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2007

Apostila da Ocina Prtica de Gentica, Genoma e Biotecnologia

Terceiro mdulo Transformao
Contedo deste mdulo Transformao bacteriana Clonagem gnica Operon Lac Expresso gentica

O fenmeno conhecido como transformao bacteriana de importncia central na biologia molecular. Por esse processo possvel a introduo de plasmdeos (que so pequenas molculas de DNA circular) fabricados ou naturais, dentro das bactrias. Em seguida possvel a realizao da propagao, expresso gnica e isolamento do DNA dos plasmdeos. O processo de transformao involve a introduo de DNA exgeno (que no pertence bactria) nas clulas bacterianas, e este DNA passa a Foi atravs da fazer parte do material gentico da bactria, podendo ser herdado pelas descoberta do novas clulas todas as vezes em que a bactria se multiplicar. Atravs da sistema conheci- manipulao gentica podemos criar um carter presente na bactria do como Operon que passar a ser hereditrio. No entanto, para permitir a entrada de Lac que os cien- DNA plasmidial nas clulas bacterianas, as bactrias devem apresentar tistas obtiveram condies siolgicas especiais. Este estado siolgico especial chamado as primeiras pistas de competncia. Uma bactria competente uma bactria que est apta de como os genes a receber DNA exgeno. A competncia pode ocorrer naturalmente ou pode ser produzida atravs de diferentes tcnicas. Estas tcnicas envolvem so regulados. o tratamento com solues como cloreto de clcio e mudanas bruscas O Operon Lac, de temperatura. Os ons de metal e as mudanas bruscas de temperatura descoberto em alteram a permeabilidade da parede celular, fazendo com que estas clulas 1959 pelos cienpermitam a entrada de DNA exgeno atravs da membrana celular. As tistas do Instituto bactrias competentes so bastante frgeis e devem ser manuseadas com Pasteur- Fanois cuidado. Jacob e Jaques A quantidade de clulas transformadas por 1 micrograma de DNA Monod-, revelou chamada e cincia da transformao. Na prtica, pouca quantidade de que os genes po- DNA usada (5 a 100 nanogramas), uma vez que muito DNA pode inibir a dem ser controla- transformao. Muitos plasmdeos servem como instrumentos teis para dos por um outro o bilogo molecular. Um exemplo o pGAL, presente em muitas cpias em linhagens espec cas de E. coli. grupo de genes, Este plasmdeo foi modificado por chamados genes tcnicas de engenharia gentica reguladores. (veja a figura do mapa circular do pGAL no final desta apostila). Na clula, este plasmdeo no se junta ao cromossomo bacteriano, mas se replica independentemente. Modificaes neste plasmdeo incluem adio do gene lac Z que produz uma enzima

O Operon Lac formado pelos seguintes componentes: 1. Gene regulador: produz uma protena que reprime o Operon quando no h lactose no meio; 2. Operador: regio do DNA onde a protena produzida pelo gene regulador se liga; 3. Promotor: local onde a enzima que produz a ta de RNA-m (chamada de RNA polimerase) se liga; 4. Genes estruturais: os genes que produzem as enzimas propriamente ditas. Neste caso so as enzimas necessrias para o metabolismo de lactose (beta-galactosidase, betagalactosidase permease e beta-galactosidase transacetilase).

Operons so grupos de genes dispostos em seqncia e transcritos por uma nica ta de RNA mensageiro presentes em bactrias. O Operon Lac Z possui 3 genes: Lac Z (que produz a enzima beta-galactosidase), Lac Y (que produz uma protena que permite a entrada de lactose na clula) e um terceiro gene cuja funo ainda no est clara. O Operon Lac s transcrito quando no h glicose no meio onde est a bactria. A enzima beta-galactosidase converte a lactose em galactose e glicose, que ento utilizada como fonte de energia.

chamada beta-galactosidase. A presena desta enzima faz com que a colnia da bactria que tem em seu interior este plasmdeo seja azul quando colocada em presena do composto qumico X-gal. Isto ocorre porque a quebra do composto qumico X-gal pela enzima beta-galactosidase forma um produto colorido, de cor azul. Quando adicionamos um fragmento exgeno de DNA (que no pertence ao plasmdeo) dentro do plasmdeo, fazemos atravs de uma reao chamada de ligao. Antes da reao de ligao cortamos o DNA circular do plasmdeo com uma enzima de restrio X e utilizamos a mesma enzima de restrio para cortar o fragmento de DNA exgeno que se pretende introduzir no plasmdeo. Assim, tanto plasmdeo como fragmento de DNA iro possuir o que chamamos de extremidades coesivas, ou seja, as extremidades dos fragmentos de DNA so complementares. O stio de restrio da enzima utilizada para cortar o plasmdeo se localiza exatamente na regio onde est o gene que codi ca a enzima betagalactosidase. Assim, quando o plasmdeo cortado e introduzimos um fragmento de DNA exgeno nesta regio, o gene que produz a enzima beta-galactosidase destrudo. Sendo assim, as colnias de bactrias que possurem o plasmdeo com a enzima betagalactosidase intacta em seu interior iro produzir colnias azuis, enquanto a colnia de bactria que possuir o plasmdeo que teve a enzima beta-galactosidase destruda ir produzir colnias brancas. As bactrias utilizadas neste experimento no possuem este gene, sendo assim, na falta do plasmdeo contendo este gene, as bactrias iro produzir colnias brancas. Outro importante instrumento utilizado em experimentos de clonagem o antibitico. As bactrias utilizadas neste experimento no so resistentes ao antibitico ampicilina. No entanto, o plasmdeo utilizado possui o gene de resistncia ampicilina. Deste modo, apenas as bactrias possuindo plasmdeos em seu interior sero resistentes ampicilina. As que no possuem o plasmdeo morrero na presena da ampicilina. Nesta aula iremos transformar uma linhagem bacteriana com um plasmdeo espec co e poderemos observar todos os fenmenos descritos anteriormente.

Atividade de Laboratrio Preparao para transformao (por grupo) 1) Coloque os tubos em que esto escritos pGAL e controle (10ul), no gelo. Coloque as iniciais do seu grupo nos tubos pGAL e controle. 2) Trans ra 40 microlitros do volume do tubo escrito bactria para cada um dos dois tubos, isto , pGAL e controle. 3) Feche os tubos, mexa dando petelecos e coloque-os de volta no gelo. 4) Deixe as clulas no gelo por 10 minutos.

Porque usar controles em experimentos? O controle utilizado pelo cientista como uma demonstrao de que os resultados obtidos em um experimento esto dentro das possibilidades previstas e que os mesmos podem ser considerados signi cativos (ou no). Por exemplo, se quisermos demonstrar que Procedimento para a transformao o plasmdeo pGAL tem a capacidade 0 1) Coloque as clulas a 42 C por 1 minuto e meio. de se inserir dentro da bactria e deste 2) Coloque os tubos de volta no gelo por 1 minuto. modo torn-la resistente `a ampicilina 3) Adicione 0,75 ml de meio LB aos tubos pGAL (contendo o plasmdeo) e controle e se ao realizarmos o experimento de (contendo gua). introduo do pGAL dentro da bactria tambm introduzimos o meio no qual 4) Deixe os tubos incubando a 370C por 30 minutos. est o pGAL (meio LB), como podemos 5) Recolha os tubos e deixe a temperatura ambiente. demonstrar que de fato o pGAL, e no o meio LB que vai junto com o pGAL, que Plaqueamento e seleo de bactrias proporciona a resistncia ampicilina? Se 1) Coloque as iniciais do seu grupo em todos as placas. usarmos apenas o meio LB sem o pGAL 2) Na placa escrita LB/Amp- adicione 10 ul de X-gal na superfcie da para transformar a bactria, seremos capazes de dizer se o pGAL, ou o meio placa e deixe-a secar por uns 5 a 10 minutos. Escreva na placa: LB, que confere tal resistncia. controle 1.

3) Numa das placas escrita LB/AMP+, adicione X-gal do mesmo modo como descrito antes e escreva: controle 2. Na outra placa LB/AMP+, adicione X-gal, como descrito anteriormente, e escreva : pGAL. Plaqueamento de clulas do tubo controle 1) Dispense 40 microlitros do tubo escrito controle nas placas escritas control 1 e control 2. 2) Espalhe as clulas. 3) Espere secar. Plaqueamento de clulas do tubo com pGAL 1) Dispense 40 microlitrosdo tubo pGAL DNA na placa escrita pGAL. 2) Espalhe as clulas. 3) Espere secar. Deixe incubando na bancada de cabea para baixo!
O gene Lac Z muito utilizado como gene reprter nos experimentos com DNA recombinante. Gene reprter aquele utilizado como marcador, e oferece uma informao fundamental quanto ao sucesso do experimento em questo. O plasmdio pGal utilizado nest atividade contm em seu interior o gene que produz a enzima beta-galactosidase ( lacZ ). A linhagem de bactria utilizada no possui este gene. Para testar se o plasmdio foi introduzido na bactria com sucesso, o cientista utiliza um substrato chamado X-gal, (5- bromo-1-cloro3-indoil- -D-galactoside) que quando degradado pela beta-galactosidase produz um produto azul. Assim, se as colnias de bactrias forem azuis, signi ca que o plasmdio foi introduzido na bactria com sucesso, uma vez que so eles que possuem esta enzima em seu interior. Este sitema pode informar ao cientista se o seu experimento de introduo do plasmdio na bactria funcionou ou no.

Em 1 litro de meio LB (Luria-Bertani) h: 10g Bacto-triptone. 5g de extrato de levedura 10g NaCl. Esse o prato preferido da bactria!

Tente responder s seguintes perguntas 1) Por que as clulas competentes que no receberam o plasmdeo no conseguem crescer no meio contendo ampicilina?

2) Por que as colnias da placa controle 1 no so azuis?

3) Por que necessrio se utilizar controles neste experimento e que tipo de pergunta os controles 1 e 2 podem responder?