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UNIVERSIDADE ESTADUAL DO SUDOESTE DA BAHIA UESB DEPARTAMENTO DE QUMICA E EXATAS DQE DISCIPLINA: BIOQUMICA BSICA

DISCENTE:JAMILE FERREIRA E RUBENS SANTOS

ENZIMAS: FATORES QUE INFLUENCIAM A ATIVIDADE ENZIMTICA

Relatrio elaborado para fins avaliativos da Disciplina de Bioqumica Bsica. Ministrado pelo docente Jeferson. Por Rubens Santos e Jamile Ferreira.

Jequi BA Fevereiro de 2013 OBJETIVO Montar ensaios enzimticos, evidenciando a atividade de enzimas como catalisadores biolgicos

Analisar fatores que interferem na catlise enzimtica

INTRODUO

As enzimas so biocatalizadores, ou seja, so molculas, na sua maioria protenas, que tm a capacidade de acelerar uma reao, sem que ela seja consumida. A designao de biocatalizador advm do fato de serem compostos orgnicos presentes no organismo (bio-) e como j foi referido anteriormente, por aumentarem a velocidade das reaes (-catalisador). Ao atuarem como

catalisadores diminuem a energia necessria para desencadear uma reao. Deste modo possvel acelerar a velocidade da reao tornando assim permissvel a ocorrncia de um maior nmero de reaes num determinado espao de tempo. Fatores que condicionam a atividade enzimtica, existem diversos fatores que condicionam a atividade enzimtica entre os quais destacamos: Temperatura PH Concentrao do Substrato Concentrao da Enzima Temperatura: A temperatura exerce influncia sobre a atividade enzimtica na medida em que condicionam as ligaes intramoleculares da enzima: Quando a enzima submetida a uma temperatura elevada as ligaes qumicas rompem-se

conduzindo a uma alterao da conformao da enzima e, consquentemente, a uma alterao do centro ativo. A enzima sofre ento desnaturao, ao que corresponde uma perda da atividade biolgica permanente (processo irreversvel). As temperaturas baixas no constituem um processo irreversvel mas sim reversvel uma vez que apenas causam a inativao das enzimas. Com o aumento de

temperatura e as enzimas no so destrudas a atividade das mesmas restabelecida, pH=0. O pH interfere na atividade enzimtica uma vez que altera distribuio de cargas eltricas da enzima influenciando a conformao do centro ativo e, consequentemente, a sua interao com o substrato. As enzimas possuem um PH timo acima ou abaixo dos valores dos valores para os quais a atividade enzimtica diminui e acaba por cessar. Concentrao do Substrato: O aumento da concentrao do substrato aumenta a atividade enzimtica o que pressupe um aumento da velocidade da reao, desde que haja enzima disponvel h qual o substrato se ir ligar. Quando deixa de haver enzima disponvel (saturao da enzima) a velocidade da reao no aumenta, mantm-se constante. Concentrao da enzima: com o aumento da concentrao da enzima d-se, consequentemente, o aumento da atividade enzimtica e o aumento da velocidade da reao desde que haja substrato disponvel.

MATERIAIS E REAGENTES

Banho de gelo; Banho-maria; Bico e gs e tela de amianto; Pipeta de Pasteur; Termmetro; Proveta; Pipetas graduadas; Tubos de ensaio;

Erlenmeyer; Becker Soluo de NaCl 0,1 %; Soluo de amido 1%; Tampo fosfato 0,1 mol.L-1; cido actico 0,1 mol.L-1 Tampo Tris 0,1 mol.L-1 Soluo de lugol;

Parte experimental ETAPA A: PREPARO DO EXTRATO ENZIMTICO

Ao fazer analise da salivar coletou-se aproximadamente 3 mL da saliva filtrada e diluiu-se com soluo de NaCl 0,1% na proporo 1:10.

ETAPA B: ESPECIFICIDADE ENZIMTICA Na etapa B, preparou dois tubos de ensaios, contendo as seguintes substncias, vide tabela 1. Tabela1: substncias para analise. SUBSTNCIAS Amido Sacarose Amilase 1 Presente Ausente Presente 2 Ausente Presente Presente

Em seguida incubiu-se os dois tubos de ensaio em banho-maria a 37C. Posteriormente fez o teste do lugol nos tubos 1 e 2 para verificar se h hidrlise do amido. ETAPA C: DESNATURAO DAS ENZIMAS: INFLUNCIA DA TEMPERATURA NA ATIVIDADE ENZIMTICA Foram colocados em trs tubos respectivamente, vide tabela 2. Tabela 2: amostras para analise. Tubos de ensaios 1 2 3 2,5 2,5 2,5 gua destilada Amilase salivar in natura Amilase salivar fervida por 10 min e resfriada Quantidade em mL Substncias

Acrescentou-se em cada tubo, 5 mL de soluo de amido e foram incubadas a 37C por 10 minutos. Em seguida, aps incubao, retiraram duas alquotas de 2 mL de cada tubo, deste modo ter-se- seis alquotas finais. Deixou-se esfriar. Logo aps, acrescentou-se as trs primeiras alquotas a uma gota do reagente de lugol,

s outras trs restantes, fazendo o teste de Fehling e foram observados e anotados os resultados.

ETAPA D: EFEITO DA CONCENTRAO DO SUBSTRATO Foram preparados os seguintes tubos, vide tabela 3. Tabela 3: concentrao do substrato. Tubos 1 2 3 4 5 6 7 Amido 1% 0,0 mL 0,2 mL 0,4 mL 0,6 mL 1,0 mL 2,0 mL 3,2 mL gua destilada 3,2 mL 3,0 mL 2,8 mL 2,6 mL 2,2 mL 1,2 mL 0,0 mL

Adicionaram se 0,1 mL da soluo de amilase (colocado no fundo do tubo e agitado), esperaram 3 minutos em banho-maria a 37C, mergulhando todos os tubos, ao mesmo tempo, em banho-maria de gua fervente. Em seguida deixou esfri-lo e fez o teste do iodo (2 a 3 gotas de lugol). Logo aps, analisou os resultados, observando a diferena de intensidade de cor nos vrios tubos.

ETAPA D: EFEITO DO pH Preparou os seguintes tubos:

- tubo 1: 1 mL de tampo fosfato 1 mol.L-1, pH 7,0 + 2 mL de amido 1%;

- tubo 2: 1 mL de cido actico 1 mol.L-1, pH 2,0 + 2 mL de amido 1%; - tubo 3: 1 mL de tampo Tris 1 mol.L-1, pH 12,0 + 2 mL de amido 1%; Em cada tubo, adicionou-se 0,5 mL da soluo de amilase (no fundo do tubo, agitando bem), esperam aproximadamente 10 minutos, em seguida adicionou algumas gotas de lugol e foram analisados os resultados.

RESULTADO E DISCUSSO

1. A Especificidade:

Lugol + amido (padro) = forma um complexo azulado Para dar-se incio ao experimento foi incubada a soluo de amido a uma temperatura em torno de 37 C, para que esta ficasse com uma temperatura relativamente aproximada ao do corpo humano, e assim fazendo com que a enzima (amilase salivar) estivesse com seu melhor desempenho. Preparamos tambm uma soluo salivar diluda (1:10). Enquanto a soluo de amido se estabilizava, preparou-se 2 tubos de para o teste de Lugol. Baseado na colorao do lugol + amido pode observar que com a adio de Lugol resulta na formao de um complexo de colorao azul escuro, fato pelo qual h interao do iodo com a estrutura hlice do amido, como observado na figura 1.

Amilose + Amido + incubao = a soluo no ficou azulada

Amilase e Amido com reagente Lugol, formao do produto Maltose, a amilase salivar quebrou o amido, e no foi identificada a presena do amido pois no houve a formao de colorao. Amilase + Amido = Maltose. Resultado negativo.

Amilose + sacarose + incubao = no se observou reao Pois nem todas as molculas grandes, do complexo colorido com o iodo. Isso porque necessrio que a molcula apresente uma conformao que propicie o "encaixe" do iodo. A celulose um exemplo de polissacardeo que no d reao colorida com o iodo, como ocorre com amilose + sacarose. Como o Lugol no reage com monossacardeos, dissacardeos e celuloses, nas reaes com agua, glicose, sacarose, e tambm na soluo os resultados foram negativos. Na presena do amido a colorao se tornou azul, dando um resultado positivo, sabendo-se que este reagente que a base de iodo reage com polissacardeos. Vale ressalta que a hidrlise pela -amilase, portanto, transforma o amido (no redutor e com a reao azul com o iodo), progressivamente com acrodextrinas (com baixo poder redutor e no corveis pelo iodo) e em glicose, maltose, isomaltose e oligolosdios redutores que tambm no desenvolvem colorao com iodo.

2. Desnaturao

Tubos de ensaios 1 2 3 Com lugol

Quantidade em mL 2,5 2,5 2,5

Substncias gua destilada Amilase salivar in natura Amilase salivar fervida por 10 min e resfriada

Tubo 1 = reagiu (ou talvez s tenha dissolvido o Lugol)

Tubo 2 = no reagiu com o lugol Tubo 3 = reagiu com o lugol. O Lugol no reage com monossacardeos, dissacardeos e celuloses, nas reaes com agua, glicose, sacarose, e tambm na soluo os resultados foram negativos. Na presena do amido a colorao se tornou azul, dando um resultado positivo, sabendo-se que este reagente que a base de iodo reage com polissacardeos.

Com Fehling Tubo 1.1 = no reagiu Tubo 2.1 = reagiu pelo teste de Fehling (formou um precipitado avermelhado) Tubo 3.1 = no reagiu com o teste de Fehling

Nessa reao, o aparecimento de um precipitado de colorao vermelho-tijolo indica que os ons Cu2+ do reagente de Fehling foram reduzidos a Cu+, indicando a presena de um acar redutor.

3. pH :
- tubo 1: 1 mL de tampo fosfato 1 mol.L-1, pH 7,0 + 2 mL de amido 1%; - tubo 2: 1 mL de cido actico 1 mol.L-1, pH 2,0 + 2 mL de amido 1%; - tubo 3: 1 mL de tampo Tris 1 mol.L-1, pH 12,0 + 2 mL de amido 1%; Assim foram observados os seguintes resultados: Tubo 1 (Lugol) = reagiu, a soluo ficou bastante escurecida Tubo 2 (Lugol) = reagiu bastante com o lugol, a soluo ficou azulada Tubo 3 (lugol) = no reagiu A amilase salivar apenas atua em situaes de pH prximo da neutralidade, motivo pelo qual o pH da boca varia entre os 6 e os 7,4. A sua ao prolonga-se mesmo no decurso do processo de deglutio, at a chegada ao estmago, onde inativada pelo pH cido do suco gstrico.

4. Concentrao:

Tubos 1 2 3 4 5 6 7

Amido 1% 0,0 mL 0,2 mL 0,4 mL 0,6 mL 1,0 mL 2,0 mL 3,2 mL

gua destilada 3,2 mL 3,0 mL 2,8 mL 2,6 mL 2,2 mL 1,2 mL 0,0 mL

1. Sem reao com o lugol 2. Pouca reao, baixa colorao azulada 3. Pouca reao, baixa colorao, colorao mais intensa que no tubo 2 4. A partir de 4, a colorao vai aumentando a tonalidade azulada. Com os resultados obtidos, observar que com a adio de Lugol resulta na formao de um complexo de colorao azul escuro, medida que vo adicionando amido, ou seja, aumentando a concentrao do amido, esse fato ocorre pelo qual h interao do iodo com a estrutura hlice do amido.

CONCLUSO Partir dessa atividade experimental compreendemos como a concentrao das enzimas, temperatura, especificidade e pH influenciam nas reaes catalisadas. Percebemos tambm que na realizao da prtica nem sempre os resultados esperados so obtidos devido a combinao de vrios fatores.

REFERNCIAS BIBLIOGRAFICAS

CAMPBELL, M. K. Bioqumica, Porto Alegre, Editora Artmed, 3 Edio, 2000. Lehninger, A.L.; Nelson, D. L.; Cox, M. M. Princpios de bioqumica. So Paulo: Sarvier, 1995.

NELSON, D.L; COX, M.M. Lehninger Princpios de Bioqumica, So Paulo, Editora Sarvier, 3 Edio, 2002.