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Procedimentos de preparao de uma lmina histolgica para observao em microscopia ptica

Visa preparao dos tecidos destinados ao estudado microscopia de luz. O exame ao microscpio feito geralmente por luz transmitida Significa que a luz deve atravessar o objeto a ser examinado. Assim: necessria a obteno de fragmentos dos tecidos que sero coletados em lminas muito finas e transparentes.

Fixao Incluso/Embebio: Desidratao Diafanizao Corte: Seces ao micrtomo/criostato Montagem da lmina Colorao Observao ao microscpio

Destina-se a preservar as clulas, evitando as modificaes post mortem conhecidas por autlise e conservando, deste modo, a estrutura morfolgica.

Consiste basicamente na estabilizao da estrutura das protenas, por coagulao.

Os agentes fixadores mais utilizados so o formol tamponado e o lquido de Bouin. Ambos fixam as protenas evitando sua degradao

o fixador mais utilizado o formol, por ser mais acessvel e de uso simples

Contudo, seus satisfatrios.

resultados

geralmente

no

so

Por isto, recomendada a dissoluo de formol em tampo fosfatado (Junqueira e Junqueira, 1983).

 

Outros: lcool etlico, cido actico, cido pcrico. O tempo de fixao depender do tamanho do fragmento do tecido, podendo variar entre 06 e 24h.

recomendado que, sempre que possvel, no ultrapasse a 3 mm de espessura.

Objetivo: proceder com a infiltrao de substncias endurecedoras nos fragmentos dos rgos Permite a delgados. obteno dos cortes extremamente

 

So etapas rigorosamente seqenciais e obrigatrias Uma etapa mal executada acarretar em material de m qualidade para anlise.

Desidratao Diafanizao

Objetivo: retirar a gua dos tecidos e a sua substitu-la por lcool.

So utilizados lcoois graduados adequados ao fixador e ao material.

em

tempos

Para ME, utiliza-se ainda acetona ou xido de propileno.

Objetivo: retirar o lcool da pea (as substncias inclusoras dissolvem-se mal no lcool) e torn-la transparente.

Utiliza substncias solveis em lcool e capazes de elimin-lo, por exemplo o toluol, xilol, benzol, etc.

Comumente: parafina histolgica e resinas plsticas, metacrilato resina epon As resinas apresentam resultados mais adequado As substncias que retiraram o lcool so substitudas por parafina fundida em pequenos blocos.

 

Obteno de cortes o mais delgado possvel, que possibilite a sua observao aos microscpios de luz ou eletrnico. De um modo geral, so obtidos cortes entre 5 e 7 micrmetros. Micrtomo: - aparelho apropriado para este fim - sua regulagem medida em micrmetros e nanmetros - permite a obteno do corte na espessura desejada - formado por uma lmina (fixa ou descartvel) de ao, afiada, e um brao ao qual se prende o bloco e que se desloca verticalmente.

Micrtmo (tipo rotativo) e operao de corte

Lminas:
   

Previamente limpas com detergente Estocadas em lcool 80% Previamente secas. Antes da sua utilizao, necessrio revestir suas superfcies com uma fina camada de albumina para facilitar a adeso da pea.

As fitas obtidas a partir do micrtomo so transferidas para um banhomaria, com o auxlio de uma pina, para serem distendidas A gua deve estar entre 3 e 8 C abaixo do ponto de fuso da parafina utilizada. Nesta etapa, so retiradas as dobras e evitadas as bolhas abaixo da fita. Aps a distenso, os cortes so separados individualmente ou em grupos, conforme a convenincia, utilizando se lminas de vidro Os cortes obtidos podem ser transferidos, inicialmente, para uma estufa onde ficam alguns minutos (no mais que dez minutos) para posteriormente serem colocados em um suporte inclinado. Finalmente, os cortes devem ser depositados em uma estufa a 60 C para secagem entre uma e 24 horas.

 

Importante para a visualizao das estruturas do tecido.

Geralmente podem ser agrupados em trs classes distintas (Gartner e Hiatt, 1999):

1. Corantes que diferenciam os componentes cidos e bsicos das clulas; 2. Corantes especializados que diferenciam os componentes fibrosos da matriz extracelular; 3. Sais metlicos que precipitam nos tecidos.

Os corantes mais utilizados nos procedimentos histolgicos so a Hematoxilina e a Eosina (HE). A Hematoxilina uma base que cora, preferencialmente, componentes cidos das clulas em um tom azulado escuro. Como os componentes cidos mais abundantes so o DNA e o RNA, tanto o ncleo, quanto certas partes do citoplasma, se tornam azulados. Esses componentes so chamados de basfilos. A Eosina, ao contrrio, um cido que cora as estruturas bsicas da clula de rosa. Estas estruturas so abundantes no citoplasma e so chamadas de acidfilas.

 

   

Componentes celulares e de tecidos: purificados e isolados Usa fora centrfuga para separar Em funo do coeficiente de sedimentao Coeficiente de sedimentao: tamanho, forma, densidade e viscosidade do meio Assim: a composio qumica as funes podem ser estudadas in vitro As fraes obtidas: ME

Mtodos que identificam e localizam substncias em cortes histolgicos ou em clulas cultivadas

uma tcnica histolgica que tem por objetivo a identificao da natureza qumica de constituintes celulares. Consiste na colorao especfica desses constituintes, recorrendo basicamente a substncias que, reagindo com os componentes celulares, do origem a produtos corados. Esta tcnica contrasta com a colorao histolgica comum, na medida em que esta ltima se baseia na absoro, pelas estruturas, de substncias coradas (os corantes), enquanto que na histoqumica, as cores so propriedades de produtos que se formam in situ.

Um dos exemplos clssicos o mtodo de Feulgen que se destina a identificar o DNA.

O princpio da reao baseia-se no fato de que o DNA, aps hidrlise cida moderada, quando tratado pelo reagente de Schiff , d lugar formao de um produto que se cora em vermelho arroxeado.

 

So processos de colorao que conferem especificidade Expem os grupamentos e radicais qumicos que compem as estruturas Assim so especificamente histoqumicos. evidenciados pelos corantes

Ex: carboidratos, cidos nuclicos, aminocidos, ons, lipdeos, etc. - Localizao de cidos nuclicos: mtodo de Feulgen. - Localizao de carboidratos: tcnica do PAS (Periodic AcidSchiff).

 

   

Molcula: compostos especficos que se ligam mesma Compostos: acoplados a uma marcador Conjunto: molcula-composto-marcador microscpio Marcadores: substncias fluorescentes tomos radioativos molculas de enzimas (peroxidase) metais Detectam: acares, protenas e cidos nuclicos

Faloidina: filamentos de actina

Protena A: imunoglobulinas

Lectinas: molculas de membranas celulares contendo seqncias especficas de acares

Metodologia que utiliza anticorpos para identificar molculas em cortes ou camadas de clulas. Clulas em cultura ou um corte de tecido: supes conter uma determinada protena So incubados numa soluo que contm um anticorpo Anticorpo: reconhece essa protena se liga especificamente protena sua localizao pode ser evidenciada por microscopia eletrnica ou de luz dependendo do marcador Exigncia: disponibilidade do Ac contra a protena que se quer detectar

 

Produzir Acs contra a protena X de uma certa espcie animal (rato) Se X j est isolada: injetada numa outra espcie (coelho) Se a protena muito diferente para este animal reconhec-la como estranha O animal vai produzir Acs contra a protena: Acs de coelho contra protena X de rato Esses Acs so coletados do plasma do animal e utilizados na imucitoqumica

 

 

Ag num animal Vrios grupos de linfcitos podem reconhecer pores diferentes de X Produzindo Acs diferentes contra as vrias pores Resulta: mistura de Acs Mistura: Anticorpo policlonal

  

 

Fornecer a protena X a linfcitos mantidos em cultura Os diferentes grupos (clone) de linfcitos produziro Acs diferentes contar as vrias pores da protena X Cada clone: isolado e cultivado isoladamente Os diferentes Acs contra X podem ser coletados e separados Cada um destes Acs: um Ac monoclonal

 

  

So mais especficos Mais precisos no reconhecimento da protena X Assim: menos ligaes inespecficas com outras protenas Poderia dificultar o reconhecimento da protena X

Tcnica direta:


O Ac contra a protena X (monoclonal ou policlonal) ligado a uma marcador apropriado Um corte de tecido incubado com o Ac durante algum tempo O Ac interage e se liga a X Em seguida, o corte lavado para remoo do Ac no ligado O corte pode ento ser observado por microscopia de luz ou eletrnica (dependendo do marcador)

   

Tcnica Indireta:
  

Necessrio: produzir dois Acs Um Ac contra a protena de ratos feitos por um coelho Um Ac de um outro coelho injetado numa 3 espcie: ovelha O Ac de coelho considerado estranho por ovelhas e cabras produzir um Ac contra a imunoglobulina: um anti-Ac ou antiimunoglobulina ser ligado ao marcador

Tcnica Indireta:


Um corte de tecido de rato que se supe conter a protena X incubado inicialmente com Ac de coelho antiprotena X de rato Lavar os cortes Incub-los com o anti-Ac marcado que reconhecer e se ligar ao Ac de coelho que se havia ligado protena X O corte pode ento ser observado por microscopia de luz ou eletrnica (dependendo do marcador)

 

  

Ultracentrifugao Cromatografia Eletroforese em gel

Uma mistura de protenas obtida de clulas ou de tecidos homogeneizados Centrifugada em alta velocidade por vrias horas As protenas se separam em bandas (de acordo com o tamanho e a densidade das molculas) Meio centrifugado: drenado e dividido em vrias fraes (contm as protenas) A podem ser analisadas separadamente

 

Uma soluo contendo uma mistura de protenas colocada numa coluna Coluna: preenchida por partculas com diferentes propriedades Durante a migrao pela coluna, o movimento das protenas retardado pela interao com as partculas Quando o lquido da coluna recolhido, diferentes grupos de protenas podem ser coletados separadamente.

Isolamento das protenas Deteco e identificao das protenas Colorao Radioautografia Immunoblotting

Misturas de protenas so obtidas de clulas e tecidos homogeneizados So tratadas com detergente (dodecil sulfato de sdio) e mercaptoetanol: desenovelar e separar as cadeias e subunidades de protenas Coloca-se as amostras na poro superior de uma placa de gel de poliacrilamida Placa de gel: submetida a uma corrente eltrica contnua Migrao das protenas ao longo do gel

 

Colorao:  As protenas so coradas  A intensidade da colorao proporcional concentrao das protenas Radioautografia:  Um filme de raios X colocado sobre o gel durante algum tempo e depois revelado  Revelao: manchas escuras no filme de raios X Immunoblotting:  As protenas podem ser transferidas do gel para uma membrana de nitrocelulose  incubada com um Ac que reconhece protenas que podem estar presentes

Permite a identificao de seqncias especficas de DNA ou RNA

a ligao entre duas molculas de cadeia nica de cidos nuclicos: DNA com DNA, RNA com RNA ou RNA com DNA se reconhecem um ao outro se suas seqncias forem complementares, formando molculas de cadeia dupla

Tcnicas altamente especficas

Utilizadas em pesquisas, medicina forense

diagnstico

clnico

Quando aplicada diretamente:


   

Clulas Cortes de tecidos Esfregaos Cromossomos de clulas mitticas

Excelente para:


Averiguar se uma clula tem uma seqncia especfica de DNA Definir a localizao de um gene num cromossomo Identificar as clulas nas quais um gene especfico est sendo transcrito

 

   

O DNA deve ser inicialmente desnaturado Por calor ou agentes desnaturantes Fazendo com que as duas cadeias se separem As cadeias separadas esto prontas para serem ligadas a um segmento de cadeia simples de DNA ou a um segmento de RNA que sejam complementares seqncia que desejamos analisar Esta seqncia: sonda

Obtida:  Clonagem  PCR (amplificao da seqncia)  Sntese (se for curta) Deve ser ligada a um marcador: istopo radioativo ou nucleotdeo modificado

As lminas contendo os cortes de tecido, clulas ou cromossomos so aquecidas

Em seguida, uma soluo contendo a sonda colocada sobre o espcime por um perodo de tempo necessrio

Depois de lavar a lmina, a localizao da sonda ligada a sua seqncia complementar denunciada pelo marcador

Southern blotting eletroforese com molculas de DNA

Northern blotting - eletroforese com molculas de RNA

Exemplos de protenas (Ags) importantes para o diagnstico e subseqente controle de tratamento de algumas doenas Antgenos Finalidade Diagnstica

Protenas de filamentos intermedirios Citoqueratinas Tumores de origem epitelial Protena fibrilar cida glacial Tumores de certas clulas da neurglia Vimetina Tumores de tecido conjuntivo Desmina Tumores de tecido muscular Outras protenas Hormnios proticos ou polipetdicos polipetdicos Antgeno carcinoembriognico (CEA) mamrias

Tumores produtores de hormnios proticos ou Tumores de glndulas, princip. as do tubo digestivo e

Receptores para hormnios esterides Tumores das clulas dos ductos das glndulas mamrias Antgenos de vrus Infeces virais Junqueira e Carneiro. Histologia Bsica. Texto e Atlas. 11 Edio, Editora
Guanabara: Rio de Janeiro, 2006.

Distores e artefatos causados pelo processamento dos tecidos

A totalidade do tecido

Duas dimenses e trs dimenses

  

As vrias etapas podem distorcer os tecidos Imagem que pode diferir da real in vivo Causa: retrao produzida pelo fixador, etanol e calor da parafina usada para a incluso Retrao atenuada: tecidos includos com resina Conseqncia da retrao: espaos artificiais nas clulas e entre as clulas e outros componentes de tecido

 

Tb provocam espaos artificiais: a perda de molculas que no foram mantidas corretamente nos tecidos pelo fixador ou que foram retiradas pelas solues de desidratao e clareamento Espaos artificiais e distores: artefatos de tcnica Outros artefatos: pregas do corte capilares sangneos precipitados de corantes ou de sujeira grnulos citoplasmticos

Dificuldade: impossibilidade de se corar diferencialmente todos os componentes da clula e tecidos num s preparado Necessrio: vrias preparaes diferentes Cada qual corada por mtodos diferentes Obter: uma viso completa da composio e estrutura de um tecido

  

Corte em seces de uma estrutura tridimensional: parecem ter s duas dimenses comprimento e largura

Freqente causa de erros

Necessrio diferentes

estudar

vrias

seces

em

planos

Colorao:
  

Do tipo Romanowsky Papanicolau Azul de Metileno

    

Panptico, Diff-Quick, Wright, May-Grumwald-Giemsa Baratas, fceis de preparar, guardar e usar. Coram bem microrganismos e o citoplasma. Coram mal os ncleos, mas o suficiente para avaliar critrios de malignidade. Particularidades: Panptico Diff-Quick: no cora bem grnulos de mastcitos (problema) May-Grunwald-Giemsa: a melhor delas ( um pouco mais complicada) TODAS necessitam fixao ao ar (rpida!!!)

 

demorada e complicada, mas a rainha das coloraes para citologia. tima colorao de ncleos e citoplasma. tima para avaliar critrios de malignidade. Permite enxergar os ncleos mesmo em grumos grandes de clulas. Necessita fixao com lcool 70 a 90% ou fixador citolgico !!!!

  

 

Fcil de utilizar Cora mal o citoplasma, mas cora muito bem o ncleo e permite avaliar detalhes nucleares. Cora bem grnulos de mastcitos

Fim !!!