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INTRODUCCIN

Es importante para cualquier qumico-frmaco-bilogo en cualquiera de las reas en que se desarrolle conocer y entender cul es el procedimiento y que es lo que sucede qumico, fsico o biolgicamente en cada mtodo que realiza, adems de saber cul es el mtodo analtico que va aplicar en cada situacin, as como saber explicarlo de manera sencilla y entendible a cualquier persona. Entendiendo esto y con el propsito de conocer los fundamentos y procesos de los mtodos y pruebas de anlisis ms frecuentes en el rea clnica, especialmente se presenta la siguiente investigacin sobre una prueba sencilla de embarazo,

especficamente usando tiras reactivas, aunque el fundamento de las pruebas caseras es el mismo. El resultado se da en minutos. Se ha elegido esta prueba por su popularidad pero sobre todo por su sencillez, puesto que no se ocupa de gran conocimiento para su interpretacin, sin embargo debo preguntarme Qu hay detrs de esas rayas coloreadas ya sea en positivo o en negativo? Puesto que en esta prueba se constata la presencia de la hormona Gonadotropina Corinica Humana (hCG) en suero u orina en un tiempo inmediato, inclusive a los 7-8 das de la gestacin. Mediante este trabajo se trata de explicar la importancia de esta hormona, el fundamento de la Inmunocromatografa con tiras, desglosando que es la inmunologa, que es la cromatografa y el uso de las tiras reactivas adems de presentar un ejemplo de la aplicacin de la misma.

INMUNOCROMATOGRAFA EN UNA PRUEBA ESPECFICA DE EMBARAZO

1.- GONADOTROPINA CORINICA HUMANA (HCG hCG)


La Gonadotropina Corinica humana (hCG) es una hormona glicoproteica formada por dos subunidades diferentes (alfa y beta), la cadena alfa es comn a la de las hormonas TSH, FSH y LH, mientras que la cadena beta es especfica de la hCG. Esta hormona es secretada por las clulas trofoblsticas del tejido placentario y por algunas clulas malignas y es secretada a la circulacin sangunea y excretada en la orina. Es por ello que la determinacin de hCG en suero u orina resulta de gran inters en: 1.- El diagnstico temprano del embarazo: El papel fisiolgico principal de esta hormona es mantener el cuerpo lteo durante el embarazo. La hCG es el ms importante marcador para el diagnstico precoz del embarazo porque durante un embarazo normal los valores de hCG se duplican de 1.3 a 2 das, alcanzando el valor ms elevado entre las semanas 8 a 12. Despus de este incremento el nivel de hCG disminuye lentamente hasta una concentracin que se mantiene durante todo el embarazo. Luego del trmino del embarazo el nivel de hCG disminuye rpidamente al valor normal. Mientras el nivel de hCG en mujeres no embarazadas y en hombre sanos est normalmente bajo 1 a 2 UI/I, la hCG se eleva rpidamente y puede alcanzar concentraciones iguales o superiores a 10 a 30 UI/I el da de la primera falta de menstruacin; hacia el octavo da despus de la implantacin, el vulo fecundado inicia su actividad trofoblstica produciendo millonsimas de miligramo de hCG que se pueden detectar habitualmente en suero y orina. Una orina diluida puede originar resultados negativos, pero si an se sospecha un embarazo, es conveniente repetir el ensayo 48 h despus utilizando la primera orina de la maana. 2.- La evaluacin de trastornos del embarazo: En los trastornos a principios del embarazo, como embarazo ectpico y la amenaza de aborto espontneo, la concentracin de hCG en un determinado perodo de gestacin y su ritmo de ascenso, es anormalmente baja, aunque los valores oscilan en un rango muy amplio. No es posible distinguir un embarazo normal de un embarazo ectpico nicamente sobre la base de los resultados del ensayo. 3.- Como marcador tumoral: La Gonadotropina Corinica es considerada como un marcador tumoral asociado a enfermedades malignas trofoblsticas de origen gestacional y no gestacional y a tumores de clulas germinativas por lo cual se ha utilizado este

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marcador no slo para el diagnstico, sino para vigilar el tratamiento en pacientes con tumores secretores de HCG. 4.- Marcador de riesgo para el Sndrome de Down: Varios investigadores reportaron niveles significativamente elevados de hCG en el suero de embarazadas portadoras de un feto con el Sndrome de Down. Considerando la relacin entre los niveles bajos de Alfa-fetoprotena y el Sndrome de Down y la edad materna en esta aberracin gentica, se comprobado la utilidad clnica del pesquisaje combinado de AFP y hCG ms edad materna para calcular el riesgo de Sndrome de Down entre las 15 y 19 semanas de gestacin, con niveles de deteccin que oscilan entre 55 y 65 % llegando en algunos casos hasta un 80 % para un 5 a 7 % de falsos positivos.

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2- FUNDAMENTOS DE LA PRUEBA
En la actualidad, la inmunocromatografa es una de las tcnicas de inmunodiagnstico ms modernas cuyas principales ventajas son la sencillez y rapidez del test debido a que no es necesario reactivos ni instrumentacin adicional y se viene utilizando para el diagnstico rpido de varias enfermedades, el ejemplo ms conocido son los test de embarazo de las farmacias.

INMUNOLOGA: La inmunologa es la ciencia biolgica que estudia todos los mecanismos fisiolgicos de defensa de la integridad biolgica del organismo. Dichos mecanismos consisten esencialmente en la identificacin de lo extrao y su destruccin. La inmunologa tambin estudia los factores inespecficos que coadyuvan a los anteriores en sus efectos finales. El sistema inmune es el encargado de garantizar la integridad del cuerpo frente a todos los intrusos y de reconocer y aplacar la degeneracin celular, previniendo as procesos cancergenos. Para lograrlo cuenta con diferentes componentes: rganos, clulas y sustancias. El sistema inmunitario consta de varias "lneas de defensa" principales: Inmunidad innata (natural o inespecfica): es una lnea de defensa que permite controlar a mayor parte de los agentes patgenos. Inmunidad adquirida (adaptativa o especfica): suministra una respuesta especfica frente a cada agente infeccioso. Posee memoria inmunolgica especfica, que tiende a evitar que el agente infeccioso provoque enfermedad en una segunda infeccin. Los ensayos inmunolgicos son procedimientos en los cuales se utilizan anticuerpos como reactivos enlazantes especficos que tienen aplicacin universal para la determinacin o cuantificacin de frmacos teraputicos y no teraputicos, diversas sustancias biolgicas, sustancias infecciosas o anticuerpos de respuesta del husped en el suero, en la orina, en el lquido cefalorraqudeo, en saliva y en cualquier lquido biolgico donde se encuentre la sustancia a investigar.

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CROMATOGRAFA La cromatografa es un mtodo fsico de separacin, identificacin y determinacin de los componentes qumicos en mezclas complejas. Los componentes que se han de separar se distribuyen en dos fases, una de las cuales se mueve en una direccin definida (gas, un lquido o un fluido supercrtico). Esta fase mvil se hace pasar a travs de una fase estacionaria con la que es inmiscible, y que se fija a una columna o una superficie slida. Las dos fases se eligen de tal forma, que los componentes de la muestra se distribuyen de modo distinto entre la fase mvil y la fase estacionaria. Aquellos componentes que son fuertemente retenidos por la fase estacionaria se mueven lentamente con el flujo de la fase mvil; por el contrario, los componentes que se unen dbilmente a la fase estacionaria, se mueven con rapidez. Como consecuencia de la distinta movilidad (puede ser tambin por sus cargas, masas, tamaos moleculares, polaridad de sus enlaces, potenciales redox), los componentes de la muestra se separan en bandas o zonas discretas que pueden analizarse cualitativa y/o cuantitativamente. Como resultado hay una gran variedad de tcnicas para llevar a cabo la separacin de una sustancia, que se clasifica en cuatro grandes grupos segn el mecanismo de separacin: Cromatografa de reparto: separa los solutos basndose en la solubilidad. Cromatografa de adsorcin: se basa en la afinidad de adsorcin. Cromatografa de exclusin: separa solutos segn su peso molecular. Cromatografa de intercambio inico: separa solutos segn la carga inica.

Para la prueba de hCG se utiliza el principio de la cromatografa de adsorcin y el de la cromatografa de flujo lateral.

INMUNOCROMATOGRAFA. La Inmunocromatografa es una tcnica inmunolgica que permite visualizar la reaccin antgeno-anticuerpo por la acumulacin del oro coloidal del conjugado en zonas especficas del papel de nitrocelulosa que presenta unida a su superficie un ligando (anticuerpos de captura), una molcula ante la que tiene afinidad una o ms de las protenas presentes en las mezcla a separar. Al atravesar la tira, si la muestra contiene el antgeno problema, ste se unir al conjugado formando un complejo inmune y migrar a travs de la membrana de nitrocelulosa, (el ligando secuestra la protena afn), si no contiene el antgeno migrarn el conjugado y la muestra sin unirse.

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La zona de captura est formada por un segundo anticuerpo especfico contra otro eptopo del antgeno. Al llegar la muestra a esta zona, los complejos formados por la unin del antgeno y conjugado quedarn retenidos y la lnea se colorear y la prueba ser positiva, de lo contrario, la prueba ser negativa. La zona control est formada por un tercer anticuerpo que reconoce al reactivo de deteccin. Cuando el resto de muestra alcanza esta zona, el anticuerpo se unir al conjugado libre que no ha quedado retenido en la zona de captura. Esta lnea es un control porque se colorea siempre, con muestras positivas y negativas.

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TIRAS REACTIVAS Las tiras reactivas son mtodos de qumica seca, algunas de las cuales son de uso habitual en el mbito de la atencin primaria. Su utilizacin permite realizar una aproximacin diagnstica y el seguimiento de algunas patologas sin tener que retrasar la decisin teraputica a tomar. Su utilizacin es sencilla y no requieren de complejos mtodos que dificulten su empleo. Existen distintos tipos de tiras: Las tiras multitest incorporan varias determinaciones que las hacen muy polivalentes, por lo que permiten realizar una aproximacin a patologas muy frecuentes en la consulta diaria de atencin primaria. Habitualmente incorporan la determinacin de pH, nitritos, leucocitos (estearasa leucocitaria), protenas, glucosa, cuerpos cetnicos, sangre (hemoglobina, mioglobina), bilirrubina y urobilingeno. Hay con menos determinaciones y usos ms concretos. Las tiras de monodeterminacin son especficas para un solo tipo de prueba. El rea de la prueba de la tira reactiva contiene dos tipos de anticuerpos monoclonales: 1. Anticuerpos monoclonales libres. 2. Anticuerpos monoclonales fijados al sustrato en la ventana de prueba. Los anticuerpos libre son especficos para hCG y estn marcados con un colorante. Los anticuerpos fijados tienen especificidad contra el complejo hCG-anticuerpo libre. Cuando la tira reactiva entra en contacto con la orina que contiene hCG los anticuerpos libres se unen a la hCG y luego se unen a los anticuerpos fijados de modo que forma un sndwich. 3. Entonces los anticuerpos marcados con colorante crean un cambio de color visible en la ventana de prueba. Comunmente utiliza un anticuerpo monoclonal de ratn especfico al hCG en un inmunoensayo cromatogrfico de flujo lateral en un paso. La tirilla de la prueba consiste de una almohadilla conteniendo un conjugado de anticuerpo monoclonal de ratn anti-hCG conjugada a oro coloidal; y de una membrana de nitrocelulosa conteniendo una lnea de la prueba (lnea T) y una lnea de control (lnea C). Cuando una cantidad adecuada de la muestra es aplicada en la almohadilla del dispositivo, la hCG en la muestra se une a sitios donde se encuentra el anticuerpo-dorado conjugado sobre la almohadilla para formar un complejo y migra a travs de la tirilla. Si la muestra contiene HCG a niveles cercanos o mayores a 25 mlU/ml, el complejo se unir al anticuerpo capturado en la capa que existe en la lnea T para formar una banda

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de color vino. Si la muestra no contiene HCG o los niveles de HCG son inferiores a los niveles detectables, la Lnea T no se formar. La lnea C est cubierta con un anticuerpo cabra anti-ratn, la cual se deber unir al anticuerpo-dorado conjugado y formar una lnea color vino sin importar la presencia de la hormona HCG.

Conservacin: Alejar de la luz, a 230C (la sensibilidad disminuye <2 C, temperaturas > 30C

reducen la vida media del producto). Proteger de la humead y del calor excesivo.

Guardar en un rea fra y seca en las condiciones apropiadas dentro de su embalaje original hasta la fecha de caducidad indicada en la etiqueta. Revisar si hay roturas en el sobre contenedor. No abrir el envase hasta el

momento de realizar la prueba. Revisar la presencia de lneas o manchas en la tira antes de su utilizacin, porque

si existe un cambio de color indica una prdida de reactividad.

Control de calidad: Control Interno.- La regin de control (C) de la tira el cual permite confirmar que el volumen de muestras utilizado en el ensayo ha sido el adecuado y el procedimiento ha sido realizada de manera correcta. La aparicin de una banda de color en la zona C indica que el conjugado ha migrado correctamente a travs de la zona de reaccin. Si no aparece la lnea, la prueba debe considerarse no vlida. En los sueros muy positivos, la banda puede ser dbil, aunque visible. Se debe obtener un resultado positivo claro.

CRITERIOS DE DESEMPEO (dependen de la marca) 1. Exactitud. En un estudio con un total de 150 muestras, la exactitud fue de 99%. Falsos positivos son inferiores al 1% Falsos negativos inferiores al 1% 2. Reproducibilidad. La precisin fue determinada mediante 5 rplicas de 5 muestras que fueron identificados correctamente el 100 % del tiempo.

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3. Especificidad. Las siguientes concentraciones de hormonas homlogas a la hCG no presentaron interferencia en el diagnostico TSH 1000 mUI/L WHO 68/38 LH 300-500 UI/L WHO 2do IS 80/552 FSH 1000 UI/L WHO 1er IS 83/575 4. Sensibilidad. Valor discriminante: niveles de hCG de 20 UI/L o superiores. Muestras de orina con niveles de hCG (1 000 000 UI/L) resultan sistemticamente positivas. Orinas de hombres sanos y mujeres no embarazadas presentan niveles de hCG no detectables. 5. Efecto prozona Ausente por lo menos hasta concentraciones de 1 000 000 mUI/mL de hCG.

INTERFERENCIAS En los casos de embarazo ectpico, toxemia del embarazo y aborto inminente, la excrecin de hCG puede estar disminuida obtenindose resultados falsos negativos. Muestras de mujeres con enfermedades trofoblsticas como cori-carcinoma o mola hidatiforme, que secretan hCG, pueden producir resultados falso positivos. Cuando la orina es diluida la concentracin de hCG puede no ser representativa de la concentracin en la sangre, y la prueba puede dar un falso negativo.

LIMITACIONES DEL MTODO. o o La prueba es slo para diagnstico in vitro profesional. Resultados preliminares cualitativos, no son concluyentes.

o Deben excluirse enfermedades relacionadas con hCG antes de realizar un diagnstico de embarazo. o No puede distinguirse un embarazo ectpico. o La tira reactiva si se mantiene dentro de la muestra mucho tiempo, las sustancias qumicas impregnadas en la tira tienen a disolverse, con lo que se obtendrn lecturas y cifras pocos precisas. o Si los reactivos de la muestra se mezclan, las lecturas tambin sern poco precisas.

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3- REALIZACIN DE LA PRUEBA hCG


TIPO DE ENSAYO: MUESTRA: SENSIBILIDAD: ESPECIFICIDAD: MTODO : PRESENTACIN: CUALITATIVO SUERO / ORINA 25 mUI/Ml > 99 % INMUNOCROMATOGRFICO TIRAS REACTIVAS

MUESTRAS Orina: recogido mediante procedimientos estndar en recipiente limpio y estril No es preciso filtrar ni centrifugar a menos que presenten precipitados visibles. Se recomienda utilizar la primera orina de la maana puesto que sta contiene la mxima concentracin de hCG, aunque puede utilizarse orina recogida a cualquier hora del da. La muestra debe ser analizada preferiblemente el mismo da de su recoleccin, si esto no es posible consrvela en refrigeracin. Las muestras son estables durante 2 das a 2-8C o hasta un mes si se congelan a 20C. Antes de realizar la prueba, la muestra debe descongelarse completamente, descongelar repetidamente. Suero: tomarse mediante venopuncin normal, recolectarse en un recipiente sin anticoagulante. Puede obtenerse en cualquier momento pues no es necesario que el paciente est en ayunas. No utilice muestras turbias ya que pueden estar contaminadas por microorganismos. No utilice muestras hemolizadas. Manipular todas las muestras y material utilizado como posiblemente infeccioso. PROCEDIMIENTO (Solo para uso profesional.) 1. Dejar atemperar los materiales y las muestras a temperatura ambiente. 2. Extraiga del recipiente de almacenamiento las tiras reactivas a utilizar e identificar cada una con los datos de la muestra 3. Dispensar 0,5 mL de muestra en un pequeo tubo o frasco. 4. Sumerja la tira reactiva durante 10 a 15 segundos en la muestra de Suero/Orina mientras el extremo de la flecha apunta hacia abajo. No sumerja la tira ms all de la lnea MAX (mxima) o roja. 5. Retrela y colquela sobre una superficie plana, limpia, seca y no absorbente. 6. Examinar los resultados a los 3 minutos cuando analice una muestra de orina o a los 5 minutos cuando analice una muestra de suero. homogenizarla y atemperarla. Evitar congelar y

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Dependiendo de la concentracin de hCG en la muestra, los resultados positivos pueden observarse incluso antes de 40 segundos. Para confirmar los resultados negativos, se requiere el tiempo completo de reaccin (cinco minutos). LECTURA DE RESULTADOS: La regin de control (C) es la ms cercana al lado de sujecin de la tira (cubierto con pelcula coloreada) y la regin de prueba (T) es la ms cercana al lado absorbente de la tira reactiva. No interprete los resultados despus de 10 minutos de reaccin. Examinar la presencia de bandas coloreadas. Resultado positivo. Aparecen dos bandas de color (rojo, violeta o rosa): una en la zona de test T y la otra en la zona de control C. El resultado es positivo aunque las bandas sean dbiles, variar debido a que las concentraciones de hCG varan en las diferentes etapas del embarazo. La intensidad del color de la lnea de la regin de la prueba (T) puede variar dependiendo la concentracin de hCG presente en la muestra. Por lo tanto, cualquier coloracin, por muy dbil que sea sta, en la lnea de la regin de la prueba (T) deber considerarse positiva. En los sueros con elevada concentracin de hCG, la banda en la zona de control C puede ser dbil. El resultado positivo indica que se ha detectado una concentracin de hCG mayor o igual a 20 mUI/ml en la muestra. Resultado negativo. Aparece una banda de color nicamente en la zona de control C. No hay una banda visible en la regin de prueba (T). Resultado Incorrecto. Ausencia de bandas de color o presencia de una nica banda en la zona de test T. Repita de nuevo el procedimiento utilizando una nueva prueba reactiva.

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CONCLUSIN
Las tiras reactivas permiten la determinacin visual cualitativa en un slo paso de la presencia de Gonadotropina Corinica Humana (hCG) en muestras de suero u orina como ayuda para deteccin temprana del embarazo mediante un inmunoensayo por cromatografa de flujo lateral en fase slida donde la mezcla fluye por capilaridad a travs de la tira. La prueba utiliza dos lneas para indicar los resultados. La lnea de la prueba utiliza una combinacin de anticuerpos que incluyen un anticuerpo monoclonal hCG-colorante para detectar selectivamente niveles elevados de hCG. La lnea de control est compuesta por anticuerpos policlonales de cabra en fase slida y partculas coloidales de oro. Una vez sumergida la tira en la muestra, un anti-hCG marcado con oro coloidal se solubiliza y se une a la hCG presente en la muestra. En menos de 5 minutos, pueden detectarse niveles de hCG tan bajos como 10 mIU/ml.

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GLOSARIO
Anlisis cualitativo: estudio detallado que detecta la naturaleza de las diversas sustancias presentes en un material o muestra. Determina sus componentes y propiedades. Anticuerpo: son molculas proteicas secretadas por un tipo celular del sistema inmune, tienen afinidad por sus antgenos correspondientes. Anticuerpo monoclonal: Anticuerpo policlonal: Antgeno: es una molcula de superficie celular, principalmente protenas, que puede inducir la formacin de anticuerpos. Eptopo: porcin especfica de un antgeno que es reconocida por las clulas presentadoras de antgenos, produciendo de esta manera una respuesta inmune especfica. Especificidad: es la capacidad que tiene de catalogarlo como sano cuando no lo es. La propiedad de un mtodo de responder exclusivamente a la caracterstica o el analito definido. Lmite de deteccin: es la cantidad ms baja de analito que puede detectarse, pero no necesariamente cuantificarse, bajo las condiciones experimentales establecidas. Selectividad: es la capacidad del mtodo para evaluar nicamente el principio activo ntegro de forma exacta y especfica, en presencia de los dos componentes que puedan estar. Sensibilidad: es la capacidad de una prueba de diagnosticar a un paciente como enfermo cuando no lo es. Oro coloidal: tambin conocido como nanogold, es una suspensin o coloide de micropartculas clasificadas de oro en un lquido, generalmente agua. El lquido es de color rojo intenso para las partculas menores de 100 nanmetros o un color amarillento sucio para partculas ms grandes. Las nano-partculas pueden venir en una variedad de formas: esferas, barras, cubos, y casquillos.

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BIBLIOGRAFA
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