UNIVERSIDAD ESPECIALIZADA DE LAS AMERICAS (Extensin Chiriqu)

Manual de las Pruebas de Hematologa, Prueba de Serologa y Pruebas de Qumica Especial

Tcnico Asistente Laboratorio Clnico Sanitario

Presentado por: Ana Castillo 4-773-765 Yoswal Gantes 4-775-1626 Anginy Concepcin 4-762-242 Eneida Lezcano 4-770-718 Evelyn Lezcano 4-770-719

Profesor: Luis Ayarza

2013

DEDICATORIA
Este trabajo que con muchos esfuerzos hemos realizados se lo dedicamos a nuestro profesor LUIS AYARZA. Tambin ha requerido de mucha dedicacin, no hubiese sido posible su finalizacin sin la cooperacin interesada de todos y cada una de las personas y muchas las que han sido un soporte muy fuerte en momento de angustia y desesperacin

AGRADECIMIENTO
Agradecemos principalmente a Dios, que nos ha guiado y dado la fortaleza de seguir adelante, a nuestras familias por su comprensin, adems de sus apoyos incondicional a lo largo de nuestros estudios. Y a todas las personas que en una u otra forma nos apoyaron en la realizacin de este trabajo. Y por ltimo le agradecemos a nuestros compaeros, amistades y apoyo moral han aportado en un alto porcentaje y a nuestras ganas de seguir adelante en nuestra carrera profesional.

INDICE
Introduccin Captulo I 1. Manual de Hematologa. 1.1 La Hematologa. 1.1.2 Enfermedades hematolgicas. 1.1.3 Pruebas que se realizan en un laboratorio de hematolgica 1.2 Como interpretar los hemogramas. 1.3 Pruebas hematolgicas habituales. 1.4 rea de hematologa y coagulacin. 1.5 Los 5 tipos de exmenes de sangre ms frecuentes 1.5.1 Exmenes hematolgicos 1.5.2 Valores hematolgicos normales 1.6 Hematologa 1.6.1 Coagulacin 1.6.2 Drogas 1.7 Biometra hemtica 1.8 Prueba de coagulacin 1.8.1 Puncin capilar 1.8.2 Puncin venosa 1.8.3 Determinacin de hemoglobina (hb) 1.8.4 Determinacin de hematocrito 1.8.5. Cuenta de eritrocitria 1.8.6. Cuenta leucocitaria 1.9 Anticoagulante
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1.9.1 Tipo de tubos con anticoagulante Captulo II 2. La Serologa 2.1 Las enfermedades detectables con la serologa 2.1.2 Las tcnicas de serologa 2.1.3 Tcnicas rpidas y automatizacin 2.1.4 Mtodo cuantitativo: concepto de titulo de un suero 2. 2 Realizacin de examen 2.2.1 Indicaciones 2.2.2 Valores normales 2.2.3 Valores anormales 2.3 Riesgo 2.4 Tubos que se utilizan para serologa 2.5 Pruebas de serologa o de laboratorio 2.5.1 Utilidad de los estudios serolgicos 2.6 Eleccin de un prueba serolgica, sensibilidad y especialidad 2.7 Valores predictivos 2.8 Perfiles serolgicos 2.8.1 Utilidad clnica del perfil serolgico 2.8.2 Algunos ejemplos de la utilidad de los perfiles serolgicos 2.9 Principalmente hay dos posibles campos de utilidad para la serologa

Capitulo III 3. Qumica especial 3.1 Pruebas Especiales que se realizan en el laboratorio Clnico Captulo IV 4. La tincin de gran 4.1 La Metodologa 4.1.1 Explicacin 4.2 Teora 4.3 Tcnicas de coloracin de gram 4.3.1 Tincin 4.3.2 Enjuague 4.4 Bacteria resistente a la tincin de gran 4.5 Utilidad 4.6 Fundamentos de la diferenciacin de gram positivo y gram negativo. 4.7 Causa que altera la tincin Gram

INTRODUCCIN La hematologa es la ciencia que estudia los componentes sanguneos, tales como: las clulas (hemates o eritrocitos o glbulos rojos, leucocitos o glbulos blancos y plaquetas), plasma y de los tejidos formadores de esas clulas (rganos hematopoyticos: mdula sea, sistema linftico, bazo,). Y en el laboratorio de hematologa se llevan a cabo estos estudios. Las pruebas que se realizan en el laboratorio son para observar el desarrollo y las alteraciones de los componentes de la sangre o tejidos hematopoyticos. Cuando se produce dichas alteraciones en el organismo o se modifican los parmetros de los componentes, que en condiciones normales son constantes, nos indica que hay una enfermedad o infeccin en el organismo. La serologa aprovecha la habilidad de los organismos de defenderse ante una infeccin por un patgeno. Esta defensa incluye diferentes mecanismos especficos e inespecficos, de los cuales los inespecficos son innatos e incluyen mucosas, sistemas mecnicos, macrfagos etc. Algunos componentes de este sistema constituyen la base sobre la que funciona el sistema especfico dado que es un sistema que adquiere inmunidad tras la fagocitosis y exposicin de un antgeno por los macrfagos, su posterior reconocimiento e interaccin con los linfocitos que estimula la formacin de anticuerpos. Tras una infeccin la presencia de anticuerpos se puede detectar en general en un plazo de entre 10 y 15 das dependiendo del tipo, cantidad, virulencia y patognicas del antgeno y del estado, la va de infeccin y la capacidad inmune del animal infectado. La qumica Especial se realiza en el suero que es la parte amarillenta de la sangre que queda despus de que la sangre se ha coagulado y las clulas sanguneas se han removido. La tincin de Gram es un tipo de tincin diferencial empleado en microbiologa para la visualizacin de bacterias, sobre todo en muestras clnicas. Debe su nombre al bacterilogo dans Christian Gram, que desarroll la tcnica en 1884. Se utiliza tanto para poder referirse a la morfologa celular bacteriana como para poder realizar una primera aproximacin a la diferenciacin bacteriana,
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considerndose Bacteria Gram positiva a las bacterias que se visualizan de color violeta y Bacteria Gram negativa a las que se visualizan de color rosa.

CAPITULO I
Pruebas de Hematologa

MANUAL DE HEMATOLOGA
Objetivo: Repasar y conocer mejor las tcnicas ms importantes del laboratorio de hematologa, as como sus beneficios y la importancia de stas a la hora de detectar enfermedades

LA HEMATOLOGIA
La Hematologa (de gr.hema: sangre, logo: estudio hematologa: estudio de la sangre , --, "sangre" y -, "estudio") es la especialidad mdica que se dedica al tratamiento de los pacientes con enfermedades hematolgicas, para ello se encarga del estudio e investigacin de la sangre y los rganos hematopoyticos (mdula sea, ganglios linfticos, bazo, etc) tanto sanos como enfermos.1 HEMO-significado de sangre, griego ejemplos de palabras: hematocrito, hematoma.

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OBJETIVO DE LA HEMATOLOGIA
La hematologa es la rama de la ciencia mdica que se encarga del estudio de los elementos formes de la sangre y sus precursores, as como de los trastornos estructurales y bioqumicos de estos elementos, que puedan conducir a una enfermedad. La hematologa es una ciencia que comprende el estudio de la etiologa, diagnstico, tratamiento, pronstico y prevencin de las enfermedades de la sangre y rganos hemolinfa productores. Los especialistas en este dominio son llamados hematlogos. La hematologa comprende el estudio del paquete celular, el perfil o el estado sanguneo, los cuales son:

Recuento de eritrocitos (y valor hematocrito) Recuento de leucocitos Determinacin de hemoglobina Velocidad de sedimentacin globular (VSG) Frmula leucocitaria (recuento diferencial de leucocitos).

ENFERMEDADES HEMATOLOGICA
Las enfermedades hematolgicas afectan la produccin de sangre y sus componentes, como los glbulos rojos, glbulos blancos, la hemoglobina, las protenas plasmticas, el mecanismo de coagulacin (hemostasia), etc. -lnea elitroide, lnea granulo citaras, megacarociaticas.

PRUEBAS QUE SE REALIZAN EN UN LABORATORIO DE HEMATOLOGA:

1. Pruebas hematocito mtricas: En ellas se observan y valoran la morfologa y fisiologa de los componentes sanguneos. Como por ejemplo: Hemograma, recuento de hemates (RBC), hematocrito (HTO, %HTO), concentracin de hemoglobina ([Hb]),

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ndices eritrocitarios (VCM, CHCM, HCM), recuento de leucocitos (WBC), recuento de plaquetas (PLT), VSG, 2. Pruebas de Hemostasia: En ellas se valora la coagulacin sangunea. Como por ejemplo: Tiempo de protrombina (TP), tiempo de tromboplatina parcial activada (TTPA), tiempo de trombina (TT), 3. Pruebas de Banco de Sangre y Hemoterapia: Se realizan para la captacin de donantes (se determina su grupo sanguneo y se realizan pruebas de compatibilidad), recepcin, procesamiento y fraccionamiento de la sangre donada, almacenaje de la misma y el control de los hemoderivados. En los hospitales hay una seccin que funciona como un banco de sangre, donde se encuentran las bolsas de sangre y se realizan las pruebas de compatibilidad entre las bolsas y los receptores. 4. Pruebas de Inmunologa y Serologa: La inmuno hematologa se encarga de estudiar la presencia de antgenos (Ag) y anticuerpos (Ac), normalmente para los trasplantes y al determinar el grupo sanguneo. La serologa estudia el suero, en el se buscan anticuerpos (Ac) que normalmente provocan infecciones en el organismo.

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COMO INTERPRETAR LOS HEMOGRAMO

El hemograma puede contener tambin otros recuentos de clulas sanguneas. Pdale a su Hematlogo u onclogo que le explique lo que son las pruebas y lo que significan. Adems, en un anlisis de clulas sanguneas se puede ver si tiene en la sangre clulas inmaduras, denominadas pro mielocitos, mielocitos o ameloblastos (las clulas ms inmaduras). Estas clulas suelen estar solamente en lamdula sea, pero en la LMC estas clulas inmaduras migran de la mdula sea a la sangre.

PRUEBAS HEMATOLGICAS HABITUALES

Perfil hematolgico bsico Hemates Varn 4,5-5,5 3 10 12 /l Mujer 3,8-4,8 3 10 12 /l
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Hemoglobina Varn 130-170 g/l Mujer 120-150 g/l Hematocrito Varn 0,40-0,50 l/l Mujer 0,36-0,46 l/l Volumen corpuscular medio (VCM) 80-100 fl Hemoglobina corpuscular media (HCM) 27-32 pg Concentracin corpuscular media de hemoglobina (CCMH) 315-345 g/l Leucocitos 7,0-10,0 3 10 9 /l Recuento diferencial leucocitario Neutrfilos 40-80 % (2,0-7,0 3 10 9 /l) Bandas 0-6 % (0,0-0,5 3 10 9 /l) Linfocitos 17-45 % (1,0-3,0 3 10 9 /l) Monocitos 2-10 % (0,2-1,0 3 10 9 /l) Eosinfilos 0-5 % (0,0-0,5 3 10 9 /l) Basfilos 0-2 % (0,0-0,1 3 10 9 /l)

Plaquetas 150-400 3 10 9 /l Velocidad de sedimentacin globular (VSG) primera hora Varn (mm) Mujer (mm) 17-50 aos 10 19

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51-60 aos 12 19 61-70 aos 14 20 > 70 aos 30 35 Viscosidad plasmtica 25 C: 1,4-1,7 mP Mielograma: recuento porcentual Serie paqueteara 0,0-0,4 Serie roja 18,4-33, Proeritroblastos 0,2-1,3 Eritroblastos basfilos 0,5-2,4 Eritroblastos policromatfilos 17,9-29,2 Eritroblastos ortocromticos 0,4-4,6 Serie blanca 50,4-70,3 Blastos 0,2-1,5 Pro mielocitos 2,1-4,1 Mielocitos 8,4-17,0 Metamielocitos 10,0-26,8 No segmentados + segmentados 15,7-31,0 Otras clulas 11,5-27,9 Linfocitos 11,1-23,2 Plasmocitos 0,4-3,9 Monocitos + macrfagos 0,0-0,8 Relacin mieloeritroide 1,5-3,3
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Poblaciones linfocitarias Linfocitos T CD2 80 71-90 CD3 72 60-83 CD5 70 56-83 Subpoblaciones de linfocitos T CD4 44 30-60 CD8 29 17-42 CD3+ CD56+ 3,5 0-18 CD57+ CD8+ 6 0-14 CD4/CD8 1,6 0,5-2,9 Linfocitos NK CD3- CD56+ 10 1- 19 CD16 13 5-48 Linfocitos B CD19 14 5-22 CD19+ CD5+ 3 0,1-12 Interpretacin de las pruebas sistemticas de la coagulacin Prolongacin aislada del TTPA Antecedentes personales o familiares hemorrgicos Hemofilia A Hemofilia B
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 Dficit de FXI Inhibidor adquirido anti-FVIII Sin antecedentes personales y familiares hemorrgicos Dficit de FXII Dficit de precalicrena Dficit de ciningeno Inhibidor lpico Prolongacin del TTPA y del tiempo de sangra Enfermedad o sndrome de von Willebrand Prolongaciones del TTPA y del tiempo de protrombina Deficiencia de uno o ms de los siguientes factores: FII, FV, FX y FI Insuficiencia heptica Ingestin de anti vitaminas K Tratamiento fibrinoltico Coagulacin intravascular diseminada Heparina Prolongacin aislada de tiempo de protrombina Deficiencia de FVII Prolongacin del tiempo de trombina Heparina Hipofibrinogenemia/disfibrinogenemia Coagulacin intravascular diseminada
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Hepatopata Tratamiento fibrinoltico Pruebas sistemticas normales con antecedentes hemorrgicos Sospecha de deficiencia de FXIII Sospecha de deficiencia de a 2 antiplasmina.

REA DE HEMATOLOGIA Y COAGULACION

En el rea de hematologa se realizan estudios hematolgicos cualitativos, cuantitativos y morfolgicos. En esta rea, el hemograma o cuadro hemtico es una de las pruebas ms solicitadas y realizadas. Con el fin de brindar este servicio nuestro Laboratorio Clnico cuenta con auto analizadores de ltima generacin que le permiten al mdico contar con nuevos parmetros, convirtindose en una herramienta de rutina que permite una mayor utilidad clnica, con mayor exactitud, precisin y costo razonable. Se procesan cuadros hemticos en equipos de avanzada tecnologa, reportando de 18 a 21 parmetros acompaados de sus histogramas y disperso gramas. Por otro lado, en el rea de coagulacin se procesan pruebas rutinarias como tiempo de protrombina (PT), tiempo parcial de tromboplastinas (PTT). Tambin se realizan estudios ms especializados para el diagnstico de los trastornos hemorrgicos y trombocitos. Contamos con los siguientes equipos para la realizacin de las pruebas que hacen parte de esta rea: HEMATOLOGIA TIEMPO MUESTRA SANGRE TOTAL SANGRE TOTAL SUERO
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BIOMETRIA HEMATICA COMPLETA CON 1 DIA PLAQUETAS COOMBS DIRECTO COOMBS INDIRECTO 1 DIA 1 DIA

FIBRINOGENO GRUPO SANGUINEO Y FACTOR RH PLAQUETAS RETICULOCITOS RETRACCION DEL COAGULO TIEMPO DE SANGRADO TIEMPO DE COAGULACION TIEMPO DE PROTROMBINA (T.P) TIEMPO DE PARCIAL (T.P.T)

2 DIAS 1 DIA 1 DIA 1 DIA 1 DIA 1 DIA 1 DIA 1 DIA

PLASMA SANGRE TOTAL SANGRE TOTAL SANGRE TOTAL SANGRE TOTAL SANGRE TOTAL SANGRE TOTAL PLASMA PLASMA PLASMA SANGRE TOTAL

TROMBOPLASTINA 1 DIA 2 DIAS 1 DIA

TIEMPO DE TROMBINA ( T.T ) VEL.DE SED.GLOBULAR

LOS 5 TIPOS DE EXAMENES DE SANGRE MS FRECUENTES

1. Hematologa completa o conteo sanguneo completo (CBC): Una de las pruebas de sangre ms frecuentes, como parte de un chequeo de rutina. Determina la cantidad y forma de los glbulos rojos, los glbulos blancos, las plaquetas, la hemoglobina, el volumen corpuscular media, ayudando a detectar enfermedades de la sangre, como la anemia, infecciones, problemas de coagulacin, cncer de la sangre y trastornos del sistema inmunolgico. 2. Qumica sangunea o panel metablico bsico (BMP): Mide diferentes sustancias qumicas en la sangre, en esta prueba se utiliza el plasma sanguneo y brinda informacin sobre los msculos (incluyendo el corazn), los huesos, los riones y el hgado, ya que incluye las pruebas que miden la glucosa en la sangre, el calcio, los electrolitos y adems de las pruebas de funcin renal.
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3. Anlisis de enzimas sanguneas: Estas ayudan a controlar las reacciones qumicas en el cuerpo y se centra en las pruebas de enzimas sanguneas que se utilizan para ayudar al diagnostico de un ataque al corazn. Estas pruebas incluyen la troponina y la creatin -quinasa CK-MB 4. Examen de sangre para el riesgo de las enfermedades cardiacas: Para analizar las sustancias en la sangre que transportan el colesterol. El panel de lipoprotena mide los niveles de colesterol total de colesterol LDL, el colesterol HDL y triglicridos en su sangre. Los niveles anormales de colesterol o triglicridos pueden ser signos de un mayor riesgo de cardiopata coronaria. 5. Pruebas de coagulacin de la sangre: Los resultados anormales pueden sugerir un riesgo de sangrado o de formacin de cogulos en los vasos sanguneos. Son utilizadas para diagnosticar los trastornos en la coagulacin o para controlar a las personas que estn tomando medicamentos para disminuir el riesgo de cogulos de sangre (Warfarina y la Heparina).

EXAMENES HEMATOLOGICOS
I - Sangre, Hematologa Clulas del lupus, cada muestra de coagulacin, tiempo del coagulo, tiempo de retraccin del coagulo Tiempo de lisis del coombs directo, test de coombs indirecto Prueba de cuerpos de Heinz Deshidrogenasa Glucosa -6- fosfato en eritrocitos Deshidrogenasa -6- fosfogluconato en eritrocitos Ferritina

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Fibringeno, productos de degradacin del fierro srico fierro, capacidad de fijacin (incluye fierro srico fierro), cintica del (cada determinacin fierro, prueba de sobrecarga grupos sanguneos ABO y RHO (incluye estudio de factor du en RH negativos) Hematocrito Hemoglobina en sangre total Hemoglobina Glicosilada Hemoglobina, electroforesis de (incluye HB. total) Hemograma (incluye recuentos de leucocitos y eritrocitos, hemoglobina, hematocrito, formula leucocitaria, caractersticas de los elementos figurados y velocidad de eritrosedimentacin) Protrombina, tiempo de o consumo de (incluye INR, relacin internacional normalizada) Recuentos de eosinofilos (absoluto) Recuentos de eritrocitos, absoluto (Proc. Aut.) Recuentos de leucocitos, absoluto (Proc. Aut.) Recuentos de linfocitos (absoluto) Recuentos de plaquetas (absoluto) Recuento de reticulocitos Recuento diferencial o formula leucocitaria Sangra, tiempo de (IVY) Sobrevida del eritrocito Subgrupo ABO y RH fenotipo - genotipo RH c/u Transferrina

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Tromboplastina, tiempo de generacin de (TGT) Velocidad de eritrosedimentacin Vitamina B12, Absorcin.

VALORES HEMATOLOGICOS NORMALES

Hemostasia:

Plaquetas: 150 - 450 Tiempo sangra: 3 - 9min Tiempo protrombina: 13 - 14 seg (va extrnseca) Tiempo tromboplastina: 35 - 45 seg (va intrnseca) Tiempo trombina: 10 - 12 seg (va comn) Test reptil as: 17 - 19 seg. Fibringeno: 2 - 4 g/l PDF< 10 mg/l

Hematimetra:

Hemates: 4.5 - 6.5 millones (hombre), 3.9 - 4.6 (mujer) Hto: 40 - 54% (hombre), 35 - 47 (mujer) Hb: 13 -18 g/l (hombre), 11.4 - 16.5 (mujer) HCM: 27 - 32 pg. VCM: 76 - 96 CHCM: 31 - 35 Reticulocitos: 0.5 - 2 %

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Leucocitos: 4.000 - 8.000, Neutrofilos: 40 - 75 %, Linfocitos: 20 - 45 %, Monocitos: 2 - 10 %, Eosinfilos: 1 - 6 %, Basfilos: 0 - 1 % HbA2: 1.5 - 3.5 % HbF: <2 % Plaquetas: 150 - 400 mil.

Plasma:

Na+ .......................................136 - 148 mol/l ...............,.........70 105 mg/dl K+....................................... 3.6 - 5 "" Cl+ ........................................95 - 105 "" CO3H- ..................................24 - 32 "" PO4H- .................................0.8 - 1.1 "" Ca++. ...................................2.12 - 2.61 "" ................................4.2 - 5.3 mEq/l..............8.8 - 10.5 mg/dl Mg++...................................0.7 - 1.0 "" ....................................1.6 2.6 mg/dl Zn++....................................8 - 20 mcmol/l Fe++,+++................................85Ferritina...............................15-200 ngr/dl Glucosa................................2.5 - 4.7 mol/l ...........................70 105 mg/dl Creatinina ...........................62 ...............................0.7 - 1.3 mg/dl Albmina ............................3.5 - 5 g/dl
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-155

124

mol/l

Colesterol (HDL)...................35 LDL........................100 - 180 mg/dl Amilasa ................................70 - 300 UI/l

65

mg/dl,

CPK......................................25 - 145 mUI/ml, MB (normal < 6 %), MM (normal 94 -100 % %) Fosfatasa alcalina .............10 - 95 UI/l Osmolalidad........................285 - 295 mosm/kg de agua Osmolaridad........................278 - 298 mOsm/kg.

HEMATOLOGA
Coagulacin Hemodilucin Hipervolmica Hemodilucin Normovolmica Sustitucin Componentes Sanguneos Valores Hematolgicos normales.

COAGULACION
Factores de la Coagulacin:
Factores de la Coagulacin Factor I II III IV V Nombre Factor Fibringeno Protrombina Tromboplastina Tisular Calcio Proacelerina, F. Labil 1 da Duracin de la Vida Media 4 a 5 das 3 das

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VII VIII vW IX X XI XII

Proconvertina, F. Estable F. Antihemoflico A Factor von Willebrand F. Antihemoflico B, F. Christmas Factor Stuart Precursor de la tromboplastina plasmtica Factor Hagemann, F. de contacto

4 a 6 horas 12 a 18 horas 12 a 18 horas 18 a 24 horas 1 a 2 horas 2 a 3 horas 2 horas das

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F. Estabilizante de la fibrina

Fisiologa de la Coagulacin:

Laboratorio: APTT (Tiempo Parcial de Tromboplastina activada) (Va Intrnseca):

Normal 25-34 seg. F II, V, VIII, IX, X, XI, XII C(excepto F VII) (Va extrnseca). en dficit o inhibicin de factores (II, V, VIII, IX, X, XI, XII), dficit vit K, anticumarnicos, heparina, hemofilia A y B.

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Quick / TP (Tiempo Protrombina Tiempo de Tromboplastina) (Va extrnseca)

Normal: 11.5-13.5 seg (70-100 %) F II, V, VII, IX, X Para prueba del anticoagulante. sistema extrnseco y del tratamiento

en dficit de factores (II, V, VII, IX, X), dficit vit K, anticoagulantes dicumarnicos, hepatopatas, CID.

ACT (Tiempo Coagulacin Activado):

Normal 120-150 Seg, rango teraputico: 350 seg. Para chequeo de la terapia con heparina.

Tiempo de Hemorragia (tiempo de sangra):

IVY (1 - 9 min), DUKE (1 - 4 min). Normal 2-6 ' (Chequeo de la funcin paqueteara) Patolgico > 10 minutos. trombocito pea, CID, prpura, enf. de von Willebrand, trat. con aspirina.

TT (Tiempo trombina):

Normal 13-18'', Para chequeo de la terapia con heparina. heparinizacin. CID, afibrinogemia.

Fibringeno:

Normal 1.5 - 4.5 g/l, 150 - 450 mg % afibrinogenemia, CID, infecciones.

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Productos de degradacin del Fibringeno (PDF)

Normal < 10 mg/l

Tiempo de Reptilase(va comn)

Normal < 22 seg. ;

Plaquetas

150.000 - 400.000/mm3 Diagnstico de la coagulopata:

1. Anamnesis 2. Pruebas de Laboratorio si la Anamnesis es positiva: Q Tiempo de T. T. Plaquetas Fibringeno (TP) Hemorragia Reptilase Cefalina -/= = = = + +++ + = = +++ + = = = = = = ++ ++ = = ++ ++ + = = = = = =

PTT Enfermedad Heptica Warfarina Trombocito pea Aspirina Heparina Hemofilia

+/= + =/+ ++ = = + + = =

+/= = = = = =

von Willebrand +

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CID. Enfermedad Heptica Severa Transfusin Masiva

+/= ++

--

++

++

++

--

++

Drogas:
Heparina Dosis: bolus 5'000 UI, mujer 300 (hombre 400) UI/kg /24 hrs. En ciruga vascular, en el postoperatorio dependiendo el tipo de ciruga: 10'000 UI/24 h. Antdoto: Portaminas UI = 1.5 x dosis UI de Heparina, en infusin lenta. Efectos: 1. Alergia Tipo I 2. Cada presin sangunea (Depresin miocrdica) 3. Hipertona arterial pulmonar Warfarina Antagonista de la vitamina K Bloquea la formacin de los Factores II, VII, IX, X Antdoto: Vit cido Acetilsaliclico Inhibidor irreversible de la ciclo-oxigenas; vida del trombocito 7 das
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Monitorizacin Tiempo de sangra: 2 das despus de la retirada, significante mejora. 4 das despus de la retirada, alcanzada la lnea basal. Capacidad de agregacin: 4 das despus de la retirada, normal a 100 mg/da. 7 das despus de la retirada, normal a 300 mg/da. cido Tranexmico Inhibidor de la actividad del plasmingeno (antifibrinoltico) Son necesarios niveles de actividad de 5 - 10 g/ml Dosis: 10gr (= 20 Amp de 0.5 gr) cido tranexmico en 250 ml NaCl en 30 min. (Inerve. Cardiacas). Momento: 20 min antes del comienzo de la intervencin. No se han observado interferencias con los test de ACT. Aprotinina (Trasylol) Formando parte de mecanismos todava desconocidos (inhibicin de la trombina y plasmina), la Aprotinina con su conexin a los desrdenes del cogulo puede reducir la prdida de sangre, y respectivamente, la necesidad de una transfusin sangunea. Dosis: (Intervenciones cardiacas) Inicial: (= 280 mg) durante la apertura del trax en 20 min. Despus: hasta el final de la operacin 500 000 E/h Aprotinina El control de de la accin de la heparina por medio del ACT con la aprotinina no es fiable. La Aprotinina trabaja sinrgicamente con la
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heparina pero puede causar resistencia a la heparina. Durante el bypass, la ACT el valor debe estar por lo menos en 750 seg. Antitrombina III De acuerdo con las pruebas de coagulacin (Disponible 24 h/d) Adultos: Comenzar con 2'500 UI Plasma Fresco Congelado Una bolsa aumenta el T. de Quick en un 5 % (1 UI/kg KG aumenta el T de Quick en un 2% y los factores en un 1%) Incremento factores de la coagulacin 2-3 % Volumen: 250 +/- 50 ml. Atencin: No calentarlo por encima de los 38 C Fibringeno Pool de concentrado de fibringeno, 1 Botella = 1g ( en 50 ml: 20 mg/ml) HBs-Ag y Anti-HIV negativo Para aumentar el nivel a 1 g/l: 3 - 4 g Fibringeno Factor VII Dosis (de acuerdo con las pruebas), comenzar con 600 UI Factor VIII Frascos con 200 o 500 UI Dosificacin para la hemofilia A (iv, mximo 4 ml/min): Dosis en UI = kg KG x incremento factor requerido % x 0.5 o: Sangrado Intervencin Dosis Duracin
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Hemorragia espontanea de articulaciones Bajo Sangrado de nariz bajo Sangrado suave de otras partes Hemartrosis completa Sangrado antebrazo/pantorrilla Sangrado del psoas Extraccin dentaria Sangrado por una lesin Preparacin operaciones Severo para Repetir la mitad de la 35 - 50 dosis inicial cada 8 UI/kg 12 horas y en Repetir la mitad de la 15 - 35 dosis inicial cada 8 UI/kg 12 h en 3 - 4 das 10 -15 A menudo basta con UI/kg una dosis

Medio

Sangrado intracraneal Sangrado gastrointestinal (incluyendo faringe lengua)

Factor IX Factor IX (Complejo SRK): Incluyendo: F. II, VII, IX, X. 200/500/1000 IU por frasco Dosificacin para la hemofilia B: Dosis en UI = kg KG x incremento factor requerido % o: Sangrado Intervencin Dosis Duracin
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Hemorragia espontanea articulaciones Bajo

de

10 -25 A menudo basta con Sangrado de nariz bajo UI/kg una dosis Sangrado suave otras partes de

Medio

Hemartrosis completa Sangrado en 15 antebrazo/pantorrilla. UI/kg Sangrado del psoas Extraccin dentaria Sangrado lesin Preparacin operaciones por una para

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Repetir la mitad de la dosis inicial cada 8 12 h asta la curacin

Severo

Sangrado intracraneal Sangrado gastrointestinal (incluyendo faringe y lengua)

Consultar Consultar

Hemodilucin Hipervolmica Utilizar: Dextrano 40 7.5 ml/kg y Ringer L 7.5 ml/kg en 30 min. Como alternativa Dextrano 70 8 - 12 ml/kg o Expafusin 10 - 15 ml/kg en 30 a 60 min. Hemodilucin Normovolmica

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 1) Volumen extrable: (Frmula de Dubousset) VE = Peso/13 x [Hto inicial-Hto final/(Hto inicial + Hto final)/2] (Frmula de Bourke simplificada) (MS) (Hto inicial - Hto final) [3 - (Hto inicial - Hto final)/2], donde: MS = masa sangunea en litros, Hti y Htf expresados en decimales (para un 45 % es 0.45) La MS se determina por la frmula de Allen: MS = (0.417 x T3+ 0.045 x P) - 0.03 para el hombre MS = (0.414 x T3+ 0.0328 x P) - 0.03 para la mujer. P = peso en Kg, T = talla en m Al volumen extrable restar un 25 % y un 20 % ms para seguridad Extraer 450 ml de sangre en 10 - 15 min Aadir a la bolsa de sangre (de 400 a 500 cc) 63 cc de CPD.

2) Relleno o reemplazamiento:

a) Si se utilizan cristaloides reemplazar del 300 al 400 % del volumen extrado. b) Si se utilizan coloides pasar de un 20 a un 50 % ms del volumen extrado (normalmente de un 20 a 25 %): -- Gelatinas y dextranos 40, pasar el mismo volumen que en la hemodilucin durante las siguientes 24 horas. -- Hidroxietilalmidn de bajo PM, limitado a 1.5 - 2 gr/kg-1/da-1mas lejos de esta cantidad utilizar gelatinas.

Etiquetar las bolsas con todos los datos. Almacenarlas a 4 C. Es preferible utilizarlas antes de 4 horas.
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BIOMETRIA HEMATICA.
La biometra hemtica es un estudio de los elementos que conforman la sangre, tanto los celulares como los slidos presentes en el plasma, este ensayo sirve para determinar las alteraciones tanto cuantitativas (anemias, policitemias, leucocitosis, leucopenias), como cualitativas de los elementos formes de la sangre. En DiagSA las muestras sanguneas son procesadas utilizando un contador automatizado CoulterAcT-Diff, del que se obtiene el hemograma, para posteriormente ser teidas con una tincin de MayGrunwald-Giemsa, para su anlisis microscpico. Esto junto con algunos otros procedimientos, nos permite reportarle hasta 20 parmetros que le ayudaran a usted en su diagnstico. Los analitos que reportamos en la biometra hemtica son:
Hematocrito Hemoglobina Velocidad de Sedimentacin Eritrocitos Volumen globular C.M.H.C. Slidos totales Plaquetas Fibringeno Relacin Protenas: Fibringeno Leucocitos Linfocitos Monocitos Neutrfilos Segmentados Neutrfilos en Banda Eosinfilos Basfilos Mielocitos Meta mielocitos y Clulas indiferenciadas

Al final del informe en la seccin Comentarios, le reportaremos en su caso las caractersticas observadas en los eritrocitos, como por ejemplo: tamao, forma, color., as como de la lnea leucocitaria le reportaremos las anormalidades presentes en la muestra. Los valores de referencia que se reportan corresponden a la especie en cuestin (caninos, felinos, equinos), y sirven de base para que con los valores obtenidos y la Historia Clnica del paciente, el Mdico
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Veterinario concrete un Diagnstico Diferencial a fin dar el tratamiento ms adecuado o sugerir se realicen estudios complementarios. Para el envo de este tipo de muestras se requiere sangre en un tubo adicionado con EDTA (tubo de tapn lila), el volumen mnimo necesario es de 2mL, debe evitarse el que la sangre forme cogulos. Para su correcta preservacin la muestra debe ser refrigerada (entre 2 C y 8C) durante su almacenamiento y transporte. Este tipo de muestra tambin es til para otros estudios como: Bsqueda de Hemoparsitos Celulares, Conteo de Reticulocitos, Determinacin de Fibringeno, Cuenta celular. PRUEBAS DE COAGULACION Estas pruebas junto con la determinacin del nmero de plaquetas son de gran ayuda en los cuadros hemorrgicos de los animales. En las intoxicaciones con cumarnicos (relentecidas), la valoracin del tiempo de protrombina, y del tiempo parcial de protrombina, es mandataria para determinar tanto la presencia de estos txicos, como la efectividad del tratamiento administrado. Las muestras de sangre para estos estudios deben remitirse ya sea en un tubo de plstico usando EDTA como anticoagulante si se trata de muestras para conteo plaquetario, o bien usando ACD (cido Citrato Dextrosa) como anticoagulante (tubos de tapn azul), cuando se trata de determinar los tiempos de coagulacin. El ACD debe ser usado en una relacin 1:9 con el volumen de sangre tomado. Por ejemplo 0.2mL de ACD para 1.8mL de sangre completa. Para estas pruebas se requiere un volumen mnimo de 2mL, debe evitarse el que la sangre forme cogulos. La muestra debe ser mantenida en refrigeracin (entre 2 C y 8C), durante su almacenamiento y transporte.
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Estas muestras deben procesarse en las siguientes 4 horas a su toma. Fundamentacin Terica: Es una prueba de deteccin bsica y constituye la tcnica de laboratorio que se pide con ms frecuencia. Los datos que proporciona constituyen informacin diagnstica muy valiosa sobre el sistema hematolgico y otros aparatos del cuerpo, pronstico, respuesta al tratamiento y recuperacin. Consta de una serie de pruebas que determinan el nmero, variedad, porcentaje, concentracin y calidad de las clulas sanguneas. Preparacin del paciente: 1.- Evitar la tensin todo lo posible debido a que las alteraciones fisiolgicas cambian los valores. 2.- Tanto la deshidratacin como la sobre hidratacin alteran en forma considerable los valores. 3.- No es necesario el ayuno, sin embargo los alimentos con un alto contenido en grasas alteran los resultados. PUNCIN CAPILAR Fundamento terico: Para tomar una muestra en forma adecuada se necesita la tcnica correcta y el momento preciso en caso necesario. Cuando se necesita un frotis de sangre perifrica, se prefiere la sangre capilar. Metodologa: 1.- Tome la muestra de las yemas de los dedos o lbulo de la oreja (adultos); del dedo pulgar del pie o del tobillo (en lactantes).
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2.- Desinfecte el sitio de la puncin, squelo y puncione la piel con una lanceta estril que no debe penetrar ms de 2 mm; si se utiliza isodine. Permita que se seque completamente. 3.- Deseche la primera gota de sangre. Tome las gotas subsecuentes en un micro tubo y prepare las laminillas con esa muestra. Recomendaciones: No oprima el sitio de la puncin para obtener sangre porque se altera la composicin heptica o invalida los resultados. Muchas veces se facilita la toma e muestra si se calienta la extremidad o se coloca en postura colgante. Preparacin del cliente: Instruya al paciente sobre el propsito y la tcnica de su prueba. Cuidado del paciente despus de la prueba: Aplique una pequea curacin o cinta adhesiva sobre el sitio de la puncin, si bien hay que verificar presencia de hemorragia. De haberla, presione; en caso de que persista el sangrado, busque en los antecedentes del paciente si ha sido sometido a un tratamiento con anticoagulantes (aspirina). PUNCION VENOSA Fundamento terico: La puncin venosa permite extraer una mayor cantidad de sangre para las pruebas necesarias. Las venas de eleccin suelen ser las de la cara anterior del antebrazo porque resulta fcil acceder a ellas. Las cifras hepticas permanecen constantes no obstante el sitio seleccionado para obtener la puncin venosa. Metodologa:

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1.- Coloque un torniquete en la parte superior del brazo para producir congestin venosa. 2.- Pida al paciente que abra y cierre el brazo y cierre el puo varias veces. Escoja una vena accesible. 3.- Limpie el sitio de puncin y squelo con una gasa estril. El isodine debe secarse. 4.- Puncione la vena segn la tcnica explicada por la maestra. En el adulto, las agujas de calibre 21 ms o menos dificultan la extraccin de sangre. 5.- Una vez que penetra en la vena, la sangre llena los tubos aspiradores automticamente por la presin negativa dentro del tubo. 6.- Retire el torniquete antes de extraer la aguja o se producir una hemorragia. 7.- Extraiga la aguja y aplique presin y una cinta adhesiva estril en el sitio de la puncin. 8.- El conservador o anticoagulante que se aade al tubo depende de la prueba. Importante: Para la mayora de las pruebas hematolgicas se utiliza como anticoagulante el cido etilendiaminotetractico (EDTA) o edtico. Es necesario colocar la cantidad adecuada del anticoagulante, ya que la mayora de las pruebas se invalidan con sangre muy poco coagulada. Preparacin del paciente: 1.- Instruya al paciente sobre la tcnica para tomar la muestra. Valore la existencia de problemas hemorrgicos o de circulacin o alergias en ltex. 2.- Avisar al paciente que al introducir la aguja sentir dolor.
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3.- Extienda completamente el brazo con la superficie palmar hacia arriba. 4.- Si existen dificultades para extraer la muestra, se entibia la extremidad con toallas hmedas y calientes o con cobijas, adems se debe permitir que la extremidad permanezca inclinada durante varios minutos antes de realizar la puncin. Cuidados despus de la prueba: No extraiga sangre de la misma extremidad utilizada para la administracin intravenosa de medicamentos, lquidos o transfusiones. La puncin venosa causa infeccin, alteraciones, o retraso en la cicatrizacin. El torniquete prolongado provoca xtasis y hemoconcentracin. DETERMINACION DE HEMOGLOBINA (HB) Fundamento: Es una protena conjugada de color rojo integrantes de los eritrocitos entre un 31-34%. Existen varios mtodos para determinacin como hematina cida, hematina alcalina, oxihemoglobina, car oxihemoglobina y cian metahemoglobina; ste ltimo es el de eleccin por que es estable en soluciones diluidas, porque existen en el mercado estndares de cian metahemoglobina y porque las lecturas se pueden hacer en espectrofotmetro de uso comn y corriente. La sangre se hemoliza por agregado de un agente desactivo, con el ferrocianuro de potasio se oxidan el tomo de fierro de ferroso a frrico para producir metahemoglobina. El cianuro de potasio estabiliza la metahemoglobina pasando de cian metahemoglobina. La cloracin producida es directamente proporcional a la concentracin de hemoglobina presente.
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Material: Tubos de ensayo de 13 x 100 ml Pipetas de 1ml Pipetas de Sal Boquillas Gradillas Gasa Celdas para espectrofotmetro Sangre capilar o venosa con anticoagulante. Reactivos: EDTA al 10 % (.07 ml por .5 ml de sangre) Reactivo DE Drabkin: -ferrocianuro de potasio -cianuro de potasio -bicarbonato de potasio Solucin estndar de cian metahemoglobina. Procedimiento: 1.- Colocar en un tubo de ensayo 5 ml de reactivo de Drabkin 2.- Homogeneizar bien la sangre 3.- Llenar en sangre hasta la marca de la pipeta de Sahli 4.-Mezclar la sangre con el disolvente
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5.- Dejar Reposar 10 min. Para la formacin de cian metahemoglobina 6.- leer a 540 nanmetros en el espectrofotmetro contra un blanco de reactivo. 7.- comparar con la curva calibrada de estndares. Valores de referencia: Mujeres: 12 -14 gr/dl Mujeres embarazadas: 11-14 gr/dl Hombres: 13-19gr/dl Recin nacidos: 13.19gr/d

DETERMINACIN DEL HEMATOCRITO

Es sencillo y exacto y es importante para determinar los ndices eritrocitarios Fundamento: El hematocrito mide el porcentaje del volumen de sangre total pero ocupada solamente por los eritrocitos Material (macro hematocrito) Tubo de Wintrobe que tiene 11.5 cm de largo x 3 mm de luz (hueco). Para el micro se usa el tubo capilar) Pipeta Pasteur larga o pipeta para llenado de hematocrito Centrfuga Sangre capilar (micro) o venosa (macro) con anticoagulante Reactivos. Procedimiento:
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1.- Homogeneizar perfectamente la sangre haciendo girar el tubo 2.- Utilizando la pipeta Pasteur se llena de sangre el tubo de Wintrobe exactamente hasta 10, no deben quedar burbujas de aire en el tubo 3.-Centrfuga a 3600 rev x min. Durante 30 min. 4.- Leer en la lnea de separacin de la columna de glbulos rojos sabiendo que cada raya tiene 1% Valores de referencia: H= 47 +- 2.5 M= 42+- 2.5

CUENTA ERITROCITARIA
Introduccin: Cuando la eritropoyesis tiene lugar normalmente, su resultado final es la produccin de una clula-eritrocito perfectamente diferenciada y apta para su funcin principal que es la de transportar oxgeno y CO2 . La falta de ncleo le confiere la virtud de acarrear el oxgeno sin consumir prcticamente nada de l; su forma bicncava es la que mejor se presta para afrontar la hemlisis; su membrana no admite la salida de hemoglobina. Fundamento terico: Consiste en diluir la sangre con el lquido de Hayem en una proporcin exacta y luego examinar al microscopio una pequea cantidad de la muestra colocada en la cmara de Neubauer, contando el nmero de elementos que se encuentran en el retculo de la cmara y mediante una operacin matemtica se obtiene la cifra total. Material: Tubos de ensayo de 13x100mm
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Pipetas de Thomas para glbulos rojos Cmara de Neubauer Boquillas Microscopio Gasa Gradilla Sangre capilar o venosa con anticoagulante Cmara de Neubauer La que ms se utiliza es la de Neubauer que presenta un retculo con una superficie total de 9mm2 dividida en 9 cuadros de 1mm2 los cuatro cuadros grandes de los extremos son los que usualmente se emplean para contar leucocitos. De los 9 cuadros centrales grandes el central es el nico dividido en 25 cuadros. Reactivos: EDTA (sal di sdica) al 10% Lquido de Hayem: Cloruro de mercurio 0.5 g Cloruro de sodio 1.0g Sulfato de sodio 5.0g Agua destilada 100ml Procedimiento: Las pipetas estn constituidas por dos porciones capilares y un bulbo central. El tubo capilar inferior est dividido en 10 partes iguales con marcos de0.5 y 1.0.
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En el interior del bulbo existe una perlita de plstico (roja), para favorecer la mezcla de la sangre con el lquido y en el capilar superior hay una marca 101. 1.- llenar con sangre bien mezclada la pipeta de Thoma, hasta la marca 0.5. 2.- se limpia cuidadosamente con gasa la parte externa de la pipeta. 3.- completar con lquido de Hayem hasta la marca 101. 4.- agitar durante 3 minutos para mezclar perfectamente. 5.- colocar el cubre hematmetro sobre la cmara. 6.- desechar las primeras 4-5 gotas de la pipeta y llenar la cmara por uno de los bordes del cubre hematmetro. 7.- se deja que el lquidos penetre lentamente entre la cuadrcula y el cubre hematmetro hasta que la plataforma de recuento este completamente cubierto. 8.- dejar reposar de 3.5 minutos sobre la platina del microscopio. 9.- con objetivo de 40x se encuentra los eritrocitos contenidos en 80 cuadros pequeos; uno central y cuatro de los extremos. Clculos: Si se considera que el retculo central tiene 400 cuadritos se realizar el siguiente clculo. N x 200 x 10 x 400 = N x 10,000 80 N= nmero de eritrocitos contados 200= factor de dilucin

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10= correccin x altura de la cmara Valores de referencia: Hombres 4.5 x 106 - 5.5 x 106 mm3 Mujeres 4.3 x 106 - 5.0 x 106 mm3

ndices eritrocitarios
Sirven para clasificar a los eritrocitos de acuerdo a su tamao y contenido de hemoglobina Se utiliza el hematocrito y la cuenta de eritrocitos para calcular los ndices: -VCM (Volumen Corpuscular Medio) -CMHC (Concentracin Media de la Hemoglobina Corpuscular) -HCM (Hemoglobina Corpuscular Media) Es posible medir de manera directa los ndices eritrocitarios en contadores celulares automticos. Por ejemplo: el coulter; al pasar los eritrocitos a travs de un orificio en el cual fluye una corriente elctrica.
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CUENTA LEUCOCITARIA
Introduccin: La leucopoyesis es un proceso que se lleva a cabo con gran actividad, ya que si el nmero de granulocitos circulantes de ninguna manera es comparable al de los eritrocitos, en cambio se estima que la sobrevida de los neutrfilos no excede de 5 das, de las cuales solo pasan 10 hrs. en la sangre circulante. Fundamento: La sangre se diluye 1:2 con una solucin hipotnica de cido actico que destruye a los eritrocitos. El azul de metileno permite reconocer fcilmente el lquido y observar mejor los glbulos blancos, a los que tie ligeramente Los normoblastos no se destruyen, por lo que se deben tomar en cuenta para corregir los resultados Material: Tubos de ensayo de 13 x 100mm Pipeta de Thoma para glbulos blancos Cmara de Neubauer Microscopio Boquillas Gasa Sangre capilar o venosa con anticoagulante Reactivos: EDTA (sal disdica) al 10 %
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Liquido de Turk: cido actico glacial 3.0 ml Agua destilada c.b.p. 100 ml Adicionar 1 o 2 gotas de azul de metileno Procedimiento 1.- Llenar la pipeta con sangre bien mezclados hasta la marca de .5 2.- Limpiar cuidadosamente la pipeta por fuera 3.- Aforar con solucin de Turk hasta la marca de II 4.- Agitar la pipeta durante 3 min. 5.- Se desechan las primeras 4 o 5 gotas de la pipeta y se carga la cmara de Neubauer 6.-Dejar reposar la cmara durante 3 min. 7.- En el microscopio con el objetivo de 10x, se cuentan los leucocitos presentes en los cuatro cuadros grandes de los extremos 8.- Multiplicar por 50 el promedio de los leucocitos con la siguiente frmula Clulas contadas x 20 (dilucin) x 10 (correccin de altura) / 4 (nm. De cuadro de 1mm contados) Este factor vara si se cambia la dilucin y o el nmero de cuadros contados *En caso de existir normo lastos (eritrocitos nucleados) deber hacer la cuenta diferencial leucocitaria Valores de referencia:
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Leucocitos: -Adultos: 5000 - 10 000 / mm3 - Recin nacidos: 10 000 - 25 000 / mm3 -Nios: 8000 - 15 000 *Cuenta diferencial leucocitaria Fundamento: Se realizar este proceso en caso de existir normo lastos (eritrocitos nucleados) en la cuenta leucocitaria Por este proceso se podr decir cuntosnormo lastos hay por cada 100 leucocitos. Ejemplo: Si hay 28 normo lastos por cada 100 leucocitos se aplica la siguiente relacin: 128 - 100 12000 -- x x = 9375 leucocitos La cuenta leucocitaria diferencial es el conteo del nmero de los distintos tipos de leucocitos. Identifica a los individuos con una mayor susceptibilidad a la infeccin Tcnica: La cuenta leucocitaria total circulante se divide en 5 tipos de leucocitos: -neutrfilos (en banda y segmentados). Su citoplasma es incoloro y tiene mltiples granos color gris; o puede ser multilobulado, que posee cuatro lbulos nucleares.

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-eosinfilos: es redondo u ovalado, el ncleo posee no ms de tres lbulos y en el citoplasma se observa no ms de 20 granos color naranja. -basfilos: se caracterizan por sus grandes granulaciones azul oscuro. Estos grnulos son hidrosolubles. -linfocitos: Su citoplasma es azul plido y la cromatina nuclear color prpura azulado oscuro; casi no posee citoplasma. -monocitos: su ncleo suele ser arrionado. Contiene una red de cromatina. El citoplasma se tie de un color azul grisceo y contiene finas granulaciones color rosa. Valores de referencia: Neutrfilos: -en banda 0-11% -segmentados 25-62% Eosinfilos: 0-2% Basfilos: 0-1% Linfocitos: 25-40% Monocitos: 3-12% *Tincin de Wright Fundamento: La tincin de Wright es una tincin de tipo Romanowsky. Es extremadamente importante en el laboratorio de hematologa este tipo de tincin, ya que puede obtenerse una cantidad abundante de informacin a partir del examen de un frotis de sangre perifrica bien teido
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Una tincin de Romanowsky consiste en azul de metileno y sus productos de oxidacin, as como eosina Y o eosina B La accin combinada de estos colorantes produce el efecto Romanowsky y da una coloracin prpura a los ncleos de los leucocitos y a los grnulos neutroflicos y de color rosado a los eritrocitos. Los componentes de este efecto son el azul B y la eosina Y Las propiedades de tincin de Romanowsky dependen del enlace de los colorantes a las estructuras qumicas y de las interacciones del azul B y la eosina Y. Los agrupamientos de cidos nucledos, las protenas de los ncleos celulares y el citoplasma inmaduro reactivo, fijan el azul B, colorante bsico La eosina Y, colorante cido, se fija a los agrupamientos bsicos de las molculas de hemoglobina y a las protenas bsicas. Material: Frotis sanguneo Agua destilada Eosina B Eosina Y Azul de metileno Alcohol metlico Procedimiento: 1.- Hacer un frotis sanguneo, ni demasiado delgado, ni que llegue al extremo del portaobjetos 2.- Fijar el frotis con alcohol metlico y dejar secar 3.- Sumergir el portaobjetos en el hemoclorante 1, durante 5 o 6 segundos
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4.- Lavar con Buffer 7.2 y sacudir para eliminar exceso 5.- Sumergir por 6-8 segundos en el hemoclorante 2 6.- Lavar con buffer 7.2 y dejar secar 7.- Observar al microscopio

CUENTA PAQUETARIA
Fundamento: Las plaquetas son fragmentos de una clula llamada megacariocito, se encuentran unas 250 mil x mm3, su vida media es de 9.5 das, sus funciones principales son: coagulacin y mantener la integridad de las paredes de los vasos. Miden de 3-4 micras de dimetro, son redondeadas, se pueden observar con una tincin azul de crisil brillante, no tienen ncleo; el nmero de plaquetas es el resultado el equilibrio entre el numero de plaquetas producidas en la mdula sea y las utilizadas, tambin de la prdida o destruccin de la sangre perifrica. Material: Sangre venosa con EDTA al 10% Tubo de ensayo de 13 x 100ml Pipeta de Thomas para glbulos rojos Cmara de Neubauer Caja de petri Gradilla Reactivos: Colorante de azul de cresil brillante
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EDTA al 10 % Procedimiento: 1.- Asepsia y obtencin de la muestra Adultos o nios: La sangre se extrae de una vena (puncin venosa), usualmente de la parte interior del codo o del dorso de la mano. El sitio de puncin se limpia con un antisptico y luego se coloca un torniquete. -Bebs o nios pequeos: En los bebs o nios pequeos, el rea se limpia con un antisptico y se punza con una aguja o lanceta para luego recoger la sangre en una pipeta. 2.-Descargar la pipeta en el lquido diluyente 3.-Enjuagar y llenar hasta la marca 1 y con la , muestra de sangre hasta 1.1 4.-Mezclar de 3-5 minutos 5.-Tirar las primeras 3-5 gotas 6.-cargar la cmara cuenta glbulos 7.- dejar reposar 5 minutos, en una caja petri con un papel filtro hmedo 8.- Dejar reposar la cmara 9.- observar por le objetivo 10x 10.- las plaquetas aparecen como cuerpos coloreados en todo el cuadro central. Clculo: Numero de plaquetas contadas x 1000
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Valores de referencia: 150 mil- 450 mil /mm3 Cuidados durante el examen: Cuando se inserta la aguja para extraer la sangre, algunas personas sienten un dolor moderado, mientras que otras slo sienten un pinchazo o sensacin de picadura. Despus, puede haber una sensacin pulstil. El conteo plaquetario se puede ver afectado por muchos estados patolgicos. Igualmente, se puede medir para evaluar la causa de un sangrado excesivo. Entre los medicamentos que pueden disminuir el conteo de plaquetas estn: agentes quimioteraputicos, cloranfenicol, colchicina, agentes bloqueadores H2, heparina, hidralacina, indometacina, isoniacida, quinolina, estreptomicina, sulfonamida, diurticos tiazdicos y tolbutamina.

ANTICOAGULANTE Fundamento terico: Los anticoagulantes son medios que actan como bloqueantes de la coagulacin o bien de la agregacin de plaquetas. Se utilizan para romper el trombo o bien para prevenir que los trombos se repitan. La heparina alarga el tiempo de coagulacin. S e administra mediante inyeccin subcutnea, pero tambin hay otros grupos que se toman por va oral. En stos grupos de medicamentos debe hacerse un control de tiempo de coagulacin para evitar un exceso de actividad y como consecuencia la aparicin de hemorragias.
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Hay dos sales: clcica y sdica. La clcica se usan va subcutnea, pero los dos se pueden usas endovenosas. La heparina se utiliza cuando es preciso. La accin de anticoagulantes es rpida y de poco tiempo. En el manejo de la accin anticoagulante prolongada se utiliza acecumorol. Se han utilizado diversas medicaciones como anticoagulantes paqueteras, la aspirina y medicamentos vasodilatadores, como el dipridamol, ambos tienen un mecanismo diferente de accin y pueden asociarse para obtener una sinergia de accin. TIPOS DE TUBOS CON ANTICOAGULANTES EDTA (C10H6N2O8):Etilendiaminotetraactico o sal disdica, di potsica. Acta mediante un efecto quelante sobre el calcio (Ca++) impidiendo la coagulacin de la sangre. Se utiliza para: recuentos celulares (hemates, leucocitos y plaquetas), hematocrito, concentracin de hemoglobina ([Hb]), frotis sanguneos (utilizados para la determinacin de la formula leucocitaria u observacin de la morfologa de hemates, leucocito,). CITRATO TRISDICO (C6H5O7Na3): Se une al calcio (Ca++) evitando as la coagulacin sangunea, provoca que desaparezcan los iones de calcio del plasma. Se utiliza para: la velocidad de sedimentacin globular (VSG) en proporcin 1/4, las pruebas de coagulacin en proporcin 1/9. OXALATOS: Son menos comunes, se usan para la determinacin de la glucosa. La sangre debe mezclar inmediatamente con el anticoagulante, para ello se invierte suavemente el tubo varias veces hasta obtener
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una mezcla homognea, tambin podemos utilizar rotores especiales. HEPARINA SDICA/ HEPARINA LITIO: Impide que la protrombina se transforme en trombina. Se utiliza para: estudios de bioqumicas en urgencias (heparina con litio), estudios de linfocitos (heparina sdica). No se recomienda utilizar muestras con heparina para realizar frotis para la tincin de panptico. La sangre total heparinizada se utiliza para transfusiones de gran volumen en ciruga cardiaca. La heparina no tiene efecto conservador por ello la sangre tratada con este anticoagulante de ser usada antes de 48h desde su extraccin. ACD: El anticoagulante es el citrato, la dextrosa y la adenia ayudan a mantener los procesos metablicos de los eritrocitos (formacin de ATP). Se usa en proporcin 1/4, para estudios metablicos. CPD-A: El anticoagulante es el citrato, el fosfato retrasa la disminucin de los niveles de 2,3 DPG de los hemates, la dextrosa y la adenina ayudan a mantener los procesos metablicos de los eritrocitos (formacin de ATP). Se utiliza en el banco de sangre para conservar las unidades de sangre.

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CAPITULO II
Pruebas de Serologia

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LA SEROLOGIA
Es el estudio que permite comprobar la presencia de anticuerpos en sangre. Es una prueba fundamental a la hora de realizar donaciones de sangre y transfusiones. Este se basa en un examen serolgico, que
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tiene como fin el conocer la exposicin o presencia previa de un microorganismo patgeno en particular y a partir de ella la capacidad de respuesta del individuo a tal infeccin. Para ello se debe tomar una muestra de sangre en volumen apropiado segn la tcnica que se emplee (ELISA, IFI, Western blot, IHA, etc.). Se puede usar la sangre total o tomar solo el suero, el cual se obtiene luego de centrifugar la sangre previamente coagulada, para eliminar las clulas sanguneas de la reaccin. Este examen se realiza tambin para descartar sospechas sobre alguna infeccin, si se encuentran razones para pronosticar una enfermedad existente, el examen se puede repetir a las dos semanas de la primera toma de muestra sangunea. La serologa permite detectar infecciones o qu tanto el individuo es inmune a una infeccin o enfermedad especfica. OBJETIVO: Identificacin de problemas de salud. Determinacin de la distribucin de una enfermedad. Conocer los diferentes procedimientos que se llevan a cabo en el rea de serologa.

LAS ENFERMEDADES DETECTABLES CON LA SEROLOGIA SON LAS SIGUIENTES

Sarampin, rubola, carbunco, SIDA, hepatitis viral, brucelosis, amebiasis, infeccin nictica, VSR, tularemia, sfilis, toxoplasmosis y una variedad de enfermedades ms.

LAS TCNICAS DE SEROLOGA

Los diferentes test serolgicos aprovechan una serie de fenmenos fisiolgicos como son el sistema de complemento, las reacciones entre anticuerpo y antgeno, la precipitacin y la aglutinacin. Los sistemas ms importantes aprovechados para estas pruebas son:

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a) El sistema de complemento El sistema o la cascada de complemento consiste en veinte protenas sricas algunas de ellas termolbiles. La formacin de un complejo de antgeno y anticuerpo activa este sistema de protenas que interacciona de forma secuencial. Su activacin resulta en una reaccin con las membranas de clulas que puede causar bien su activacin, la alteracin de su estructura o su destruccin. Eritrocitos sobre la superficie de los cuales se han fijado anticuerpos son destruidos mediante lisis por el sistema de complemento. Una de las pruebas conocidas de serologa aprovecha esta accin ltica del complemento. La tcnica utiliza cantidades conocidas de complemento para medir la cantidad de anticuerpos presentes en una muestra. Para no medir concentraciones errneas los factores de complemento propios de la muestra, todos ellos termolbiles, se desactivan mediante calentamiento a 56C durante 30 minutos previamente a la realizacin de la prueba. b) La reaccin de anticuerpos con el antgeno La reaccin entre anticuerpos y antgeno es muy especfica, y por esta razn constituye un instrumento muy valioso para mediante un componente conocido (antgeno) identificar la presencia de un desconocido con un alto nivel de seguridad. La aplicacin de estos recursos es muy amplia, sobre todo en el diagnstico y en la monitorizacin de enfermedades infectocontagiosas. La reaccin de un antgeno con anticuerpos resulta en la formacin de complejos inmunes de diferentes tipos (precipitantes, etc.). Dependiendo del antgeno y el sistema de prueba utilizada se pueden obtener y medir diferentes tipos de estos complejos. En general, en las pruebas de serologa se emplea una cantidad conocida de antgeno y se diluye el suero que se investiga de forma seriada. Se mide la concentracin del suero que an inhibe (mediante complejos anticuerpo antgeno) una accin concreta del antgeno, o la que an forma complejos que provocan una reaccin
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demostrable. Esta concentracin del suero es expresado como el ttulo de anticuerpos del suero.

TECNICAS RAPIDAS Y AUTOMATIZACION

El laboratorio de serologa, encuadrado en el Servicio de Microbiologa Clnica, es el encargado de realizar el diagnstico indirecto a travs de una tecnologa que ha evolucionado en el estudio y diagnstico de las enfermedades infecciosas muy rpidamente; la aparicin de los anticuerpos monoclonales fue el eje sobre el que este cambio comenz a producirse. La produccin controlada de anticuerpos ms especficos y de mayor afinidad hizo posible, por una parte la mejora de las tcnicas ya existentes (IFI, Ltex, Hemaglutinacin etc.) y por otra la aparicin de micro tcnicas, (RIA, ELISA, etc.), que utilizan pequeos volmenes de muestra para su realizacin. La unidad de volumen pas de ser el mililitro (ml) al micro litro (&micro), La disminucin de los tamaos de todos los utensilios de trabajo del laboratorio, ( pipetas, baos, aparicin de placas de micro tcnica, etc., etc.) ha precipitado igualmente un cambio radical en las formas de trabajar en los mismos de tal manera que las tcnicas de realizacin manual han sido sustituidas, en su mayora, por aparatos automticos que permiten en primer lugar el manejo de gran cantidad de muestras y en segundo lugar la realizacin simultnea de gran nmero de pruebas y tcnicas quedando los procedimientos manuales relegados para realizar o pruebas individualizadas muy rpidas o aquellas de las que existe poca demanda. Desde siempre el inconveniente ms importante que ha tenido el diagnstico indirecto ha sido su falta de rapidez. Al tiempo que tarda el organismo en formar los anticuerpos se le sumaba la tediosidad en tiempo de la realizacin tcnica. La llegada de la biologa molecular ha puesto a nuestra disposicin la posibilidad de producir antgenos nativos lo que ha permitido una gran expansin del catlogo de pruebas diagnsticas disponibles en los ltimos aos y por otro se ha mejorado mucho las pruebas permitiendo acortar sustancialmente los tiempos de realizacin de las mismas. En la actualidad es muy rara la
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metodologa que no pueda realizarse a lo largo de unas pocas horas o incluso minutos y todas ellas con una calidad excelente. Todas pueden por tanto considerarse como tcnicas cortas y aunque es muy difcil de precisar en cunto disminuye el coste de la enfermedad la celeridad y el significado diagnstico de un resultado serolgico, s es cierto que en muchas ocasiones elimina la prctica de otras exploraciones complementarias y la aplicacin ms dirigida de los tratamientos. Esto hace del mismo un mtodo nada despreciable, y a veces nico, a la hora de plantearse en clnica el diagnstico etiolgico de algunas enfermedades infecciosas.

METODOS CUANTITATIVOS: CONCEPTO DE TITULO DE UN SUERO

En muchas ocasiones interesa conocer no slo si el paciente tiene o no anticuerpos frente a un/unos patgenos determinados sino qu concentracin otasa de ellos tiene. Esto es til ya que para muchas infecciones es posible correlacionar la concentracin con la situacin clnica o decidir si aquella ha sido una respuesta eficiente como resultado de una vacunacin. Para ello, realizamos diluciones seriadas del suero que irn sucesivamente disminuyendo la concentracin de anticuerpos; el ttulo del suero ser la ltima dilucin del suero que da una reaccin positiva. Segn esto, un suero con un ttulo 1/32 tendr menos anticuerpos que un suero con un ttulo 1/256. Se dice que un ttulo es significativo cuando estadsticamente esa concentracin, o una superior, se asocia con el estado de enfermedad. Este mtodo de expresin del resultado serolgico ha sido empleado durante muchos aos y es el mtodo ms inteligible ya que la cifra se correlaciona rpidamente con su significado. Existe adems mucha experiencia clnica acumulada y definidos bastantes ttulos significativos para muchas infecciones. En nuestra opinin, y siempre que se pueda, los resultados de una prueba serolgica deben ser
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expresados as ya que es, probablemente, la valoracin mejor interpretada en la clnica. An hoy se realizan pruebas cuantitativas cuyo sistema de medida es el ttulo del suero. En general todas son tcnicas que se emplean en el diagnstico desde hace mucho tiempo y que tienen ya una solvencia clnica ms que comprobada (fijacin de complemento, aglutinacin en tubo y porta, inmunofluorescencia, etc.). En otras ocasiones el resultado se expresa en funcin de una curva que se construye cada vez y que tiene unos valores conocidos por nosotros. Los resultados de cada muestra son obtenidos por comparacin con los valores de la curva Los laboratorios actuales orientan las tcnicas manuales a la realizacin de pruebas con poca demanda y por tanto no rentables para la automatizacin o aquellas que son de muy corta realizacin. Entre estas encontramos las comnmente conocidas como pruebas de Ltex, aglutinacin en tubo o porta, inmunofluorescencia y algunas pruebas enzimticas con soporte de macropartculas en las que el resultado de la reaccin adopta formas significativas cuando la reaccin es positiva. En general estas pruebas tienen una sensibilidad excelente cuando las comparamos con las de referencia lo que ha permitido incorporarlas a las pequeas unidades de Diagnstico Rpido de los Servicios de Microbiologa. Las pruebas que pueden automatizarse se realizan mediante mquinas robots. El ideal de estas mquinas es el evitar cualquier trabajo manual, ganar en seguridad y disminuir la penosidad en el trabajo. La seguridad se obtiene al evitar en lo posible los errores humanos ya que por lo general estas mquinas identifican las muestras mediante cdigos de barras, la diluyen si es necesario, la dispensan y realizan la incubacin y lectura con interpretacin de los resultados si han sido programadas por el facultativo. Pueden trabajar con un nmero ilimitado de sueros si el diseo es de carga continua. La mayora de ellas estn programadas para realizar simultneamente diferentes determinaciones a una sola muestra. Esta capacidad multiparamtrica capacita a los laboratorios para la realizacin diaria de una gran cantidad de determinaciones en
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corto intervalo de tiempo, con el inconveniente de que en muchos casos las pruebas no pueden personalizarse.

REALIZACION DEL EXAMEN

La sangre se extrae de una vena, usualmente de la parte interior del codo o del dorso de la mano. El sitio de puncin se limpia con un antisptico. El mdico coloca una banda elstica alrededor de la parte superior del brazo con el fin de aplicar presin en el rea y hacer que la vena se llene de sangre. Luego, el mdico introduce suavemente una aguja en la vena y recoge la sangre en un frasco hermtico o en un tubo adherido a la aguja. La banda elstica se retira del brazo. Una vez que se ha recogido la muestra de sangre, se retira la aguja y se cubre el sitio de puncin para detener cualquier sangrado. En bebs o en nios pequeos, se puede utilizar un instrumento puntiagudo llamado lanceta para punzar la piel y hacerla sangrar. La sangre se recoge en un tubo pequeo de vidrio llamado pipeta, en un portaobjetos o en una tira reactiva. Finalmente, se puede colocar un vendaje sobre el rea si hay algn sangrado. La sangre se analiza luego en un laboratorio para determinar la forma como ciertos anticuerpos reaccionan con antgenos especficos. El examen se puede utilizar para confirmar la identidad de microorganismos especficos. Existen varias tcnicas serolgicas que se utilizan dependiendo de los anticuerpos de los cuales se sospecha entre las que se pueden mencionar aglutinacin, precipitacin, fijacin del complemento, anticuerpos fluorescentes y otras.

INDICACIONES
Un examen serolgico puede determinar si la persona alguna vez ha estado expuesta a un microorganismo particular (antgeno), pero esto no necesariamente es indicio de una infeccin actual.
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Este examen se realiza tambin para descartar sospechas sobre alguna infeccin, si se encuentran razones para pronosticar una enfermedad existente, el examen se puede repetir a las dos semanas de la primera toma de muestra sangunea. La serologa permite detectar infecciones y / o que tanto el individuo es inmune a una infeccin o enfermedad especfica.

VALORES NORMALES
Normalmente, no se encuentran anticuerpos en la muestra de sangre. Nota: Los rangos de los valores normales pueden variar ligeramente entre diferentes laboratorios. La persona debe hablar con el mdico acerca del significado de los resultados especficos de su examen.

VALORES ANORMALES
Si se encuentran anticuerpos, la persona puede expuesta a algn tipo de antgeno. A medida que empeora, se presentarn ms anticuerpos. Si se enfermedad, es posible que sea necesario repetir el das a 2 semanas despus del primero. haber estado la enfermedad sospecha una examen de 10

La deteccin de anticuerpos se puede utilizar ya sea para diagnosticar una infeccin previa o activa, o para determinar si el individuo es inmune a una re infeccin por parte de un organismo. Algunas de las diferentes enfermedades que se pueden detectar son:

Amebiasis. Carbunco. Brucelosis. Virus de inmunodeficiencia humana (VIH). Infeccin nictica. Sarampin. Rubola. Virus sindical respiratorio (VSR). Sfilis. Tularemia.
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Hepatitis viral (diversos tipos).

Las afecciones adicionales bajo las cuales se puede realizar el examen son:

Absceso heptico amebiano. Eritema infeccioso. Artritis nictica. Meningitis criptoccica. Meningitis por H. influenza. Meningitis meningoccica. Artritis viral.

RIESGOS
Las venas y arterias varan de tamao de un paciente otro y de un lado del cuerpo a otro, razn por la cual obtener una muestra de sangre de algunas personas puede resultar ms difcil que de otras. Otros riesgos asociados con la extraccin de sangre son leves, pero pueden ser:

Sangrado excesivo. Desmayo o sensacin de mareo. Hematoma (acumulacin de sangre debajo de la piel). Infeccin (un riesgo leve cada vez que se presenta ruptura de la piel).

TUBOS QUE SE UTILIZAN PARA SEROLOGIA

TUBO CON TAPA ROJA:Tubo para serologa, sin anticoagulante, en plstico, transparencia cristal, con el interior recubierto de silicona y activador de cogulo, con un volumen
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aproximado de aspiracin de 4.0 ml, de 13 x 75 mm, con tapa de seguridad HEMOGARD y tapn siliconado hemorrepelente.

TUBO CON TAPA AMARILLA: Tubo para serologa, sin anticoagulante, con gel separador, en vidrio con fondo de doble espesor, con el interior recubierto de silicona y activador de cogulo, con un volumen aproximado de aspiracin de 6.0 ml, de 13 x 100 mm, con tapa de seguridad HEMOGARD y tapn siliconado hemorrepelente.

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PRUEBAS SEROLOGICAS O DE LABORATORIO

Las pruebas biolgicas o in vitro (en laboratorio, no en el animal) son formas de evaluacin relativas, que detectan concentraciones comparativas de ciertas clases de inmunoglobulinas (Ig) que podran estar presentes en algunas alergias. El nivel de desarrollo y avance en veterinaria no es an comparable al alcanzado en medicina humana, por lo que su efectividad y sensibilidad estn an en estudio. En muchos pases, sta tecnologa ha avanzado mucho, y las pruebas son ms depuradas y sensibles, pero en otras regiones las pruebas disponibles resultan anticuadas, y por ende la fiabilidad puede ser discutible. An as pueden resultar efectivas en la determinacin de causas de alergia, pero teniendo en cuenta sus limitaciones, a fin de sacarles provecho frente a su alto costo. Las pruebas deberan ser evaluadas por un alergista que pueda interpretar la relacin de los hallazgos del anlisis frente a la historia del animal y teniendo en cuenta su medio ambiente. Debera solicitarse la medicin de alrgenos individuales y evitar el uso de grupos de alrgenos que pueden dar resultados desconcertantes. Evitar las pruebas que miden alrgenos alimentarios o de contacto, ya que su efectividad no est comprobado y pueden causar desazn en el propietario. Para ste tipo de alrgenos existen otras pruebas mucho ms efectivas y seguras. En definitiva, ciertas pruebas biolgicas pueden servir solamente para que el propietario tome conciencia de que su animal es alrgico, lo cual ya se sospechaba antes. Los animales que no presentan alergias tambin pueden dar resultados positivos en stas pruebas, lo que complica la evaluacin.

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UTILIDAD DE LOS ESTUDIOS SEROLOGICOS

Los estudios serolgicos pueden emplearse fundamentalmente para: 1.- Estudios de diagnstico Aunque el diagnstico directo tiene muchas ventajas, existen situaciones en las cuales ste no es posible o es muy caro. En general se trata de infecciones vricas de aislamiento difcil o no vricas pero de patgeno difcilmente cultivable o no cultivable. En estos casos, el diagnstico indirecto puede darnos a conocer la etiologa de la infeccin. 2.- Estudios epidemiolgicos La demostracin del estado inmunitario de una poblacin con respecto a uno o varios patgenos puede hacerse fcilmente mediante este tipo de diagnstico. El estudio retrospectivo de los anticuerpos presentes nos indicar la prevalencia de este microorganismo/s en dicha poblacin y dependiendo de su distribucin etaria la conveniencia o no de establecer campaas de vacunacin

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ELECCION DE UNA PRUEBA SEROLOGICA. SENSIBILIDAD, ESPECIFICIDAD

La incorporacin de una tcnica nueva a un laboratorio clnico debe de estar precedida de estudios de evaluacin. Una prueba serolgica se evala, fundamentalmente, por los parmetros de sensibilidad, especificidad y valor predictivo. Del conocimiento de estos tres valores intrnsecos de la misma se deducir su aplicacin o no en determinadas circunstancias y como deber interpretarse su resultado ya sea positivo o negativo. La medida de la sensibilidad se realiza probando la prueba en pacientes que sabemos que estn en la situacin que queremos diagnosticar. Cuantos ms resultados positivos produzca en este grupo de enfermos ms sensibilidad tendr la prueba y menos resultados falsos negativos (FN) obtendremos; definimos pues la sensibilidad como el porcentaje de verdaderos positivos (VP) que son detectados en individuos con esa enfermedad y esa tcnica. En serologa es difcil tener pruebas con el 100% de sensibilidad y casi todas producen algn resultado negativo falso. La especificidad se mide, por el contrario, realizando la prueba en colectivos de personas que no padecen la enfermedad que queremos diagnosticar con ella. La especificidad por tanto se define como el porcentaje de verdaderos negativos que sern detectados en pacientes sanos con esa prueba. Las pruebas apropiadas producen, en este colectivo, gran cantidad de resultados negativos y muy escasos falsos positivos (FP). Existen muchas pruebas serolgicas con especificidades casi del 100%. Estos dos parmetros son propiedades intrnsecas del test y no varan nunca con relacin a la poblacin estudiada.

VALOR PREDICTIVO
La utilidad de una prueba es la resultante de los valores predictivos (VP), positivo (VPP) o negativo (VPN), obtenidos al emplearla sobre una poblacin general en la que existen individuos sanos e infectados por el agente frente al que queremos investigar los anticuerpos.
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Conocer estos valores es muy importante ya que ellos sern los que nos indiquen la conveniencia de emplearlo para confirmar una enfermedad o para descartarla. El VPP de una prueba es el porcentaje de resultados verdaderamente positivos (VP) obtenidos con ella cuando la aplicamos a una poblacin general. Igualmente el VPN es el porcentaje de pruebas verdaderamente negativas (VN) aplicadas a la misma poblacin. VPP y VPN se calculan mediante las siguientes relaciones: VPP = (VP/ (VP+FP)) x100 y VPN=(VN/(VN+FN))x100 El VPP y VPN se encuentran enormemente influidos por la prevalencia de la patologa que queramos estudiar de tal manera que en ocasiones y tendr un mayor valor predictivo el resultado negativo que el positivo. (Una prueba de rosa de bengala negativa, con cualquier prevalencia, descarta casi con seguridad la infeccin por Brcela mientras que un resultado positivo no asegura de la enfermedad y menos en una zona endmica con elevada prevalencia). As pues el empleo de una prueba de sensibilidad alta en una poblacin determinada nos asegura que casi todos los pacientes con anticuerpos especficos, se clasificarn como positivos pero no nos asegura que todos ellos sean VP; su VPP est influido por la prevalencia. En la tabla 1 se exponen los VPP y VPN de una prueba serolgica con una sensibilidad y especificidad del 98 % en relacin con la prevalencia de la enfermedad por 100.000 habitantes. En estas condiciones slo con prevalencias superiores a un 10 % obtenemos VPP significativos. Esto supone que el resultado de una misma prueba serolgica pueda tener diferente valor predictivo: Si empleamos una prueba para rastreo del virus de hepatitis B con una sensibilidad y especificidad del 99% en un banco de sangre (prevalencia en donantes de 0,8 %) el VPP ser de 47 %. Esa misma prueba empleada en una poblacin de pacientes con sntomas compatibles de enfermedad (Laboratorio de microbiologa, con prevalencias de 10%) presenta un VPP de 91%. El empleo de tcnicas con elevada especificidad nos garantizar que las muestras positivas lo son de verdad pero no que todas las negativas lo sean. Al igual que en el caso anterior el VPP y VPN se ven muy influidos por la prevalencia.
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Valores predictivos positivo y negativo de una prueba con 98 % de sensibilidad y 98 % de especificidad segn la prevalencia Prevalencia por 100.000 1.000 3.000 10.000 20.000 30.000 VPP VPN 33 % 100 % 60 % 100 % 84 % 100 % 92 % 99 % 95 % 99%

PERFILES SEROLOGICOS
En la prctica diaria el diagnstico indirecto se ha decantado, en los ltimos aos, por el estudio de las muestras mediante perfiles serolgicos. La lgica de estas agrupaciones, similar a lo que realiza en el diagnstico directo, descansa en que generalmente el problema clnico requiere investigar varios patgenos como posibles agentes etiolgicos, como responsables de la patologa del paciente. Las alternativas son pues explorarlos uno a uno o simultneamente. Obviamente la primera frmula es ms lenta y, probablemente, ms econmica. La segunda es lo contrario y probablemente ms eficaz desde el punto de vista clnico. En ocasiones el perfil se divide en dos o tres niveles que se ejecutan progresivamente segn los resultados obtenidos en el nivel anterior. Este mtodo de perfiles no es nuevo, pero en la actualidad la disponibilidad comercial de muchos antgenos y la automatizacin ha impulsado su utilizacin y a nosotros nos parece un sistema bueno y eficaz para el diagnstico dada la excelente relacin entre coste, eficacia y tiempo de respuesta diagnstica. Esta filosofa de trabajo supone una organizacin especial del laboratorio de tal suerte que la mayora de las tcnicas se realicen con una frecuencia mayor a la requerida si se buscan patgenos de manera independiente.

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UTILIZACION CLINICA DE LOS PERFILES SEROLOGICOS

Dependiendo de la clase de anticuerpos que ponga en evidencia la tcnica empleada (IgG, IgM o ambos) ser necesario, como ya se cit en otra parte, el estudio de una o dos muestras de suero realizadas, en este ltimo supuesto, simultneamente. En el caso de deteccin de IgM una muestra extrada en la fase aguda ser suficiente. En el supuesto de que midan IgG o ambas clases es mandatorio el estudio seriado.

ALGUNOS EJEMPLOS DE LA UTILIDAD DE LOS PERFILES SEROLOGICO:

Perfil respiratorio Perfil para el estudio de las Hepatitis Virales Perfil serolgico para Virus de la inmunodeficiencia adquirida Perfil para gestantes e infecciones congnitas

PRINCIPALMENTE HAY DOS POSIBLES CAMPOS DE UTILIDAD PARA LA SEROLOGIA

a) El diagnstico de un proceso infeccioso en curso Si se utiliza con este fin hay que observar una serie de requerimientos muy concretos: La deteccin de anticuerpos (inmunoglobulinas G) frente a un antgeno especfico significa que el animal ha sido recientemente expuesto a este antgeno y que se ha producido una infeccin. Para poder determinar que hay una infeccin en curso e incluso que una enfermedad clnica est relacionado con el patgeno en cuestin hace falta el examen de muestras seriadas es decir al mnimo dos muestras en una distancia de 10 das en las que se demostrara un aumento del ttulo de anticuerpos cuatro veces la primera cifra.
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 En algunas infecciones, que producen inmunidad persistente la deteccin de anticuerpos en una sola muestra si puede ser diagnstica (Herpes virus, HIV). Las tcnicas existentes de deteccin de anticuerpos generalmente no pueden distinguir entre anticuerpos procedentes de una infeccin o de una vacunacin Para la deteccin de anticuerpos es necesario que el animal infectado tenga un sistema inmune funcional que produce anticuerpos. Los anticuerpos producidos con respuesta a una infeccin desaparecen con el tiempo de la circulacin sangunea, y en algunos individuos o especies la respuesta a un infeccin determinada es muy dbil. Por estas dos razones la ausencia de anticuerpos no necesariamente significa la ausencia de una infeccin. Algunos anticuerpos producidos contra un antgeno pueden tener reacciones cruzadas con otro antgeno y producir resultados falsos positivos (APMV-1 y aPMV-3) En el caso del diagnstico clnico en general es mejor la deteccin del patgeno o de su ADN que la presencia de anticuerpos frente a l.

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CAPITULO III
Pruebas Qumica Especial

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Qumica Especial
La qumica Especial se realiza en el suero que es la parte amarillenta de la sangre que queda despus de que la sangre se ha coagulado y las clulas sanguneas se han removido. La mayora de los exmenes que pertenecen a este departamento determinan principalmente hormonas secretadas por el cuerpo humano. Tambin una parte muy importante de la qumica especial es la determinacin de los marcadores tumorales. Resultados anormales conllevan a diagnsticos de enfermedades como desordenes de la tiroides, enfermedades de los ovarios y testculos, desordenes de crecimiento y diversos tipos de cncer.

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PRUEBAS ESPECIALES QUE SE REALIZAN EN EL LABORATORIO CLINICO Proteinura Protenas de Bence Jones Microalbuminura Clculo Urinario Creatinia en Orina Depuracin de Creatinina Nitrgeno Ureico en Orina Calcio en Orina Potasio en Orina Magnesio en Orina Cocaina Marihuana Opiaceos Escopolamina Extasis 17 Cetoesteroides 17 Hidroxicorticoesteroides cido Vanilmandlico Catecolaminas Electrlitos en Orina Cortisol Hormona de Crecimiento Somatomedina C cido Valproico Carbamazepina Fenitoina Litio

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CAPITULO IV
Tincin de Gram

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Tincin
Una tincin o coloracin es una tcnica auxiliar utilizada en microscopa para mejorar el contraste en la imagen vista al microscopio. Los colorantes y tinturas son sustancias que usualmente se utilizan en biologa y medicina para resaltar estructuras en tejidos biolgicos que van a ser observados con la ayuda de diferentes tipos de microscopios. Los diferentes colorantes pueden ser utilizados para aumentar la definicin y examinar grandes cortes de tejido (resaltando por ejemplo fibras musculares o tejido conectivo), poblaciones celulares (por ejemplo clasificando diferentes clulas sanguneas) o incluso para resaltar organelos dentro de clulas individuales. En bioqumica, esto implica agregar un colorante especfico (esto significa que se una de manera selectiva ya sea a ADN, protenas, lpidos, carbohidratos, etc.) a un sustrato para cualificar o cuantificar la presencia de un determinado compuesto. Tanto la tincin como el marcado fluorescente pueden servir para los mismos propsitos. Diferentes tipos de tinciones biolgicas son utilizadas tambin para marcar clulas en citometra de flujo y para marcar protenas o cidos nucleicos en electroforesis en gel. Las tinciones no estn limitadas a su uso en materiales biolgicos, tambin pueden ser utilizadas para estudiar la morfologa de otros materiales (por ejemplo, las estructuras la melares de polmeros semicristalinos de las estructuras de dominio de bloques de copolmeros.

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Un espcimen histolgico teido, colocado entre portaobjetos y cubreobjetos, montado sobre la platina de un microscopio ptico. Tincin in vivo e in vitro Una tincin in vivo (tincin supravital) es el proceso de teir tejidos vivos. Al provocar que determinadas clulas o estructuras adquieran los colores de contraste, se puede estudiar su ubicacin y morfologa mientras estn desempeando su funcin. El propsito ms comn es revelar detalles de la cito estructura que de otra manera no resultaran evidentes, sin embargo, la tincin supravital puede revelar adems donde aparece un determinado producto qumico o donde se lleva a cabo una determinada reaccin qumica dentro de las clulas o tejidos. A menudo estas tinciones son llamadas tinciones vitales o supravitales. Se introducen en el organismo mientras las clulas an se encuentran vivas. Para conseguir el efecto deseado, el colorante usualmente se utiliza en soluciones muy diluidas que van entre 1:5.000 a 1:50.000. A pesar de esto las tinciones son eventualmente txicas para los organismos, algunas ms que otras. Una tincin in vitro involucra el coloreo de clulas o estructuras que han sido removidas de su contexto biolgico. Se utiliza a menudo una combinacin de varios colorantes para revelar ms detalles y caractersticas de las que se obtendran con la utilizacin de uno solo. Combinados con protocolos especficos de fijacin y de preparacin de muestras, los cientficos y profesionales de la salud pueden utilizar estas tcnicas estandarizadas como una herramienta diagnstica repetible y consistente. Una contratincin es una tincin que consigue que las clulas o estructuras sean ms visibles, cuando no se consigue que sean totalmente visibles con la tincin principal. Por ejemplo, el cristal violeta tie nicamente a las bacterias Gram positivas en la tincin de Gram. Se utiliza una contratincin de safranina (que colorea todas las clulas), para permitir tambin la identificacin de bacterias Gram negativas.

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Es de notar que muchas tinciones pueden ser utilizadas tanto en clulas vivas como en clulas fijadas. Mtodos de tincin in vitro Preparacin Las etapas preparatorias involucradas en una tincin van a depender del tipo de anlisis planeado; bajo estas premisas se puede considerar que algunos o todos de los siguientes pasos podran requerirse.

Fijacin: de por s, esta etapa puede consistir en varios pasos. La fijacin es una modificacin de las propiedades fisicoqumicas de las protenas que forman una clula o tejido y que tiene por finalidad preservar las formas de las clulas o tejidos tanto como sea posible. A veces se puede utilizar una fijacin por calor para matar, adherir y alterar un espcimen de modo que acepte la tincin. La mayor parte de las veces se utiliza un fijador qumico. Los fijadores qumicos en general causan la formacin de enlaces cruzados entre protenas, o entre protenas y otras sustancias presentes en la muestra, incrementando su resistencia mecnica. Entre los fiadores qumicos ms comunes se encuentran el formaldehdo, etanol, metanol, y/o el cido pcrico. Pequeos bloques de tejido pueden ser embebidos en parafina o algn polmero, proceso conocido como inclusin, para incrementar su resistencia y estabilidad, y para hacer ms fcil cortarlos en rodajas extremadamente delgadas, ya que cuanto ms delgado es un corte histolgico, ms definicin se obtiene en las imgenes microscpicas. Permeabilizacin este paso implica el tratamiento de las clulas con un surfactante suave. Este tipo de tratamiento tiene como finalidad disolver la membrana celular para permitir que las grandes molculas de colorante puedan acceder a las estructuras del interior de las clulas. Montaje frecuentemente implica adherir los cortes histolgicos a un portaobjetos de vidrio para su observacin al microscopio o anlisis. En algunos casos, se puede cultivar a las clulas
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directamente sobre le portaobjetos. En muestras de clulas sueltas, como las que se presentan en un extendido de sangre o de fluidos biolgicos, la muestra puede ser aplicada directamente sobre el portaobjetos. Para piezas de tejido de mayor tamao, se utiliza un micrtomo que corta la muestra en rodajas sumamente delgadas. Estas rodajas son luego adheridas al portaobjetos por medio de una substancia que funciona como pegamento, ya sea una resina transparente, gelatina o clara de huevo. El montaje tiene por finalidad aumentar la resistencia mecnica de una muestra que de otra manera sera extremadamente frgil, para que soporte el proceso de teido conservando lo ms posible su estructura original.

Tincin adecuada En su forma ms simple, el verdadero proceso de tincin puede implicar la inmersin de la muestra (antes o despus de la fijacin y el montaje) en la solucin colorante, seguido del aclarado que es un lavado para eliminar el exceso de colorante y la observacin. Muchos tintes, sin embargo, requieren del uso de un mordiente, esto es, un compuesto qumico que reacciona con el colorante para formar un precipitado coloreado insoluble. Cuando la solucin de colorante en exceso se elimina durante el aclarado, la tincin mordentada permanece. La mayora de los colorantes utilizados en microscopa se encuentran disponibles como colorantes certificados. Esto significa que los colorantes ofrecidos por el fabricante han sido evaluados por un organismo independiente, la Biological Stain Commission, y que este organismo ha determinado que el producto ofrecido cumple o excede ciertos estndares de pureza, concentracin de sustancia colorante y desempeo en las tcnicas de tincin empleadas. Estos estndares son publicados detalladamente en la revista Biotechnic & Histochemistry.1 Muchos colorantes presentan una composicin diferente entre diferentes fabricantes. La utilizacin de colorantes certificados elimina una fuente de resultados inesperados.
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Tincin directa Hablamos de tincin directa cuando el colorante interacciona directamente con el sustrato, sin otro tratamiento previo. Tincin indirecta Se denomina de este modo a las tinciones que hacen uso de un mordiente. Un mordiente habitual es el cido tnico. Afinidad de diferentes tejidos por diferentes colorantes Cuando un tejido u estructura subcelular presenta una afinidad por un determinado colorante se suele designar por los sufijos -filo o -flico. Por ejemplo, los tejidos que se tien con azure suelen ser nombrados como azurfilos o azuroflicos. Tambin puede ser utilizado para designar propiedades tintoriales ms generalizadas, por ejemplo los tejidos que se tien con colorantes de naturaleza cida (por ejemplo la eosina) suelen ser denominados como acidoflicos, basoflicos cuando se tien con colorantes de naturaleza bsica (tales como por ejemplo el azul de metileno o la hematoxilina), y anfiflicos cuando aceptan ambos colorantes. Por el contrario, los tejidos cromfobos no toman colorante con facilidad. Tincin negativa Un mtodo sencillo de tincin para bacterias, que adems es un claro caso de cromofobia y que por lo tanto funciona aun cuando los mtodos de tincin positiva fallan, es la tincin negativa. Esto puede ser conseguido simplemente extendiendo la muestra en un portaobjetos y aplicando directamente sobre ella una gota de nigrosina o tinta china y cubriendo luego la muestra humedecida con un cubreobjetos. Luego de esto, los microorganismos pueden ser observados fcilmente por medio de microscopa en campo claro como inclusiones claras muy bien contrastadas contra el medio oscuro que las rodea. Adicionalmente, la tincin negativa es una tcnica suave que no destruye a los microorganismos, permitiendo por lo tanto un recultivo posterior para el estudio de patgenos. Colorantes

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La mayora de los colorantes son compuestos orgnicos que tienen alguna afinidad especfica por los materiales celulares. Muchos colorantes utilizados con frecuencia son molculas cargadas positivamente (cationes) y se combinan con intensidad con los constituyentes celulares cargados negativamente, tales como los cidos nucleicos y los polisacridos cidos. Ejemplos de colorantes catinicos son el azul de metileno, el cristal violeta y la safranina. Otros colorantes son molculas cargadas negativamente (aniones) y se combinan con los constituyentes celulares cargados positivamente, tales como muchas protenas. Esos colorantes incluyen la eosina, la fucsina cida y el rojo Congo. Otro grupo de colorantes son sustancias liposolubles; los colorantes de este grupo se combinan con los materiales lipdicos de la clula, usndose a menudo para revelar la localizacin de las gotculas o depsitos de grasa. Un ejemplo de colorante liposoluble es el negro Sudn. Si se desea simplemente incrementar el contraste de las clulas para la microscopa, son suficientes los procedimientos simples de tincin. El azul de metileno es un buen colorante simple que acta sobre todas las clulas bacterianas rpidamente y que no produce un color tan intenso que oscurezca los detalles celulares. Es especialmente til para detectar la presencia de bacterias en muestras naturales, puesto que la mayor parte del material no celular no se tie. Colorantes histolgicos ms comunes Los diferentes colorantes reaccionan o se concentran en diferentes partes de las clulas o tejidos, y estas propiedades son utilizadas como una ventaja para revelar partes o reas especficas. Algunos de los colorantes biolgicos ms comunes se listan ms abajo. A menos que se indique lo contrario la mayora de estos colorantes se utilizan con clulas y tejidos fijados. Las tinciones vitales (que pueden ser utilizadas con organismos vivos) se encuentran destacadas. Azul brillante de Coomassie Coomassie blue (tambin conocido como azul brillante) es un colorante que tie en forma no especfica a todas las protenas con un fuerte color azul. Se utiliza frecuentemente para teir las corridas de protenas en las electroforesis en gel.
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Azul de metileno Azul de metileno se utiliza para teir clulas animales, para hacer ms visibles sus ncleos. Es tambin utilizado para teir los extendidos de sangre para ser utilizados en citologa y como colorante vital en el recuento de reticulocitos. Azul Nilo El Nile blue (o Nile blue A), es decir azul Nilo, tie a los ncleos de color azul. Tambin puede ser utilizado para teir clulas vivas. Bismarck brown Bismarck brown, Marrn Bismarck, (tambin conocido como Bismarck brown Y o Manchester brown) le imparte un color amarillo a las mucinas cidas. Se puede utilizar con clulas vivas. Bromuro de etidio El bromuro de etidio (BE) se intercala en el ADN y le otorga un color rojo naranja fluorescente. A pesar de que no es capaz de teir clulas vivas ya que no atraviesa las membranas intactas, puede ser utilizado para identificar clulas que se encuentran en las etapas finales de la apoptosis, ya que tales clulas poseen unas membranas mucho ms permeables. Por el mismo motivo, el bromuro de etidio es utilizado como un marcador de apoptosis en poblaciones celulares y para localizar las bandas de ADN en una corrida en electroforesis en gel. Este colorante puede ser utilizado en combinacin con naranja de acridina (NA) en el conteo de clulas viables. Esta tincin combinada BE/NA le otorga a las clulas vivas un color verde fluorescente mientras que las clulas apoptticas aparecen con la distintiva fluorescencia rojo-naranja. Carmn El carmn es un colorante de un intenso color rojo que puede ser utilizado como sal de litio para teir glicgeno, mientras que las sales de alumbre-carmn son colorantes que se adhieren al ncleo. Las tinciones con carmn requieren del uso de un mordiente, que usualmente es aluminio o alumbre. Cristal violeta
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El cristal violeta, al ser combinado con un mordiente adecuado, tie las paredes celulares de color prpura. El cristal violeta es un componente importante en la coloracin de Gram. DAPI El DAPI es un colorante nuclear (tie el ncleo) fosforescente, se excita con luz ultravioleta para producir una fuerte fluorescencia azul cuando se encuentra unido al ADN. El DAPI se une a las regiones de alta repeticin A=T en los cromosomas. Adems no es visible cuando se utiliza con un microscopio de transmisin corriente. Puede ser utilizado en clulas vivas o fijadas. La tcnica de tincin con DAPI es especialmente adecuada para el recuento celular. Eosina La eosina se utiliza ms frecuentemente como contra coloracin de la hematoxilina, impartiendo un color que va del rosado al rojo al material citoplasmtico, membrana celular, y algunas estructuras extracelulares. Adems imparte un fuerte color rojo a los eritrocitos. La eosina puede ser utilizada tambin en algunas variantes de la coloracin de Gram, y en muchos otros protocolos de tincin. De hecho existen dos compuestos muy estrechamente relacionados (aunque no iguales) conocidos como eosina. El ms frecuentemente utilizado es la eosina Y (tambin conocida como eosina amarillenta) ya que posee una tonalidad amarillenta muy suave. El otro compuesto conocido como eosina es la eosina B, tambin conocida como eosina azulada o rojo imperial, la cual posee una suave tonalidad azul. Los dos colorantes son intercambiables, y la utilizacin de uno u otro es ms una cuestin de preferencia y tradicin.

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Lista de algunas de las tinciones ms comunes Nota: Esta lista incluye slo algunas de las tinciones ms comunes, y no es ni con mucho completa.
Tincin Tipo Caractersticas Uso Ejemplo

Hematoxilina

Bsica / Acidoflica

Tie ncleos, cidos nucleicos y estructuras Tincin basoflicas histolgica (mitocondrias y general ribosomas) en azul.

Eosina

cida / Basoflica

Tie protenas y estructuras con afinidad por los cidos en diferentes tonos de rojo

Tincin histolgica general

Los ncleos aparecen en azul (hematoxilina) Los cidos nucleicos asociados a Tincin protena (ej. histolgica ribosomas) en general violeta Fibra muscular en rojo Tejido conectivo en rosado
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Tincin Bicomponente hematoxilinaAnfiflica eosina

Tincin hemalumbreeosina

Similar a la tincin Tincin H&E con colores histolgica ms marcados y general definidos

Los ncleos aparecen en azul (hematoxilina) La elastina aparece en negro (orcena)

Tincin HOPS

Fibra muscular en rojo (filoxina) Tejido conectivo (colgeno) en amarillo (safranina)

Policromtica

Los ncleos aparecen en azul (hematoxilina) Fibra muscular en rojo (filoxina) Tejido conectivo (colgeno) en amarillo (safranina)

Tincin HPS

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Permite ver la cromatina con mucha claridad

Ncleos aparecen entre azul y negro Clulas con alto contenido Se utiliza para diferenciar de queratina clulas en en amarillo muestras de Glucgeno en secreciones biolgicas amarillo (esputo, LCR, Clulas orina, etc.) y en superficiales raspados y biopsias. Permite de naranja a distinguir con rosado. relativa facilidad clulas con Clulas transformaciones intermedias y neoplsicas, parabasales levaduras y entre turquesa bacterias. y azul. Clulas metaplsicas muestran coloraciones mezcladas (P. Ej. verde y rosa)

Tincin de Papanicolau

Tincin de Romanowsky

Pancromtica de Romanowsky

Extendidos sanguneos

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Tincin de Wright

Tincin de Giemsa

Tincin de Jenner

Tincin de Leishman

Tincin de Field

Tincin de May Grnwald Tincin de May GrnwaldGiemsa Tie de azul oscuro restos de Supravital cidos nucleicos, metacromtic y los proteoglicanos a cidos en varios tonos de violeta. Diagnstico de anemias regenerativas Demostracin de estructuras metacromticas

Tincin con azul de metileno

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Tincin con azul de prusia

Diagnstico de Tie los depsitos hemopoyesis de hemosiderina ineficaz, y hierro de color y hemocromatosi azul-celeste s

Los ncleos aparecen en marrn o negro Queratina y msculo en rojo

Tincin tricrmica de Masson

Los citoplasmas en tonos de rosa El colgeno y hueso en azul o verde

Tricrmica Tincin tricrmica de Lillie Smil tricrmica de Masson

Tincin tricrmica AZAN de Heidenhan

Smil tricrmica de Masson, los citoplasmas aparecen en tonos de rojo ms profundos y el conectivo en tonos ms intensos de azul Smil tricrmica de Masson

Tincin tricrmica de Mallory

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Ncleos celulares color marrn a negro. Colgeno (tejido conectivo fibroso): Color rosa o rojo. Msculo y Citoplasma: Color amarillo. Negro = ncleos, fibras elsticas Amarillo = colgeno, fibras reticulares Azul = sustancia basal, mucina Rojo brillante = fibrina Rojo = msculo

Tincin de Van Gieson

Tincin de Movat

Tincin tricrmica de Gmri Tincin de Warthin-Starry

Tricrmica Argntica

Argntica Tincin de Von Kossa Tie de tonos de marrn y negro los depsitos de
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fosfato inorgnico en hueso. Tincin de Golgi

Tincin de Bielchowsky

Tincin de Jones Tinciones para Microbiologa Tincin de Gram

Tincin de Ziehl-Neelsen Tincin de SchaefferFulton Tincin de Conklin Tie endosporas de verde y bacterias en rojo Tie endosporas de verde, similar a SchaefferFulton Deteccin de microorganismos, en especial fngicos. Sirve para diferenciar endosporas y bacterias

Tincin de Grocott

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Tincin de Dieterle

Bsqueda de microorganismos, ej., Treponema pallidum

Tincin negativa

Es muy utilizada en microscopa Tie el exterior, electrnica. En pero no el interior microscopa de clulas y ptica para estructuras identificar microorganismos encapsulados. Tie las paredes celulares de polisacridos de un intenso color rojo Sirve para diferenciar bacterias con pared de polisacridos de otras que no. (Ej Cryptococcus son mucicarmina +)

Tincin con mucicarmina

Tinciones para Organelos Produce colores prpuras y violetas en presencia de mucopolisacrido s cidos sulfatados Tinciones para Fibras Tincin de Weigert Tie fibras elsticas en tonos de azul y violeta Tie fibras elsticas en tonos de marrn y negro Tinciones para Carbohidratos
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Tincin metacromtic a

Tincin con orcena

Tincin PAS

Tie carbohidratos y protenas glicosiladas de color rojo magenta Tie el almidn de azul, el glucgeno de amarillo y el resto en tonos de ocre

Tincin con Lugol

Tincin con Carmn

Tie el glicgeno de intenso color rojo.

Tinciones para Protenas Dependiendo del fijado tie protenas y cidos nucleicos en tonos de negro y marrn Se utiliza con hematoxilina Tie eosina en el amiloide de un patologa cuando intenso color rojo se busca amiloide Tie mucopolisacrido s cidos de color azul

Tincin argntica

Tincin con Rojo Congo

Tincin con Alcian Blue

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Tincin con Coomassie Brilliant Blue

Tie inespecficamente protenas de color azul

Tinciones para cidos Nucleicos Tincin de Feulgen Tie el ADN y cromosomas de color rojo-violeta Tie ADN y cromosomas de color verde fluorescente, ARN y ribosomas en color rojo fluorescente Tie ADN de color azul-celeste fluorescente

Naranja de acridina

DAPI

Bromuro de etidio Tinciones para Lpidos Tincin con Luxol Fast Blue Tcnica de la Hematina cida de Baker Tie la mielina de azul-celeste Tie fosfolpidos y nucleoprotenas de color azul negro

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Tincin con Oil Red O

Tie lpidos neutros de color rojo intenso

Tincin con Sudan Black B

Sudn lipoflica

Tie gotas de lpidos neutros de color negro azulado

Tincin con Sudan II Tincin con Sudan III Tincin con Sudan IV Tie lpidos neutros de color rojo

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TINCION DE GRAM
La tincin de Gram o coloracin de Gram es un tipo de tincin diferencial empleado en Bacteriologa para la visualizacin de bacterias, sobre todo en muestras clnicas. Debe su nombre al bacterilogo dans Christian Gram, que desarroll la tcnica en 1884. Se utiliza tanto para poder referirse a la morfologa celular bacteriana como para poder realizar una primera aproximacin a la diferenciacin bacteriana, considerndose Bacteria Gram positiva a las bacterias que se visualizan de color moradas y Bacteria Gram negativa a las que se visualizan de color rosa o rojo o grosella.

METODOLOGIA
Recoger muestras. Hacer el extendido en espiral.

Dejar secar a temperatura ambiente o fijarlas utilizando un mechero. Fijar la muestra con metanol durante un minuto o al calor (flameado 3 veces aprox.) Agregar azul violeta (cristal violeta o violeta de genciana) y esperar 1 minuto. Todas las clulas gram positivas se tien de color azul-prpura. Enjuagar con agua. Agregar Lugol y esperar entre 1 minuto. Enjuagar con agua.

Agregar alcohol acetona y esperar 30 segundos (parte crtica de la coloracin). Enjuagar con agua.

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 Tincin de contraste agregando safranina o fucsina bsica y esperar 1 minuto. Este tinte dejar de color rosado-rojizo las bacterias Gram negativas. Para observar al microscopio ptico es conveniente hacerlo a 100x con aceite de inmersin. EXPLICACION El cristal violeta (colorante catinico) penetra en todas las clulas bacterianas (tanto Gram positivas como Gram negativas) a travs de la pared bacteriana. El Lugol es un compuesto formado por I2 (yodo) en equilibrio con KI (yoduro de potasio) y Sl (Siulterio), los cuales estn presente para solubilizar el yodo, y actan de mordiente, haciendo que el cristal violeta se fije con mayor intensidad a la pared de la clula bacteriana. El I2 entra en las clulas y forma un complejo insoluble en solucin acuosa con el cristal violeta.. La mezcla de alcohol-acetona que se agrega, sirve para realizar la decoloracin, ya que en la misma es soluble el complejo I2/cristal violeta. Los organismos Gram positivos no se decoloran, mientras que los Gram negativos s lo hacen. Para poner de manifiesto las clulas Gram negativas se utiliza una coloracin de contraste. Habitualmente es un colorante de color rojo, como lasafranina o la fucsina. Despus de la coloracin de contraste las clulas Gram negativas son rojas, mientras que las Gram positivas permanecen azules. La safranina puede o no utilizarse, no es crucial para la tcnica. Sirve para hacer una tincin de contraste que pone de manifiesto las bacterias Gram negativas. Al trmino del protocolo, las Gram positivas se vern azul-violceas y las Gram negativas, se vern rosas (si no se hizo la tincin de contraste) o rojas (si se us, por ejemplo, safranina). Esta importante coloracin diferencial fue descubierta por Hans Christian Gram en 1884. En este mtodo de tincin, la extensin bacteriana se cubre con solucin de uno de los colorantes de violeta de metilo, que se deja actuar durante un lapso determinado. Se escurre luego el exceso de violeta de metilo y se aade luego una solucin de yodo, que se deja durante el mismo tiempo que la anterior;
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despus se lava el portaobjetos con alcohol hasta que ste no arrastre ms colorante. Sigue a tal tratamiento una coloracin de contraste, como safranina, fucsina fenicada diluida, pardo Bismarck, pironin B o hasta inclusive verde de malaquita. Algunos microorganismos retienen el colorante violeta, an despus de tratarlos con un decolorante, y el color no se modifica al aadir ste; otros pierden con facilidad el primer tinte, y toman el segundo. Los que fijan el violeta, se califican de gram positivos, y los que pierden la primera coloracin y retienen la segunda, de gramnegativos. Basndonos pues, en la reaccin Gram, podemos clasificar a los microorganismos en uno de los dos grupos. Los colorantes de prosanilina son los que mejores resultados dan en la coloracin Gram. Los representantes ms usados de este grupo son violeta de metilo y violeta cristal o de genciana. En realidad, violeta de metilo es el nombre atribuido al compuesto tetrametil-p-rosanilina. El matiz de color de la p-rosanilina se intensifica al aumentar el nmero de grupos metilo en la molcula; por consiguiente, de los tres grupos, el tono ms oscuro es la hexametil-p-rosanilina(violeta cristal), y el tinte ms ligero, la tetrametil-p-rosanilina (violeta de metilo). Los nombres violeta de metilo 3R, 2R, R, B, 2B, 3B, etc., se refieren al nmero de grupos metilo contenido. La letra R indica matices rojos, y la letra B, tonos azules. El violeta de cristal contiene seis grupos metilo, y se considera como el mejor colorante primario para teir por el mtodo de Gram. La facultad de las clulas para tomar la coloracin Gram no es propia de toda sustancia viviente, sino que se limita casi en absoluto a hongos y bacterias. As vemos que las clulas de plantas y animales superiores no conservan la primera coloracin; los mohos se tien con cierta irregularidad; los grnulos de micelios propenden retener el colorante. La reaccin de Gram no es infalible ni constante; puede variar con el tiempo del cultivo y el pH del medio, y quiz por otras causas.

TEORIA
Un microorganismo gram positivo debe presentar una pared celular sana. El mismo microorganismo, si sufre dao de la pared por una u
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otra causa, se vuelve gram negativo. Esto indica la importancia de la pared para la retencin o el escape del colorante. Una posible teora del mecanismo de tincin es la siguiente: El colorante bsico entra al microorganismo, donde forma con el yodo una laca insoluble en agua. El alcohol o la acetona empleados para aclarar, deshidratan las paredes de los microorganismos gran positivos, tratados con mordiente, y forma una barrera que la laca no puede atravesar. En las clulas gram negativas, los lpidos de la pared (ms abundantes que en las clulas gran positivas) se disuelven por este tratamiento, lo que permite el escape del complejo de cristal violeta con yodo. Algunos autores objetan esta teora, pero es indudable la importancia general de la pared celular.

TECNICAS DE COLORACION GRAM

Fijar un frotis Con la ayuda de un mechero, flamear un asa bacteriolgica y esperar que enfre un poco. Tomar el asa (previamente flameada) y con sta tomar un poco de muestra. Una vez obtenida una pequea cantidad de la muestra (con el asa), hacer que sta tenga contacto con una lmina portaobjetos, la cual servir para depositar la muestra contenida en el asa. Con el asa (conteniendo la muestra) sobre la lmina portaobjetos, proceder a realizar la extensin de la muestra en el portaobjetos mediante movimientos giratorios (dar vueltas con el asa) sobre la lmina, de tal forma que al terminar la extensin, tengamos como producto una espiral en la parte media de la lmina. Esperar que seque al aire libre o ayudarse con la llama de un mechero para fijar la muestra, teniendo en cuenta que el calor no debe ser directo (slo se pasa por la llama), puesto que el calor excesivo puede cambiar la morfologa celular de las bacterias a observar. El calor deseable es aqul en el que el portaobjetos sea apenas demasiado caliente para ser colocado sobre el dorso de la mano.
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TINCION
Con violeta cristal, violeta de genciana, azul de metileno o en todo caso tinta china utilizando una cantidad suficiente de dicho colorante sobre la muestra, como para lograr cubrirla por completo. Se deja actuar al colorante por 1 minuto. Esta tincin de 1 minuto est dada para trabajar a una temperatura ambiente de 25 C.

ENJUAGUE
Al transcurrir el minuto, se debe enjuagar la lmina conteniendo la muestra con agua corriente. Para realizar el lavado, se debe tener en cuenta que el chorro de agua NO debe caer directamente sobre la muestra, sta debe caer sobre la parte superior de la lmina que no contiene muestra. El chorro debe ser un chorro delgado, aproximadamente de medio a un milmetro de espesor. Tambin el enjuague se debe realizar poniendo la lmina portaobjetos en posicin inclinada hacia abajo... La solucin de cristal violeta, se recomienda sea al 1%. Mordiente Una vez enjuagado el portaobjetos, se aplica como mordiente yodo o lugol durante un minuto ms. El mordiente es cualquier sustancia que forma compuestos insolubles con colorantes y determina su fijacin en las bacterias. Decoloracin (paso crtico) Pasado el minuto de haber actuado el mordiente, el frotis se decolora con etanol al 75 %, etanol al 95 %, acetona o alcohol-acetona, hasta que ya no escurra ms lquido azul. Para esto se utiliza el gotero del frasco del decolorante. Se van aadiendo cantidades suficientes del decolorante, hasta lograr que ste salga totalmente transparente, es decir, hasta que ya no escurra ms lquido azul. Lavado y secado Lavar con agua para quitar los residuos de decolorante y esperar que seque la lmina al aire libre o con la ayuda de la llama de un mechero de la forma anteriormente descrita.
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Tincin de contraste Una vez que la lmina ya sec, procedemos a teir nuevamente, pero esta vez se va a utilizar un colorante de contraste como por ejemplo la safranina, dejar actuar durante 1 minuto. Nuevo enjuague Pasado el minuto correspondiente, se procede a enjuagar la lmina con agua, se escurre el agua sobrante y se seca en la forma anteriormente descrita. De esta manera, ya tendremos listo el frotis para su respectiva observacin microscpica.

BACTERIAS RESISTENTES A LA TINCION GRAM

Las siguientes bacterias de naturaleza gran positiva, tien como gramnegativas: Mycobacterias (estn encapsuladas). Mycoplasmas (no tienen pared). Formas L (prdida ocasional de la pared).

Protoplastos y esferoplastos (eliminacin total y parcial de la pared, respectivamente).

UTILIDAD
En el anlisis de muestras clnicas suele ser un estudio fundamental por cumplir varias funciones: Identificacin preliminar de la bacteria causal de la infeccin.

Utilidad como control calidad del aislamiento bacteriano. Los morfotipos bacterianos identificados en la tincin de Gram se deben de corresponder con aislamientos bacterianos realizados en los cultivos. Si se observan mayor nmero de formas bacterianas que las aisladas
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hay que reconsiderar los medios de cultivos empleados as como la atmsfera de incubacin. A partir de la tincin de Gram pueden distinguirse varios morfotipos distintos: Los cocos son de forma esfrica. Pueden aparecer aislados despus de la divisin celular (Micrococos), aparecer por pares (Diplococos), formar cadenas (Estreptococos), o agruparse de manera irregular (Estafilococos). Los bacilos poseen forma alargada. En general suelen agruparse en forma de cadena (Estreptobacilos) o en empalizada. Tambin pueden distinguirse los espirales, que se clasifican en espirilos si son de forma rgida o espiroquetas si son blandas y onduladas. Si por el contrario, poseen forma de "coma", o curvados, entonces se los designa vibrios.

FUNDAMENTOS DE LA DIFERENCIACION DE GRAM POSITIVO Y GRAM NEGATIVO

Los fundamentos de la tcnica se basan en las diferencias entre las paredes celulares de las bacterias Gram positivas y Gram negativas La pared celular de las bacterias Gram positivas posee una gruesa capa de peptidoglicano, adems de dos clases de cidos teicoicos: Anclado en la cara interna de la pared celular y unido a la membrana plasmtica, se encuentra el cido lipoteicoico, y ms en la superficie, el cido teicoico que est anclado solamente en el peptidoglicano (tambin conocido como murena) Por el contrario, la capa de peptidoglucano de las Gram negativas es delgada, y se encuentra unida a una segunda membrana plasmtica exterior (de composicin distinta a la interna) por medio de lipoprotenas. Tiene una capa delgada de peptidoglicano unida a una membrana exterior por lipoprotenas. La membrana exterior est hecha de protena, fosfolpido y lipopolisacrido. Por lo tanto, ambos tipos de bacterias se tien diferencialmente debido a estas direrencias constitutivas de su pared. La clave es el peptidoglicano, ya que es el material que confiere su rigidez a la pared
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celular bacteriana, y las Gram positivas lo poseen en mucha mayor proporcin que las Gram negativas. La diferencia que se observa en la resistencia a la decoloracin, se debe a que la membrana externa de las Gram negativas es soluble en solventes orgnicos, como por ejemplo la mezcla de alcohol/acetona. La capa de peptidoglucano que posee es demasiado delgada como para poder retener el complejo de cristal violeta/yodo que se form previamente, y por lo tanto este complejo se escapa, perdindose la coloracin azul-violcea. Pero por el contrario, las Gram positivas, al poseer una pared celular ms resistente y con mayor proporcin de peptidoglicanos, no son susceptibles a la accin del solvente orgnico, sino que este acta deshidratando los poros cerrndolos, lo que impide que pueda escaparse el complejo cristal violeta/yodo, y manteniendo la coloracin azul-violcea.

CAUSA QUE ALTERE LA TINCION DE GRAM

I: Edad de la bacteria. II: Errores del operador. III: Uso de antibiticos

A pesar de la gran utilidad del la tincin de Gram, este mtodo debe ser valorado con precaucin, ya que la reaccin puede variar segn la edad de las clulas (cultivos viejos de bacterias gram positivas pueden perder capas de peptidoglicanos y teirse como gram negativos) y la tcnica empleada (Al decolorar por un tiempo muy prolongado se puede correr el riesgo que bacterias gram positivas se tian como gram negativas),Es por esta situacin que junto a la muestra deben teirse controles con bacterias gram positivas (ej. S. aureus) y gram negativas (ej. E. coli).

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CONCLUSION
Pudimos repasar y conocer mejor estas tcnicas y sobre todo la importancia de conocer bien los procedimientos y de estudiarlos y comprenderlos correctamente, no solo a la hora de calificar la materia, sino para poder ponerlos en prctica y tener un conocimiento general acerca de la sangre, lo cual es la finalidad de la capacitacin de laboratorito clnico-hematologa, formar ntegramente alumnos capaces de realizar este tipo de anlisis. La serologa es un instrumento verstil y de gran inters para el trabajo de conservacin y de los centros de recuperacin. Como prueba diagnstica, mtodo de monitorizacin e instrumento para la evaluacin de riesgos su validez depende de la correcta seleccin, aplicacin e interpretacin de la prueba a utilizar. Una parte muy importante de la qumica especial es la determinacin de los marcadores tumorales. Aunque las bacterias no aparecen en diferentes medio que las rodea, difieren mucho qumicamente esta diferencia qumica es los que permite distinguir las bacterias por Tincin, pues generalmente, el colorante reacciona con la clula bacteriana, pero no reacciona con su medio exterior.

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BIBLIOGRAFIA
http://www.uam.es/departamentos/medicina/anesnet/agend a/hematologia. http://www.slideshare.net/enfermeria1234/exmenes-delaboratorio-clnico http://www.ctv.es/USERS/pasi/labora/hemato.htm http://www.umm.edu/esp_ency/article/003647.htm http://html.rincondelvago.com/manual-de-hematologia.html http://www.mycmllife.eu/es/understanding_cml/further_infor mation/haematological_tests/ http://coli.usal.es/web/abydl/biblioteca/bibelectro.alu/docum entos/protocolos3/diagmicro/Serologia.html http://www.ferato.com/wiki/index.php/Serolog%C3%ADa Aulton Michael E., Ciencia y diseo de formas farmacuticas, 2 edicin, Ed. Elsevier Espaa, 2004. Bergey, David H.; John G. Holt; Noel R. Krieg; Peter H.A. Sneath (1994). Bergey's Manual of Determinative Bacteriology (9th Ed.). Lippincott Williams & Wilkins. ISBN 0-683-00603-7. Madigan, MT; Martinko J, Parker J (2004). Brock Biology of Microorganisms (10th ed.). Lippincott Williams & Wilkins. ISBN 0-13-066271-2. Sgaard M, Nrgaard M, Schnheyder H (2007). "First notification of positive blood cultures: high accuracy of the Gram stain report (Epub ahead of publication)". J Clin Microbiol 45: 1113.

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ANEXOS

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