, mientras que las molculas de -CN interaccionan con las 1-CN formando agregados que limitan el tamao de la micela. Una vez formada la micela, el CCP acta como un agente estabilizador formando uniones que dan lugar a una estructura mucho ms estable. Un ao ms tarde, en 1970, Garnier y Ribadeau-Dumas presentan un modelo alternativo de estructura interna (Figura 3B). En dicho modelo se resalta el papel de la -CN como elemento clave de la estructura de la micela de casena considerada como una red porosa tridimensional de protenas agregadas.Este modelo no asigna un papel importante al CCP, que estara implicado simplemente como nexo de unin intermicelar. Los modelos de estructura interna no tuvieron gran aceptacin a partir de los aos setenta. Sin embargo, como resultado de recientes controversias generadas en relacin con los modelos de subunidades, Holt (1992) y Horne (1998) han reconsiderado los modelos de estructura interna y proponen modelos originales alternativos incluidos en esta categora. Modelo de Holt Este modelo (Holt, 1992) rechaza el concepto de submicela y describe la micela como un entramado flexible de casena aproximadamente esfrico y fuertemente hidratado y mineralizado (Figura 4, A). En este modelo, las molculas de casena formaran una estructura gelatinosa con nanogrnulos (nanoclusters) de CCP, donde el extremo C-terminal de la -CN se extendera hacia el exterior de la superficie micelar contribuyendo a la formacin de la capa pilosa. Los nanogrnulos constituiran el centro de crecimiento de la micela. Holt et al. (1998) descubren que la secuencia aminoacdica fosforilada de la -CN podra unirse a los nanogrnulos de CCP, estabilizndolos y regulando su tamao. Sin estas estructuras fosfopeptdicas los nanogrnulos aumentaran de tamao en exceso y precipitaran. Este descubrimiento llev a De Kruif y Holt (2003) a afirmar que los nanogrnulos seran las piezas centrales de la estructura de la micela de casena. Este modelo explica el reducido dimetro (unos pocos nanmetros) de las regiones de CCP observadas por Knoop et al. (1973) en el interior de las micelas. Tambin, justifica el elevado tiempo necesario para el intercambio entre las fracciones de calcio coloidal y soluble. Por el contrario, el modelo de Holt no ofrece una explicacin plausible sobre la formacin de la capa pilosa y la reducida presencia de -CN en el interior de las micelas. Walstra (1999) ha intentado conciliar su modelo clsico de subunidades con las evidencias en favor de la presencia de nanogrnulos homogneamente distribuidos a lo largo de la micela. Este investigador propone un modelo (Figura 4, B) en el que se sugiere que el CCP en lugar de situarse hacia el exterior de las submicelas y actuar como nexo de unin entre las mismas, ms bien se localiza en el interior de las submicelas. Sin embargo, Dalgleish et al. en 2004, mediante el empleo de microscopa electrnica de barrido de alta resolucin, no encuentran evidencias que justifiquen la existencia de las submicelas pero s determinan resultados convincentes de la organizacin de las casenas en el interior de la micela donde aparecen estructuras tubulares de 20 nm de dimetro. Los autores de este ltimo estudio sugieren que la superficie micelar no es lisa y contiene huecos entre las subestructuras tubulares (Figura 4D).

Modelo de doble unin de Horne El modelo de doble unin propuesto por Horne en 1998 (Figura 4, C) podra considerarse como una extensin del modelo de estructura interna de Holt. El modelo de doble unin, a diferencia del de Holt, sugiere que las interacciones protena-protena son esenciales y considera que la naturaleza anfiflica de las casenas es la responsable de la polimerizacin y estructuracin micelar. El CCP se puede extraer fcilmente de las micelas de casena mediante acidificacin de la leche a temperaturas por debajo de 20C sin que se ocasione alteracin aparente de la estructura micelar. Adems, la adicin de urea induce la disociacin de la micela de casena sin que se produzca la disolucin del CCP. La mayora de los modelos anteriormente descritos no proporcionan una explicacin adecuada de dichos hallazgos, que sugieren claramente al CCP como modulador de la funcin del Ca2+ y del fosfato en la micela ms que como responsable directo de la unin entre las submicelas. El modelo de doble unin, en un intento de superar esta limitacin observada en los modelos anteriores, identifica dos tipos de uniones como principales responsables de la cohesin y estabilidad micelar. En este modelo, las interacciones hidrofbicas seran las responsables de la fuerza de atraccin que contribuyen a la formacin y estabilizacin de la micela, mientras que las repulsiones de tipo electrosttico seran las limitadoras del crecimiento ininterrumpido de la misma. De esta forma, y por el contrario que en los modelos previos, el modelo de estructura interna introducido por Horne proporciona una explicacin vlida de los mecanismos de ensamblaje, formacin y crecimiento micelar. Dicho modelo se corresponde ampliamente con las micrografas electrnicas de transmisin obtenidas por McMahon y McManus (1998). Horne (2006) comenta que el modelo de Holt tambin explica lo observado en las micrografas electrnicas obtenidas por McMahon y McManus (1998) y coincide con el modelo de doble unin en cuanto al tamao de los nanogrnulos. Sin embargo concluye que el modelo de Holt lleva a confusin e improvisa en muchos aspectos. Finalmente, el modelo propuesto por Horne constituye una buena herramienta para profundizar en el anlisis y compresin de algunos de los fenmenos fsicos y reolgicos ms complejos, y de mayor transcendencia funcional, que caracterizan a los geles lcteos. DISCUSIN El estudio y conocimiento de la estructura de la casena es fundamental para una mejor comprensin, aprovechamiento y control de su funcionalidad en la elaboracin de productos lcteos. A pesar de la gran cantidad de estudios que se han realizado durante los ltimos cincuenta aos con el objetivo de clarificar la verdadera estructura de la micela de casena, sta no es conocida ni comprendida an con suficiente detalle, por lo que se requiere un mayor esfuerzo investigador que permita una mejor explotacin tecnolgica de las propiedades fsicas, qumicas y estructurales del sistema micelar.