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UNIVERSIDADE FEDERAL RURAL DO RIO DE JANEIRO INSTITUTO DE CINCIAS EXATAS DEPARTAMENTO DE QUMICA SETOR DE BIOQUMICA

Bioqumica Experimental
Roteiros de Prticas e Fundamentos Tericos

2013
ESPECTROFOTOMETRIA
INTRODUO: A espectrofotometria uma tcnica analtica que avalia a capacidade dos solutos absorverem luz em comprimentos de onda especficos. A medida da luz absorvida permite, entre outras coisas, inferir sobre a concentrao do soluto em determinada soluo ou material biolgico.

Radiao Eletromagntica - Uma radiao eletromagntica, como a luz visvel, pode ser descrita (Figura 1): Como uma onda constituda por um componente vetor eltrico e por um componente vetor magntico Como uma srie de pacotes discretos de energia (ftons)

No primeiro caso, pode-se aplicar radiao os parmetros caractersticos de um movimento ondulatrio (comprimento de onda, frequncia e nmero de ondas).

Figura 1: Representao esquemtica de uma radiao eletromagntica. O campo eltrico e o campo magntico so perpendiculares entre si e ambos oscilam perpendicularmente direo de propagao da onda, onde E o campo eltrico e M o campo magntico.

A energia eletromagntica no precisa de um meio material para se propagar, sendo definida como uma energia que se move na forma de ondas eletromagnticas velocidade da luz (300.000 km/s). Dado que a velocidade de propagao das ondas eletromagnticas diretamente proporcional sua frequncia e comprimento de onda, esta pode ser expressa por:

Onde:

(1)

c=f X

c: velocidade da luz (m/s) f: frequncia (ciclos/s ou Hz) : comprimento de onda (m)

Comprimento de onda () a distncia linear entre dois picos de ondas. As unidades usadas para o comprimento de onda de uma radiao eletromagntica: 1 nanmetro (nm) = 10-9 m

1 micrmetro (m) = 10-6 m 1 angstrom () = 10-10 m = 10-8 cm

Frequncia (f) o nmero de ondas completas (ciclos) que passam por um determinado ponto por segundo. Unidade: s-1 Nmero de ondas o nmero de ciclos (ondas) por cm. Unidade: cm-1 Teoria de Planck e o espectro eletromagntico - A distribuio das radiaes eletromagntico existentes na natureza pela ordem dos seus comprimentos de onda ou nmero de onda constitui o espectro eletromagntico.

Em 10-27 e (2), temos:

que erg.s.

constante de Planck = 6,62 x Combinando (1)

Assim a energia de cada fton proporcional frequncia e ao nmero de onda e inversamente proporcional ao comprimento de onda (Figura 2).

Figura 2: Representao do espectro eletromagntico.

OBJETIVO GERAL DA PRTICA: Dosagens de espcies qumicas mediante a absoro de luz e construo de curva padro. I. DETERMINAO DO ESPECTRO DE ABSORO: 1. Objetivo: Determinar o comprimento de onda timo (pico de absoro mximo) para o corante indicado.

2. Princpio do mtodo: A Colorimetria e a Espectrofotometria podem ser conceituadas como um procedimento analtico atravs do qual se determina a concentrao de espcies qumicas mediante a absoro de energia radiante (luz). Fotometria uma tcnica de anlise quantitativa que envolve a medida de intensidade de absoro de luz monocromtica de um composto qumico em soluo. Serve para identificar o comprimento de onda caracterstico para cada composto e para quantificao do composto atravs de: 1) absoro direta e 2) atravs de mtodo colorimtrico. As relaes quantitativas nesta tcnica so dadas pela combinao de duas leis (Lei de Lambert-Beer):

Lei de Lambert: quando um feixe de luz passa atravs de um meio absorvente (slido ou lquido), pores iguais deste meio iro absorver luz. Lei de Beer: a absoro da luz proporcional concentrao do soluto na soluo.

Ento, a intensidade de absoro depende: do comprimento de onda escolhido (normalmente usa o mx onde o composto absorve mais luz); do percurso que o feixe de luz percorrer na soluo; da concentrao do composto nessa soluo. A lei de Lambert-Beer relaciona esses trs fatores e estabelece que: A = .l.c Onde: A = absorvncia (definida pela reao seguinte: A = - log It/I0, que por ser uma razo, no possui unidade (Io intensidade de luz incidente; It intensidade de luz transmitida); = absortividade molar (caracterstico de cada substncia), em L.(mol.cm)-1; l = caminho ptico (percurso da luz monocromtica na soluo), em cm; c = concentrao da substncia em mol/L.

Figura 3: Io intensidade de luz incidente; It intensidade de luz transmitida aps percorrer o caminho ptico (l) pela soluo da amostra.

Desta forma, mantendo-se o caminho ptico constante, a absorvncia torna-se diretamente proporcional concentrao da substncia no respectivo mx. A frao de luz que passa por uma amostra (a transmitncia = It/I0) est relacionada logaritmicamente, e no linearmente, com a concentrao da amostra (Figura 3). Ento, estabelecendo a relao: A = log Io/It Ou seja: Quando Io = 100% Quando It = 1 Quando It = 100% Quando It = zero A = 2 log It A=2 A=0 A= log 100/It log 100 log It A = 2 log It

A intensidade da radiao transmitida por uma substncia utilizada para a sua determinao quantitativa. Essa a base dos ensaios colorimtricos e espectrofotomtricos. Para descontarmos a absorvncia do meio em que o soluto est dissolvido (solventes como gua, tampes, solventes apolares, etc) utiliza-se um branco (que vai conter tudo que se tem no meio a ser medido a absorvncia menos o soluto). Espectrofotmetros instrumento utilizado para medir a quantidade de luz de um dado comprimento de onda que transmitida por uma amostra (Figura 4).

Intensidade da luz incidente I0 Monocromador

Intensidade da luz transmitida I

Lmpada

Detector Cubeta com amostra com c moles/litros da espcie a ser analisada

Figura 4: Principais componentes de um espectrofotmetro . Uma fonte (lmpada) emite a luz com uma grande faixa de espectro. Essa luz selecionada por um monocromador que transmite em um comprimento de onda especfico. A luz monocromtica passa atravs da amostra em uma cubeta com caminho ptico l. Uma parte da luz absorvida pela amostra dependendo da concentrao (quanto maior a concentrao da amostra maior ser a luz absorvida). A luz transmitida medida por um detector.

Cubetas: uma vez selecionado o no qual se deseja fazer a anlise, essa radiao especfica atravessar um recipiente, com caminho tico definido, que contem a amostra (cubeta). As cubetas de vidro so as mais baratas do que as de quartzo e por isso devem ser usadas sempre que possvel. No entanto o vidro absorve radiao na faixa do UV e tem sua utilizao limitada para a faixa de 360 a 800nm, enquanto as cubetas de quartzo podem ser usadas de 200 a 800nm. 3. Reagentes e preparo das solues:

Azul de metileno, alaranjado de metila, violeta cristal e vermelho de metila, solues 1 mg% (0,001%):

Dissolver 0,001 g do corante em 100 mL de gua destilada (usar um balo volumtrico). 4. Procedimento:

Branco: pipetar 3 mL do solvente (gua) utilizado para solubilizar o corante na cubeta de vidro; Realizar a leitura no espectrofotmetro (zerar a leitura - branco); Pipetar 3 mL da soluo contendo o corante designado na cubeta de vidro; Realizar as leituras e anotar as absorvncias nos comprimentos de onda relacionados abaixo:

CORANTE: (nm) ABS 400 420 440 470 500 530 570 600 630 660 690

II. CONSTRUO DA CURVA PADRO (DETERMINAO DA LEI DE LAMBERT-BEER): 1. Objetivo: Construir uma curva padro e determinar a concentrao de uma amostra de corante desconhecida. 2. Princpio do mtodo: Podemos utilizar uma soluo de concentrao conhecida do composto a ser analisado (ou outra substncia de caractersticas qumicas semelhantes) para construir um grfico de absorvncia em funo da concentrao da substncia em questo. Com este grfico, denominado curva padro, podemos medir a quantidade da molcula (soluto) que absorve um determinado comprimento de luz em amostras de concentrao desconhecida, desde que, estas estejam nas mesmo condies utilizadas para a construo da curva padro (mesmos reagentes, mesma temperatura, etc) (Figura 5).

Figura 5: Um exemplo de uma curva padro. ABS x concentrao (mol/L)

3. Reagentes e preparo das solues: Idem a seo anterior. 4. Procedimento:

Identificar 7 tubos de ensaio e coloc-los em uma estante; Adicionar os reagentes conforme a tabela abaixo;

TUBO Corante 1mg% (mL) Amostra (mL) gua destilada (mL)

B 0 0 5

1 1 0 4

2 2 0 3

3 3 0 2

4 4 0 1

5 5 0 0

D 0 5 0

ABS Concentrao (mg%)

Realizar as leituras no espectrofotmetro (tubos 1-5 e D) no comprimento de onda ideal para o seu corante (volumes e procedimento similares ao efetuado na prtica anterior) e anotar os valores obtidos;

III. REGRESSO LINEAR E CONSTRUO DOS GRFICOS Aps a construo da curva padro temos as absorvncias para diferentes diluies de uma soluo de concentrao conhecida (soluo padro). A absorvncia de uma soluo proporcional concentrao da soluo e a distncia percorrida pelo feixe de luz atravs da soluo (Lei de Lambert-Beer). Ento, ao se construir o grfico com os dados obtidos acima (curva padro), temos:

AN A3 A2 A1
C1 = A1 C2 = A2 C3 = A3 ... CN = AN Teoricamente, A1/C1 = A2/C2 = A3/C3 = AN/CN Onde:

3 2 1

C1

C2

C3

CN

A = absorvncia; C = concentrao conhecida do padro

No entanto, h disperso dos pontos na prtica, ento, se traa a melhor reta, ou se determina o coeficiente angular mdio: Segundo a equao da reta: y = ax + b (sendo a o coeficiente angular da reta e b o coeficiente linear) Ou seja: A = . C + b (b = 0) ou = A/ C

Calcula-se o para cada concentrao (1 = A1/C1; 2 = A2/C2 ....) O mdio obtido a partir do somatrio de todos os calculados e representa a inclinao da reta. Ento: Se = A/ C C = A/ Pode-se calcular a Cd (desconhecida) com os seguintes dados: Cd = Ad/ m

REFERNCIAS: PETKOWICZ, C.L.O. Bioqumica. 7. ed. Curitiba: Ed. UFPR, 2007. CISTERNAS, J.R.; VARGA, J.; MONTE, O. Fundamentos de bioqumica experimental. 2. ed. So Paulo: Atheneu, 2005. MASTROENI, M.F.; GERN, R.M.M. Bioqumica: prticas adaptadas. So Paulo: Atheneu, 2008. NARDY, M. B.C.; STELLA, M.B.; OLIVEIRA, C. Prticas de laboratrio de bioqumica e biofsica: uma viso integrada. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2009.

MTODOS QUALITATIVOS DE ANLISE DE BIOMOLCULAS


INTRODUO: Muitas molculas biolgicas so macromolculas, que so polmeros de alto peso molecular constitudos pela repetio de unidades menores, chamados monmeros. Estas macromolculas se apresentam em grande variedade quanto ao tamanho e tambm quanto aos seus monmeros constituintes. Entre as macromolculas de maior importncia esto as protenas, formadas por aminocidos; os polissacardeos (carboidratos), polmeros de acares simples, como a glicose; e os cidos nuclicos (DNA e RNA), constitudos por nucleotdeos. Alm destas macromolculas, molculas menores como lipdios, gua, sais minerais e vitaminas tambm possuem um importante papel na constituio e funo celular. Embora molculas individuais de lipdios sejam

muito menores do que protenas, cidos nuclicos e carboidratos, estes tambm apresentam unidades monomricas e muitos podem se associar no covalentemente formando agregados maiores. A bioqumica preocupa-se com o estudo tanto da constituio destas biomolculas como a importncia biolgica dos processos e interaes destas. A identificao destas biomolculas, assim como o conhecimento de suas caractersticas e propriedades um passo essencial para o entendimento destes processos. OBJETIVO GERAL DA PRTICA: Identificar a presena de diferentes biomolculas (protenas, lipdios, cidos nucleicos, carboidratos e tambm aminocidos) em amostras biolgicas atravs de reaes especficas. Nesta prtica cada grupo ir receber um conjunto com 6 amostras e dever identificar para cada amostra se esta um lipdio, uma protena, um aminocido, um carboidrato ou um cido nuclico. Para atingir este objetivo sero realizados os testes qualitativos descritos abaixo. A. TESTE PARA LIPDIOS (TESTE DE SOLUBILIDADE EM GUA): Identificao da presena de lipdios nas amostras desconhecidas. 2. Princpio do mtodo: Os lipdios so molculas com grande variedade estrutural e funcional, no entanto, estas substncias so caracterizadas pela baixa solubilidade em gua e outros solventes polares, e alta solubilidade em solventes apolares. 3. Procedimento:

1. Objetivo:

Identificar 7 tubos de ensaio conforme a tabela abaixo e colocar em uma estante; Adicionar os reagentes conforme a tabela abaixo:

Obs. Note que voc far um controle positivo do teste usando uma amostra de leo. Lipdio (mL) 1,0 Amostra (mL) 1,0 1,0 1,0 Resultados

TUBO CP A no__ A no__ A no__

gua 2,0 2,0 2,0 2,0

A no__

1,0 2,0 Legenda: CP (controle positivo); A (amostra).

No teste considerado positivo para a presena de lipdios quando houver a formao de duas fases.

B. TESTE PARA PROTENAS (REAO DO BIURETO) 1. Objetivo: Identificar a presena de protenas nas amostras desconhecidas. 2. Princpio do mtodo: Protenas e peptdeos com no mnimo trs aminocidos, na presena do Reativo de Biureto desenvolvem uma colorao prpura. Este mtodo baseado na reao do sulfato de cobre em meio alcalino (reativo de Biureto) com protenas e peptdeos. O nome do mtodo provm do fato de que a uria aquecida a 180 oC forma um composto chamado Biureto. Este composto na presena de ons de cobre em meio fortemente alcalino formar um composto de cor azul.

Uria
Figura 14: Reao do Biureto.

Biureto

Complexo com cobre

Quando o composto contm duas ou mais ligaes peptdicas, produz um complexo cobre-protena ou cobre-peptdeo de cor prpura ou azul-violeta, que absorve luz a 545 nm. A intensidade de cor produzida proporcional ao nmero de ligaes peptdicas que esto reagindo, portanto, a quantidade de protenas presentes pode ser determinada. Quando a soluo possuir elevada concentrao de peptdeos (tri-, oligo- e polipeptdeos) a colorao desenvolvida ser rosa a avermelhada. A sensibilidade do mtodo de 0,5 a 5 mg/mL.

3. Reagentes e preparo das solues: Reagente de Biureto:

Dissolver 1,5 g de CuSO4.5H2O e 6 g de tartarato duplo de sdio e potssio (C4H4O6.Na.K.4H2O) em 500 mL de gua; Adicionar 300 mL de NaOH 10%; Adicionar gua destilada suficiente para completar o volume final para 1 litro de soluo. Conservar a temperatura ambiente protegido da luz.

Soluo padro de casena 1%:

1. Dissolver 2 g de casena em 200 mL de gua destilada. Aliquotar em fraes


de 10 mL e conservar a 20oC. 4. Procedimento:

Identificar os tubos de ensaio conforme a tabela abaixo e colocar em uma estante; Adicionar os reagentes conforme a tabela abaixo:

Obs. Note que voc far um branco de reao usando apenas gua e um controle positivo do teste usando casena (uma protena encontrada no leite). Reativo Resultados do Biureto (mL) 1,0 4,0 1,0 4,0 1,0 4,0 1,0 4,0 1,0 4,0 Legenda: B (branco); CP (controle positivo); A (amostra). gua (mL) Casena 10 mg/mL (mL) Amostra (mL)

TUBO B CP A no__ A no__ A no__

Aps a adio do reativo do Biureto, agitar os tubos e deixar em repouso por 30 minutos; No teste considerado positivo se a amostra desenvolver uma colorao prpura de forma semelhante ao controle positivo (porm a intensidade depende da concentrao de protena, como veremos em prticas posteriores.

C. TESTE PARA AMINOCIDOS (REAO DA NIHNIDRINA)

1. Objetivo: Identificar a presena de aminocidos nas amostras desconhecidas. 2. Princpio do mtodo: O grupo amino dos aminocidos muito resistente hidrlise, porm pode ser removido facilmente por oxidao. A ninhidrina (hidrato de tricetohidrindeno) um poderoso agente oxidante causando a desaminao oxidativa de -aminocidos produzindo CO2, NH3 e um aldedo com um carbono a menos que o aminocido inicial (Figura 6). Ento, a ninhidrina reduzida (hidridantina) reage com NH3 liberado e outra molcula de ninhidrina, formando um complexo arroxeado que apresenta absoro mxima a 570 nm. A intensidade de cor, sob condies padro, a base para um teste quantitativo extremamente til. Outras aminas, alm dos -aminocidos, tambm reagem com a ninhidrina dando uma colorao azul, mas sem a liberao de CO2. Cabe ressaltar que o produto da reao de iminocidos, como a prolina e hidroxiprolina, com ninhidrina apresenta colorao amarela ao invs de roxa, cujo mximo de absoro ocorre em = 440 nm. Neste caso no h liberao de NH3, porm h produo de teores quantitativos de CO2.
aminocido

ninidrina

Pigmento prpura

Figura 6: Esquema geral da reao de aminocidos com ninhidrina.

3. Reagentes e preparo de solues Ninhidrina 0,25%

Pesar 0,25 g de ninhidrina e dissolver em acetona at completar o volume de 100 mL. Alanina 0,1 M

Pesar 0,890 g de L-alanina dissolver em gua destilada e avolumar para um balo volumtrico de 100 mL Prolina 0,1M

Pesar 2,30 g de L-prolina, dissolver em gua destilada e avolumar para um balo de 200 mL. 4. Procedimento:

Identificar os tubos de ensaio conforme a tabela abaixo e colocar em uma estante; Adicionar os reagentes conforme a tabela abaixo:

Obs. Note que voc far um branco de reao usando apenas gua e um controle positivo do teste usando o aminocido alanina e um controle positivo para prolina ou alanina que resultam em uma colorao amarela. Tubo B CP1 CP2 A no__ A no__ gua (mL) 1,0 Alanina 0,1 M (mL) 1,0 Prolina 0,1 M (mL) 1,0 Amostra (mL) 1,0 1,0 Ninhidrina 0,25% (gotas) 5 5 5 5 5 Resultados

Aps a adio da ninhidrina, aquec-los em banho-maria a 100 C

por 3 minutos; No teste considerado positivo para a presena de aminocidos quando

ocorre a formao de uma colorao rosa (no caso da maioria dos aminocidos) e para iminocidos (prolina) ou cistena colorao amarela. D. TESTE PARA CARBOIDRATOS (REAO DA ANTRONA): 1. Objetivo: Identificar a presena de carboidratos nas amostras desconhecidas.

2. Princpio do mtodo: O reagente de antrona contm antranol em meio de H2SO4 concentrado. O calor liberado pela diluio do H2SO4 suficiente para que a reao ocorra. No caso de oligo e polissacardeos, o cido atua como catalisador de hidrlise convertendo-se a monossacardeos (hexoses e pentoses) e tambm como agente desidratante levando formao de hidroximetilfurfural e furfural que, na presena de antranol, do produtos de condensao coloridos.

OH

H H C OH O C

O H

H H C OH O

H C OH OH

hidroximetilfurfural

antranol

Complexo verde musgo


Figura 7: Reao de Antrona.

H H C OH O

H C OH OH

O hidroximetilfurfural proveniente da desidratao de hexoses produz uma substncia de colorao verde musgo relativamente estvel enquanto que o furfural proveniente da desidratao de pentoses fornece um produto de cor anloga, mas que em alguns minutos se torna vermelho-amarelada ou rubi. 3. Reagentes e preparo das solues: Reativo Antrona

Pesar 0,2 g de antrona (C14H10O) e dissolver em 100 mL de cido sulfrico (H2SO4) 95%. Glicose 2 mg/mL

Pesar 0,2 g de glicose dissolver em gua destilada e avolumar para um balo volumtrico de 100 mL. 4. Procedimento:

Identificar os tubos de ensaio conforme a tabela abaixo e colocar em uma estante; Adicionar os reagentes conforme a tabela abaixo:

Obs. Note que voc far um branco de reao usando apenas gua e um controle positivo do teste usando glicose. Glicose 2 mg/mL (mL) 0,1 Amostra (mL) 0,1 Reagente de Antrona (mL) 0,5 0,5 0,5 Resultados

TUBO B CP A no__

gua (mL) 0,1 -

A no__

0,1 0,5 Legenda: B (branco); CP (controle positivo); A (amostra). Em banho de gelo, adicionar o reagente de Antrona e deixar por 5 minutos; Aquecer em banho fervente (100oC) por 10 minutos; No teste considerado positivo para a presena de carboidratos quando ocorre a formao de uma colorao verde.

REFERNCIAS:
MASTROENI, M.F.; GERN, R.M.M. Bioqumica: prticas adaptadas. So Paulo: Atheneu, 2008. DAVID L. NELSON & MICHAEL M. COX. Lehninger. Principles of Biochemistry. 5 Edition. W. H. Freeman and Company. New York.

ANLISE QUALITATIVA DE AMINOCIDOS


1. Objetivo: Identificar a presena de aminocidos nas amostras desconhecidas. 2. Princpio do mtodo: O grupo amino dos aminocidos muito resistente hidrlise, porm pode ser removido facilmente por oxidao. A ninhidrina (hidrato de tricetohidrindeno) um poderoso agente oxidante causando a desaminao oxidativa de -aminocidos produzindo CO2, NH3 e um aldedo com um carbono a menos que o aminocido inicial (Figura abaixo). Ento, a ninhidrina reduzida (hidridantina) reage com NH 3 liberado e outra molcula de ninhidrina, formando um complexo arroxeado que apresenta absoro mxima a 570 nm. A intensidade de cor, sob condies padro, a base para um teste quantitativo extremamente til. Outras aminas, alm dos -aminocidos, tambm reagem com a ninhidrina dando uma colorao azul, mas sem a liberao de CO2. Cabe ressaltar que o produto da reao prolina ninhidrina de e iminocidos, apresenta como a hidroxiprolina, com

colorao

amarela ao invs de roxa, cujo mximo de absoro ocorre em = 440 nm. Neste caso no h liberao de NH3, porm h produo de teores quantitativos de CO2. 3. Reagentes e preparo de solues Ninhidrina 0,25%

Pesar 0,25 g de ninhidrina e dissolver em acetona at completar o volume de 100 mL. Alanina 0,1 M

Pesar 0,890 g de L-alanina dissolver em gua destilada e avolumar para um balo volumtrico de 100 mL Glicina 0,1M

Pesar 2,30 g de L-glicina, dissolver em gua destilada e avolumar para um balo de 200 mL. 4. Procedimento:

Identificar os tubos de ensaio conforme a tabela abaixo e colocar em uma estante; Adicionar os reagentes conforme a tabela abaixo:

Obs. Note que voc far um branco de reao usando apenas gua Tubo Amostra/Concentrao Volume - mL Ninhidrina 0,25% - (gotas) 1 gua 1,0 5 2 Triptofano 0,1 M 1,0 5 3 Alanina 0,1 M 1,0 5 4 Leucina 0,1 M 1,0 5 5 Aspartame 4 %* 1,0 5 6 Soluo protica 1,0 5 * Aspartame (L-aspartil-fenilalanina metil ster), adoante 200 vezes mais potente do que o acar. Dissolver o contedo de um envelope em 20 mL de gua destilada.

Aps a adio da ninhidrina, aquec-los em banho-maria a 100 C

por 3 minutos; No teste considerado positivo para a presena de aminocidos quando

ocorre a formao de uma colorao rosa (no caso da maioria dos aminocidos) e para iminocidos (prolina) ou cistena colorao amarela. I. CROMATOGRAFIA EM PAPEL 1. Objetivo:

No caso desta aula prtica confirmar a identidade do aminocido presente na amostra dada ao grupo. Porm, cabe ressaltar que esta tcnica pode ser usada para separao e deteco de aminocidos presentes em misturas. 2. Princpio do mtodo: As tcnicas de cromatografia em geral so utilizadas para separao e purificao de vrias classes de biomolculas, porm o tipo de cromatografia e o protocolo variam com o objetivo e caractersticas/tipo de amostra. No entanto, todos os tipos de cromatografia baseiam-se na interao da amostra a ser analisada (soluto) com duas entidades fsicas distintas: a fase mvel (que pode ser gasosa ou lquida), e a fase estacionria. A fase mvel move a amostra pela fase estacionria e a separao dos componentes depende da sua distribuio e interao diferencial com a fase mvel e/ou com a fase estacionria. Na presente aula prtica, usaremos cromatografia em papel (CP), tcnica usada para separao, deteco e caracterizao de aminocidos e que constitui uma das tcnicas cromatogrficas mais simples e que requer menos instrumentos para sua realizao, porm a que apresenta as maiores restries para sua utilizao em termos analticos. Para iniciar o processo a(s) amostra(s) contendo o(s) aminocido(s) (so) aplicada(s) em uma fase estacionria (no caso, o papel) na parte inferior marcada por uma linha lpis (origem). Os pontos de aplicao de cada amostra so secos e aplica-se novamente a respectiva amostra a cada ponto vrias vezes, secando sempre o papel antes da prxima aplicao (Figura 3). Finalmente, o papel com as amostras secas posto em uma cmara tendo a extremidade inferior em contato com o solvente (que pode ser uma mistura de solventes e gua), porm sem permitir que os pontos onde as amostras foram aplicadas tenha contato direto ou seja submerso pelo solvente contido no recipiente. Assim, o solvente se difunde pelo papel por capilaridade, os componentes da amostra se distribuem pelas fases mvel (solvente) e estacionria (papel) de acordo com sua solubilidade (Figura 11). O papel composto por molculas de celulose que possuem uma forte afinidade pela gua presente na mistura de solvente, mas muito pouca afinidade pela fase orgnica, atuando como suporte inerte contendo a fase estacionria aquosa (polar). A medida que o solvente contendo o soluto flui atravs do papel, uma partio deste composto ocorre entre a fase mvel orgnica (pouco polar) e a fase estacionria aquosa. Desta forma, parte do soluto deixa o papel e entra na fase mvel. Quando a fase mvel alcana uma seo do papel que no contm soluto, o fenmeno de partio ocorre novamente, s que agora o soluto transferido da fase

mvel para a fase estacionria. Com o fluxo contnuo de solvente, o efeito desta partio entre as fases mvel e estacionria possibilita a transferncia do soluto do seu ponto de aplicao no papel, para outro ponto localizado a alguma distncia do local de aplicao no sentido do fluxo de solvente. Como os aminocidos diferem no grupamento R, possuem diferentes solubilidades, propriedade usada para sua separao no presente mtodo, apresentando portanto diferentes taxas de migrao (Rf). A deteco (Figura 3) se d atravs de agentes capazes de revelar os aminocidos em geral (como ninhidrina) ou especficos para determinados aminocidos (como Sakaguchi para arginina, Pauly para histidina e Nitroprussiato para cistena). 3. Reagentes e preparo das solues: Solvente de Partridge (n-butanol/cido actico glacial/gua 4:1:1)

Misturar 400 mL de n-butanol com 100 mL de cido actico glacial e 100 mL de gua Ninhidrina 0,25%

Pesar 0,25g de ninhidrina e dissolver em acetona at completar o volume de 100 mL. 4. Procedimento:

Traar linhas (bem leves) de lpis, a 2 cm da borda inferior e 1,0 cm da borda superior do papel de filtro. Evitar tocar no papel durante toda a operao. As amostras devem ser aplicadas (com tubos capilares) nos pontos numerados de tal modo que a mancha formada sobre o papel seja a menor possvel.

Aplique a amostra em um ponto do papel conforme o desenho:

Front

P1

P2

P3

M 2,0 cm

Seque as amostras (pode ser usado um secador).

Colocar o papel em uma cuba apropriada contendo o solvente de Partridge. Tome o cuidado de no toc-lo com os dedos e no encostar na parede da cuba.

Fechar a cuba. Deixar o solvente migrar at 1,0 cm da borda superior. Retirar o papel. Deixar secar temperatura ambiente. Pulverizar a tira de papel com a soluo reveladora de Ninhidrina e levar estufa (60C) por 15 minutos. Aps revelao, calcular o RF dos padres e da mistura, para sua identificao.

DETERMINAO DA CONCENTRAO DE PROTENAS EM UMA AMOSTRA BIOLGICA PELO MTODO DO BIURETO


Mtodos de determinao da concentrao de protenas A determinao da concentrao de protenas em materiais biolgicos necessria em diversas situaes, como na purificao de uma determinada protena a partir de um extrato de material biolgico para o estudo de suas propriedades e funes, ou na avaliao dos nveis de certas protenas que tm suas quantidades alteradas em determinadas situaes patolgicas. Existem diversos mtodos para a determinao do contedo total de protenas em uma amostra. Suspenses puras de protenas apresentam absoro de luz de comprimento de onda abaixo de 230 nm com absoro mxima a 220 nm, correspondente principalmente s ligaes peptdicas. Entretanto, j que outros compostos como cidos carboxlicos, ons de tampo, alcois, bicarbonato e substncias aromticas tambm absorvem nesta regio, os resultados obtidos devem ser interpretados com cuidado. As protenas tambm absorvem luz ultravioleta em comprimentos de onda prximos a 280 nm que correspondem a presena de tirosina (275 nm), triptofano (280 nm) e fenilalanina (260 nm) nas molculas. Como o teor destes aminocidos varia entre diferentes protenas, a absoro a 280 nm ser particular de cada grupo de protenas. A quantificao de protenas atravs da absoro a 280 nm uma tcnica rpida e eficiente, entretanto ela est sujeita a interferncias, particularmente de cidos nuclicos que exibem absoro mxima a 260 nm. Outros mtodos bastante comuns baseiam-se no contedo de nitrognio de protenas (todas as protenas possuem um contedo mdio de nitrognio de 16%), como o mtodo de Kjeldahl, ou na reao de sulfato de cobre em meio alcalino com protenas, que fornece

um produto de colorao prpura, como no mtodo do Biureto. Tambm bastante utilizado, o mtodo de Folin-Lowry apresenta modificaes ao mtodo do Biureto. Neste mtodo, aps a realizao do mtodo do Biureto adicionado reao o reagente de Ciocalteau (cido fosfotngstico fosfomobildico) que reduzido pela tirosina presente nas molculas de protenas. Nesta reao a colorao desenvolvida mais muito mais intensa, tornando o mtodo 100 vezes mais sensvel do que o mtodo do Biureto, sendo este bastante til para amostras muito diludas. Todos os mtodos possuem vantagens e limitaes, portanto a escolha deve ser cautelosa e levar em considerao os diversos fatores relativos aquela analise, como, por exemplo, as caractersticas da amostra e a disponibilidade de recursos como equipamentos e reagentes. Nesta prtica ser realizado o mtodo do Biureto, que ser descrito em maiores detalhes a seguir. OBJETIVO GERAL DA PRTICA: Construir uma curva padro de protenas e determinar a concentrao de protenas totais em uma amostra biolgica desconhecida pelo mtodo do Biureto. I. CONSTRUO DE UMA CURVA PADRO E DETERMINAO DA

CONCENTRAO DE PROTENAS EM UMA AMOSTRA DESCONHECIDA: 1. Objetivo: Determinao da concentrao de protenas atravs da formao de produtos com colorao que podero ser quantificados por espectrofotometria. 2. Princpio do mtodo: Este mtodo baseado na reao do sulfato de cobre em meio alcalino (reativo de Biureto) com protenas e peptdeos (no mnimo tripeptdeos). Maiores detalhes podem ser encontrados no roteiro da aula Anlise Qualitativa de Biomolculas. 3. Reagentes e preparo das solues: Reagente de Biureto:

Dissolver 1,5 g de CuSO4.5H2O e 6 g de tartarato duplo de sdio e potssio (C4H4O6.Na.K.4H2O) em 500 mL de gua; Adicionar 300 mL de NaOH 10%;

Adicionar gua destilada suficiente para completar o volume final para 1 litro de soluo. Conservar a temperatura ambiente protegido da luz.

Soluo padro de casena 1% (10 mg/mL):

2. Pesar 1g de casena, dissolver com aproximadamente 70mL de gua destilada


e depois adicionar hidrxido de sdio 1M at a soluo tornar-se lmpida e completar o volume para 100mL. Aliquotar em fraes de 10 mL e conservar a 20oC. 4. Procedimento: A) Construo da curva padro (ou curva de calibrao) e determinao da concentrao de protenas em uma amostra biolgica de concentrao desconhecida

Identificar 7 tubos de ensaio e colocar em uma estante; Adicionar os reagentes conforme a tabela seguinte:

Tubo (N o ) B 1 2 4 5 6 7

H2O (mL) 1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 -

Casena 10 mg/mL (mL) 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 -

Amostra 1,0

Reativo de Biureto (mL) 4,0 4,0 4,0 4,0 4,0 4,0 4,0

Abs. 540 nm

Aps a adio do reativo do Biureto, agitar os tubos e deixar em

repouso por 30 minutos (a colorao prpura formada indicativa da presena de protenas);

Neste momento, inicie a realizao do protocolo seguinte (abaixo) para

a determinao da concentrao de protenas na amostra de concentrao desconhecida que seu grupo recebeu no inicio desta aula; REFERNCIAS: PETKOWICZ, C.L.O. Bioqumica. 7. ed. Curitiba: Ed. UFPR, 2007. NARDY, M. B.C.; STELLA, M.B.; OLIVEIRA, C. Prticas de laboratrio de bioqumica e biofsica: uma viso integrada. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2009.

DAVID L. NELSON & MICHAEL M. COX. Lehninger. Principles of Biochemistry. 5 Edition. W. H. Freeman and Company. New York.

CINTICA ENZIMTICA
OBJETIVO GERAL DA PRTICA: Determinao da atividade enzimtica da invertase de levedura. I. CONSTRUO DA CURVA PADRO DE AUCAR REDUTOR: 1. Objetivo: A construo da curva padro de acar redutor (glicose) servir para determinar a concentrao de glicose produzida pela reao da invertase. 2. Princpio do experimento: As reaes qumicas conduzidas pelos organismos vivos so, na sua grande maioria, catalisadas enzimaticamente, tornando a velocidade das mesmas compatveis com as exigncias metablicas. A enzima escolhida para este estudo justamente a invertase da levedura que catalisa a hidrlise da sacarose para produzir glicose e frutose:
C12H22O11 + H2O sacarose gua C6H12O6 + C6H12O6 glicose frutose

Conhecendo-se por colorimetria a quantidade (g) de acar redutor formado, por um clculo estequiomtrico simples, pode-se determinar a quantidade correspondente (g) sacarose hidrolisada. Podemos determinar a afinidade de determinada enzima pelo substrato da reao que catalisa utilizando um valor KM, que a concentrao de substrato necessria para se atingir metade da velocidade mxima da reao catalisada pela enzima em questo. Um modelo da reao onde a enzima interage com o substrato est fornecido abaixo:
E +S ES E +P

onde E a enzima, S o substrato, ES o complexo enzima-substrato e P o produto da reao. Observe que a enzima devolvida ao meio na mesma proporo em que foi utilizada na reao esquerda. Michaelis e Menten, com essas consideraes, desenvolveram a expresso de velocidade para uma reao catalisada enzimaticamente e desta forma puderam descrever o comportamento de diversas enzimas.
V = Vmx * [S] KM + [S]

onde [S] a concentrao do substrato e Vmx a velocidade mxima da reao, em mol (de produto formado) por unidade de tempo. Assim a levedura (Saccharomyces cerevisiae), por intermdio da "invertase" hidrolisa a sacarose resultando numa mistura equimolecular de glicose e frutose, acares esses que so absorvidos pela clula. A membrana plasmtica impermevel sacarose, e a levedura acaba excretando a invertase (sendo, pois, uma exoenzima) para a hidrlise ocorrer fora da clula de levedura.

Hidrlise da sacarose catalisada pela invertase. Tanto a glicose quanto a frutose so acares redutores.

No presente experimento a invertase ser obtida de levedura de panificao (fermento Fleischmann) e adicionada sacarose (acar no redutor), cuja hidrlise resulta na formao de acares redutores (glicose e frutose) que sero estimados pela reao de Somogyi-Nelson. Para tal se colocar a enzima frente diferentes concentraes de substrato (sacarose), resultando em diferentes velocidades de reao enzimtica, permitindo, mediante um tratamento matemtico adequado, determinar graficamente os valores de Km e Vm para a reao enzimtica da levedura. II. CONSTRUO DA CURVA PADRO DE AUCAR REDUTOR: 3. Objetivo:

A construo da curva padro de acar redutor (glicose) servir para determinar a concentrao de glicose produzida pela reao da invertase. 4. Princpio do experimento: A invertase uma enzima hidroltica que catalisa a hidrlise da sacarose, dando como produto a glicose e a frutose. A sacarose um dissacardeo no-redutor assim para cada molcula de sacarose hidrolisada, duas molculas redutoras so formadas.

CH2OH H OH

CH2OH

O
H OH H H

HOCH2

H CH2OH H

H OH

O
H OH H H OH

HOCH2 O H + OH OH H H OH

H CH2OH H

H OH

OH OH SACAROSE (NO REDUTOR)

GLICOSE REDUTORES

FRUTOSE

Figura 19: Esquema geral da reao da invertase.

O nome da invertase foi dado a esta enzima porque ao hidrolisar a sacarose liberando glicose e frutose, ocorre uma inverso do sinal da rotao ptica de positivo para negativo sendo denominado acar invertido. A sacarose tem um desvio de +66,5, a glicose de +52,7 enquanto o desvio da frutose de -92 , portanto aps a hidrlise, a rotao ptica que era de 66,5 passa a ser -39,3. As propriedades qumicas da sacarose e do acar invertido so bem diferentes quanto ao poder edulcorante, solubilidade, poder redutor. As enzimas que catalisam a hidrlise da sacarose so largamente distribudas. As mais conhecidas so a invertase de leveduras e a sacarase intestinal. Sendo um acar no redutor, pode-se medir a atividade hidroltica da enzima pelo aparecimento de acar redutor (glicose mais frutose) aps a incubao com a enzima. Para determinar a quantidade de acar redutor formado, basta utilizar uma curva-padro de acar redutor elaborado nas mesmas condies. 5. Reagentes e preparo das solues:

Reativo de Somoggy

Dissolver 28 g de fosfato dissdico anidro (Na2HPO4) e 40 g de tartarato duplo de sdio e potssio (C4H4O6NaK) em 500 mL de gua destilada; adicionar 100 mL

de hidrxido de sdio (NaOH) 1 M, dissolver 8 g de sulfato de cobre cristalizado em 80 mL de gua destilada e adicionar lentamente com agitao. Aps, acrescentar 180 g de sulfato de sdio anidro (Na2SO4), homogeneizar e completar o volume para 1000 mL em um balo volumtrico. Deixar em repouso por 2 dias e filtrar se necessrio. Manter em frasco mbar.

Reativo de Nelson

Dissolver 50 g de molibdato de amnio [(NH 4) MoO4] em 800 mL de gua destilada; adicionar 52 mL de cido sulfrico (H2SO4) concentrado lentamente com agitao. Aps, dissolver 3 g de arseniato de sdio (Na2HAsO4.7H2O) em 50 mL de gua destilada, adicionar soluo acima e homogeneizar. Completar o volume para 1000 mL em um balo volumtrico. Deixar em repouso por 2 dias, manter em frasco mbar.

Glicose 0,02% (0,2 mg/mL)

Pesar 0,02 g de glicose, dissolver em gua destilada e completar o volume para 100 mL em um balo volumtrico. 6. Procedimento:

Identificar 6 tubos de ensaio, colocar em uma estante e adicionar os reagentes conforme a tabela abaixo:

Tubos

H2O (mL)

Glicose 0,2 mg/mL (mL) 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0

Reativo de Somoggy 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0


Agitar bem e levar ao banho-maria fervente (100C) por 10 min

Reativo de Nelson 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0

H2O (mL) 7,0 7,0 7,0 7,0 7,0 7,0

Glicose (mg)

ABS (530 nm)

B 1 2 3 4 5

1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 0

Esta curva servir para determinar a concentrao do acar redutor produzido Com os dados obtidos construir a curva-padro (absorvncia x concentrao

a partir da sacarose por ao da invertase; de glicose).

III.

CONSTRUO DA CURVA DE MICHAELIS-MENTEN E CLCULO DO GRFICO DE LINEWEAVER-BURK: 1. Objetivo: Determinao dos parmetros cinticos Km (constante de Michaelis) e Vmx (velocidade mxima) atravs da construo dos grficos de Michaelis-Menten e de Lineweaver-Burk. . 2. Reagentes e preparo das solues: Os mesmos utilizados nos experimentos anteriores. 3. Procedimento:

Adicionar os reagentes em tubos de ensaio conforme a tabela abaixo:

Tampo* (mL)

Sacarose 0,4 M (mL) Enzima (mL) 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5
Agitar bem e levar ao banhomaria por 15 min. A 37oC

Reativo de Somoggy (mL) 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0
Agitar bem e levar ao banhomaria fervente (100C) por 10 min

Reativo de Nelson (mL) 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0

H2O (mL)

Absorvncia a 530 nm

B1 1 B2 2 B3 3 B4 4 B5 5

2,3 1,8 2,1 1,6 1,7 1,2 0,9 0,4 0,5 0

0,2 0,2 0,4 0,4 0,8 0,8 1,6 1,6 2,0 2,0

5,5 5,5 5,5 5,5 5,5 5,5 5,5 5,5 5,5 5,5

Construir os grficos: velocidade x concentrao de sacarose (Grfico de Michaelis-Menten) e 1/V x 1/S (Grfico de Lineweaver-Burk ou duplo-recproco).

1. Agora com seus dados experimentais complete a tabela abaixo: tubo 1 2 3 4 5 2 Construa o grfico de Michaelis-Menten (curva de sbstrato) em papel milimetrado. 3. Calcule os inversos e complete a tabela abaixo tubo 1 2 3 4 5 1/[sacarose] 1/atividade [sacarose] (M) Atividade (g/mL/min)

4. Construa o grfico de Lineweaver-Burk (duplo recproco) em papel milimetrado. 5. Calcule a constante de Michaelis e a velocidade mxima da enzima

ANLISE QUALITATIVA DE CARBOIDRATOS


Propriedades Qumicas dos carboidratos Diferentemente dos aminocidos que apresentam reaes especficas baseadas principalmente na natureza qumica de seu radical, os carboidratos apresentam estruturas muito parecidas entre si o que os torna quase impossveis de identific-los. Neste caso o que se faz caracterizar grupos de carboidratos utilizando suas propriedades qumicas comuns. As reaes mais utilizadas na prtica esto baseadas em 2 dessas propriedades: 1) Desidratao de carboidratos por cidos fortes Hexoses e pentoses colocadas nestas condies so desidratadas, respectivamente a hidroximetilfurfural e furfural; estes compostos so capazes de se condensar com substncias fenlicas, com aminas aromticas, tiocompostos, uria.

Os complexos formados so, algumas vezes, coloridos e utilizados para a caracterizao de certos grupos glicdicos. Neste caso, situam-se: A) Reao de antrona Teste geral de glicdios O reagente de antrona contm antranol em meio de H2SO4 concentrado. O calor liberado pela diluio do H 2SO4 suficiente para que a reao ocorra. No caso de oligo e polissacardeos, o cido atua como catalisador de hidrlise convertendo-se a monossacardeos (hexoses e pentoses) e tambm como agente desidratante levando a formao de hidroximetilfurfural e furfural que, em presena de antranol, do produtos de condensao coloridos.
H H C OH O C H O
OH

+ hidroximetilfurfural

H H C OH antranol O

H C OH OH

Complexo verde azulado

H H C OH O

H C OH OH

O hidroximetilfurfural proveniente da desidratao de hexoses produz uma substncia de colorao verde azulada realtivamente estvel enquanto que o furfural proveniente da desidratao de pentoses fornece um produto de cor anloga, mas que em alguns inutos se torna vermelho-amarelada ou rubi. O teste de antrona muito sensvel e pode ser usado, quando modificado, para a quantificao de glicdios. B) Reao de Seliwanoff Teste de diferenciao entre aldoses e cetose A reao feita com resorcinol em meio de HCl quente. As cetohexoses do um produto de colorao vermelha que se desenvolve rapidamente; as aldohexoses correspondentes reagem mais lentamente. Durante o tempo em que cetohexoses so desidratadas e reagem com o resorcinol fornecendo o produto, as aldohexoses fornecem apenas um produto levemente rosa.
HOH2C H O OH H H OH H CH2OH H H HOH2C O COH

OH

+ H2O

OH

hidroximetilfurfural

resorcinol

cetohexose Produto de colorao vermelha


C) Reao de Bial Teste para a identificao de pentoses e certos cidos urnicos (galacturnico, glicurnico e outros) que se decompem durante o aquecimento em presena de H+, formando pentoses. O reagente consiste de orcinol em meio de HCl concentrado e em presena de ons Fe+3. O furfural proveniente da desidratao de pentoses quando aquecido em presena do reagente de Bial fornece uma cor verde. O hidroximetilfurfural (hexoses) reage formando um produto diferente que oscila entre amarelo e marrom.
H OH C OH H C OH OH
H O COH
CH3

H C H H C COH

+
HO

pentose

2H2O

furfural

orcinol

OH

Produto de colorao verde


O teste de Bial foi modificado a permitir quantificar pentoses, trioses e o cio 5cetoaldnico. As cetoheptoses fornecem produtos de colorao prpura, as cetohexoses e metilpentoses formam inicialmente um produto de cor laranja que em repouso, posteriormente, precipita apresentando uma cor verde. 2) Poder redutor Os aucares contm grupos aldedos e cetonas capazes de reduzir sais de metais pesados; desses os sais mais usados so dos de Cu+2. O princpio fundamental de todos os procedimentos analticos que utilizam Cu +2 sua dissoluo em meio alcalino em presena de cidos orgnicos (como cido ctrico e o cido tartrico) capazes de formarem complexos. Tambm podem ser empregados outros cidos orgnicos como EDTA, cido lctico, cido trihidroxiglutrico ou cido sacrico. A reao de formao do complexo ocorre em geral em meio fortemente alcalino e isto promove profundas modificaes na estrutura do acar. Os aucares apresentam um poder redutor diferente sobre o on Cu+2. Isso significa que dois tipos de hexoses em uma mesma concentrao fornecem quantidades diferentes de xido

cuproso (produto final da reao). A quantidade de ons cobre reduzida pelos diferentes glicdios funo do pH, da temperatura, da concentrao e dos tipos de glicdios e ons orgnicos complexantes. H diversos mtodos para a determinao de teor de Cu2O, os mais utilizados para a determinao em material biolgico, so os colorimtricos que utilizam o Cu2O dissolvido em excesso de reagentes como fosfomolibdato, fosfotungstato ou arsniomolibdato, formando um complexo azul. Dentre os testes baseados em poder redutor de glicdio destacam-se: A) Teste de Benedict Teste geral de glicdio redutores. O reagente consiste de uma nica soluo onde esto presentes ons Cu+2, citrato e carbonato de sdio. A reao complexa e influenciada por uma srie de fatores podendo ser esquematizada por:

Cu+2 + glicdio

Composto oxidado + Cu2O (precipitado vermelho)

B) Teste de Barfoed modificado Teste de diferenciao entre monossacardeos e dissacardeos redutores A reao feita usando-se acetato de cobre em meio de cido lctico (reagente de Barfoed) a quente e por 30 segundos; o produto formado nesta primeira etapa posteriormente revelado com soluo de fosfomolibdato. S monossacardeos formam produto de cor azul. A adio de cido fosfomolbdico leva a formao de um complexo corado de azul intenso.

Cu+2 + glicdio

Composto oxidado + Cu2O H3PO4 . 12 MoO3 Complexo de cor azul

OBJETIVO GERAL DA PRTICA Identificar os carboidratos presentes em diferentes amostras dadas. Determinar algumas de suas propriedades qumicas. I. TESTE DE BENEDICT: 1. Objetivo:

Identificar

se

amostra

apresenta

acar

redutor

(monossacardeos

dissacardeos) em sua composio. 2. Reagentes e preparo das solues: Reativo Benedict Pesar 17,3 g de sulfato de cobre (CuSO4 . 5H2O), 173 g de citrato de sdio (Na3C6H5O7), 100 g de carbonato de sdio anidro (Na2CO3), dissolver em gua destilada e completar o volume para 1000 mL em um balo volumtrico. 3. Procedimento:

glicose. Tubos

Adicionar os reagentes de acordo com a tabela abaixo:

Obs. Note que voc ir fazer um controle positivo do teste usando uma soluo de H2O (mL) Amostras (mL) Reagente de Resultados

Benedict (mL) B 0,2 ----1,0 CP ----0,2 1,0 CN ----0,2 1,0 A ----0,2 1,0 Legenda: B (Branco); CP (Controle Positivo - acar redutor); CN (Controle Negativo acar no redutor) e A (Amostra). Aquecer os tubos em banho fervente (100oC) por 5 minutos; O teste positivo se houver o desenvolvimento da colorao vermelha tijolo. II. TESTE DE BARFOED MODIFICADO: 1. Objetivos: Diferenciar monossacardeos redutores de dissacardeos redutores. 2. Reagentes e preparo das solues:

Reativo Barfoed Modificado:

Dissolver 48 g de acetato cprico ((CH 3COO)2 Cu.H2O) em 900 mL de gua destilada quente, adicionar lentamente 50 mL de cido ltico (C3H6O3) 8,5%. Resfriar e completar o volume para 1000 mL em um balo volumtrico. Filtrar se necessrio.

Reagente Fosfomoldico:

Dissolver 150 g de cido molbdico (H2MoO4) e 75 g de carbonato de sdio anidro (Na2CO3) em 500 mL de gua destilada quente com agitao. Aquecer at ebulio. Filtrar.

Adicionar 300 mL de cido fosfrico (H3PO4) 85%. Completar o volume para 1000 mL em um balo volumtrico. 3. Procedimento:

Tubos H2O (mL) B CP CN A 0,2 -------------

Adicionar os reagentes de acordo com a tabela abaixo: Amostras (mL) ----0,2 0,2 0,2 Reagente de Barfoed (mL) 1,0 1,0 1,0 1,0 Aquecer os tubos em banho fervente (100oC) por 30 segundos Reagente Fosfomobdlico (mL) 0,5 0,5 0,5 0,5 Resultados

Legenda: B (Branco); CP (Controle Positivo monossacardeo redutor); CN (Controle negativo dissacardeo redutor); A (Amostra).

III.

O teste positivo se houver o desenvolvimento da colorao azul escuro.

TESTE DO IODO 1. Objetivos: O objetivo do teste permitir que o aluno seja capaz de identificar uma amostra contendo o polissacardeo amido. 2. Princpio do mtodo: 3. Reagentes e preparo das solues:

Lugol (KI -I2) Pesar 5 g de iodo (I2) e 10 g de iodeto de potssio (KI) , dissolver em gua destilada e
completar o volume para 1000 mL em um balo volumtrico. 4. Procedimento:

Adicionar os reagentes de acordo com a tabela abaixo: H2O (mL) 2,0 ------------Amostras (mL) ----2,0 2,0 2,0 LUGOL (gotas) 2 2 2 2 Resultados

Tubos B CP CN A

Legenda: B (Branco); CP (Controle Positivo - amido); CN (Controle negativo glicose); A (Amostra). Aguardar 30 segundos temperatura ambiente; O teste positivo se houver o desenvolvimento da colorao verde azulada. REFERNCIAS: DAVID L. NELSON & MICHAEL M. COX. Lehninger. Principles of Biochemistry. 5 Edition. W. H. Freeman and Company. New York.

ANLISE QUANTITATIVA DE COLESTEROL (Reao de Liebermann-Buchard)


1. Objetivos: Determinar concentrao de colesterol em uma amostra biolgica

desconhecida. 2. Princpio do mtodo: Os esterides, incluindo o colesterol, apresentam em sua estrutura o ciclopentanoperidrofenantreno que representado por quatro anis fundidos (A, B, C, D). O colesterol, que um lcool esteride ou esterol, apresenta uma funo alcolica na posio C3, uma insaturao entre os carbonos C5 e C6 e uma cadeia alquila em C17. Embora as propriedades de solubilidade sejam anlogas as dos lipdios, esterides como colesterol, possuem estrutura e propriedades qumicas diferentes, podendo ser evidenciados atravs de reaes de colorao especficas: O cido sulfrico concentrado causa a desidratao da molcula de colesterol no grupo hidroxila C3 , fornecendo como produto o 3,5-colestadieno. O derivado

desidratado na presena do reativo cromognico produz o cido bis-3,5-colestadienilmono-sulfnico de colorao verde. 3. Procedimento: I. Construo de uma curva padro e determinao da concentrao de colesterol em uma amostra desconhecida:

Em tubos de ensaios, adicione os reagentes seguindo a ordem da tabela:

TUBO

Branco 1 2 3 4 5 A

Padro de colesterol (0,3 mg/ mL) (mL) 0,1 0,2 0,4 0,8 1,0

Amostra (mL)

Clorofrmio (mL)

Anidrido Actico (mL)

H2SO4 Conc (mL)

Colesterol (mg)

ABS

5,0 1,0 0,1 4,9 1,0 0,1 4,8 1,0 0,1 4,6 1,0 0,1 4,2 1,0 0,1 4,0 1,0 0,1 1,0 4,0 1,0 0,1 Misturar e deixar em repouso por 10 minutos no escuro (em caso de presena de colesterol desenvolve-se uma colorao verde);

Realizar a leitura em espectrofotmetro a 650 nm.

REFERNCIAS: DAVID L. NELSON & MICHAEL M. COX. Lehninger. Principles of Biochemistry. 5 Edition. W. H. Freeman and Company. New York.

ANLISE QUALITATIVA DE CIDOS NUCLEICOS (Extrao e caracterizao de DNA de cebola)


INTRODUO: Os cidos nucleicos (DNA e RNA) so macromolculas formadas por subunidades repetidas chamadas nucleotdeos, os quais so unidos atravs de ligaes fosfodister, formando uma fita de comprimento variado (Figura 1). Os nucleotdeos, que possuem as caractersticas de serem estveis em uma ampla faixa de pH, so constitudos por trs estruturas: uma base nitrogenada: existem duas classes de bases nitrogenadas: as purinas e as pirimidinas. As principais purinas so guanina e adenina; e as principais pirimidinas so citosina, uracila e timina. Uracila , geralmente, encontrada s em RNA e timina, s em DNA; um acar do tipo pentose: as pentoses podem ser de dois tipos: ribose, presente apenas nas molculas de RNA e desoxirribose, presente apenas nas molculas de DNA; um grupo fosfato: PO43-.

Figura 1. Estrutura do DNA. O DNA relativamente estvel em solues aquosas prximas do pH neutro, o que o torna adequado para o armazenamento da informao gentica ao longo do tempo. Ao contrario, o RNA mais instvel ( mais suscetvel hidrlise). A separao das fitas de DNA pode ser estudada elevando-se a temperatura de uma soluo. Em temperaturas relativamente baixas, poucos pares de bases so rompidos. Em temperaturas elevadas, as fitas de DNA se separam e adquirem uma conformao em espiral aleatria. A esse fenmeno d-se o nome de desnaturao.

OBJETIVO GERAL DA PRTICA: Realizar a extrao e a caracterizao de DNA de uma amostra biolgica. EXTRAO DE DNA: 1. Objetivo: Extrair DNA de uma amostra biolgica (cebola). 2. Princpio do mtodo: Os mtodos utilizados para a extrao e dosagem do DNA celular nuclear de eucariontes implicam no rompimento das membranas citoplasmtica e nuclear. Neste experimento, o rompimento das membranas plasmtica e nuclear ser realizado com o tratamento de um detergente comum. Os tratamentos com detergentes, inicos ou no, so largamente utilizados na solubilizao de protenas e lipdeos de membrana. Nestes processos de solubilizao por detergentes, so formadas micelas, que consistem de protenas, lipdios e detergentes. O tratamento das clulas com uma concentrao relativamente alta de detergente resulta no rompimento das membranas celulares e subsequente liberao das nucleoprotenas. A atividade da enzima digestiva (DNAase) ser inibida pela ao do EDTA em meio alcalino que altera pH e quela os ons divalentes necessrios ao da DNAase. A soluo salina (NaCl) no incio da experincia diminui a agregao proteica e minimiza a formao de precipitados (nucleoprotenas). A adio de etanol sobre a fase aquosa, contendo os cidos nucleicos dissolvidos, resultar na precipitao destes, uma vez que o etanol diminui a constante dieltrica da gua, promovendo uma menor solubilizao das molculas de DNA.

3. Reagentes e preparo das solues: Amostra: cebola gua destilada Soluo salina concentrada Etanol absoluto 95% Detergente (soluo de lise SDS 0,1 % + EDTA 25 mM, pH 8,0) Reativo de difenilamina

4. Procedimento: Descascar 1/2 cebola de tamanho mdio; Ralar a cebola em ralador comum ou processador de alimentos ( importante que no haja grandes pedaos de cebola); Homogeneizar em gua destilada (20 mL aproximadamente); Acrescentar ao homogeneizado, colher de cloreto de sdio e 3 mL de detergente; Misturar evitando a formao de espuma; Filtrar a suspenso em um funil com filtro de papel, perfex, algodo ou gase, recolhendo o filtrado em uma proveta; Adicionar ao filtrado 20 mL de etanol 95% com auxlio do basto de vidro. No misturar! Observar na interfase a formao de um material insolvel filamentoso (Figura 2). Com auxlio do basto de vidro, transferir o material insolvel para um recipiente contento 1 mL de H2O destilada.

cido Nucleico

Antes

Depois

Figura 2: Formao do material insolvel filamentoso (novelo) aps adio de lcool soluo. REAO DE DIFENILAMINA: 1. Objetivo: Detectar a presena de desoxirribose. 2. Princpio do mtodo: Em meio cido, as desoxirriboses livres de bases nitrogenadas geram grupamentos aldedicos livres, que por sua vez sofrem desidratao, originando como produto aldedos -hidroxilevulnicos (Figura 3). Estes aldedos formados reagem com a difenilamina, gerando um produto de colorao azul (com absorvncia mxima em 595 nm). Assim a reao da difenilamina til para caracterizar, indiretamente, a presena de DNA.
H C O H C O

CH2

CH2

+ H+

H C OH H C H C H OH OH

+ CH2
C O OH

N H Difenilamina

H2O

H C H

2-desoxirribose

Aldedo -hidroxilevulnico Complexo de cor azul

Figura 3: Reao da desoxirribose com difenilamina em meio cido.

3. Reagentes e preparo das solues: Reativo de difenilamina: Pesar 1 g de difenilamina, dissolver em 100 mL de cido actico P.A e adicionar 2,75 mL cido sulfrico P.A. 4. Procedimento: Identificar 2 tubos de ensaio e colocar em uma estante; Adicionar os reagentes conforme a tabela abaixo. TUBO Amostra Volume de (mL) 1,0 1,0 Reativo de Difenilamina (mL) 1 1 HCl 37% (GOTAS) 2 2

B gua D DNA de cebola Legenda: B (branco) e D (DNA).

Misturar e manter os tubos em banho fervente (100oC) por 10 min; Retirar os tubos do banho-maria e resfri-los; Identificar a formao de uma colorao azul na tubo contendo a amostra de DNA (realizar a leitura no espectrofotmetro a 595 nm no caso de quantificao).