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Enzimas= fatores que influenciam a atividade enzimática

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UNIVERSIDADE ESTADUAL DO SUDOESTE DA BAHIA – UESB DEPARTAMENTO DE QUÍMICA E EXATAS – DQE DISCIPLINA: BIOQUÍMICA BÁSICA

DISCENTE:JAMILE FERREIRA E RUBENS SANTOS

ENZIMAS: FATORES QUE INFLUENCIAM A ATIVIDADE ENZIMÁTICA

Relatório elaborado para fins avaliativos da Disciplina de Bioquímica Básica. Ministrado pelo docente Jeferson. Por Rubens Santos e Jamile Ferreira.

Jequié – BA Fevereiro de 2013 OBJETIVO  Montar ensaios enzimáticos, evidenciando a atividade de enzimas como catalisadores biológicos 

Analisar fatores que interferem na catálise enzimática

INTRODUÇÃO

As enzimas são biocatalizadores, ou seja, são moléculas, na sua maioria proteínas, que têm a capacidade de acelerar uma reação, sem que ela seja consumida. A designação de biocatalizador advém do fato de serem compostos orgânicos presentes no organismo (bio-) e como já foi referido anteriormente, por aumentarem a velocidade das reações (-catalisador). Ao atuarem como

catalisadores diminuem a energia necessária para desencadear uma reação. Deste modo é possível acelerar a velocidade da reação tornando assim permissível a ocorrência de um maior número de reações num determinado espaço de tempo. Fatores que condicionam a atividade enzimática, existem diversos fatores que condicionam a atividade enzimática entre os quais destacamos: • • • • Temperatura PH Concentração do Substrato Concentração da Enzima Temperatura: A temperatura exerce influência sobre a atividade enzimática na medida em que condicionam as ligações intramoleculares da enzima: Quando a enzima é submetida a uma temperatura elevada as ligações químicas rompem-se

conduzindo a uma alteração da conformação da enzima e, consquentemente, a uma alteração do centro ativo. A enzima sofre então desnaturação, ao que corresponde uma perda da atividade biológica permanente (processo irreversível). As temperaturas baixas não constituem um processo irreversível mas sim reversível uma vez que apenas causam a inativação das enzimas. Com o aumento de

temperatura e as enzimas não são destruídas a atividade das mesmas é restabelecida, pH=0. O pH interfere na atividade enzimática uma vez que altera distribuição de cargas elétricas da enzima influenciando a conformação do centro ativo e, consequentemente, a sua interação com o substrato. As enzimas possuem um PH ótimo acima ou abaixo dos valores dos valores para os quais a atividade enzimática diminui e acaba por cessar. Concentração do Substrato: O aumento da concentração do substrato aumenta a atividade enzimática o que pressupõe um aumento da velocidade da reação, desde que haja enzima disponível há qual o substrato se irá ligar. Quando deixa de haver enzima disponível (saturação da enzima) a velocidade da reação não aumenta, mantém-se constante. Concentração da enzima: com o aumento da concentração da enzima dá-se, consequentemente, o aumento da atividade enzimática e o aumento da velocidade da reação desde que haja substrato disponível.

MATERIAIS E REAGENTES                

Banho de gelo; Banho-maria; Bico e gás e tela de amianto; Pipeta de Pasteur; Termômetro; Proveta; Pipetas graduadas; Tubos de ensaio;

Erlenmeyer; Becker Solução de NaCl 0,1 %; Solução de amido 1%; Tampão fosfato 0,1 mol.L-1; Ácido acético 0,1 mol.L-1 Tampão Tris 0,1 mol.L-1 Solução de lugol;

Parte experimental ETAPA A: PREPARO DO EXTRATO ENZIMÁTICO

Ao fazer analise da salivar coletou-se aproximadamente 3 mL da saliva filtrada e diluiu-se com solução de NaCl 0,1% na proporção 1:10.

ETAPA B: ESPECIFICIDADE ENZIMÁTICA Na etapa B, preparou dois tubos de ensaios, contendo as seguintes substâncias, vide tabela 1. Tabela1: substâncias para analise. SUBSTÂNCIAS Amido Sacarose Amilase 1 Presente Ausente Presente 2 Ausente Presente Presente

Em seguida incubiu-se os dois tubos de ensaio em banho-maria a 37ºC. Posteriormente fez o teste do lugol nos tubos 1 e 2 para verificar se há hidrólise do amido. ETAPA C: DESNATURAÇÃO DAS ENZIMAS: INFLUÊNCIA DA TEMPERATURA NA ATIVIDADE ENZIMÁTICA Foram colocados em três tubos respectivamente, vide tabela 2. Tabela 2: amostras para analise. Tubos de ensaios 1 2 3 2,5 2,5 2,5 Água destilada Amilase salivar in natura Amilase salivar fervida por 10 min e resfriada Quantidade em mL Substâncias

Acrescentou-se em cada tubo, 5 mL de solução de amido e foram incubadas a 37ºC por 10 minutos. Em seguida, após incubação, retiraram duas alíquotas de 2 mL de cada tubo, deste modo ter-se-á seis alíquotas finais. Deixou-se esfriar. Logo após, acrescentou-se as três primeiras alíquotas a uma gota do reagente de lugol,

às outras três restantes, fazendo o teste de Fehling e foram observados e anotados os resultados.

ETAPA D: EFEITO DA CONCENTRAÇÃO DO SUBSTRATO Foram preparados os seguintes tubos, vide tabela 3. Tabela 3: concentração do substrato. Tubos 1 2 3 4 5 6 7 Amido 1% 0,0 mL 0,2 mL 0,4 mL 0,6 mL 1,0 mL 2,0 mL 3,2 mL Água destilada 3,2 mL 3,0 mL 2,8 mL 2,6 mL 2,2 mL 1,2 mL 0,0 mL

Adicionaram se 0,1 mL da solução de amilase (colocado no fundo do tubo e agitado), esperaram 3 minutos em banho-maria a 37ºC, mergulhando todos os tubos, ao mesmo tempo, em banho-maria de água fervente. Em seguida deixou esfriá-lo e fez o teste do iodo (2 a 3 gotas de lugol). Logo após, analisou os resultados, observando a diferença de intensidade de cor nos vários tubos.

ETAPA D: EFEITO DO pH Preparou os seguintes tubos:

- tubo 1: 1 mL de tampão fosfato 1 mol.L-1, pH 7,0 + 2 mL de amido 1%;

- tubo 2: 1 mL de ácido acético 1 mol.L-1, pH 2,0 + 2 mL de amido 1%; - tubo 3: 1 mL de tampão Tris 1 mol.L-1, pH 12,0 + 2 mL de amido 1%; Em cada tubo, adicionou-se 0,5 mL da solução de amilase (no fundo do tubo, agitando bem), esperam aproximadamente 10 minutos, em seguida adicionou algumas gotas de lugol e foram analisados os resultados.

RESULTADO E DISCUSSÃO

1. A Especificidade:

Lugol + amido (padrão) = forma um complexo azulado Para dar-se início ao experimento foi incubada a solução de amido a uma temperatura em torno de 37° C, para que esta ficasse com uma temperatura relativamente aproximada ao do corpo humano, e assim fazendo com que a enzima (amilase salivar) estivesse com seu melhor desempenho. Preparamos também uma solução salivar diluída (1:10). Enquanto a solução de amido se estabilizava, preparou-se 2 tubos de para o teste de Lugol. Baseado na coloração do “lugol + amido” pode observar que com a adição de Lugol resulta na formação de um complexo de coloração azul escuro, fato pelo qual há interação do iodo com a estrutura α – hélice do amido, como é observado na figura 1.

Amilose + Amido + incubação = a solução não ficou azulada

Amilase e Amido com reagente Lugol, formação do produto Maltose, a amilase salivar quebrou o amido, e não foi identificada a presença do amido pois não houve a formação de coloração. Amilase + Amido = Maltose. Resultado negativo.

Amilose + sacarose + incubação = não se observou reação Pois nem todas as moléculas grandes, dão complexo colorido com o iodo. Isso porque é necessário que a molécula apresente uma conformação que propicie o "encaixe" do iodo. A celulose é um exemplo de polissacarídeo que não dá reação colorida com o iodo, como ocorre com amilose + sacarose. Como o Lugol não reage com monossacarídeos, dissacarídeos e celuloses, nas reações com agua, glicose, sacarose, e também na solução os resultados foram negativos. Na presença do amido a coloração se tornou azul, dando um resultado positivo, sabendo-se que este reagente que é a base de iodo reage com polissacarídeos. Vale ressalta que a hidrólise pela α-amilase, portanto, transforma o amido (não redutor e com a reação azul com o iodo), progressivamente com acrodextrinas (com baixo poder redutor e não coráveis pelo iodo) e em glicose, maltose, isomaltose e oligolosídios redutores que também não desenvolvem coloração com iodo.

2. Desnaturação

Tubos de ensaios 1 2 3 Com lugol

Quantidade em mL 2,5 2,5 2,5

Substâncias Água destilada Amilase salivar in natura Amilase salivar fervida por 10 min e resfriada

Tubo 1 = reagiu (ou talvez só tenha dissolvido o Lugol)

Tubo 2 = não reagiu com o lugol Tubo 3 = reagiu com o lugol. O Lugol não reage com monossacarídeos, dissacarídeos e celuloses, nas reações com agua, glicose, sacarose, e também na solução os resultados foram negativos. Na presença do amido a coloração se tornou azul, dando um resultado positivo, sabendo-se que este reagente que é a base de iodo reage com polissacarídeos.

Com Fehling Tubo 1.1 = não reagiu Tubo 2.1 = reagiu pelo teste de Fehling (formou um precipitado avermelhado) Tubo 3.1 = não reagiu com o teste de Fehling

Nessa reação, o aparecimento de um precipitado de coloração vermelho-tijolo indica que os íons Cu2+ do reagente de Fehling foram reduzidos a Cu+, indicando a presença de um açúcar redutor.

3. pH :
- tubo 1: 1 mL de tampão fosfato 1 mol.L-1, pH 7,0 + 2 mL de amido 1%; - tubo 2: 1 mL de ácido acético 1 mol.L-1, pH 2,0 + 2 mL de amido 1%; - tubo 3: 1 mL de tampão Tris 1 mol.L-1, pH 12,0 + 2 mL de amido 1%; Assim foram observados os seguintes resultados: Tubo 1 (Lugol) = reagiu, a solução ficou bastante escurecida Tubo 2 (Lugol) = reagiu bastante com o lugol, a solução ficou azulada Tubo 3 (lugol) = não reagiu A amilase salivar apenas atua em situações de pH próximo da neutralidade, motivo pelo qual o pH da boca varia entre os 6 e os 7,4. A sua ação prolonga-se mesmo no decurso do processo de deglutição, até a chegada ao estômago, onde é inativada pelo pH ácido do suco gástrico.

4. Concentração:

Tubos 1 2 3 4 5 6 7

Amido 1% 0,0 mL 0,2 mL 0,4 mL 0,6 mL 1,0 mL 2,0 mL 3,2 mL

Água destilada 3,2 mL 3,0 mL 2,8 mL 2,6 mL 2,2 mL 1,2 mL 0,0 mL

1. Sem reação com o lugol 2. Pouca reação, baixa coloração azulada 3. Pouca reação, baixa coloração, coloração mais intensa que no tubo 2 4. A partir de 4, a coloração vai aumentando a tonalidade azulada. Com os resultados obtidos, observar que com a adição de Lugol resulta na formação de um complexo de coloração azul escuro, à medida que vão adicionando amido, ou seja, aumentando a concentração do amido, esse fato ocorre pelo qual há interação do iodo com a estrutura α – hélice do amido.

CONCLUSÃO Partir dessa atividade experimental compreendemos como a concentração das enzimas, temperatura, especificidade e pH influenciam nas reações catalisadas. Percebemos também que na realização da prática nem sempre os resultados esperados são obtidos devido a combinação de vários fatores.

REFERÊNCIAS BIBLIOGRAFICAS

CAMPBELL, M. K. Bioquímica, Porto Alegre, Editora Artmed, 3ª Edição, 2000. Lehninger, A.L.; Nelson, D. L.; Cox, M. M. Princípios de bioquímica. São Paulo: Sarvier, 1995.

NELSON, D.L; COX, M.M. Lehninger Princípios de Bioquímica, São Paulo, Editora Sarvier, 3ª Edição, 2002.

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