ELISA Y ELISA-POT (ELISPOT)

ELISA
Es el ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA). Utiliza como sus siglas lo indican una enzima como marcador para mediar la formacin de complejos antgeno-anticuerpo.

 Existen diversas variaciones al mtodo de ELISA para detectar y cuantificar ligandos de alto peso molecular (>30 000 daltons), el marcador enzimtico que se emplea en estos anlisis se conjuga con un ligando, que puede ser un antgeno, un anticuerpo especfico para el antgeno de inters o un anticuerpo para el anticuerpo primario.

Casi todas las pruebas ELISA son ensayos en fase slida en los
cuales se absorbe un antgeno o un anticuerpo sobre un soporte slido.

 Todas las pruebas ELISA se requiere de un paso de separacin para eliminar el conjugado enzimtico libre antes de proceder a determinar la cantidad de conjugado enzimtico enlazado. Para lo cual se aade sustrato enzimtico y se mide la reaccin cataltica entre la enzima y el sustrato. Una sola protena enzimtica puede transformar en algunos minutos gran nmero de molculas de sustrato en una cantidad igualmente abundante de producto final, produciendo un cambio de color amplificado y que se detecta con facilidad.

 En el mtodo ELISA de inhibicin el cambio de color se reduce, porque la actividad enzimtica se inhibe cuando el anticuerpo se enlaza al conjugado enzimtico.

ELISA se basa en varias teoras:

1)El antgeno y anticuerpo pueden enlazarse a una superficie portadora insoluble y retener su reactividad inmunolgica. 2)Las enzimas tienen actividad especfica alta y convierten una cantidad relativamente grande de sustrato en producto detectable, lo que permite detectar concentraciones muy bajas del ligando. 3) La actividad enzimtica o reactividad inmunolgica de los conjugados se preserva y permanece estable durante el anlisis y el almacenamiento. 4) Las enzimas no estn presentes en el lquido biolgico que se va a analizar.

Los anticuerpos utilizados en el mtodo ELISA son de origen monoclonal o policlonal que se suministran como antisuero no fraccionado o fracciones de inmunoglobulina purificada. Pueden ser solubles o estar inmviles en un soporte slido. Son empleados como conjugados no marcados o enzimticos Y reaccionan con determinante antignico especfico de un antgeno o de un anticuerpo ligando-especfico (anticuerpo primario).

 Los antgenos se purifican o se producen con tecnologa recombinante, y al igual que los anticuerpos se utilizan como conjugados marcados o enzimticos y son inmviles o solubles, dependiendo del protocolo de anlisis. Como se puede deducir los conjugados enzimticos son antgenos o anticuerpos unidos en forma covalente a la enzima de eleccin . El reactivo que se forma de la unin covalente entre enzima y antgeno o anticuerpo es el conjugado.

Las combinaciones de enzima y sustrato que se emplean en los diversos mtodos ELISA incluyen:
1) Peroxidasa de rbano y su sustrato, perxido de hidrgeno que en presencia de cromgeno o-fenilendiamina produce un producto color amarillo-naranja medible 2) Galactosidasa beta y su sustrato o-nitrofenil-beta-D- galactopiransido que se transforma en un producto nitrofenolado amarillento medible

3) Fosfatas alcalina y su sustrato p-nitrofenilfosfato que tambin se transforma en nitrofenolato. Se utiliza cido sulfrico para inhibir la actividad enzimtica y estabilizar el producto final de reaccin que tiene color.

ENSAYOS DE ENLACE COMPETITIVO

Los ELISA en fase slida, no competitivos se utilizan para determinar antgenos, haptenos o anticuerpos. Aqu el ligando no marcado compite con un ligando conjugado con enzima por un nmero limitado de sitios de enlace con el anticuerpo inmovilizado, y siguiendo el protocolo se retira el ligando no reactante, para as poder relacionar inversamente la cantidad de producto que se forma con la concentracin del ligando no marcado en la muestra problema.

ENSAYOS DE ENLACE NO COMPETITIVOS

Son denominados tambin, tcnicas del emparedado. Son los mtodos ms utilizados para determinar antgenos que por lo menos tienen dos determinantes antignicos. Como fase slida pueden ser utilizadas perlas de poliestireno en donde se absorbe un exceso de anticuerpos generalmente monoclonales, y se sigue el protocolo de trabajo retirando tambin como en los casos anteriores el exceso de antgeno presente no unido.

TCNICAS DE ENSAYO INMUNOLGICO POR MULTIPLICACIN ENZIMTICA

EMIT es un anlisis sin separacin en el cual se emplea una enzima conjugada al hapteno de inters como marcador en una reaccin enzima-sustrato como sistema de deteccin. Este tipo de anlisis lo describieron Rubenstein y colaboradores en 1972. Su principio es que se pueden determinar la cantidad de interaccin entre el hapteno y el anticuerpo utilizando un marcador enzimtico.

 Se basa en una reaccin de enlace competitivo entre el hapteno de la muestra y el hapteno conjugado con la enzima en un nmero limitado de sitios de enlace con el anticuerpo. El enlace del anticuerpo al hapteno conjugado con la enzima produce inhibicin de la actividad enzimtica. Esta inhibicin se debe a que el anticuerpo interfiere estricamente con el enlace del sustrato al sitio cataltico de la enzima o el enlace del anticuerpo transforma la configuracin de la enzima. La cantidad de hapteno en la muestra determina el nmero de sitios para anticuerpos disponibles para enlazar e inactivar el hapteno conjugado con la enzima. A medida que hay ms hapteno hay menos anticuerpo disponible para inhibir la actividad enzimtica,por lo que el cambio de color se observa directamente proporcional a la cantidad de hapteno presente en la muestra.

ELISPOT

ELISPOT
El ensayo de puntos por inmunoabsorcin unida a enzimas (Enzime-Linked InmunoSorbent SPOT) es un mtodo comn utilizado para monitorizar la respuesta inmune de seres humanos y animales. Fue desarrollado por Cecil Czerkinsky en 1983. Los ensayos ELISPOT se encuentran basados, y fueron desarrollados a partir de una versin modificada de los ELISA. En concreto el primer ELISPOT fue desarrollado para enumerar clulas B secretoras de anticuerpos especficos, y luego fue subsecuentemente adaptada para varias finalidades, especialmente para la identificacin y enumeracin de clulas productoras de citoquinas.

 Bajo las condiciones correctas un ensayo de tipo ELISPOT permite la

individualizacin de cada una de las clulas secretoras o activadas, en base a la visualizacin de su producto secretorio.

Por lo tanto los ensayos ELISPOT proveen tanto informacin cualitativa

(tipo de protena secretoria) como cuantitativa (nmero de clulas reactivas).

Debido a la exquisita sensibilidad de los ensayos ELISPOT, se ha convertido en una prctica relativamente sencilla la caracterizacin de poblaciones celulares sumamente pequeas (por ejemplo las responsables de una respuesta contra un antgeno especfico). Algo que hace unos aos era prcticamente imposible.

Esta excepcional sensibilidad es en parte debida a que el producto secretorio es rpidamente capturado en torno a la clula, antes de que se diluya en el sobrenadante, antes de que sea capturado por clulas adyacentes, o sea degradado. Esto hace a los ensayos ELISPOT mucho mas sensibles que los convencionales ELISA. Los lmites de deteccin para estos ensayos se encuentran en el orden de 1:100.000 molculas, esto permite automatizar gran parte del proceso lo que a su vez permite un mayor nivel de precisin que el que puede ser alcanzado por medio de tcnicas manuales.

TCNICA ELISPOT
Esta tcnica permite detectar clulas B productoras de un aticuerpo especfico o clulas T productoras de una determinada citoquina. Para poer detectar las clulas productoras de anticuerpo, los linfocitos se extienden en una placa sensibilizada con antgeno. Los anticuerpos secretados se unen al antgeno situado en las proximidades de la clula productora. A continuacin, se detectan los puntos en que el anticuerpo se ha unido al antgeno mediante la adicin de una enzima conjugada con anti-inmunoglobulina y un cromgeno. Para poder detectar las clulas productoras de citoquina se aaden a las placas anticuerpo anti-citoquina y se visualiza la citoquina capturada mediante una enzima conjugada con una anticuerpo frente a otro eptopo de la citoquina.